專利名稱：檢測核酸中雜化作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
，并且首先是在如臨床診斷或工業(yè)活性化合物研究等的那些要參照自動化方法來保證高的樣品處理量的領(lǐng)域內(nèi)，需要找到能用以實現(xiàn)測量結(jié)果的標準化而毋需高昂的校準測量過程。用于檢測核酸中雜化作用的現(xiàn)有技術(shù)的體系，以及其用于表達分析方面強烈地依賴于用作核酸試樣或作為合成核酸試樣模板的待測mRNA的完整性。這些體系首先由于標記要雜化的未結(jié)合固相的核酸(核酸試樣)而變得易于錯誤解釋，這就會弄錯所有的測量結(jié)果。
本發(fā)明的方法可用于表達分析，并且在這分析過程中未標記的靶核酸與連接固相的探針的序列特異性雜化作用可以定量確定，而并不依賴于核酸試樣的完整性。能在表面上檢測不同核酸探針的最大數(shù)值是受限于光學和“微流控”的面積中的物理限制，而本發(fā)明公開了一種使用某種體系的DNA陣列，該體系中不受因光學和“微流控”面積的物理限制而受到限制，而且和現(xiàn)有技術(shù)中的體系相比較，特定面積上可檢測的核酸試樣可以明顯提高。
一優(yōu)選實施方式，公開了一種用于檢測在固相結(jié)合的核酸探針上發(fā)生雜化作用的方法，該方法通過使用固相結(jié)合的標記過的探針而實現(xiàn)了測量結(jié)果的標準化，使用未標記的核酸試樣或靶核酸并同時在特定點上對不同靶核酸的表達進行分析。本發(fā)明的固相結(jié)合的核酸試樣可以是DNA或DNA/PNA嵌合體形式[Finn，P.J.等“Synthesis and properties of DNA-PNA chimericoligomers”，1996，Nuc.Acids.Res.，vol.24(17)Ratilainen.T.等“Thermodynamics of sequence-specific binding of PNA to DNA”，2000，Biochemistry，vol.39；van der Laan，A.C.等“Optimization of the bindingproperties of PNA-(5’)-DNA-Chimerae”，1998，Bioorg.Med.Chem.Lett.，vol.8]，由于其自身序列而構(gòu)成分子內(nèi)的次級結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以通過雙鏈特異性的核酸內(nèi)切酶而進行識別和裂解。本發(fā)明由于形成分子內(nèi)次級結(jié)構(gòu)而以雙鏈形式存在的核酸探針的部分基本上是DNA，從而就能保障對雙鏈特異性的核酸內(nèi)切酶的可達性。
由于本發(fā)明的固相結(jié)合的探針-靶核酸與待檢測的核酸進行雜化作用，因而分子內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)，并因此雙鏈區(qū)會分解，并且不再能通過雙鏈特異性的核酸內(nèi)切酶進行識別和裂解。非雜化的且固相結(jié)合的核苷酸探針能被酶裂解。本發(fā)明核酸探針的標記部分由于酶的裂解而從表面分離，滲入到周圍介質(zhì)中，并且適當時還可以將其洗去。在緊接著將非雜化的核酸探針進行酶分解后，測定那些雜化過且未被酶平截的核酸探針的熒光團。該方法的信號-本底比只是取決于所用雙鏈特異性的核酸內(nèi)切酶的質(zhì)量以及與未雜化的核酸探針的分離完全性，并對應(yīng)于與用放射性標記的核酸進行雜化作用的信號-本底比。
由于不是對確定的核酸試樣或靶核酸，而是對固相結(jié)合的核酸探針進行標記，所以可以將許多具有不同序列特殊性的核酸探針固定在表面上的特定的面積或特定的點上(點)，這些核酸探針的數(shù)量等于所存在的熒光體團數(shù)量，因而具有可以根據(jù)其激發(fā)或發(fā)射最大值而從光譜上進行區(qū)分的熒光團。本方法的靈敏度可以通過與核酸探針共價連接的熒光體數(shù)目而進行提高。
除了已知的熒光團外也可以使用部分結(jié)合對，如洋地黃毒苷、生物素或其他半抗原用于標記固相結(jié)合的探針。特別是結(jié)合不同半抗原的分子(免疫球蛋白，鏈菌抗生物素)是與不同底物特異性的酶共價連結(jié)的。這些酶可以是堿性磷酸酶、過氧化物酶、酸性磷酸酶等。因此可以根據(jù)可用的不同半抗原的數(shù)目和可用的不同酶共軛體的數(shù)目，將任意多的具有不同序列特性的核酸探針固定在表面上的特定的面積或點(點)上。
用于與經(jīng)固定的核酸探針進行雜化作用的核酸試樣或靶核酸可以是未經(jīng)標記的DNA、cDNA、cRNA或mRNA。與傳統(tǒng)體系相比，為僅使用部分靶核酸或核酸試樣進行雜化作用，這部分是與核酸探針的檢測模塊互補的，因為在本體系中核酸探針是標記的。所述體系的另一優(yōu)點是，檢測靈敏度并不取決于核酸試樣的標記效果，而是只取決于核酸探針的標記。而這就可以更為精確地進行確定。
本發(fā)明的核酸探針如

圖1A所示。典型的核酸探針具有以下成分·至少一種官能基團(1)如氨基基團(NH2)、硫醇基(SH)，或是部分結(jié)合對如生物素、洋地黃毒苷用以接合到固相。
·優(yōu)選是大于11個C2鍵長度的間隔模塊(2)，且其端部之一與官能基團共價連接。
·序列段α(識別和分裂模塊)，其長度優(yōu)選為5-12個核苷酸，由DNA組成并且其3’-端位上共價連接到與固相連結(jié)的間隔模塊的末端。序列段α含有用于限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列。
·序列片段β(檢測模塊)，其長度優(yōu)選為12道30個核苷酸，其3’-端位上共價連接到序列片段α(識別和分裂模塊)的5’-端位并且它可以是DNA、RNA或PNA。序列片段β是構(gòu)成分子的部分該分子，它在適當反應(yīng)條件下可作為探針和待檢測的靶核酸形成異源雙鏈體。序列片段β的核苷酸和/或糖-磷酸鹽主鏈或假肽主鏈(Pseudopeptidrückgrat)可以和熒光團共價連結(jié)。
·序列片段α’(識別和分裂模塊)，其由DNA組成并且其3’-端位與序列片段β的5’-端位共價連接。片段α’的序列互補于對應(yīng)的序列片段α。
·間隔模塊(3)，其優(yōu)選具有大于11個C2鍵的長度并共價連接到序列段α’的5’-端位。
·適當時還有一分支模塊[Newcome G.R.等“Dendritic MoleculesConepts，Synthesis，Perspectives”，1966.CH Publishers](未示出)，其共價連接到間隔模塊(3)的端部且其不與序列片段α’的5’-端位連接。在該分支模塊的各端上可以連接有直至n個的其他分支模塊，從而獲得3n末端的最大數(shù)，同時在各個末端·連接有熒光團(4)或是部分結(jié)合對(生物素或洋地黃毒苷)。
探針通過單元(1)與固態(tài)基體連接。此外，該固體表面可以是平整表面，也可以是凸的或是凹的，還可以是纖維或是無機、有機材料制成的微米或納米顆粒。以下將連接到這種固態(tài)基體上的本發(fā)明的核酸探針稱為DNA陣列。序列片段α和α’是彼此互補的并且可以在適當?shù)臈l件下形成雙鏈區(qū)，也就是雙鏈體α-α’(參見圖1B)。通過分子內(nèi)的雙鏈體形成作用而生成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，對于單鏈構(gòu)象的熱動力學是有利的。于是，在低于序列片段α或α’的平衡熔融溫度Tm的溫度下，分子只以具有分子內(nèi)雙鏈體α-α’的發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在，而該結(jié)構(gòu)通過限制性核酸內(nèi)切酶而以序列特異性方式分裂。
在利用限制性核酸內(nèi)切酶進行裂解后，單元(1)，(2)和適當時還有少量的單元(α)的核苷酸還是保持與固相連接。探針的標記單元會滲入周圍的介質(zhì)，并適當時將其洗去。
通過與靶核酸雜化，該核酸可以是RNA或DNA并且其序列是與序列片段β的序列互補的，探針是以與核酸試樣構(gòu)成的雙鏈體形式部分存在。在這種情況下序列片段α和α’以單鏈形式存在，并不能通過限制性核酸內(nèi)切酶或其他雙鏈特異性的核酸酶裂解。與分子內(nèi)雙鏈體α-α’相比，為保證由核酸試樣和序列片段β所組成的異源雙鏈體能具有足夠的穩(wěn)定性，序列片段β的平衡熔融溫度Tm(β)必須要高于序列片段α或α’的；也就是Tm(β)＞Tm(α)[Bonnet，G.等，“Thermodynamic basis of the enhanced specificity ofstructured DNA probes”，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.，vol.96]。理想的是，由核酸試樣與序列片段β所構(gòu)成的異源雙鏈體的平衡熔融溫度Tm(β)要高于分子內(nèi)雙鏈體α-α’的平衡熔融溫度10℃-25℃。和帶有相同靶核酸的線形核酸探針相比，可以構(gòu)成次級結(jié)構(gòu)的核酸探針具有更高的序列特異性。不具有錯配堿基的核酸探針/靶核酸雙鏈體和具有錯配堿基的核酸探針/靶核酸雙鏈體的平衡熔融溫度差ΔTm，在能構(gòu)成次級結(jié)構(gòu)的核酸探針中約為在線形核酸探針中的兩倍高[[Bonnet，G.等，“Thermodunamic basis of the enhanced specificity ofstructured DNA probes”，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.，vol.96]。
本發(fā)明的方法可優(yōu)選用于多重分析。在這種情況下，將n個不同的核酸探針固定在相同面積上，且這些核酸探針本身在序列片段β中，在熒光團的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜內(nèi)[Vet，J.A.M.等，“Multiplex detection of four pathogenicretroviruses using molecular beacons”，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.，vol.96；Marras，S.A.E.等，“Multiplex detection of single-nucleotide variations using molecularbeacons”，1999，Genetic Analysis；Biomolecular Engineering，vol.14]，以及適當時也在包含于序列段α和α’中的對于限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列方面是可以相互區(qū)分的。用印刷法將含有等摩爾量的這些n個不同核酸探針的水溶液沉積并固定在固體表面上[Cheung，V.G.等“Making and readingmicroarrays”，Nature Genetics，vol.21，Jan.1999；Bowtell，D.D.L.，“Optionsavailable-from start to finish-for obtaining expression data by microarray”，Nature Genetics，vol.21，1999]。這些面積可以是DNA陣列上的“點”或者是微米或納米顆粒的表面。
這樣，就可以同時分析具有不同序列的n個不同的靶核酸與其序列片段α和α’含有對限制性核酸內(nèi)切酶相同的識別序列的n個不同核酸探針之間的雜化作用。如果核酸探針的序列片段α和α’含有針對n個不同限制性核酸內(nèi)切酶的n個不同的識別序列，則就可以對n個不同序列的不同靶核酸與n個不同核酸探針之間的雜化作用進行同時或是優(yōu)選進行順次的分析。
可以根據(jù)以下方法而將本發(fā)明的方法用于對核酸探針與靶核酸或核酸試樣之間的雜化作用進行多重分析在下述的優(yōu)選條件下使由一個或多個連接到固態(tài)基體的本發(fā)明的核酸探針組成的DNA陣列與可以是RNA或DNA的未標記的核酸試樣相接觸。根據(jù)要雜化的表面而在45℃下用20μl-200μl合適的雜化緩沖液培養(yǎng)DNA陣列。
將0.1μg-50μg的未標記核酸試樣溶于300μl合適的雜化溶液中，在與DNA陣列的雜化作用開始前在約99℃加熱5分鐘，并接著冷卻5分鐘至約45℃。從DNA陣列中去除雜化緩沖液，并用含有核酸試樣的雜化液代替。用核酸試樣在45℃-60℃下培養(yǎng)DNA陣列16小時。在去除了核酸試樣溶液之后，各在50℃-65℃下用不同離子濃度的洗滌緩沖液洗滌DNA陣列。根據(jù)核酸試樣的種類(DNA或RNA)，它們的長度以及根據(jù)被固定的核酸探針的種類(DNA，RNA或PNA)和長度來挑選合適的雜化和洗滌條件[Anderson，M.L.M.“Nucleic acid Hybridization”，1998，Springer-Verlag Telos；Schena，M.“DNA-MicroarraysA practical approach”.1999，Oxford University Press]。
在α-α’雙鏈體范圍內(nèi)通過限制性核酸內(nèi)切酶而進行的未雜化核酸探針的裂解過程優(yōu)選是在25℃-37℃下并在生產(chǎn)商所推薦的反應(yīng)條件下進行。限制性核酸內(nèi)切酶的活性可以通過向反應(yīng)物料中添加類脂類化合物而提高到高達34倍[Kinnunen等，“Materials and methods for digestion of DNA or RNA usingrestriction endonucleases”，美國專利5879950]。在洗滌步驟后，根據(jù)要雜化的表面，而在25℃-37℃下用20μl-200μl由生產(chǎn)商所推薦的反應(yīng)緩沖液來培養(yǎng)DNA陣列20-60分鐘，并且該緩沖液含有0.5U-5U的能在α-α’雙鏈體范圍內(nèi)裂解核酸探針的限制性核酸內(nèi)切酶。在室溫下通過用1×TE緩沖液洗滌，將被裂解的核酸試樣，標記和限制性核酸內(nèi)切酶從DNA陣列的表面分離除去。
由本發(fā)明方法得到的信號和數(shù)據(jù)優(yōu)選按以下方法來檢測和分析在使用印刷法將標記過的探針轉(zhuǎn)移和固定到固態(tài)表面上去[Cheung，V.G.等“Making and reading microarrays”，Nature Genetics，vol.21，Jan.1999；Bowtell，D.D.L.，“Options available-from start to finish-for obtaining expression data bymicroarray”，Nature Genetics，vol.21，1999]之前，要確定每個核酸探針的標記度。通過在260nm的波長下借助Lambert-Beerschen規(guī)則測定核酸水溶液的吸收量來確定核酸濃度(A260＝ε×d×c，其中A260是λ＝260nm時的吸收量，ε是核酸的摩爾消光系數(shù)[cm-1M-1]，其取決于堿基序列和待測核酸的長度，d是所用比色皿的層厚度而c是核酸的濃度[M])。
共軛連接核酸探針的熒光團的濃度是通過利用Lambert-Beerschen規(guī)則，在符合熒光團吸收最大值(λmax)的波長處，測定標記過的核酸探針水溶液的吸收度來確定。為了能精確確定與熒光團共軛連接的核酸的濃度，必須要考慮到大多數(shù)的熒光團都吸收波長為260nm的光。在260nm處的總吸收度中要扣除熒光團提供的部分，這部分是在熒光團最大吸收度(λmax)的波長處的熒光團吸收度與校正因子CF260的乘積(A核酸＝A260-(Aλmax×CF260))。不同熒光團的摩爾消光系數(shù)和260nm處的吸收度的校正因子(CF260)都可從這些熒光團的生產(chǎn)商那里得到(Molecular Probes，BioRad等)。
與核酸探針共軛連接的熒光團濃度對核酸探針濃度的比等于與核酸探針共軛連接的熒光團的量。為了確定被標記的核酸探針的特定熒光，就要確定的這些核酸探針特定量的熒光。然后特殊的熒光就可以在與靶核酸或核酸試樣進行雜化作用之前精確確定連接在固態(tài)基體上的核酸探針分子的數(shù)量。這樣，要考慮被固定核酸探針的含量變化，這種變化影響與靶核酸或核酸試樣進行的雜化作用，并對其計算修正。因此，按本發(fā)明基于靶核酸或核酸試樣與核酸探針之間的雜化作用而進行的測量可以是標準化的。
優(yōu)選通過聚焦激光掃描顯微鏡來確定DNA陣列中每個樣品點的熒光放射。用于在很小面積上確定熒光放射的裝置可由一系列的廠商提供，并且在生物技術(shù)領(lǐng)域中是實驗室標準的[Cheung，V.G.等“Making and readingmicroarrays”，Nature Genetics，vol.21，Jan.1999；Bowtell，D.D.L.，“Optionsavailable-from start to finish-for obtaining expression data by microarray” ，Nature Genetics，vol.21，Jan.1999]。為使測量結(jié)果標準化，就要在雜化作用前確定被固定的核酸探針的熒光。如果在陣列的每一個樣品點上都固定有核酸探針該探針是特定序列特異性并用特定熒光團標記，則可以用具有相應(yīng)于熒光團最大吸收值(λAbs.max)的波長的光來激發(fā)熒光，并在相應(yīng)于最大發(fā)射值(λEm.max)的波長處進行檢測。如果在DNA陣列的每個樣品點上固定有具有不同序列特異性的n個不同核酸探針，且這些探針標記有n個不同的光譜上區(qū)分的熒光團，則可以用具有相應(yīng)于這些熒光團最大吸收值(λAbs.max)的波長的光來激發(fā)n個不同熒光團的熒光，并在相應(yīng)于最大發(fā)射值(λEm.max)的波長處進行檢測。根據(jù)所用的儀器，可以同時或相繼確定不同熒光團的熒光。
本發(fā)明將通過以下實施例更詳細地得到闡述。
實施例1將兩次改性的的低聚脫氧核苷酸且其5’-和3’-端位各以C22的間隔與共價連接到異硫氰酸鹽熒光素(FITC)和氨基基團(NH2)(序列AFITC-5’gcccgcgcAATAGGGATGGCTCAACAgcgcgggc3-(C22)NH2和BFITC-5’gcccgcgcTTAGAGTGCAAAATGAAAGCGCCgcgcgggc3-(C22)NH2)溶入100μl的偶合緩沖液(500mM Na2HPO4，pH8.5，1mM EDTA)中(濃度500pmol/ml)。在RT(室溫)下于微滴定盤(Thermowell M PCR-Platte，Corning*Surface Technologies)的孔中，在各情況下培養(yǎng)100μl低聚核苷酸溶液30min，且該低聚核苷酸共價連接在孔的表面，如表1所示
表1

表1微滴定盤上核酸試樣A和B的位置然后用200μl的10mM Tris pH8.0，150mM的NaCl洗滌微滴定盤中的孔5次。然后在熒光分光光度計中(分子設(shè)備(Molecular Devices)SpectramaxGemini XS)，于λAbs.max＝490nm的激發(fā)波長和λEm.max＝520nm的發(fā)射波長的條件下測定結(jié)合在微滴定盤孔中的低聚核苷酸的熒光強度。所得數(shù)據(jù)列于表3和畫于圖2(圖表1)中表3

表3共價連接在微滴定盤孔中的低聚核苷酸的熒光強度×1000各用125μl的含有0.1mg/ml鮭魚精子DNA碎片(Gibco BRL/LifeTechnologies)；0.5mg/ml乙?；腂SA(Gibco BRL/Life Technologies)；1×MES(100mM MES，1.0M NaCl，20mM EDTA，0.01％ Tween 20)的雜化溶液在60℃溫度下對微滴定盤的孔進行預雜化4小時。
在分離了預雜化溶液后，將125μl的含有1nmol在0.1mg/ml鮭魚精子DNA碎片(Gibco BRL/Life Technologies)中的樣品-RNA-低聚核苷酸(序列A’＝5’UGUUGAGCCAUCCCUAUU3’和B’＝5’GGCGCUUUCAUUUUGCACUCUAA3’)；0.5mg/ml乙酰化的BSA(Gibco BRL/Life Technologies)；1×MES(100mMMES，1.0M NaCl，20mM EDTA，0.01％ Tween 20)的雜化溶液添加到微滴定盤的孔中。配料列于表2中表2

表2微滴定盤上以A’，B’和-標記的區(qū)域與核酸試樣A’，B’或預雜化溶液進行雜化。
在95℃加熱配料20min，在一小時內(nèi)再冷卻到60℃并在60℃下雜化16小時。
在去除核酸試樣溶液后，在25℃下用“不精確的”緩沖洗液(6×SSPE；0.01％ Tween 20)對微滴定盤的孔洗滌十次5分鐘，接著再在55℃下用“精確的”緩沖洗液(100mM MES；0.1M NaCl；0.01％ Tween 20)對其洗滌五次5分鐘。洗滌后，在37℃下用150μl的1×反應(yīng)緩沖液(NEB Buffer3)使微滴定盤的孔均衡化10分鐘，接著各用100μl的含有2單元的限制性核酸內(nèi)切酶Aci1(New England Biolabs)的1×反應(yīng)緩沖液在37℃下培養(yǎng)1小時。反應(yīng)通過添加1/5體積終止液(0.5％w/v SDS，50mM EDTA)和將微滴定盤加熱至75℃而終止。接著在室溫下用各150μl的1×TE緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA，pH＝8.0)洗滌微滴定盤孔6次。所有在室溫下沒有進行的培養(yǎng)物在有蓋的加熱器的Biometra UNOTMThermoblock中進行加熱。然后在熒光分光光度計中(Molecular DevicesSpectramax Gemini XS)，于λAbs.max＝490nm的激發(fā)波長和λEm.max＝520nm的發(fā)射波長的條件下測定各個微滴盤孔中的熒光強度。所得數(shù)據(jù)列于表4和圖表1(圖2)中表4

表4在雜化與限制性消化后，共價連接于微滴定盤孔中的低聚核苷酸的熒光強度×1000可在孔2A-2H，4A-4H，6A-6H，8A-8H，10A-10H，12A-12H，1B，1D，1E，1H，3A，3C，3E，3G，5B，5D，5F，5H，7A，7C，7E，7G，9B，9D，9F，9H，11B，11D，11E以及11G的孔區(qū)域檢測到的信號對應(yīng)于系統(tǒng)的背景熒光，并且要將它們從在核酸試樣A和B的區(qū)域中檢測到的信號中扣除。
實施例2以異氰酸酯熒光素(FITC)標記的核酸試樣的序列AFITC-5’gcccgcgcAATAGGGATGGCTCAACAgcgcgggc3，BFITC-5’gcccgcgc TTAGAGTGCAAAATGAAAGCGCCgcgcgggc3’和CFITC-5’gcccgcgc GTTTT TTTTTTTTGGTTTTTTTTTTTC-gcgcgggc3’(對照；背景熒光的確定)，在固定在固態(tài)基體上不同測試點上使其與從K562細胞中分離出來的5μg樣品-RNA，在25pM對照-RNA，0.1mg/ml鮭魚精子DNA碎片DNA(Gibco BRL/Life Technologies)；0.5mg/ml乙?；腂SA(Gibco BRL/Life Technologies)；1×MES(100mM MES，1.0M NaCl，20mMEDTA，0.01％ Tween 20)中在55℃溫度下進行雜化16小時。在去除了核酸試樣溶液后，在25℃下用“不精確的”緩沖洗液(6×SSPE；0.01％Tween 20)對DNA陣列洗滌十次5分鐘，接著再在50℃下用“精確的”緩沖洗液(100mM MES；0.1M NaCl；0.01％ Tween 20)對其洗滌五次5分鐘。
洗滌后，在37℃下用1×反應(yīng)緩沖液對DNA陣列進行均衡化處理10分鐘。接著用100μl含有2單元的限制性核酸內(nèi)切酶Acil的1×反應(yīng)緩沖液在37℃下培養(yǎng)1小時。反應(yīng)通過添加1/5體積終止液(0.5％w/v SDS，50mM EDTA)并將DNA陣列加熱至75℃而終止。接著在室溫下于1×TE緩沖液(10mM Tri，1mM EDTA，pH＝8.0)中洗滌DNA陣列4-8次。用波長為λAbs.max＝490nm的光波激發(fā)滯留在DNA陣列上的雜化過的探針的熒光，并在波長λEm.max＝520nm處的光波下進行檢測?？稍诤怂嵩嚇覥的范圍內(nèi)檢測到的信號對應(yīng)于系統(tǒng)的背景熒光，并且要將它們從在核酸試樣A和B的區(qū)域中檢測到的信號中扣除。
實施例3將用熒光團FITC(λAbs.max＝490nm，λEm.max＝520nm)，Cascade Blue(λAbs.max＝400nm，λEm.max＝420nm)和BODIPY TR14(λAbs.max＝595nm，λEm.max＝625nm)標記過的核酸試樣共同固定到規(guī)定面積A(試樣點A)上，核酸試樣具有序列A(FITC)-5’gcccgcgcAATAGGGATGGCTCAACA-gcgcgggc3’，B(Cascade Blue)-5’gcccgcgcTTAGAGTGCAAAATGAAAGCGCCgcgcgggc3’和C(BODIPY TR14)-5’gcccgcgcTTTCTCTACCTCCTCACATTGTGgcgcgggc3’。將用作用于確定背景熒光的對照物的核酸探針共同固定在另一規(guī)定面積B(試樣點B)上，該核酸探針是D(FITC)-5’gcccgcgcGTTTTTTTTTTTTGGTTTTTTTTTTTC-gcgcgggc3’，E(Cascade Blue)-5’gcccgcgcGTTTTTTTTTTTTGGTTTTTTTTTTTC-gcgcgggc3’和F(BODIPY TR14)-5’gcccgcgcGTTTTTTTTTTTTGGTTTTTTTTTTTC-gcgcgggc3’。使DNA陣列與0.1μg的樣本RNA(cRNA)，在25pM對照-RNA，0.1mg/ml鮭魚精子DNA碎片(Gibco BRL/Life Technologies)；0.5mg/ml乙?；腂SA(Gibco BRL/Life Technologies)；1×MES(100mM MES，1.0M NaCl，20mM EDTA，0.01％ Tween 20)中進行雜化16小時，溫度為55℃，且試樣RNA含有序列D’＝5’UGUUGAGCCAUCCCUAUU3’，E’＝5’GGCGCUUUCAUUUUGCACUCUAA3’和F’＝5’CACAAUGUGAGGAGGUAGAGAAA3’。在去除了核酸試樣溶液后，在25℃下用“非精確的”緩沖洗液(6×SSPE；0.01％ Tween 20)對DNA陣列洗滌十次5分鐘，接著再在50℃下用“精確的”緩沖洗液(100mM MES；0.1M NaCl；0.01％ Tween 20)對其洗滌五次5分鐘。
洗滌后，在37℃下用1×反應(yīng)緩沖液對DNA陣列進行均衡化處理10分鐘。接著用100μl的含有2單元的限制性核酸內(nèi)切酶Acil的1×反應(yīng)緩沖液在37℃下培養(yǎng)1小時。反應(yīng)通過添加1/5體積終止液(0.5％w/v SDS，50mMEDTA)和將DNA陣列加熱至75℃而終止。接著在室溫下于1×TE(10mM Tris，1mM EDTA，pH＝8.0)中洗滌DNA陣列4-8次。用波長為λAbs.max＝490nm，λAbs.max＝400nm或λAbs.max＝595nm的光波激發(fā)滯留在DNA陣列上且用熒光團FITC，Cascade Blue或BODIPY TR14標記過的雜化探針的熒光，并在波長λEm.max＝520nm，λEm.max＝420nm或λEm.mmax＝625nm處的光波下進行檢測。在試樣點B的范圍內(nèi)檢測到的信號對應(yīng)于系統(tǒng)的背景熒光，并且要將它們從在試樣點A的區(qū)域中檢測到的信號中扣除。
權(quán)利要求
1.通過雜化作用檢測靶核酸的方法，其特征在于，在該方法中a)使用至少一種以其端部之一和一固相連接的核酸探針進行雜化作用，其中核酸探針是靶核酸序列或與其互補的序列，該序列以在短核酸序列側(cè)接在其3’-端位并以與該核酸互補的核酸序列側(cè)接到5’-端位上，該核酸構(gòu)成了一條DNA雙鏈并由此構(gòu)成裂解模塊，該模塊可以被雙鏈特異性的核酸酶所裂解并具有的核酸探針在另一端部具有一個標記；b)利用至少一種雙鏈特異性的核酸酶來進行至少一次處理，和c)確定經(jīng)步驟b)后連接到固相上的標記的比例。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于在建立的方法中同時使用多個含有相互不同靶序列的核酸探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2之一的方法，其特征在于，在一過程中使用多個具有彼此不同的并能為不同雙鏈特異性的核酸酶所裂解的分解模塊的核酸探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中之一的方法，其特征在于核酸探針具有多個彼此不同的標記。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于上述標記是指熒光團和/或部分結(jié)合對。
6.用于檢測與靶核酸進行雜化作用的試驗盒，其特征在于試驗盒是用于實施一種可使用至少其端部之一和固相連接的核酸探針，和含有靶核酸序列的核酸探針進行雜化作用，該序列以短核酸序列側(cè)接在3’-端位上并以與此核酸互補的核酸序列側(cè)接在5’-端位上，該核酸序列構(gòu)成了DNA雙鏈并因此而可構(gòu)成裂解模塊并能被雙鏈特異性的核酸酶所裂解，且具有的核酸探針在其另一端具有標記。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的試驗盒，其特征在于適于實施如權(quán)利要求1至5中之一所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過雜化作用檢測靶核酸的方法，在該方法中a)用至少一種其端部之一和固相連接的核酸探針，與具有靶核酸序列或與其互補的序列的核酸探針進行雜化作用，該序列以短核酸序列側(cè)接在3’－端位上并以與其互補的核酸序列側(cè)接在5’－端位上，這構(gòu)成DNA雙鏈和由此構(gòu)成的裂解模塊，該模塊可以被雙鏈特異性的核酸酶所裂解且具有的核酸探針在另一端具有一個標記；b)利用至少一種雙鏈特異性的核酸酶進行至少一次處理，和c)確定經(jīng)步驟b)后連接在固相上的標記的比例。
文檔編號C12N15/09GK1610757SQ02826559
公開日2005年4月27日 申請日期2002年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月29日
發(fā)明者克里斯托弗·查爾斯 申請人:富卡斯吉諾米克斯有限責任公司