專利名稱：從感染細(xì)胞中回收和純化痘病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從感染細(xì)胞中回收痘病毒(poxvirus)，特別是改良的安卡拉痘苗病毒(痘苗病毒Ankara，MVA)，的方法。根據(jù)本發(fā)明，將痘病毒感染細(xì)胞進(jìn)行高壓勻漿作用以獲得含痘病毒的勻漿物。可將含痘病毒的勻漿物進(jìn)行至少一個純化步驟以獲得痘病毒富集部分。本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明方法獲得的含痘病毒部分和含痘病毒的勻漿物。
背景技術(shù)：
痘病毒科(poxviridae)由在脊椎動物和無脊椎動物細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的龐大復(fù)雜DNA病毒家族組成。痘病毒科可分為chordopoxvirinae(脊椎動物痘病毒)和entomopoxvirinae(昆蟲痘病毒)兩個亞科。
脊椎動物痘病毒包括幾種具有重要經(jīng)濟(jì)價值的動物痘病毒(分類于不同的屬)，例如駱駝痘病毒(camelpox viruses)、綿羊痘病毒(sheeppoxvirus)、山羊痘病毒(goatpox virus)或禽痘病毒(avipoxviruses)，尤其是家禽痘病毒(fowlpoxvirus)。對于預(yù)防綿羊天花和山羊天花的家畜接種，可使用減毒活病毒或滅活病毒。對于家禽接種已經(jīng)開發(fā)了以禽痘病毒為載體的重組疫苗。
由于痘病毒可感染人類細(xì)胞，因此推測也可將其用作在人體中表達(dá)異源基因的載體并誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫反應(yīng)。US 5736368和US 6051410公開了基因組中含有HIV基因的家禽痘病毒。
到目前為止，作為正痘病毒屬成員之一的天花病毒是人類最重要的痘病毒。同為痘病毒科正痘病毒屬成員之一的痘苗病毒被用作抵御天花的活疫苗。全世界范圍內(nèi)用痘苗病毒進(jìn)行的成功接種使天花病毒徹底根除(Theglobal eradication of smallpox。Final report of the global commissionfor the certification of smallpox eradication；History of PublicHealth，No.4，GenevaWorld Health Organization，1980)。自WHO宣布之后，除面臨高度感染痘病毒危險的人員(例如實(shí)驗(yàn)室工作人員)之外接種已經(jīng)中斷了許多年。由于痘苗病毒可能具有被用于生物戰(zhàn)爭或被生物恐怖分子利用的危險，使得接種計(jì)劃再次引起人們的興趣。
最近，痘苗病毒也已經(jīng)被用于工程化重組基因表達(dá)病毒載體以及作為潛在的重組活疫苗(Mackett，M.，Smith，G.L.和Moss，B.P.N.A.S.USA 797415 7419；Smith，G.L.，Mackett，M.和Moss，B.Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2，383～407)。這需要借助DNA重組技術(shù)將編碼所導(dǎo)入外源抗原的DNA序列導(dǎo)入痘苗病毒基因組中。如果該基因整合至病毒DNA上某個病毒生命周期非必需位點(diǎn)，那么該新產(chǎn)生的重組痘苗病毒就可能具有感染性，也就是說能夠感染異種細(xì)胞并因此表達(dá)整合的DNA序列(EP專利申請No.83286和No.110385)。一方面，以這種方式制備的重組痘苗病毒可用作預(yù)防傳染病的活疫苗，另一方面，也可用于在真核細(xì)胞中制備外源蛋白質(zhì)。
為開發(fā)重組活疫苗，痘苗病毒作為載體的用途受到安全問題及法規(guī)的影響。文獻(xiàn)中描述的大部分重組痘苗病毒都是以痘苗病毒W(wǎng)estern Reservestrain為基礎(chǔ)的。由于該毒株公知具有強(qiáng)神經(jīng)毒性因而極不適于在人和動物中使用(Morita et al.，Vaccine 5，65～70)。另一方面，改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)卻公知是特別安全的。MVA為痘苗病毒安卡拉株(CVA)在雞胚成纖維細(xì)胞上經(jīng)長期連續(xù)傳代獲得(參見Mayr，A.的綜述，Hochstein-Mintzel，V.和Stickl，H.Infection 3，6-14；瑞士專利No.568 392)。按布達(dá)佩斯條約要求保藏的MVA病毒株有保藏在位于Salisbury(UK)的歐洲動物細(xì)胞保藏中心(European Collection of AnimalCell Cultures，ECACC)的毒株MVA 572、MVA 575和MVA-BN，保藏編號分別為ECACC V94012707、ECACC V00120707和ECACC V00083008。MVA之所以特別是由于其極大的減毒作用，也即具有削弱的毒性或感染性但卻同時保持良好的免疫原性。為鑒定MVA病毒基因組中相對于野生型CVA毒株的變化已經(jīng)對MVA病毒進(jìn)行了分析。已鑒定出6個主要基因組DNA缺失(缺失I、II、III、IV、V和VI)，共計(jì)31,000個堿基對(Meyer，H.，Sutter，G.和Mayr A.J.Gen.Virol.，72，1031～1038)。所形成的MVA病毒嚴(yán)格限制于鳥類宿主細(xì)胞。此外，MVA的特征在于其極端的減毒作用。用多種動物模型進(jìn)行試驗(yàn)證明，MVA甚至在免疫抑制動物中都是無毒的。更重要的是，MVA的優(yōu)越特性已經(jīng)在廣泛的臨床試驗(yàn)中得到了證明(Mayr etal.，Zbl.Bakt.Hyg.1，Abt.Org.B 167 375～390，Stickl etal.，Dtsch.med.Wschr.99，2386～2392)。在這些對超過包括高危病人在內(nèi)的120 000名個體進(jìn)行的研究中，使用MVA疫苗沒有出現(xiàn)副作用。已經(jīng)構(gòu)建并在臨床試驗(yàn)中使用了可用作疫苗的重組MVA。WO 98/13500公開了一個含有且能夠表達(dá)一個或多個編碼登革熱病毒(dengue virus)抗原DNA序列的重組MVA。外源DNA序列在MVA基因組中天然產(chǎn)生缺失的位置重組進(jìn)病毒DNA。
用痘病毒或重組痘病毒接種前，必須將病毒純化至一定程度以符合規(guī)章要求。傳統(tǒng)純化痘病毒，特別是MVA和重組MVA，的方法如下述第一步培養(yǎng)易感細(xì)胞及其對應(yīng)的痘病毒。MVA的易感細(xì)胞例如是雞胚成纖維細(xì)胞。用痘病毒感染易感細(xì)胞并培養(yǎng)一段足夠允許病毒子代產(chǎn)生的時間。之后凍融細(xì)胞以從培養(yǎng)物表面分離并部分破碎細(xì)胞。離心沉淀完整細(xì)胞和破碎細(xì)胞的混合物。用超聲制備勻漿物。用蔗糖墊層(sucrose cushions)離心自勻漿物純化病毒(Joklik WK.“The purification of four strains ofpoxvirus”Virology 1962；189～18)。該過程中的關(guān)鍵步驟是用超聲波進(jìn)行勻漿(Hedstrom，K.G.和Lindberg，U.，Z.Immun.Forsch.1969137421～430；Stickl，H.，Korb，W.和Hochstein-Mintzel，V.，Zbl.Bakt.，1.Abt.Orig.(1970)，215，38～50)。在工業(yè)過程中，優(yōu)選所有的處理步驟都易于控制和重復(fù)。然而用超聲波勻漿病毒細(xì)胞懸液的缺點(diǎn)是超聲步驟難于以相同的方式重復(fù)、難于調(diào)節(jié)且難于將該方法從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模放大至工業(yè)規(guī)模。
發(fā)明目的因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種從痘病毒感染細(xì)胞回收痘病毒的方法，特別是痘苗病毒例如MVA毒株，其中對感染細(xì)胞的勻漿作用是可重復(fù)、易于控制的且易于從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模擴(kuò)到至工業(yè)規(guī)模。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及從感染細(xì)胞回收痘病毒的方法，尤其是痘苗病毒，例如Elstree株或改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)。根據(jù)本發(fā)明的從感染細(xì)胞回收痘病毒的方法包括將痘病毒感染細(xì)胞進(jìn)行高壓勻漿作用以獲得含痘病毒勻漿物的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以回收完整、具感染力的痘病毒是預(yù)料不到的。高壓勻漿作用常用于在從真核或原核細(xì)胞中分離蛋白質(zhì)和脂質(zhì)時破碎細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。US 3 983 008公開了將一種經(jīng)高壓勻漿作用從微生物細(xì)胞中抽提有用成分的方法。所抽提的化合物是酵母蛋白質(zhì)、細(xì)菌酶和酵母脂質(zhì)。DE 19918619公開了高壓勻漿用于從酵母細(xì)胞中分離HbsAg的用途。US 4 255521描述了一種經(jīng)高壓釋放從微生物細(xì)胞中抽提葡萄糖異構(gòu)酶的方法。高壓勻漿也被用于自重組釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中分離病毒樣顆粒(VLP)(Milburn和Dunnill(1994)Biotechnology andBioengineering 44，736～744)，以及腺病毒載體的生產(chǎn)和純化(US 6 194191)。VLP和腺病毒是無包膜并相當(dāng)小且簡單的病毒，因而類似細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。因此，已顯示出適于從細(xì)胞中分離蛋白質(zhì)的高壓勻漿作用也可以被用于自真核細(xì)胞中分離腺病毒和VLP并不令人感到驚奇。相反，細(xì)胞內(nèi)成熟的痘病毒病毒體(IMV，參見下述，參見Fields et al.，F(xiàn)ields Virology，1996，Lippincott-Raven publishers，Philadelphia，USA，ISBN0-7817-0253-4，第83章，第2654～5頁)具有非常復(fù)雜、涉及其它脂膜的形態(tài)學(xué)構(gòu)造。在某些方面，與跟無包膜病毒的形態(tài)學(xué)及物理特性相比，痘病毒IMV的形態(tài)學(xué)及物理特性更接近于細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和物理特性。因而可以期望用于經(jīng)高壓勻漿作用破壞細(xì)胞的條件也可由于破壞痘病毒。因此，高壓勻漿作用破碎了細(xì)胞但是卻留下足夠用于進(jìn)一步提純的完整痘病毒這樣的結(jié)果是令人驚奇的。換言之，人們無法預(yù)測到高壓勻漿可用于從感染細(xì)胞中回收痘病毒。事實(shí)上，已知的從感染細(xì)胞回收痘病毒的方法采用的是超聲波勻漿，這是一種相當(dāng)溫和的勻漿方式。與采用超聲波的回收方法相反，根據(jù)本發(fā)明的方法允許對感染細(xì)胞的可重復(fù)勻漿；該方法易于控制且易于將該過程從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模放大至工業(yè)規(guī)模。
本發(fā)明上下文中術(shù)語“痘病毒”是指屬于痘病毒科的任意一種病毒。根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選用痘病毒科脊椎動物痘病毒亞科實(shí)施，更優(yōu)選正痘病毒(orthopoxvirus)屬、禽痘病毒(avipoxvirus)屬、山羊痘病毒(capripoxvirus)和豬痘病毒(suipoxvirus)屬。本發(fā)明最優(yōu)選涉及回收和純化選自包括痘苗病毒、山羊痘病毒、綿羊痘病毒、金絲雀痘病毒(canarypoxvirus)及家禽痘病毒的組中的痘病毒的方法。特別優(yōu)選的是痘苗病毒。根據(jù)本發(fā)明方法所使用的痘苗病毒株的例子有毒株Elstree、Wyeth、Copenhagen、Temple of Heaven、NYCBH、Western Reserve。該發(fā)明并不受限于那些特別提到的痘苗病毒株，而是可以用任一痘苗病毒株代替。痘苗病毒株的一個優(yōu)選例子是改良的安卡拉痘苗病毒株(MVA)。一個典型的MVA毒株是保藏于歐洲動物細(xì)胞保藏中心、保藏編號為ECACCV00120707的MVA575。最優(yōu)選的是MVA-BN或其衍生物。MVA-BN已描述于WO 02/42480(PCT/EP01/13628)。所述的國際申請公開了能夠鑒定某一MVA株是否為MVA-BN或其衍生物的生物檢測方法以及能夠獲得MVA-BN或其衍生物的方法。該申請的內(nèi)容在本申請中用作參考。MVA-BN已保藏于歐洲動物細(xì)胞保藏中心，保藏編號為ECACC V00083008。
所要回收的病毒可以是天然病毒、減毒病毒或重組病毒。
術(shù)語“重組病毒”是指任意一種病毒基因組中插入了一個外源基因的病毒，該外源基因不是病毒基因組的天然部分。外源基因可以是治療基因、編碼包括至少一個表位以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的抗原或多肽的基因、反義表達(dá)盒或核酶。獲得重組病毒的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。外源基因優(yōu)選插入病毒基因組的非必需區(qū)域。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，外源核酸序列插入MVA基因組上天然產(chǎn)生缺失的部位(公開在PCT/EP96/02926)。
“減毒病毒”是指與非減毒親本病毒相比在感染后導(dǎo)致宿主微生物較低死亡率和/或發(fā)病率的病毒。減毒痘苗病毒的一個例子是MVA毒株，尤其是MVA-575和MVA-BN。
痘病毒，例如痘苗病毒，已知以兩種不同的形式存在在感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中附著于細(xì)胞膜的痘病毒(細(xì)胞內(nèi)的成熟病毒粒子(IMV))和已經(jīng)外化的病毒(細(xì)胞外的包膜病毒粒子(EEV))(Vanderplasschen A，Hollinshead M，Smith GL“Intracellular and extracellular vacciniavirions enter cells by different mechanisms”J.Gen.Virol.(1998)，79，877～887)。IMV和EEV都具有感染性，但由于EEV含有一酯蛋白包膜因而它們在形態(tài)上不相同。正常情況下IMV粒子比EEV更豐富，但是根據(jù)本發(fā)明的方法兩種類型的粒子都可得到。
根據(jù)本發(fā)明勻漿步驟的起始材料是被各自痘病毒感染的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，用于定義勻漿起始材料的術(shù)語“被感染細(xì)胞”是指用各自病毒感染的完整細(xì)胞、各自病毒所附著的被感染細(xì)胞的部分或片斷、或完整細(xì)胞和酶解/破碎細(xì)胞的混合物。被感染細(xì)胞的部分或片斷的粒子有各自病毒所附著的破碎/酶解細(xì)胞的細(xì)胞膜。起始材料也包括既未附著于細(xì)胞膜也未定位于細(xì)胞內(nèi)的游離病毒粒子。
為獲得作為本發(fā)明方法起始材料的被感染細(xì)胞用各自的痘病毒感染真核細(xì)胞。真核細(xì)胞是對各自痘病毒的易感細(xì)胞并允許有感染力病毒的復(fù)制和產(chǎn)生。對于所有痘病毒這樣的細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。對MVA和痘苗病毒株Elstree來說，該類型細(xì)胞的一個例子是雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)(Drexler I.，Heller K.，Wahren B.，Erfle V.和Sutter G?！案叨葴p毒的改良安卡拉痘苗可在幼鼠腎細(xì)胞，一種病毒增殖的潛在宿主，中復(fù)制但是不能在各種人轉(zhuǎn)化或原代細(xì)胞中復(fù)制”J.Gen.Virol.(1998)，79，347～352)。CEF細(xì)胞可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的條件下培養(yǎng)。優(yōu)選CEF細(xì)胞固定或搖瓶培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基。優(yōu)選于37±2℃下培養(yǎng)48至72小時。感染優(yōu)選采用感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.05至1 TCID50的痘病毒，且優(yōu)選于37±2℃下培養(yǎng)48至72小時。
可通過查看細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)來觀察感染過程，典型出現(xiàn)被感染細(xì)胞顯著變圓(rounding)。
本發(fā)明允許從被感染細(xì)胞中回收痘病毒，例如Elstree或MVA。術(shù)語“回收”的意思是，本發(fā)明的方法允許破碎被痘病毒感染的細(xì)胞和/或?qū)⒍徊《緩乃鼈兺ǔ＝Y(jié)合的細(xì)胞膜上分離，以達(dá)到進(jìn)一步可以進(jìn)一步純化痘病毒的程度。因此，從被感染細(xì)胞回收痘病毒的產(chǎn)物(本申請中指“含痘病毒的勻漿物”)是一種游離痘病毒和細(xì)胞碎片的均質(zhì)混合物，其僅含有微量完整、未破碎細(xì)胞以及結(jié)合于細(xì)胞膜的病毒。
如果被感染細(xì)胞是可經(jīng)懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)的細(xì)胞，那被感染細(xì)胞可以容易地經(jīng)通過離心收集。如果被感染細(xì)胞或多或少是完整貼壁細(xì)胞，應(yīng)當(dāng)在將它們進(jìn)行高壓勻漿前將它們從培養(yǎng)瓶中收集也就是清除下來。這樣的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。實(shí)用方法有機(jī)械方法(例如使用橡皮細(xì)胞刮刀)、物理方法(例如將培養(yǎng)容器于-15℃以下冷凍和+15℃以上融化)或生化方法(用酶處理，例如胰蛋白酶，將細(xì)胞從培養(yǎng)容器上分離下來)。若為該目的而使用酶，則應(yīng)當(dāng)控制溫育時間，因?yàn)闇赜^程中這些酶可能會破壞病毒。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中對被感染細(xì)胞，更特別是收集的被感染細(xì)胞，施加高壓勻漿步驟。本說明書中，術(shù)語“高壓勻漿”有時簡寫為“HPH”。高壓勻漿具有雙重作用。一方面，高壓勻漿導(dǎo)致完整細(xì)胞的破碎。這樣，IMV被釋放并可用于進(jìn)一步純化。另一方面，高壓勻漿具有使痘病毒從細(xì)胞膜分離或至少細(xì)胞-膜-病毒聚合體的大小被減小的效果。此外，這簡化了對痘病毒的進(jìn)一步純化。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉高壓勻漿的一般原理(White MD，Marcus D.，“Disintegration of microorganisms”，Adv.Biotechnol.Processes1988；851～96)。HPH系統(tǒng)是以在受控且可重復(fù)的條件下利用高壓迫使樣品高速通過一固定小孔為基礎(chǔ)的。本說明書中術(shù)語“噴頭”“孔”“噴嘴”可交替使用。
每個細(xì)胞破碎儀的心臟是破碎頭。破碎頭優(yōu)選包括(I)高壓腔/缸，(II)移入腔/缸并從而提高腔/缸內(nèi)壓力的高壓活塞，以及(III)噴頭/噴嘴，通過它來噴射腔內(nèi)容物。所噴射出的腔內(nèi)容物被指向一個靶表面，例如一片優(yōu)選具有允許冷卻的熱交換表面的金屬。為收集破碎的腔內(nèi)容物，系統(tǒng)中配備了收集破碎樣品的裝置(稱作“收集腔”)。典型的高壓勻漿單元有Constant Cell Disruption Systems(Low March，Daventry，Northants，NN114SD，United Kingdom)的Basic Z+。
在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，用高壓勻漿系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破碎有三個階段。(I)將樣品導(dǎo)入高壓腔/缸。隨后升高腔/缸中的壓力。最終高壓活塞下降。(II)隨后高壓活塞推動樣品以高速通過噴嘴。樣品從高壓區(qū)域向低壓區(qū)域的快速轉(zhuǎn)移導(dǎo)致細(xì)胞破碎。(III)樣品擊中靶并放射狀覆蓋于冷卻的熱交換表面。隨后產(chǎn)物流至一腔以收集。重調(diào)水壓并繼續(xù)該循環(huán)。在該過程末期將噴射的勻漿物視體積收集至適宜小瓶中。
根據(jù)本發(fā)明，為回收痘病毒，噴嘴直徑范圍在0.10～0.6mm、0.15～0.6mm、0.15～0.50mm之間，優(yōu)選范圍在0.15～0.40mm、0.20～0.50mm，更優(yōu)選在0.20～0.40mm之間，最優(yōu)選在0.25mm～0.35mm之間。最優(yōu)選直徑的例子是在0.25～0.35mm之間。
設(shè)定壓力腔/缸中的壓力值為200～1000巴，優(yōu)選400～1000巴、200～800巴，更優(yōu)選400～800巴、600～1000巴，甚至更優(yōu)選600～900巴，最優(yōu)選700～900巴。最優(yōu)選壓力為800巴。
勻漿物在出口的溫度優(yōu)選不超過+25℃，且優(yōu)選低于15℃，最優(yōu)選低于10℃。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以被幾乎線性放大，并或以分批方式或以連續(xù)方式運(yùn)作。
分批方法中，所要勻漿的每批細(xì)胞可以接受一次或多次高壓勻漿步驟。優(yōu)選每批接受一至三次勻漿步驟，最優(yōu)選僅一次。
優(yōu)選可通過測定如上所定義起始材料和經(jīng)勻漿步驟后所獲得材料的病毒滴度(等于有感染力病毒粒子的數(shù)量，測定組織培養(yǎng)感染量(TCID50)或噬斑形成單位(pfu))來檢查勻漿步驟的成功與否。換言之，也就是在高壓勻漿前、后測定病毒滴度。起始材料包含或多或少的完整細(xì)胞和占有高百分比的包含結(jié)合于細(xì)胞膜的痘病毒顆粒大聚合體。若用這一材料測定病毒滴度，則所獲得的滴度低于實(shí)際具感染力顆粒的數(shù)量。這是由于用于測定病毒滴度的測試系統(tǒng)通常是細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)(例如實(shí)施例2中所公開的系統(tǒng))，該系統(tǒng)中對被感染細(xì)胞數(shù)量或菌斑數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。這一系統(tǒng)不能區(qū)分僅由一個病毒粒子造成的一個細(xì)胞感染和由例如結(jié)合于細(xì)胞膜的病毒顆粒大聚合體造成的細(xì)胞感染所產(chǎn)生的陽性結(jié)果。高壓勻漿后痘病毒從細(xì)胞膜分離和/或細(xì)胞膜-病毒聚合體的大小顯著減小，從而產(chǎn)生大量小聚合體。若用該材料用于滴度測定則所獲得的結(jié)果較高，即使實(shí)際具感染力顆粒的數(shù)量并沒有改變。因此，優(yōu)選用至少平均值或與起始材料相比勻漿物較高的TCID50/ml(“TCID”是“組織培養(yǎng)感染量”的縮寫)來反映勻漿步驟的成功與否。實(shí)施例部分中詳細(xì)說明了如何測定TCID50/ml值。作為選擇，可用電子顯微鏡來鑒定高壓勻漿的質(zhì)量及成功與否。
為進(jìn)一步純化，將獲得的勻漿物進(jìn)行至少一次純化步驟以獲得痘病毒-富集部分。特別地，這些步驟可被用于含痘苗病毒的勻漿物，如果要用該勻漿物進(jìn)一步所述的痘苗病毒。
除其他因素外，純化步驟可以是——分批離心(例如用蔗糖墊層(sucrose cushions))或連續(xù)的流式超離心(蔗糖梯度)(Hilfenhaus，J.，Kohler，R.和Gruschkau，H.，J.Biol.Stand.(1976)4，285～293；Madalinski，W.，Bankovski，A.和Korbecki，M.，Acta Virol.(1977)21，104～108)，——超濾(例如用孔徑大于500kDa但等于或小于0.1μm的膜進(jìn)行交叉流過濾)，——柱層析(例如離子交換，疏水作用，大小排阻或組合)(Hedstrom，K.G.和Lindberg，U.，Z.Immun.Forsch.1969 137421～430；Stickl，H.，Korb，W.)和Hochstein-Mintzel，V.，Zbl.Bakt.，1.Abt.Orig.(1970)，215，38～50)或——上述全部的組合(Masuda，N.，Ellen，R.P.和Grove，D.A.，J.Bacteriol.(1981)，147(3)，1095～1104).
本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它任一純化方法也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
優(yōu)選純化步驟為超濾步驟。最優(yōu)選超濾為交叉流過濾。交叉流過濾的原理是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見，例如Richards，G.P.和Goldmintz，D.，J.Virol.Methods(1982)，4(3)，第147～153頁“Evaluation ofa cross-flow filtration technique for extraction of poliovirusesfrom inoculated oyster tissue homogenates”。
盡管一個純化步驟可能足以滿足生物醫(yī)療產(chǎn)品的規(guī)章要求，為獲得甚至更純的產(chǎn)品可以采用兩次或更多次上面提及的純化步驟。
在最優(yōu)選實(shí)施方式中，純化步驟為交叉流過濾之后進(jìn)行至少一次柱層析步驟。最優(yōu)選柱層析步驟為離子交換或疏水作用。
可選地將獲得的病毒富集部分凍干。凍干方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知(Day J.和McLellan M.，Methods in Molecular Biology(1995)，38，Humana Press，“Cryopreservation and freeze-drying protocols”)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明回收痘病毒的方法，即包含對被感染細(xì)胞進(jìn)行高壓勻漿步驟的方法，所獲得的痘病毒富集部分和/或含痘病毒的勻漿物。特別地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的回收/純化方法，即其中將經(jīng)HPH獲得的含痘病毒勻漿物進(jìn)行至少一次純化步驟的方法，所獲得的痘病毒富集部分。痘病毒可以是如上所述的任一痘病毒。特別地，根據(jù)本發(fā)明的痘病毒是象Elstree或改良的安卡拉痘苗病毒這樣的任一適合接種的痘苗病毒，最優(yōu)選MVA-BN。
根據(jù)本發(fā)明包括一個HPH步驟的方法所獲得的含痘病毒的勻漿物和/或痘病毒富集部分，HPH步驟其特征在于非常高的游離IMV痘病毒與EEV痘病毒比率。術(shù)語“游離IMV”用于指代在破碎被感染細(xì)胞前、后或過程中已經(jīng)從細(xì)胞膜分離且從而可以被進(jìn)一步純化的IMV。在所有的工業(yè)方法中制備痘病毒的起始材料包括被感染細(xì)胞以及培養(yǎng)上清液。因此，起始材料包括被感染細(xì)胞中所含的IMV痘病毒以及主要存在于上清中的EEV痘病毒。已知的破碎細(xì)胞和隨后的勻漿方法(例如使用超聲波)并不能象高壓勻漿一樣有效地破碎細(xì)胞和/或從細(xì)胞碎片中分離IMV痘病毒。換言之，大部分IMV仍然結(jié)合于細(xì)胞膜和細(xì)胞碎片。因此，游離IMV與EEV的比率低于根據(jù)本發(fā)明的方法。在使用超聲波的方法中，該比率在進(jìn)一步純化步驟過程中并不發(fā)生顯著變化，因?yàn)橥ǔMV所依舊結(jié)合的細(xì)胞碎片被去除了。與已知回收痘病毒的方法相反，根據(jù)本發(fā)明的回收方法可非常有效地破碎被感染細(xì)胞而且IMV可非常有效地從細(xì)胞膜分離。因此，可用于進(jìn)一步純化的總游離IMV量高于現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法，且因此游離IMV與EEV的比率也更高。
根據(jù)本發(fā)明的方法獲得含痘病毒的勻漿物和/或痘病毒富集部分可用作疫苗。
若含痘病毒的勻漿物和/或痘病毒富集部分包含未改良的痘病毒或減毒痘病毒，例如痘苗病毒Elstree株或MVA，則其可用于抵御痘病毒感染的接種。例如，包含痘苗病毒，例如Elstree株或MVA尤其是MVA-BN，的含病毒勻漿物和/或病毒富集部分可用作抵御天花感染的疫苗。
若含痘病毒的勻漿物和/或痘病毒富集部分包含含有且表達(dá)一個或多個外源基因的痘病毒，則該含痘病毒的勻漿物和/或痘病毒富集部分可進(jìn)一步被用于接種包括人類在內(nèi)的動物以抵御由該外源基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)。
為制備疫苗，將根據(jù)本發(fā)明方法所獲得的含痘病毒勻漿物和/或痘病毒富集部分轉(zhuǎn)換為一種生理可接受的形式。這可以根據(jù)制備用于預(yù)防天花接種的痘病毒疫苗(如Stickl，H.et al.Dtsch.Med.Wschr.99，2386～2392所述)的實(shí)踐來完成。例如，含痘病毒的勻漿物和/或痘病毒富集部分以5×108TCID50/ml的滴度于-80℃保存于約10mM Tris、140mM NaCl、pH 7.4中。為制備針劑疫苗，將保存于含有2％蛋白胨、1％人白蛋白、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)的安瓿瓶，優(yōu)選玻璃安瓿瓶，中例如103～109TCID50的病毒凍干。作為選擇，針劑疫苗可由將處方中的病毒逐步冷凍-干燥獲得。該處方可包含其它添加劑，例如甘露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或其它適于體內(nèi)給藥的添加劑，例如抗氧化劑或惰性氣體、穩(wěn)定劑或重組蛋白(例如人血清白蛋白)。適于凍干的典型的含病毒處方包含10mM Tris緩沖液、140mM NaCI、18.9g/l葡聚糖(MW 36000～40000)、45g/l蔗糖、0.108g/l L-谷氨酸單甲鹽一水化物(mono potassiumsalt monohydrate)，pH為7.4。隨后將玻璃安瓿瓶密封，且可于4℃至室溫之間保存數(shù)月。然而如果不需使用的話，優(yōu)選將安瓿瓶低于-20℃保存。
為進(jìn)行接種可將凍干或冷凍干燥的產(chǎn)品于0.1～0.5ml水溶液優(yōu)選生理鹽水或Tris緩沖液中溶解，并全身或局部給藥，即經(jīng)非腸道、肌內(nèi)或任一其它熟練從業(yè)人員已知的給藥途徑。給藥形式、劑量和次數(shù)可由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員以已知的方式進(jìn)行優(yōu)化。對于痘病毒載體最優(yōu)選采用皮下或肌內(nèi)給藥。
該發(fā)明進(jìn)一步涉及接種包括人在內(nèi)的動物的方法，包括給動物包括人根據(jù)需要用根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的含痘病毒勻漿物或痘病毒富集部分進(jìn)行接種。
發(fā)明概述除其它因素，本發(fā)明包括以下內(nèi)容的單獨(dú)或組合自被感染細(xì)胞中回收痘病毒的方法，包括將被感染細(xì)胞進(jìn)行高壓勻漿以獲得含痘病毒勻漿的步驟。
上述方法的特征在于，痘病毒選自正痘病毒、禽痘病毒、豬痘病毒和山羊痘病毒。
上述方法的特征在于，痘病毒選自痘苗病毒、山羊痘病毒、綿羊痘病毒、金絲雀痘病毒和家禽痘病毒。
上述方法的特征在于，痘苗病毒是改良的安卡拉痘苗病毒株(MVA)，尤其是保藏編號為ECACC V00083008的MVA-BN。
上述方法的特征在于，痘病毒是重組痘病毒。
上述方法的特征在于，通過將被感染細(xì)胞置于高壓腔中、提高腔中壓力并將被感染細(xì)胞經(jīng)噴嘴射出完成高壓勻漿。
上述方法的特征在于，腔中的壓力值升至200至1000巴范圍。
上述方法的特征在于，噴嘴直徑范圍為0.10至0.6mm。
上述方法的特征在于，將含痘病毒的勻漿物經(jīng)至少一次純化步驟以獲得痘病毒富集部分。
上述方法的特征在于，該至少一次純化步驟是超濾步驟。
上述方法的特征在于，該超濾為交叉流過濾。
上述方法的特征在于，交叉流過濾步驟中所使用的膜具有大于500kDa但等于或小于0.1μm的孔徑。
上述方法的特征在于，超濾后進(jìn)行至少一次柱層析步驟。
上述方法的特征在于，獲得的含痘病毒勻漿物或痘病毒富集部分為冷凍-干燥的。
經(jīng)上述方法獲得的含痘病毒勻漿物或痘病毒富集部分。
用作疫苗的上述含痘病毒勻漿物或痘病毒富集部分。
上述含痘病毒勻漿物或痘病毒富集部分用于制備疫苗的用途。
根據(jù)需要接種動物包括人的方法，其特征在于向動物體施以含痘病毒勻漿物或痘病毒富集部分或如上所述的疫苗。


附圖1將用MVA-BN感染的CEF細(xì)胞經(jīng)凍融循環(huán)處理以獲得病毒-細(xì)胞懸液。不經(jīng)對細(xì)胞-病毒-懸液的進(jìn)一步純化如實(shí)施例2中所述測定懸液的病毒滴度(“0-值”)。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)已知的一種勻漿方法用超聲波處理病毒-細(xì)胞-懸液(“超聲波儀(Sonifier)”)，或如實(shí)施例1所述用根據(jù)本發(fā)明的勻漿方法處理(“HPH”)。HPH步驟中的壓力為800巴，噴嘴直徑為0.25mm。勻漿步驟末期在此測定表達(dá)滴度。
實(shí)施例以下實(shí)施例將進(jìn)一步闡明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解，所提供的實(shí)施例決不能以將本發(fā)明所提供技術(shù)的應(yīng)用限制與這些實(shí)施例的方式進(jìn)行解釋。
實(shí)施例1用高壓勻漿器對痘病毒-細(xì)胞-懸液進(jìn)行的勻漿用MVA-BN(ECACC V00083008)感染培養(yǎng)于搖瓶的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)。凍融被感染細(xì)胞以獲得病毒-細(xì)胞-懸液。
Constant Cell Disruption Systems(Low March，Daventry，Northants，NN114SD，United Kingdom)的Basic Z+勻漿器每次裝載粗病毒-細(xì)胞-懸液50ml。為確定優(yōu)化勻漿條件，檢測了0.18至0.40范圍的噴嘴直徑和200至1000巴范圍的壓力。高壓勻漿粗懸液一、二或三次。根據(jù)產(chǎn)品說明操作勻漿器。通過檢測實(shí)施例2中所述滴度對該方法進(jìn)行評估。
在預(yù)備試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，若噴頭直徑大于0.4mm不會對勻漿效果產(chǎn)生積極影響。若噴嘴直徑為0.18mm、0.25mm及0.35mm則將病毒細(xì)胞懸液于800巴壓力下進(jìn)行一次勻漿可獲得最佳結(jié)果。在這些條件下未觀察到大的滴度差異。
比較根據(jù)本發(fā)明的方法以及現(xiàn)有技術(shù)已知的經(jīng)超聲波直流法。結(jié)果概括于附圖1。與超聲波處理相比，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生了更高的病毒滴度以及更好的懸液勻漿性，因此其更適于下游進(jìn)一步的加工處理。
實(shí)施例2改良安卡拉痘苗病毒(MVA)的滴定用基于TCID50的檢測方法以10倍稀釋液于96孔板中完成改良安卡拉痘苗病毒(MVA)滴定。
于檢測末期用抗痘苗病毒抗體和適宜染色液將被感染細(xì)胞可視化。
將2～3日齡的原代CEF(雞胚成纖維細(xì)胞)細(xì)胞于7％RPMI中稀釋至1×105細(xì)胞/ml。每份稀釋液制備8個10倍稀釋液。稀釋后于96孔板中每孔接種100μl。隨后于37℃、5％CO2下過夜培養(yǎng)細(xì)胞。
用無胎牛血清的以10倍步驟(適宜為10-1至10-12)制備含病毒溶液稀釋液。
之后將每份100μl的病毒樣品添加至含細(xì)胞板孔中。
37℃、5％CO2下溫育96孔板5天以容許病毒感染和復(fù)制。
感染5天后用痘苗病毒特異抗體染色細(xì)胞。用偶聯(lián)了二級抗體的辣根過氧化物酶(HRP)檢測該特異抗體。MVA特異抗體是一種抗痘苗病毒抗體，兔多克隆抗體，IgG片斷(Quartett，Berlin，Germany&num；9503-2057)。二級抗體是抗兔IgG抗體，偶聯(lián)了山羊單克隆抗體的HRP(Promega，Mannheim，Germany，&num；W4011)。用已知技術(shù)進(jìn)行進(jìn)行顯色反應(yīng)。
將每個在顯色反應(yīng)中呈陽性帶細(xì)胞板孔標(biāo)記為陽性以計(jì)算TCID50。
根據(jù)Spearman[1]和Kaerber[2]的公式計(jì)算滴度。由于所有檢測參數(shù)都是恒定的，因此使用了以下簡化公式。
病毒滴度[TCID50/ml]=10[a+1,5+xa8+xb8+xc8]]]>a＝最后一欄中的稀釋因子，其中所有8個孔都呈陽性Xa＝a+1欄中的陽性板孔數(shù)Xb＝a+2欄中的陽性板孔數(shù)Xc＝a+3欄中的陽性板孔數(shù)

關(guān)于微生物保藏的說明(細(xì)則13之二)


PCT/RO/134表(1992年7月)
微生物國際保藏證明(譯文)PLMD5898A

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分析證明產(chǎn)品描述 MVA-575保藏號00120707試驗(yàn)描述 細(xì)胞病變的病毒滴度TCID50的確定。(SOP ECACC/055)細(xì)胞接受標(biāo)準(zhǔn)/說明/規(guī)定陰性對照需要顯示沒有影響的信號。測試樣品系列稀釋到每一進(jìn)行稀釋的指示細(xì)胞株的4個孔中。細(xì)胞病變效果指示病毒存在。病毒滴度計(jì)算采用下述公式，其中作為展示每一稀釋少于4個陽性孔的分布結(jié)果，x表示得自標(biāo)準(zhǔn)TCID50表的值，y是所有4個孔都是陽性的最高稀釋度的值TCID50＝(1/y)×101+x時間19/01/01結(jié)果指示細(xì)胞株 BHK 21 CLONE 13陰性對照 沒有CPE測試樣品 CPE少于4個陽性孔的分布4，4，0X 0.50Y 10-5TCID50＝(1/10-5)×101+0.50＝100.65整體結(jié)果 病毒存在試驗(yàn)描述 通過在支原體豬血清瓊脂上和在支原體馬血清培養(yǎng)基中分離測定支原體。SOP QC/MYCO/01/02接受標(biāo)準(zhǔn)/說明所有陽性對照(M.pneumoniae&M.orale)需要通過在瓊脂板上的典型的菌落形成顯示支原體證據(jù)。培養(yǎng)基再次培養(yǎng)到支原體豬血清瓊脂上，通過典型的菌落形成評價支原體。所有的陰性對照瓊脂平板必須顯示沒有微生物生長。
陽性試驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)是在瓊脂板上的典型的菌落形成的支原體證據(jù)。陰性結(jié)果不顯示此證據(jù)。
測試數(shù)21702時間 12/02/01結(jié)果 陽性對照陽性陰性對照陰性試驗(yàn)結(jié)果陰性整體結(jié)果通過授權(quán) ECACC，質(zhì)量負(fù)責(zé)人，時間5/3/01
分析證明產(chǎn)品描述 MVA-575保藏號00120707試驗(yàn)描述 采用Vero指示細(xì)胞系和Hoechst33258熒光檢測系統(tǒng)測定支原體。(SOP QC/MYCO07/05)接受標(biāo)準(zhǔn)/說明 陰性對照中的Vero細(xì)胞明確可見為熒光細(xì)胞核，沒有細(xì)胞質(zhì)熒光。陽性對照(M.orale)必須顯示支原體證據(jù)為熒光細(xì)胞核加支原體DNA的核熒光。陽性試驗(yàn)結(jié)果顯示為支原體DNA的額外的核熒光。陰性對照不顯示細(xì)胞質(zhì)熒光。
測試數(shù)21702時間12/02/01結(jié)果 陽性對照 陽性陰性對照 陰性試驗(yàn)結(jié)果 陰性整體結(jié)果 通過試驗(yàn)描述 通過在胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基(TSB)上和液體巰乙醇酸鹽中分離細(xì)菌和真菌的檢測。(SOP QC/BF/01/02)接受標(biāo)準(zhǔn)/說明 所有的陽性對照(枯草芽孢桿菌，產(chǎn)芽胞梭狀芽胞桿菌，白色念珠菌)表現(xiàn)出微生物生長的證據(jù)(渾濁)，陰性對照顯示沒有微生物生產(chǎn)的證據(jù)(澄清)。
陽性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)是在任一試驗(yàn)培養(yǎng)基中的混濁。對于陰性試驗(yàn)結(jié)果所有培養(yǎng)基必須是澄清的。
測試數(shù)21702時間12/02/01結(jié)果 陽性對照 陽性陰性對照 陰性試驗(yàn)結(jié)果 陰性整體結(jié)果 通過授權(quán) ECACC，質(zhì)量負(fù)責(zé)人，時間5/3/01

關(guān)于微生物保藏的說明(細(xì)則13之二)


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微生物國際存活證明(譯文)PLMD5898A
產(chǎn)品描述 MVA-BN保藏號00083008試驗(yàn)描述 通過在支原體豬血清瓊脂上和在支原體馬血清培養(yǎng)基中分離測定支原體。SOP QC/MYCO/01/02接受標(biāo)準(zhǔn)/說明 所有陽性對照(M.pneumoniae&M.orale)需要通過在瓊脂板上的典型的菌落形成顯示支原體證據(jù)。培養(yǎng)基再次培養(yǎng)到支原體豬血清瓊脂上，通過典型的菌落形成評價支原體。所有的陰性對照瓊脂平板必須顯示沒有微生物生長。
陽性試驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)是在瓊脂板上的典型的菌落形成的支原體證據(jù)。陰性結(jié)果不顯示此證據(jù)。
測試數(shù)21487時間27/11/00結(jié)果 陽性對照 陽性陰性對照 陰性試驗(yàn)結(jié)果 陰性整體結(jié)果 通過試驗(yàn)描述 采用Vero指示細(xì)胞系和Hoechst33258熒光檢測系統(tǒng)測定支原體。(SOP QC/MYCO07/05)接受標(biāo)準(zhǔn)/說明 陰性對照中的Vero細(xì)胞明確可見為熒光細(xì)胞核，沒有細(xì)胞質(zhì)熒光。陽性對照(M.orale)必須顯示支原體證據(jù)為熒光細(xì)胞核加支原體DNA的核熒光。陽性試驗(yàn)結(jié)果顯示為支原體DNA的額外的核熒光。陰性對照不顯示細(xì)胞質(zhì)熒光。
測試數(shù)21487時間27/11/00結(jié)果 陽性對照 陽性陰性對照 陰性試驗(yàn)結(jié)果 陰性整體結(jié)果 通過授權(quán) ECACC，質(zhì)量負(fù)責(zé)人，時間4/12/02
試驗(yàn)描述 通過在胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基(TSB)上和液體巰乙醇酸鹽中分離細(xì)菌和真菌的檢測。(SOP QC/BF/01/02)接受標(biāo)準(zhǔn)/說明 所有的陽性對照(枯草芽孢桿菌，產(chǎn)芽胞梭狀芽胞桿菌，白色念珠菌)表現(xiàn)出微生物生長的證據(jù)(渾濁)，陰性對照顯示沒有微生物生產(chǎn)的證據(jù)(澄清)。
陽性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)是在任一試驗(yàn)培養(yǎng)基中的混濁。對于陰性試驗(yàn)結(jié)果所有培養(yǎng)基必須是澄清的。
測試數(shù)21487時間27/11/00結(jié)果 陽性對照 陽性陰性對照 陰性試驗(yàn)結(jié)果 陰性整體結(jié)果 通過試驗(yàn)描述 細(xì)胞病變的病毒滴度TCID50的確定。(SOP ECACC/055)細(xì)胞接受標(biāo)準(zhǔn)/說明/規(guī)定陰性對照需要顯示沒有影響的信號。測試樣品系列稀釋到每一進(jìn)行稀釋的指示細(xì)胞株的4個孔中。細(xì)胞病變效果指示病毒存在。病毒滴度計(jì)算采用下述公式，其中作為展示每一稀釋少于4個陽性孔的分布結(jié)果，x表示得自標(biāo)準(zhǔn)TCID50表的值，y是所有4個孔都是陽性的最高稀釋度的值TCID50＝(1/y)×101+x時間19/01/01結(jié)果指示細(xì)胞株 BHK 21(CLONE 13)陰性對照沒有CPE測試樣品CPE少于4個陽性孔的分布 4，4，4，3，0X 1.25Y 10-3TCID50＝(1/10-7)×101+01.25＝105.25整體結(jié)果病毒存在授權(quán) ECACC，質(zhì)量負(fù)責(zé)人，時間4/12/0權(quán)利要求
1.一種從感染細(xì)胞中回收痘病毒的方法，包括如下步驟，將感染細(xì)胞進(jìn)行高壓勻漿處理以獲得含痘病毒勻漿物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其特征在于所述痘病毒選自由正痘病毒、禽痘病毒、豬痘病毒和山羊痘病毒構(gòu)成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1～2中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述痘病毒選自痘苗病毒、山羊痘病毒、綿羊痘病毒、金絲雀痘病毒和家禽痘病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中的方法，其特征在于痘苗病毒是Elstree或改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，尤其是保藏號為ECACC V00083008的MVA-BN。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)的方法，其特征在于痘病毒為重組痘病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)的方法，其特征在于通過將被感染細(xì)胞置于高壓腔中、提高腔中壓力并將被感染細(xì)胞經(jīng)噴嘴射出進(jìn)行高壓勻漿。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于腔中的壓力值升至200至1000巴范圍。
8.根據(jù)權(quán)利要求6～7中任一項(xiàng)的方法，其特征在于噴嘴直徑范圍為0.10至0.6mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)的方法，其特征在于將含痘病毒的勻漿物經(jīng)至少一次純化步驟以獲得痘病毒富集部分。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于該至少一次純化步驟是超濾步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于該超濾為交叉流過濾。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征在于交叉流過濾步驟中所使用的膜具有大于500kDa但等于或小于0.1μm的孔徑。
13.根據(jù)權(quán)利要求10～12中任一項(xiàng)的方法，其特征在于超濾后進(jìn)行至少一次柱層析步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求1～13中任一項(xiàng)的方法，其特征在于對含痘病毒勻漿物或痘病毒富集部分進(jìn)行冷凍干燥。
15.根據(jù)權(quán)利要求1～14任一方法獲得的含痘病毒勻漿物或痘病毒富集部分。
16.用作疫苗的如權(quán)利要求15的含痘病毒勻漿物或痘病毒富集部分。
17.如權(quán)利要求15的含痘病毒勻漿物或痘病毒富集部分用于制備疫苗的用途。
18.根據(jù)需要接種包括人在內(nèi)的動物的方法，其特征在于向動物體施以權(quán)利要求15的含痘病毒勻漿物或痘病毒富集部分或權(quán)利要求16的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及從感染細(xì)胞中回收痘病毒的方法，尤其是改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。根據(jù)本發(fā)明，將病毒感染細(xì)胞進(jìn)行高壓勻漿以獲得含病毒勻漿物。對含病毒勻漿物處理至少一次純化步驟以獲得痘病毒富集部分。本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的含病毒部分和含病毒勻漿物。
文檔編號C12N7/02GK1606616SQ02825526
公開日2005年4月13日 申請日期2002年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月20日
發(fā)明者卡爾·赫勒, 賈塔·克拉默 申請人:巴法里安諾迪克有限公司