專利名稱：表達真菌mrp樣abc轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)基因生物的制作方法
相關(guān)申請的交叉參考本申請基于韓國知識產(chǎn)權(quán)局的分別于2001年10月16日和2002年10月15日提交的韓國專利申請2001-0063802和2002-0062984。
背景技術(shù)：
(a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因和用該基因轉(zhuǎn)化的生物，尤其是，涉及表達包括YCF1或YHL035C的真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因的轉(zhuǎn)化生物，從而對有毒物質(zhì)如鉛、鎘、砷和除草劑有改進的抗性和積累。
(b)相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)描述重金屬如鉛、鎘和汞等等通過天然的食物鏈在人體內(nèi)積累，并造成對腦、神經(jīng)、骨等的慢性傷害，污染的環(huán)境和傷害世代持續(xù)。這些由重金屬毒性引起的問題的典型實例是在日本發(fā)生的水俁病(Minamata disease)和Itaiitai disease。由于鉛是重金屬中引起的傷害最大的一種污染物質(zhì)(Salt，D.E.，Smith，R.D.，and Raskin，I.Phytoremediation.Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.49，643-668(1998))，從環(huán)境中除去鉛是很重要的。美國政府每年花費大約5億美元從兒童生長的環(huán)境中去除鉛(Lanphear，B.P.The paradox oflead poisoning prevention.Science，281；1617-1618(1998))。由于砷污染了飲用水從而引起皮膚疾病和癌癥，又正成為一個嚴重的問題。
已知的與有毒物質(zhì)如重金屬和農(nóng)藥的抗性或蓄積相關(guān)的基因細菌P-型ATP酶，在細菌細胞膜上把鉛泵到細胞外中起作用(Rensing，C.，Sun，Y.，Mitra，B.，and Rosen，B.P.Pb(II)-translocating P-type ATPases.J.Biol.Chem.27332614-32617(1998))；與鎘抗性相關(guān)的基因包括酵母的YCF1基因；與砷抗性相關(guān)的基因包括酵母的YCF-1和ACR基因，細菌的ArsAB基因，等等。
活的生物具有通過利用轉(zhuǎn)運蛋白或?qū)η秩肷眢w的有害物質(zhì)有親和性的生物物質(zhì)來減輕物質(zhì)毒性的機制。與目前廣泛應(yīng)用的物理的和/或化學補救(remediation)相比，使用活的生物對有害物質(zhì)有抗性的基因，可以提供一種環(huán)境友好的方式以非常低廉的成本來修復(fù)被有害物質(zhì)污染的環(huán)境(Mejareand Bulow，Trends in Biotechnology；2001，Raskin I.and Ensley B.D.Phytoremediaton of Toxic Metals，John Willy&Sons，New York；2000)。尤其是，由于植物有很多優(yōu)點如能容易表達外源基因從而表現(xiàn)新的表型，它們能以低的成本生產(chǎn)并維持，它們在審美上令人愉快等等，有關(guān)通過插入有用的基因到植物中來改良植物從而用于對環(huán)境修復(fù)的研究正在積極進行。這種使用植物來清潔環(huán)境的技術(shù)稱為“植物修復(fù)(phytoremediation)”。
由于土壤等中的毒物如鉛，鎘，砷和農(nóng)藥而導(dǎo)致環(huán)境污染的情況嚴重，非常需要用能給予對這些毒物的抗性和/或積累的基因轉(zhuǎn)化的生物。
幾篇論文中已經(jīng)描述過能用于從環(huán)境中去除鎘的轉(zhuǎn)化植物(Zhu et al.，(1999)Plant Physiol.11973-79，Hirschi et al.，(2000)Plant Physiol.124125-33，Dominguez-Solis et al.，(2001)J.Biol.Chem.2769297-9302)，但是還沒有關(guān)于具有增強的從環(huán)境中去除鉛或砷的能力的轉(zhuǎn)基因植物的報道。更進一步地，開發(fā)用YCF1轉(zhuǎn)化的生物來改進對不僅對鉛還有對鎘，砷和除草劑抗性從而去除這些毒物的嘗試還沒有公開過。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種顯示鉛抗性和積累，并編碼真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白的DNA分子(多抗藥性相關(guān)蛋白ATP結(jié)合的盒式轉(zhuǎn)運蛋白，MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白)。
進一步地，本發(fā)明涉及一種包括所述的編碼MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白的DNA分子的重組載體。
更進一步地，本發(fā)明涉及對毒物有改進的抗性和/或積累的轉(zhuǎn)化生物，其用所述的編碼真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化。
附圖簡述

圖1為野生型和YCF1裸(ycf1)酵母在對照，含鉛或鎘的培養(yǎng)基中生長的圖片，表明ycf1突變酵母比野生型酵母對鉛和鎘更敏感。
圖2A和2B為用空載體轉(zhuǎn)化的野生型酵母(wt-pSEC)，用空載體轉(zhuǎn)化的ycf1酵母(ycf1-pSEC)和用YCF1轉(zhuǎn)化的ycf1酵母(ycf1-YCF1)在對照，含鉛和鎘的培養(yǎng)基中生長的圖片(A)，和酵母系的YCF1的mRNA的Northernblot結(jié)果(B)。
圖3A和3B為ycf1-pSEC酵母，wt-pSEC酵母和ycf1-YCF1酵母中鉛(A)或砷(B)的含量圖表。
圖4為野生型，YHL035C突變(yhl035C-v)和用YHL035C轉(zhuǎn)化的yhl035C-v酵母在對照或含鉛的培養(yǎng)基中生長的照片，表明yhl035C-v酵母比野生型或用YHL035C轉(zhuǎn)化的yhl035C-v酵母對鉛更敏感。
圖5A和5B為RT-PCR結(jié)果的照片，其表明在用YCF1轉(zhuǎn)化的擬南芥(Arabidopsis thaliana)中YCF1的表達。
圖6為表明YCF1轉(zhuǎn)化的擬南芥有增強的鉛和鎘抗性的照片(A，B，C)和圖表(D，E)。
圖7為表明用YCF1轉(zhuǎn)化的擬南芥對砷有增強的抗性的照片。
圖8為表明用YCF1轉(zhuǎn)化的擬南芥對除草劑CDNB有增強的抗性的照片。
圖9A和9B為用YCF1轉(zhuǎn)化的擬南芥中鉛(A)和鎘(B)含量的圖表。
圖10A-10C顯示了來自用YCF1轉(zhuǎn)化的白楊的莖愈傷組織和葉片段比來自野生型的有增強的鉛抗性的系列照片(A，B)和圖表(C)。
圖11為用YHL035C轉(zhuǎn)化的白楊植株比野生型的白楊植株對鉛的抗性更強的照片。
發(fā)明詳述和優(yōu)選實施例本發(fā)明涉及顯示對毒物具有抗性和/或積累的基因，包含該基因的載體，以及用其轉(zhuǎn)化的細胞和生物。
本發(fā)明中顯示對毒物有抗性和/或積累的基因，是一個編碼真菌多抗藥性相關(guān)蛋白(MRP)樣ATP結(jié)合的盒式轉(zhuǎn)運蛋白(以后稱作“MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白”)。
真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白，是一種ABC轉(zhuǎn)運蛋白，在把存在于細胞質(zhì)內(nèi)的幾種有機物質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)外中起作用。ABC轉(zhuǎn)運蛋白存在于從原核生物到人類肝細胞的幾種生物中，它們能轉(zhuǎn)運很多種物質(zhì)。ABC轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運的有機物質(zhì)包括谷胱甘肽結(jié)合的重金屬，膽汁酸等。屬于真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白的YCF1已知能把鎘，砷和農(nóng)藥(agricultural chemicals)轉(zhuǎn)運到液泡中，并由此提供對這些有害物質(zhì)的抗性(Li et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9442-47，Ghosh et al.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA965001-5006)。但是使用YCF1開發(fā)對鎘，砷和農(nóng)藥都有改進抗性的生物從而去除這些有害物質(zhì)的嘗試還沒有公開過。更進一步的，YCF1對鉛的抗性還沒有報道過，也沒有任何有關(guān)YHL035C蛋白的功能和表達它的轉(zhuǎn)化體的公開。
真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因包括，例如，YCF1(酵母鎘因子1)和YHL305C基因，和與YCF1蛋白及YHL035C蛋白的氨基酸序列至少有28％序列同源性的MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因。YCF1和YHL305C基因或它們的蛋白，彼此有28％的序列同源性。本發(fā)明也包括編碼真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白，而且其氨基酸序列與YCF1或YHL035C蛋白至少有28％同源性，優(yōu)選至少40％同源性，更優(yōu)選的至少50％同源性的DNA分子。例如，可以包括通過使用CLUSRALW程序?qū)enBank的氨基酸數(shù)據(jù)庫進行比較得到的BPT1，YBT1和YOR1基因，其氨基酸序列與YCF1或YHL035C蛋白至少有28％同源性。BPT1蛋白的氨基酸序列與YCF1有40％同源性，YBT1蛋白的氨基酸序列與YHL035C有51％同源性，YOR1蛋白的氨基酸序列與YCF1有28％同源性。YBT1和BPT1是已知能轉(zhuǎn)運膽汁酸的真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白(Ortiz et al.，(1997)Journal of Biological Chemistry27215358-15365，Petrovic et al.，(2000)Yeast 16561-571)，YOR1蛋白也是一種已知能轉(zhuǎn)運幾種藥物的真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白(Decottignies et al.，(1998)Journal of Biological Chemistry 27312612-12622)。
本發(fā)明的MRP樣轉(zhuǎn)運蛋白已知有一個共同的域結(jié)構(gòu)，包括在N-末端的相當長疏水區(qū)域的N-末端延伸區(qū)域；第一跨膜區(qū)域；細胞質(zhì)區(qū)域的第一核苷酸結(jié)合折疊區(qū)域；第二跨膜區(qū)域；和位于C-末端的細胞質(zhì)區(qū)域的第二核苷酸結(jié)合折疊區(qū)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白與SEQID NO2的YCF1蛋白或SEQ ID NO4的YHL035C蛋白的氨基酸序列有至少28％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％的序列同源性。其中每個都包括N-末端延伸區(qū)域，第一跨膜區(qū)域，第一核苷酸結(jié)合折疊區(qū)，第二跨膜區(qū)域，和第二核苷酸結(jié)合折疊區(qū)，而且真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白每個區(qū)域與SEQID NO2的YCF1蛋白或SEQ ID NO4的YHL035C蛋白相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列至少有28％的序列同源性。
本發(fā)明中賦予對毒物抗性和積累的基因是YCF基因，其包括編碼YCF1蛋白的多肽的序列，例如，編碼顯示對有害物質(zhì)抗性和有害物質(zhì)積累的SEQID NO2的多肽的核苷酸序列；優(yōu)選一種顯示對選自鎘，砷或除草劑的一種或多種有害物質(zhì)具有抗性和積累以及對鉛的抗性和積累，并包括編碼SEQID NO2的YCF1多肽的核苷酸序列的YCF1基因；更優(yōu)選的具有SEQ IDNO1的核苷酸序列的YCF1基因。YCF1基因存在于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的第6染色體上。當YCF1基因表達時就能顯示它的功能，因此，本發(fā)明包括氨基酸序列與YCF1蛋白至少有28％同源性，優(yōu)選至少40％同源性，更優(yōu)選50％同源性并對有害物質(zhì)有抗性和積累的蛋白，以及編碼它們的DNA分子。
YCF1蛋白是ABC轉(zhuǎn)運蛋白中的一種，它存在于酵母的液泡膜中，而且它已知能通過用MgATP作為能量來源把存在于細胞質(zhì)中與谷胱甘肽結(jié)合的鎘轉(zhuǎn)運到液泡內(nèi)減輕鎘的毒害，(Li，Z.S.et al.A new pathway for vacularcadmium sequestration in Saccharomyces cerevisiaeYCF1-Catalyzed transportof bis(glutathionato)cadmium.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，42-47(1997))。
顯示對有害物質(zhì)抗性和/或積累的基因的另一個例子是YHL035C基因，提供了顯示對鉛抗性并包括編碼SEQ ID NO4的多肽的核苷酸序列，更加優(yōu)選的是SEQ ID NO3的核苷酸序列的YHL035C基因。YHL035C基因存在于釀酒酵母的第8條染色體上，是MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白之一。當表達時YHL035C基因時就顯示它的功能，因此，本發(fā)明包括氨基酸序列與YHL035C蛋白至少有28％同源性，優(yōu)選至少40％同源性，更優(yōu)選50％同源性并對有害物質(zhì)有抗性和積累的蛋白，以及編碼它們的DNA分子。
此外，本發(fā)明提供了一種包括編碼真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白的所述DNA分子的重組載體，優(yōu)選地提供了包括YCF1基因或YHL035C基因的重組載體。重組載體的特定的例子包括pESC-YCF1，ENpCambia-YCF1，或PBI121-YCF1重組載體，或pESC-YHL035C重組載體，和pPBI121-YHL035C。這些重組載體可以由本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)已知的方法進行構(gòu)建。
本發(fā)明中，有害物質(zhì)包括鉛，鎘，砷等重金屬，或農(nóng)藥和除草劑。除草劑一般是小分子量的親脂性化合物，已知能容易地通過植物細胞壁和干擾植物特異性程序，例如，光合電子傳遞或必需氨基酸的生物合成新陳代謝等，和例如也包括氯磺酮(chlorosulfurone)，axidofluorpen，norflurazon和氯-二硝基苯(CDNB)。
因此，可使用包括編碼本發(fā)明YCF1蛋白和YHL035C蛋白的核苷酸序列的DNA分子，或與其至少有28％同源性的DNA分子來制備顯示對有害物質(zhì)有抗性和積累的轉(zhuǎn)基因生物，而且這樣制備的轉(zhuǎn)基因生物可用于以減輕和低的成本來修復(fù)被有害物質(zhì)污染的地方。
此外，本發(fā)明涉及用編碼真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白的所述DNA分子轉(zhuǎn)化的生物。本發(fā)明也涉及用編碼真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白的所述DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因細胞，優(yōu)選植物細胞。ABC基因包括前述的所有基因，例如，優(yōu)選使用YCF1基因和YHL035C基因。
轉(zhuǎn)基因生物優(yōu)選原核或真核生物，如可使用植物，動物，酵母，大腸桿菌(E.coli)和真菌。轉(zhuǎn)基因植物包括異源DNA序列，根據(jù)遺傳工程方法，其被構(gòu)建成適合在植物細胞，植物組織或植物體內(nèi)表達。植物轉(zhuǎn)化體可根據(jù)已知技術(shù)制備，典型地使用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)。更優(yōu)選地，通過選自電穿孔，微粒注射的方法和使用基因槍構(gòu)建的重組根癌農(nóng)桿菌，通過浸(dipping)的方法導(dǎo)入到植物中。本發(fā)明的一個實施方案中，可以通過構(gòu)建包括可操作地連接使其能轉(zhuǎn)錄和翻譯MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白編碼序列的表達盒，構(gòu)建包括所述表達盒的重組載體，并把所述的重組載體導(dǎo)入到植物細胞或組織中來制備轉(zhuǎn)基因植物。
上述植物包括草本植物如擬南芥，油菜，芥菜(leaf mustards)，煙草，洋蔥，胡蘿卜，黃瓜，甜馬鈴薯(sweet potatoes)，馬鈴薯，洋白菜(napacabbages)，蘿卜(radish)，萵苣，花椰菜(broccoli)，碧冬茄(petunias)，向日葵，草等，和樹木如橄欖樹(olive)，柳樹(willow)，白樺(white birch)，楊(poplar)，和樺樹(birch)，優(yōu)選使用楊和擬南芥。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，轉(zhuǎn)基因生物包括YCF1擬南芥(保藏號KCTC10064BP)，YCF1楊，或YHL035C楊。本發(fā)明的YCF1擬南芥于2001年09月05日保藏在位于韓國的52，Eoun-dong，Yusung-gu，Daejeon韓國生物科學和生物技術(shù)研究所的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(Korean Collection forType Cultures)，保藏號為KCTC10064BP。YCF1擬南芥可以根據(jù)傳統(tǒng)的植物細胞培養(yǎng)方法和分化方法，通過組織培養(yǎng)進行無性繁殖并成長為植株。與相應(yīng)的野生型相比，YCF1擬南芥對重金屬和其它有害物質(zhì)有很好的抗性(圖6，7和8)和積累(圖9)，尤其是，它顯示了對鉛，鎘，砷和農(nóng)藥的抗性和積累。
本發(fā)明的YCF1楊和YHL035C楊植株可以根據(jù)傳統(tǒng)的植物細胞培養(yǎng)方法和分化方法，通過組織培養(yǎng)進行無性繁殖并長成植株。YCF1楊和YHL035C楊植株與相應(yīng)的野生型相比對鉛有極好的抗性(圖10和11)。
后面提供的優(yōu)選實施例可以更好地理解發(fā)明。但是，下述實施例只為了更好的理解本發(fā)明本發(fā)明并不僅局限于此。
實施例1YCF1突變酵母對鉛和鎘的敏感性野生型酵母(DTY 165)和ycf1突變酵母(DTY 167，MATa ura3 leu2 his3trp3 lys2 suc2 ycf::hisG)在YPD液體培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖(dextrose))中于30℃培養(yǎng)直到OD600達到1-2，然后相同數(shù)量(1×102，1×103，1×104或1×105)的酵母細胞，在稀釋一半(half-diluted)的含有3mM鉛的YPD固體培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)3天。同樣的，它們也在稀釋一半的含有0.1mM鎘的YPD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。實驗結(jié)果如圖1所示。
如圖1中所示，與野生型酵母相比，ycf1突變酵母在含3mM鉛的培養(yǎng)基中生長減弱，在含0.1mM鎘的培養(yǎng)基中ycf1突變酵母幾乎沒有生長。因此，它說明YCF1是一種提供鉛和鎘抗性的基因。
實施例2克隆載體的構(gòu)建2-1克隆載體(PESC-YCF1)為了分離YCF1基因，野生型酵母在3mlYPD液體培養(yǎng)基中于30℃培育12小時，然后離心(12,000rpm，20-60sec)。得到的沉淀在400μl酵母裂解緩沖液(1M山梨醇，0.1M EDTA，50mM DTT(pH7.5))中懸浮，然后加入40μl消解酶(5mg/1ml，0.9M山梨醇)，于37℃保持15到30min。接著，把它們與400ml尿素緩沖溶液(7M尿素，0.3125M氯化鈉，0.05M Tris-HCl(pH8.0)，0.02M EDTA(pH8.0)，1％肌氨酸)混合，再與苯酚/氯仿混合來分離上清液。上清液再與1ml 100％乙醇混合并離心(12,000rpm，10min.)，然后沉淀的DNA在TE緩沖溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA pH8.0)中重懸。使用分離的DNA作為模板，YCFa引物(SEQ ID NO3)，YCFb引物(SEQ ID NO4)，和LA taq聚合酶試劑盒(Takara)進行PCR來分離YCF1基因。
為了證實酵母中YCF1基因與鉛抗性相關(guān)，上述(1)中分離到的YCF1基因被克隆到pESC-URA(酵母穿梭載體，Stratagene)載體中。也就是，用限制酶XhoI和ScaI酶切YCF1 PCR產(chǎn)物來制備YCF1(XhoI/ScaI)，pESC-URA載體用HindIII消化，并用Klenow片斷和dNTPs處理來產(chǎn)生帶有平端的載體，再用限制酶XhoI酶切。用T4 DNA連接酶連接上述YCF1(XhoI/ScaI)和消化的pESC-URA載體(XhoI/平端)，來構(gòu)建重組載體pESC-YCF1。
2-2克隆載體(PESC-YHL035C)除了PCR使用實施例2-1中的酵母基因組DNA作為模板，YHL035Ca引物(SEQ ID NO9)，YHL035Cb引物(SEQ ID NO10)，和LA taq聚合酶試劑盒(Takara)外，使用與實施例2-1基本相同的程序來從酵母中分離YHL035C基因。
YHL035Ca5’-cgacgcggccgcatgggaacggatccccttattatc-3’YHL035Cb5’-cgacgcggccgccatcatcttacttgattgcttgg-3’為了在酵母中表達YHL035C基因，把YHL035C基因克隆到pESC-URA(酵母穿梭載體，Stratagene)中。YHL035C PCR產(chǎn)物用NotI酶切，并使用T4 DNA連接酶連接到pESC-URA中構(gòu)建重組載體pESC-YHL035C。
實施例3YCF1重組酵母對鉛和鎘的抗性分別構(gòu)建將空載體導(dǎo)入ycf1突變酵母中的重組酵母(ycf1-pESC酵母)，導(dǎo)入空載體到野生型酵母中的重組酵母(wt-pESC酵母)，和ycf1突變酵母中YCF1過表達的重組酵母(ycf1-YCF1)，并測試其對鉛或鎘的抗性。
3-1YCF1重組酵母的構(gòu)建酵母接種到3ml的液體YPC培養(yǎng)基中，并于30℃培養(yǎng)12小時，然后將0.5ml的培養(yǎng)物置于10ml液體YPD培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)6到8小時直到OD600達到0.5-0.8。將得到的培養(yǎng)物離心(1,500rpm，5min.)收集酵母，其在5ml緩沖液(0.1M LiOAc，TE，pH7.5)中重懸并離心。離心的酵母再在緩沖液(0.1M LiOAc，TE(pH7.5))中重懸，并在振蕩培養(yǎng)箱中于30℃培養(yǎng)1小時，然后加入質(zhì)粒pESC，pESC-YCF1或pESC-YCF1，和鮭魚精子(testis)DNA，于30℃培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)的酵母與0.7ml緩沖液(40％PEG3300，0.1M LiOAc)，TE(pH7.5)混合，并于30℃振蕩培育1小時。然后，上述混合物于42到45℃放置5min，進行熱激，并離心(2,500rpm，5min.)收集酵母。酵母用1ml TE緩沖液(pH7.5)洗滌，在0.2ml水或TE緩沖液(pH7.5)中重懸，然后在選擇培養(yǎng)基(CM Ura)中培養(yǎng)2到3天來篩選轉(zhuǎn)化的酵母(ycf1-pESC酵母，wt-pESC酵母，ycf1-YCF1酵母)。
3-2重組酵母對鉛和鎘的抗性上述構(gòu)建的ycf1-pESC酵母，wt-pESC酵母，ycf1-YCF1酵母，分別培養(yǎng)于添加了1.8mM鉛的半乳糖培養(yǎng)基中(2％半乳糖，1％到0.17％(0.1％of0.17％)YNB，0.13％dropout powder，0.5％硫酸銨)，或添加了50μM鎘的半乳糖培養(yǎng)基中。對照組培養(yǎng)于不含重金屬的半乳糖培養(yǎng)基中。各重組ycf1-pESC酵母，wt-pESC酵母，ycf1-YCF1酵母在含鉛或鎘的培養(yǎng)基中的生長程度如圖2的照片所示。
從圖2可以看出，ycf1突變酵母中YCF1過表達的ycf1-YCF1酵母在含鉛或鎘的培養(yǎng)基中比ycf1-pESC酵母或wt-pESC酵母生長的更好，這也支持了前面的YCF1基因在提供鎘抗性上起重要作用的結(jié)論。此外，它也最新揭示了該基因?qū)︺U抗性也是重要的。
3-3重組酵母中YCF1的表達為了研究實施例3中構(gòu)建的ycf1-pESC酵母，wt-pESC酵母，ycf1-YCF1酵母的表達，進行了Northern Blotting。
用液氮研磨每個重組酵母，總RNA提取緩沖液(0.25M Tris HCl pH9.0，0.25M NaCl，0.05M EDTA，0.345M對氨基水楊酸(p-Aminosalicylic acid)，0.027M三異丙基萘磺酸，0.02％β-巰基乙醇，0.024％苯酚)與苯酚/氯仿以1∶1混合。以12,000rpm離心10min得到的上清液轉(zhuǎn)移到添加了400μl異丙醇的新管中。再以12,000rpm離心10min來沉淀RNA，其然后溶解于DEPC處理水并儲存于冷凍箱中。
為了進行Northern Blot，30μg的RNA在瓊脂糖凝膠上進行RNA電泳，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。尼龍膜在雜交反應(yīng)液(6×SSPE，0.5％SDS，10％PEG，1％脫脂(nonfat)奶粉，50％甲酰胺)中于42℃振蕩(stirring)培育2小時。然后，加入用32P dCTP標記的YCF1，并于42℃反應(yīng)12小時。雜交反應(yīng)后，尼龍膜用緩沖液(2×SSPE，0.5％SDS)沖洗兩次，再用另一種緩沖液(0.2×SSPE，0.5％SDS)沖洗，干燥，然后在X-線膠片上放射自顯影。實驗結(jié)果如圖2B所示。
從圖2B，三種重組載體的Northern Blot照片可以看出，ycf1-YCF1酵母過表達YCF1 mRNA。也就是說，它證實了實施例3-2中顯示的ycf1-YCF1酵母的鉛和鎘抗性，是由于YCF1的過表達。
3-4鉛和鎘的抗性機理為了研究YCF1基因給予的鉛和鎘的抗性是否是由于重金屬的分子內(nèi)積累或分子間的釋放，進行了該實驗。
三種酵母(ycf1-pESC酵母，wt-pESC酵母和ycf1-YCF1酵母)分別在含1.5mM鉛或15μM鎘的1/2半乳糖固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，刮下培養(yǎng)的酵母并收獲。收獲的酵母置于1ml濃縮硝酸中，于200℃消化大約6小時，然后用10ml 0.5N硝酸稀釋，使用自動吸收分光計(AAS)測定酵母中含有的重金屬的量。ycf1-pESC酵母，wt-pESC酵母和ycf1-YCF1酵母的測定結(jié)果如圖3中的圖表所示。
結(jié)果，wt-pESC酵母和ycf1-YCF1酵母顯示了比ycf1-pESC酵母更高的鉛和鎘積累，特別地，wt-pESC酵母和ycf1-YCF1酵母顯示了比ycf1-pESC酵母高2倍的鉛積累。因此，它證實了YCF1基因的鉛和鎘抗性是由于這些重金屬的分子內(nèi)積累。
實施例4YHL035C重組酵母的鉛抗性4-1重組酵母的構(gòu)建根據(jù)和上述實施例3-1中基本類似的方法，分別構(gòu)建導(dǎo)入空載體到y(tǒng)hl035c突變酵母中的重組酵母(yhl035c-v酵母)，導(dǎo)入空載體到野生型酵母中的重組酵母(wt-v酵母)，和yhl035c突變酵母中YHL035C過表達的重組酵母(YHL035C酵母)，并篩選轉(zhuǎn)化的酵母(wt-v酵母，yhl035c-v酵母，YHL035C酵母)。使用這些重組酵母測試其對鉛的抗性。
4-2重組酵母的鉛抗性測試根據(jù)與上述實施例3-2基本相似的方法測試wt-v酵母，yhl035c-v酵母，YHL035C酵母的鉛抗性。wt-v酵母，yhl035c-v酵母，YHL035C酵母在含鉛培養(yǎng)基中的生長程度如圖4中的照片所示。
從圖4中可以看出，yhl035c突變酵母yhl035c-v，在含1.8mM鉛的培養(yǎng)基中比wt-v酵母更敏感。但是，yhl035c突變酵母中YHL035C被表達的YHL035C酵母又恢復(fù)了鉛抗性，并在含1.8mM鉛的培養(yǎng)基中顯示了與wt-v酵母相似的生長。因此，它新揭示了YHL035C基因在提供鉛抗性中起重要作用。
實施例5轉(zhuǎn)基因植株的制備5-1用于植物轉(zhuǎn)化的YCF1和YHL035C載體的構(gòu)建為了把YCF1基因?qū)氲街仓曛校琾ESC-YCF1質(zhì)粒的BamH I/SnaBI片斷4.6kb的YCF1，被插入到PBI121(BamH I/SmaI)，從而構(gòu)建了一個PBI121-YCF1載體。為了提高YCF1基因的表達，構(gòu)建了EnPCAMBIA1302-YCF1載體。用限制酶Sall消化PCAMBIA1302載體，并用Klenow片斷和dNTPs處理以產(chǎn)生帶有平端的載體，并插入35S增強子(BamH I/平端)到用BamH I消化的載體中，來構(gòu)建EnPCAMBIA1302載體。然后把YCF1基因(BamH I/平端)插入到EnPCAMBIA1302載體的BgIII/PmII位點構(gòu)建EnPCAMBIA1302-YCF1載體。
PBI121-YCF1和EnPCAMBIA1302-YCF1載體用電穿孔儀(BIO-RAD)導(dǎo)入到E.coli中，并培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)基中。接種一個單克隆到3mlLB(Amp)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12到16小時，離心收獲轉(zhuǎn)化的E.coli。然后，加入100μl溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(PH8.0)，10mM EDTA)到收獲的E.coli中進行重懸，再加入200μl溶液II(1％SDS，0.2N氫氧化鈉)，輕輕混勻該混合物，然后冰水上培育5min。接著加入150μl溶液III(5M醋酸鉀)到上述混合物中，慢慢地混勻3到5倍(times)，離心(12,000rpm，10min)收集上清液。上清液與100％乙醇混合來沉淀DNA，然后分離DNA并干燥。獲得的PBI121-YCF1質(zhì)粒DNA裂解于TE緩沖液中，并用限制性酶BamHI和EcoR I酶切，然后確定YCF1基因以正確的方位插入。
為了把YHL035C基因?qū)氲街仓曛校藦膶嵤├?構(gòu)建的pESC-YHL1035C載體中切出YHL035C基因，并因此在兩個末端產(chǎn)生限制性位點Sacl和EcolCR1，然后導(dǎo)入YHL035C基因到用Sacl和Smal消化的pBI121載體構(gòu)建pBI121-YHL035C載體之外，根據(jù)與構(gòu)建上述用于植株轉(zhuǎn)化的YCF1載體相類似的方法構(gòu)建了pHI121-YHL035C載體。
5-2轉(zhuǎn)基因擬南芥的制備上述實施例5-1中構(gòu)建的PBI121-YCF1和EnPCAMBIA1302-YCF1載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌(Agrobacterium)中(LBA4404)。在含有卡那霉素的MS(Murashige-Skoog)培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌，并用浸的方法轉(zhuǎn)染擬南芥(Arabidopsis thaliana)的花(Clough，S.J.，and Bent，A.F.，F(xiàn)loral dipasimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana，Plant J.，16，735-743(1988))來把YCF1基因?qū)氲街仓曛小?到5周后，收獲擬南芥植株的種子，并用卡那霉素篩選用PBI121-YCF1載體轉(zhuǎn)化的植株，以及用潮霉素篩選用EnPCAMBIA1302-YCF1載體轉(zhuǎn)化的植株來篩選YCF1擬南芥。
總共獲得了5個YCF1擬南芥植株系，檢測它們YCF1 mRNA表達水平，如果表達的mRNA包括C-端700bp的YCF1 mRNA，就可確信全長mRNA的表達。首先，從5個YCF1擬南芥植株系提取mRNA，用SEQ IDNO5/SEQ ID NO6作引物進行RT-PCR，RT-PCR結(jié)果如圖5A所示。如圖5A中所示，700bp的YCF1在植株1，3，4和5中表達，而且YCF1在植株4和5中高表達。
對上述的RT-PCR產(chǎn)物進行了Southern Blotting，結(jié)果如圖5B所示。從圖5B中可以看出，在植株1，3，4和5中表達的基因是YCF1，野生型YCF1 mRNA完全轉(zhuǎn)錄的出現(xiàn)確證了圖5A的結(jié)論。顯示YCF1高表達的YCF1擬南芥于2001年09月05日保藏在位于韓國的52，Eoun-dong，Yusung-gu，Daejeon，韓國生物科學和生物技術(shù)研究所的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures at the Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology)，保藏號為KCTC10064BP。
5-3轉(zhuǎn)基因楊的制備Bong-hwal，雜種楊(Poplulus alba x P.glandulosa)的克隆，其在室外不開花，在增殖后用作用于轉(zhuǎn)化的植株。為了確保楊的體外無菌材料，從保藏于韓國森林研究所(Korea Forest Research Institute)苗圃的無性系庫(clonebank)獲得了楊莖，并用乙醇(5min)和2％氯化鈉(20min)進行表面消毒，然后在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)了4周，開始發(fā)育的莖用作用于轉(zhuǎn)化的樣本。
使用含有靶基因的農(nóng)桿菌，愈傷組織誘導(dǎo)，莖誘導(dǎo)等等，用Noh等的方法(Genetic Engineering of Poplar(2002)，written by Noh，Eun-un et al.ISBN#89-8176-098-5 93520)進行轉(zhuǎn)化。實施例5-2中構(gòu)建的導(dǎo)入了PBI121-YCF1和EnPCAMBIA1302-YCF1載體的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefociens)，接種到LB培養(yǎng)基中并于30℃培養(yǎng)過夜，以1,000g離心10min后，棄掉培養(yǎng)基，沉淀用0.85％的氯化鈉溶液再重懸。重懸液轉(zhuǎn)到皮氏(Petri)培養(yǎng)皿，然后使體外培養(yǎng)的楊節(jié)間組織在其中浸泡20min。之后，把它放到兩張消毒的吸收濾紙之間，并輕輕擠壓來除去過多的農(nóng)桿菌，然后在不含抗生素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+2，4D 1.0mg/L，BA 0.1mg/L，NAA0.01mg/L)中共培養(yǎng)2天，接著用含有50mg/L卡那霉素和500mg/L氨噻肟頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化細胞。
形成的愈傷組織在含有50mg/L卡那霉素的莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(WPM+玉米素1.0mg/L，BA0.1mg/L，NAA0.01mg/L)(LIoyd and McCown，1981)中生長來誘導(dǎo)莖。一旦誘導(dǎo)出了莖，可以通過在含有50mg/L卡那霉素的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進行次生培養(yǎng)來誘導(dǎo)延長，通過添加0.2mg/L的IBA到同樣的培養(yǎng)基中來誘導(dǎo)生根，從而獲得整個植株體。
實施例6存在有害物質(zhì)時轉(zhuǎn)化擬南芥植株的生長實施例5中制備的YCF1擬南芥植株培養(yǎng)于含有鉛(0.9，1，1.1mM)鎘(50，60，70μM)，除草劑氯-二硝基苯(CDNB)(60μM)和五價砷(50μM)的1/2MS培養(yǎng)基中，來研究它們的生長程度。用空載體(PBI)轉(zhuǎn)化的擬南芥植株和野生型植株用作對照。實驗結(jié)果如圖6到圖8所示。
圖6顯示了用YCF1轉(zhuǎn)化的擬南芥生長的照片和圖表。如圖6所示，當YCF1擬南芥和對照植株在含鉛的培養(yǎng)基中培育3周時，YCF1擬南芥(1，3，4和5)比用PBI空載體轉(zhuǎn)化的植株和野生型植株葉中出現(xiàn)更少的缺綠癥(chlorosis)和更好的根生長(A，B和D)。當YCF1和野生型擬南芥植株在不同濃度的鎘培養(yǎng)基中生長時，野生型擬南芥植株葉中比YCF1轉(zhuǎn)化體顯示更多的缺綠癥，根長得差而且比YCF1轉(zhuǎn)化體短(C和E)。
圖7為YCF1轉(zhuǎn)化的擬南芥顯示對砷抗性的圖片。當在含60uM五價砷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周時，野生型擬南芥顯示很少的生長，但YCF1轉(zhuǎn)化體(1，2，3和4)與野生型相比顯示了好得多的生長。
圖8為用YCF1轉(zhuǎn)化的擬南芥顯示對CDNB抗性的照片。當YCF1擬南芥和對照植株在含60μM CDNB的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個月時，野生型植株萌芽很差而且?guī)缀跛劳?，但YCF1擬南芥植株生長較好，幾乎和在正常條件下生長的擬南芥植株一樣。
因此，實施例5中制備的YCF1轉(zhuǎn)化擬南芥被證實對鉛，鎘，砷和除草劑有抗性。
實施例7轉(zhuǎn)化的擬南芥植株中重金屬的積累實施例5中獲得的YCF1擬南芥植株和用空載體PBI轉(zhuǎn)化的野生型擬南芥，在含鉛(0.75mM)和鎘(70μM)的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周來研究重金屬的積累。通過和實施例6基本類似的實驗來研究鉛或鎘積累的量，結(jié)果如圖9所示，其中圖9A顯示了植株中鉛的含量，圖9B顯示了植株中鎘的含量。
如圖9A所示，YCF1擬南芥植株顯示了比用PBI轉(zhuǎn)化的植株高2倍或1.4倍的鉛積累。如圖9B所示，YCF1擬南芥植株顯示了比用PBI轉(zhuǎn)化的植株高2倍或3倍的鎘積累。
因此，證實了YCF1擬南芥植株比野生型擬南芥有更高的鉛和鎘積累。
實施例8YCF1轉(zhuǎn)化植株抗有害物質(zhì)的機理YCF1轉(zhuǎn)化植株顯示了對鉛，鎘，砷和除草劑的抗性，以及鉛和鎘的積累。為了研究這些現(xiàn)象的發(fā)生是由于YCF1蛋白把重金屬轉(zhuǎn)運到液泡中的事實，從YCF1轉(zhuǎn)化植株和野生型植株中分離液泡，并進行轉(zhuǎn)運鎘和除草劑的實驗。YCF轉(zhuǎn)化植株和野生型植株的液泡中鎘(Cd+GSH)和除草劑(DNB-GS)轉(zhuǎn)運實驗結(jié)果如下表1所示。
表1.分離自擬南芥的液泡中GS相關(guān)化合物的積累(單位pmol/l ul液泡/20min)

如上述表1所示，轉(zhuǎn)運物質(zhì)時YCF1使用MgATP作為它的能量來源，在-MgATP小組中，YCF1轉(zhuǎn)化體和野生型植株之間鎘(Cd+GSH)和除草劑(DNA-GS)含量沒有差異。但是，當加入MgATP時，YCF1轉(zhuǎn)化體液泡顯示了比野生型液泡高1.7倍的鎘積累。在除草劑(DNB-GS)中，YCF1轉(zhuǎn)化體顯示了略高于野生型的積累。
從圖6，7，8和9中可以證實，YCF1轉(zhuǎn)化擬南芥植株有比野生型高的鉛，鎘，砷和除草劑的抗性，以及更多的鉛和鎘積累。表1的結(jié)果也支持了這種現(xiàn)象是由于YCF1轉(zhuǎn)化的擬南芥植株中表達的YCF1蛋白把鎘和除草劑轉(zhuǎn)運到液泡中，并穩(wěn)定它們，從而提供了對這些有害物質(zhì)的抗性和積累的事實。
實施例9轉(zhuǎn)基因楊植株的生長9-1YCF1轉(zhuǎn)基因楊植株實施例5中制備的YCF1楊植株的葉片斷和莖，置于含有500ppm鉛的愈傷組織培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2周來研究它們生長的差異。沒有轉(zhuǎn)化的野生型楊植株作為對照，以同樣的方式進行處理，實驗結(jié)果如圖10所示。圖10為顯示YCF1轉(zhuǎn)化的植株和對照白楊植株生長的照片和圖表。
如圖10所示，在含鉛的培養(yǎng)基中，YCF1楊(1，2，3和4)莖片(stalk pieces)顯示了比野生型(wt)高2倍的生長(A和C)，YCF1楊的葉片斷(1，2和3)顯示了比野生型(wt)少的褐化，并保持了葉綠素的綠色(B)。
9-2YHL035C轉(zhuǎn)化的楊植株把實施例5中制備的YHL035C轉(zhuǎn)化楊植株轉(zhuǎn)移到盆(pot)中，并使其生長成盆苗。再把這些盆苗轉(zhuǎn)移到土壤中，并浸泡到含有500ppm硝酸鉛的溶液中。實驗結(jié)果如圖11所示。
圖11為當在含有鉛的土壤中培養(yǎng)4周時，野生型楊生長較差，但YHL035C轉(zhuǎn)化的楊比野生型生長好得多的照片。因此，實施例5中制備的YCF1轉(zhuǎn)化的楊植株和YHL035C楊植株被證實對鉛有抗性。
如上所述，本發(fā)明的YCF1基因提高了對重金屬和其它有害物質(zhì)的抗性和積累，YHL035C基因改進了對鉛的抗性，因此，能表達這些基因的轉(zhuǎn)化體可用于修復(fù)被有害物質(zhì)污染的環(huán)境。從而，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體提供了一種環(huán)境友好的方式以低成本地修復(fù)環(huán)境。

關(guān)于微生物保藏的說明(細則13之二)


PCT/RO/134表(1998年7月)
序列表<110>POSCO公司(POSCO)學校法人浦項工科大學校(POSTECH FOUNDATION)<120>表達真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)基因生物<130>OPP2002-1053KR<150>KR10-2001-0063802<151>2001-10-16<150>KR10-2002-0062984<151>2002-10-15<160>10<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>4548<212>DNA<213>ycf1基因<400>1atggctggta atcttgtttc atgggcctgc aagctctgta gatctcctga agggtttgga 60cctatatcct tttacggtga ctttactcaa tgcttcatcg acggtgtgat cctaaatcta120tcagcaattt tcatgataac cttcggtatc agagatttag ttaacctttg caagaaaaaa180cactctggca tcaaatatag gcggaattgg attattgtct ctaggatggc actagttctg240ttggagatag cgtttgtttc acttgcgtct ttaaatattt ctaaagaaga agcggaaaac300tttaccattg taagtcaata tgcttctaca atgttatctt tatttgttgc tttagcctta360cactggatag aatacgatag atcagttgta gccaatacgg tacttttatt ctattggctt420tttgaaacat tcggtaattt tgctaaacta ataaatattc taattagaca cacctacgaa480ggcatttggt attccggaca aacgggtttc atactaacgt tattccaagt aataacatgt540gccagtatcc tgttacttga agctcttcca aagaagccgc taatgccaca tcaacacata600
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Gly Lys Phe Gln Lys Gln Thr Leu Lys Cys Thr Asp Gln Arg Ile Ser515 520 525Lys Leu Asn Glu Cys Leu Gln Asn Ile Arg Ile Val Lys Tyr Phe Ala530 535 540Trp Glu Arg Asn Ile Ile Asn Glu Ile Lys Ser Ile Arg Gln Lys Glu545 550 555 560Leu Arg Ser Leu Leu Lys Lys Ser Leu Val Trp Ser Val Thr Ser Phe565 570 575Leu Trp Phe Val Thr Pro Thr Leu Val Thr Gly Val Thr Phe Ala Ile580 585 590Cys Thr Phe Val Gln His Glu Asp Leu Asn Ala Pro Leu Ala Phe Thr595 600 605Thr Leu Ser Leu Phe Thr Leu Leu Lys Thr Pro Leu Asp Gln Leu Ser610 615 620Asn Met Leu Ser Phe Ile Asn Gln Ser Lys Val Ser Leu Lys Arg Ile625 630 635 640Ser Asp Phe Leu Arg Met Asp Asp Thr Glu Lys Tyr Asn Gln Leu Thr645 650 655Ile Ser Pro Asp Lys Asn Lys Ile Glu Phe Lys Asn Ala Thr Leu Thr660 665 670Trp Asn Glu Asn Asp Ser Asp Met Asn Ala Phe Lys Leu Cys Gly Leu675 680 685Asn Ile Lys Phe Gln Ile Gly Lys Leu Asn Leu Ile Leu Gly Ser Thr690 695 700Gly Ser Gly Lys Ser Ala Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Glu Leu Asn705 710 715 720Leu Ile Ser Gly Ser Ile Ile Val Pro Ser Leu Glu Pro Lys His Asp725 730 735Leu Ile Pro Asp Cys Glu Gly Leu Thr Asn Ser Phe Ala Tyr Cys Ser740 745 750
Gln Ser Ala Trp Leu Leu Asn Asp Thr Val Lys Asn Asn Ile Ile Phe755 760 765Asp Asn Phe Tyr Asn Glu Asp Arg Tyr Asn Lys Val Ile Asp Ala Cys770 775 780Gly Leu Lys Arg Asp Leu Glu Ile Leu Pro Ala Gly Asp Leu Thr Glu785 790 795 800Ile Gly Glu Lys Gly Ile Thr Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Ile805 810 815Ser Leu Ala Arg Ala Val Tyr Ser Ser Ala Lys His Val Leu Leu Asp820 825 830Asp Cys Leu Ser Ala Val Asp Ser His Thr Ala Val Trp Ile Tyr Glu835 840 845Asn Cys Ile Thr Gly Pro Leu Met Lys Asn Arg Thr Cys Ile Leu Val850 855 860Thr His Asn Val Ser Leu Thr Leu Arg Asn Ala His Phe Ala Ile Val865 870 875 880Leu Glu Asn Gly Lys Val Lys Asn Gln Gly Thr Ile Thr Glu Leu Gln885 890 895Ser Lys Gly Leu Phe Lys Glu Lys Tyr Val Gln Leu Ser Ser Arg Asp900 905 910Ser Ile Asn Glu Lys Asn Ala Asn Arg Leu Lys Ala Pro Arg Lys Asn915 920 925Asp Ser Gln Lys Ile Glu Pro Val Thr Glu Asn Ile Asn Phe Asp Ala930 935 940Asn Phe Val Asn Asp Gly Gln Leu Ile Glu Glu Glu Glu Lys Ser Asn945 950 955 960Gly Ala Ile Ser Pro Asp Val Tyr Lys Trp Tyr Leu Lys Phe Phe Gly965 970 975Gly Phe Lys Ala Leu Thr Ala Leu Phe Ala Leu Tyr Ile Thr Ala Gln
980 985 990Ile Leu Phe Ile Ser Gln Ser Trp Trp Ile Arg His Trp Val Asn Asp99510001005Thr Asn Val Arg Ile Asn Ala Pro Gly Phe Ala Met Asp Thr Leu Pro101010151020Leu Lys Gly Met Thr Asp Ser Ser Lys Asn Lys His Asn Ala Phe Tyr1025 103010351040Tyr Leu Thr Val Tyr Phe Leu Ile Gly Ile Ile Gln Ala Met Leu Gly104510501055Gly Phe Lys Thr Met Met Thr Phe Leu Ser Gly Met Arg Ala Ser Arg106010651070Lys Ile Phe Asn Asn Leu Leu Asp Leu Val Leu His Ala Gln Ile Arg107510801085Phe Phe Asp Val Thr Pro Val Gly Arg Ile Met Asn Arg Phe Ser Lys109010951100Asp Ile Glu Gly Val Asp Gln Glu Leu Ile Pro Tyr Leu Glu Val Thr1105 11101115 1120Ile Phe Cys Leu Ile Gln Cys Ala Ser Ile Ile Phe Leu Ile Thr Val112511301135Ile Thr Pro Arg Phe Leu Thr Val Ala Val Ile Val Phe Val Leu Tyr114011451150Phe Phe Val Gly Lys Trp Tyr Leu Thr Ala Ser Arg Glu Leu Lys Arg115511601165Leu Asp Ser Ile Thr Lys Ser Pro Ile Phe Gln His Phe Ser Glu Thr117011751180Leu Val Gly Val Cys Thr Ile Arg Ala Phe Gly Asp Glu Arg Arg Phe1185 119011951200Ile Leu Glu Asn Met Asn Lys Ile Asp Gln Asn Asn Arg Ala Phe Phe120512101215
Tyr Leu Ser Val Thr Val Lys Trp Phe Ser Phe Arg Val Asp Met Ile122012251230Gly Ala Phe Ile Val Leu Ala Ser Gly Ser Phe Ile Leu Leu Asn Ile123512401245Ala Asn Ile Asp Ser Gly Leu Ala Gly Ile Ser Leu Thr Tyr Ala Ile125012551260Leu Phe Thr Asp Gly Ala Leu Trp Leu Val Arg Leu Tyr Ser Thr Phe1265 127012751280Glu Met Asn Met Asn Ser Val Glu Arg Leu Lys Glu Tyr Ser Ser Ile128512901295Glu Gln Glu Asn Tyr Leu Gly His Asp Glu Gly Arg Ile Leu Leu Leu130013051310Asn Glu Pro Ser Trp Pre Lys Asp Gly Glu Ile Glu Ile Glu Asn Leu131513201325Ser Leu Arg Tyr Ala Pro Asn Leu Pro Pro Val Ile Arg Asn Val Ser133013351340Phe Lys Val Asp Pro Gln Ser Lys Ile Gly Ile Val Gly Arg Thr Gly1345 135013551360Ala Gly Lys Ser Thr Ile Ile Thr Ala Leu Phe Arg Leu Leu Glu Pro136513701375Ile Thr Gly Cys Ile Lys Ile Asp Gly Gln Asp Ile Ser Lys Ile Asp138013851390Leu Val Thr Leu Arg Arg Ser Ile Thr Ile Ile Pro Gln Asp Pro Ile139514001405Leu Phe Ala Gly Thr lle Lys Ser Asn Val Asp Pro Tyr Asp Glu Tyr141014151420Asp Glu Lys Lys Ile Phe Lys Ala Leu Ser Gln Val Asn Leu Ile Ser1425 143014351440Ser His Glu Phe Glu Glu Val Leu Asn Ser Glu Glu Arg Phe Asn Ser144514501455
Thr His Asn Lys Phe Leu Asn Leu His Thr Glu Ile Ala Glu Gly Gly146014651470Leu Asn Leu Ser Gln Gly Glu Arg Gln Leu Leu Phe Ile Ala Arg Ser147514801485Leu Leu Arg Glu Pro Lys Ile Ile Leu Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ser149014951500Ile Asp Tyr Asp Ser Asp His Leu Ile Gln Gly Ile Ile Arg Ser Glu1505 151015151520Phe Asn Lys Ser Thr Ile Leu Thr Ile Ala His Arg Leu Arg Ser Val152515301535Ile Asp Tyr Asp Arg Ile Ile Val Met Asp Ala Gly Glu Val Lys Glu154015451550Tyr Asp Arg Pro Ser Glu Leu Leu Lys Asp Glu Arg Gly Ile Phe Tyr155515601565Ser Met Cys Arg Asp Ser Gly Gly Leu Glu Leu Leu Lys Gln Ile Ala157015751580Lys Gln Ser Ser Lys Met Met Lys1585 1590<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>YCFa引物<400>5actaccgtaa agctcgagaa aatggctggt aat33<210>6<211>27
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>YCFb引物<400>6cttgcctaag tgacgtgacg tctcctt 27<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RT-YCF1A引物<400>7catgagtgcg ttctatccct ctat24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RT-YCF1B引物<400>8ccaccttcgg ttagttgggc atct24<210>9<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物YHL035Ca
<400>9cgacgcggcc gcatgggaac ggatcccctt attatc 36<210>10<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物YHL035Cb<400>10cgacgcggcc gccatcatct tacttgattg cttgg3權(quán)利要求
1.一種DNA分子，其顯示對鉛抗性和促進積累，并編碼真菌多抗藥性相關(guān)蛋白(MRP)-樣ATP結(jié)合的盒式轉(zhuǎn)運蛋白(MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白)。
2.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白選自YCF1蛋白，YHL035C蛋白，BPT1蛋白，YBT1蛋白或YOR1蛋白。
3.權(quán)利要求2的DNA分子，其中所述的YCF1蛋白具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，而且該DNA分子具有編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求3的DNA分子，其中所述編碼YCF1蛋白的DNA分子具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求2的DNA分子，其中所述YCF1蛋白，除顯示對鉛抗性和積累外，還顯示對選自鎘，砷或除草劑的一種或多種有害物質(zhì)具有抗性和促進的積累。
6.權(quán)利要求5的DNA分子，其中所述的除草劑是氯-二硝基苯。
7.權(quán)利要求2的DNA分子，其中所述YHL035C蛋白具有SEQ ID NO4的氨基酸序列，而且該DNA分子具有編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求7的DNA分子，其中所述編碼YHL035C蛋白的DNA分子具有SEQ ID NO3的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白是與SEQ ID NO2的YCF1蛋白或SEQ ID NO4的YHL035C蛋白的氨基酸序列有至少28％的氨基酸序列同源性的真菌MRP樣轉(zhuǎn)運蛋白。
10.權(quán)利要求9的DNA分子，其中所述真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白與SEQ ID NO2的YCF1蛋白或SEQ ID NO4的YHL035C蛋白的氨基酸序列有至少28％的氨基酸同源性，和其中所述YCF1蛋白和YHL035C蛋白分別包括N-末端延伸區(qū)，第一跨膜區(qū)域，第一核苷酸結(jié)合折疊區(qū)，第二跨膜區(qū)，第二核苷酸結(jié)合折疊區(qū)，而且所述的真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白的每個區(qū)域與SEQ ID NO2的YCF1蛋白或SEQ ID NO4的YHL035C蛋白每個相應(yīng)的區(qū)域的氨基酸序列有至少28％序列同源性。
11.一種重組載體，包括權(quán)利要求1到10中任何一項的編碼真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白的DNA分子。
12.權(quán)利要求11的重組載體，其中所述的重組載體是pESC-YCF1，ENpCambia-YCF1，或PBI121-YCF1。
13.權(quán)利要求11的重組載體，其中所述的重組載體是pESC-YHL035C重組載體或pBI121-YHL035C重組載體。
14.用權(quán)利要求1到10的任一項的編碼真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因生物。
15.權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述的轉(zhuǎn)基因生物是原核生物或真核生物。
16.權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述的真核生物是動物，植物或酵母。
17.權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述的植物選自擬南芥，油菜，芥菜，煙草，洋蔥，胡蘿卜，黃瓜，甜馬鈴薯，馬鈴薯，洋白菜，蘿卜，萵苣，花椰菜，碧冬茄，向日葵，草，白樺，楊，橄欖樹，柳樹或樺。
18.權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述的轉(zhuǎn)基因生物是YCF1擬南芥(保藏號KCTC10064BP)或YCF1楊。
19.權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述的轉(zhuǎn)基因生物是YHL035C楊。
20.一種用權(quán)利要求1到10的任一項的編碼真菌MRP樣ABC轉(zhuǎn)運蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化的植物細胞。
21.權(quán)利要求20的植物細胞，其中所述的植物選自擬南芥，油菜，芥菜，煙草，洋蔥，胡蘿卜，黃瓜，甜馬鈴薯，馬鈴薯，洋白菜，蘿卜，萵苣，花椰菜，碧冬茄，向日葵，草，白樺，楊，橄欖樹，柳樹或樺樹。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離的DNA分子，其編碼賦予生物對有毒物質(zhì)如重金屬和除草劑的抗性和積累的ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白之真菌MRP(多藥耐藥性相關(guān)蛋白)亞族，包含分離DNA的載體，和用分離的DNA轉(zhuǎn)化的生物。用本發(fā)明的ABC轉(zhuǎn)運蛋白的真菌MRP亞族轉(zhuǎn)化的生物能用于修復(fù)被有毒物質(zhì)污染的環(huán)境。例如，轉(zhuǎn)化的植物可用于清潔污染的土壤或水，從而提供一種環(huán)境友好的方式以低成本修復(fù)被污染的資源。
文檔編號C12N1/19GK1602356SQ02824853
公開日2005年3月30日 申請日期2002年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月16日
發(fā)明者宋元鏞, 梁泳烈, 李永叔, 黃仁煥, 盧銀云, 催憐任, 鄭恩華, 恩里科·馬丁諾亞 申請人:Posco公司, 學校法人浦項工科大學校