專利名稱：抑制基因表達的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抑制靶基因表達的方法，通過用包含與靶基因的至少部分核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的DNA和RNA的雙鏈多核苷酸轉染入細胞、組織或單個的生物體中進行的。
背景技術：
抑制細胞、組織或單個生物體中靶基因表達的方法，包括下面一種方法(以下有時稱為RNAi方法)，其中將雙鏈RNA轉染入細胞、組織或單個生物體中，而加速了與其序列同源的mRNA的降解，結果抑制了作為該mRNA的模板的基因的表達(該效果以下有時稱為“RNAi效果”)。至今，有報道表明在植物個體(Waterhouse，P.M等，Proc.Natl.Acad.Sci，95，13959-13964(1998))、錐蟲(Ngo，H等，Proc.Natl.Acad.Sci，95，14687-14692(1998))、水螅(Lohmann J.U.等，Dev.Biol.，214，211-214(1999))、三腸蟲(Sanchez Alvarado等，Proc.Natl.Acad.Sci，96，5049-5054(1999))、線蟲(Fire，A等，Nature，391，806-811(1998))、果蠅(Kannerdell，J.R等，Cell，95，1017-1026(1998)；Misquitta，L等，Proc.Nat1.Acad.Sci，96，1451-1456(1999))利用該技術是有效的。
此外，已有報道利用19個核苷酸的具有2-核苷酸的3`端突出的雙鏈RNA可以在脊椎動物培養(yǎng)細胞中表現(xiàn)出RNAi效果，雖然該效果據(jù)報道僅限于脊椎動物(Elbashir，S等，Nature，411，494-498(2001))。下面要描述的在基因功能鑒定中，篩選適合于生產有用物質的細胞系的方法，利用RNAi方法的優(yōu)越性是很明顯地，但問題是RNA非常容易被核糖核酸酶所降解，尤其以單鏈形式存在時，因而生產成本非常高。因此，期望能夠找到一種高度穩(wěn)定的多核苷酸以用于RNAi方法。
發(fā)明公開本發(fā)明目的之一是提供一種抑制靶基因表達的方法，其中靶基因與多核苷酸序列的部分核苷酸有基本相同的核苷酸序列，該方法通過將與DNA整合而被增強了穩(wěn)定性的雙鏈多核苷酸轉染細胞、組織或單個生物體來實現(xiàn)的。
為達到的上述目的而進行了廣泛的研究，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，倉鼠培養(yǎng)細胞、CHO-KI，用具有熒光素酶基因的部分堿基序列的DNA和RNA雜交體的雙鏈多核苷酸，和DNA和RNA嵌合體的雙鏈多核苷酸進行轉染后，細胞中的熒光素酶基因的表達被抑制。這樣，我們成功的完成了本發(fā)明。
也就是說，根據(jù)本發(fā)明，提供了下面第(1)到(24)項中描述的發(fā)明。
(1)一種抑制靶基因表達的方法，其中包括用包含與靶基因的至少部分核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的DNA和RNA的雙鏈多核苷酸轉染細胞、組織或單個的生物體。
(2)根據(jù)上述第(1)項的方法，其中雙鏈多核苷酸包含自我互補的單鏈。
(3)根據(jù)上述第(1)或(2)項的方法，其中雙鏈多核苷酸是DNA鏈和RNA鏈的雜交體。
(4)根據(jù)上述第(3)項的方法，其中DNA鏈和RNA鏈的雜交體包含有義鏈DNA和反義鏈RNA。
(5)根據(jù)上述第(1)或(2)項的方法，其中雙鏈多核苷酸是DNA和RNA的嵌合體。
(6)根據(jù)上述第(1)至(5)任一項的方法，其中在雙鏈多核苷酸中，至少多核苷酸的上游部分區(qū)域是RNA。
(7)根據(jù)上述第(6)項的方法，其中上游部分區(qū)域由9到13個核苷酸組成。
(8)根據(jù)上述第(1)至(6)任一項的方法，其中雙鏈多核苷酸由19至25個核苷酸組成，并且多核苷酸至少上游一半?yún)^(qū)域是RNA。
(9)根據(jù)上述第(1)至(8)任一項的方法，其中靶基因有多個(plural)。
(10)一種分析基因功能的方法，包括利用上述第(1)至(9)任一項所述方法而抑制了靶基因表達之后，分析細胞、組織或單個生物所顯現(xiàn)的表型變化。
(11)一種賦予細胞、組織或單個生物體以特定特性的方法，包括利用上述第(1)至(9)任一項所述方法以抑制靶基因的表達。
(12)根據(jù)上述第(11)項的方法所得到的細胞、組織或單個生物體。
(13)一種篩選用于預防和/或處理與靶基因相關疾病的試劑的方法，包括用待測物質加入到根據(jù)上述第(12)項的細胞、組織或單個生物體，并進而分析細胞、組織或單個生物體的特性改變。
(14)一種用于預防和/或治療與靶基因相關疾病的試劑，包含根據(jù)上述第(13)項的方法所獲得的物質作為活性成分。
(15)一種產生預防和/或治療與靶基因相關疾病的試劑的方法，包括根據(jù)上述第(13)項的方法所選擇出的物質制備藥物制劑。
(16)一種根據(jù)上述第(1)至(9)任一項的方法，進一步的包括用包含編碼指示蛋白的DNA的表達載體轉染細胞、組織或單個生物體，繼而選擇和分析具有指示蛋白所產生的信號量達到特定強度或更高的細胞、組織或單個生物體。
(17)一種根據(jù)上述第(1)至(9)任一項的方法，進一步的包括用包含編碼指示蛋白的DNA的表達載體和包含與DNA的至少部分核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的雙鏈RNA轉染細胞、組織或單個生物體，繼而選擇和分析指示蛋白所產生的信號量減弱的細胞、組織或單個生物體。
(18)根據(jù)上述第(16)或(17)項的方法，其中指示蛋白是如下特性蛋白其中蛋白的量與該蛋白所產生的信號的量之間成比例變化。
(19)根據(jù)上述第(16)至(18)項任一項的方法，其中指示蛋白是熒光素酶。
(20)RNAi方法中的一種鑒定RNA的功能域的方法，包括(i)制備具有與靶基因的至少部分核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的的雙鏈多核苷酸，包括DNA和RNA嵌合體；(ii)用該雙鏈多核苷酸轉染細胞、組織或單個的生物體；(iii)在轉染的細胞、組織或單個的生物體中測定靶基因的表達受到抑制的程度，和(iv)鑒定對于抑制靶基因而言是所需的RNA的序列。
(21)根據(jù)上述第(20)項的方法，其中雙鏈多核苷酸中的任一條鏈是RNA鏈。
(22)在上述第(1)至(11)、(13)及(15)至(21)中任一項的方法中使用的雙鏈多核苷酸。
(23)一種制備預防和/或治療與靶基因相關疾病的試劑，至少包括根據(jù)上述第(22)項的的雙鏈多核苷酸。
(24)一種用于實施上述第(1)至(11)、(13)及(15)至(21)任一項的方法的試劑盒，至少包括根據(jù)上述第(22)項的雙鏈多核苷酸。
附圖簡述

圖1表示用于制備雙鏈多核苷酸的由21個核苷酸組成的有義單鏈多核苷酸和由21個核苷酸組成的反義單鏈多核苷酸。對于每一條序列，左端為5`末端，而右端為3`末端，粗體部分為RNA，有下劃線的為DNA。
圖2表示的是用DNA-RNA雜交體雙鏈多核苷酸轉染CHO-KI細胞而抑制luc基因的表達。
圖3表示luc基因的表達受抑制的圖，其是在每一條有義鏈均為RNA而每一條反義鏈均是DNA-RNA嵌合體所組成的雙鏈多核苷酸轉染S2細胞情況下。
圖4表示luc基因的表達受抑制的圖，其中每一條反義鏈均為RNA而每一條有義鏈均是DNA-RNA嵌合體所組成的雙鏈多核苷酸轉染Hela細胞和HEK293細胞。
圖5表示luc基因的表達受抑制的圖，其中DNA-RNA嵌合體的雙鏈多核苷酸轉染CHO-K1細胞。
本發(fā)明的最佳實施方式下面對本發(fā)明進行更詳細的描述。
(1)用于RNAi方法的包含DNA和]RNA的雙鏈多核苷酸本發(fā)明是一種抑制靶基因表達的方法，包括用包含與靶基因的至少部分核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的DNA和RNA的雙鏈多核苷酸轉染細胞、組織或單個的生物體。
在本發(fā)明中，靶基因可以是任何基因，只要在用于轉染的細胞、組織或單個的生物體中該基因可以產生mRNA，任選地可以翻譯成蛋白質(以下有時稱為“受體”)。具體地說，它可以是待轉化物的內源基因或轉基因。此外，可以位于染色體上的基因或染色體外的基因。染色體外基因的例子包括可來源于病原體如病毒、細菌、真菌或原生動物。功能可以是已知的也可以是未知的或者在其它生物體細胞中功能已知而在受體中是未知的。
包含具有與這些基因的至少部分核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的DNA和RNA的雙鏈多核苷酸(以下有時稱為“雙鏈多核苷酸”)包含與可以是靶基因核苷酸序列中的任何部分的20個或更多個核苷酸基本上相同的序列。此外，“基本上相同”意指與靶基因的序列具有50％或更高，優(yōu)選為70％或更高，更優(yōu)選為80％或更高的序列同源性。核苷酸鏈的長度可以為19個核苷酸至靶基因的開放閱讀框(ORF)的全長的任何長度，但具有19-500個核苷酸為優(yōu)選地。然而，來源于哺乳動物的細胞中，已知信號傳導系統(tǒng)可為具有長30或更多個核苷酸的RNA所激活。這被稱為干擾反應(Mareus，P.I等，Interferon，5，115-180(1983))。當這樣的雙鏈RNA導入到細胞中，許多基因的翻譯起始受PKR(ds RNA反應型蛋白激酶Bass，B.I，Nature，411，428-429(2001))的非特異性抑制，同時RNaseL被2`，5`寡聚腺苷酸化合成酶(Base，B.L，Nature，411，428-429(2001))活化導致細胞中的RNA非特異性降解。由于這些非特異性反應，對靶基因的特異性反應則被隱蔽起來。因此，利用來源于所述哺乳動物的哺乳動物個體或細胞或組織作為受體的例子中，雙鏈多核苷酸由19-25個核苷酸組成，優(yōu)選19-23個，更優(yōu)選19-21個。本發(fā)明的雙鏈多核苷酸并不必需是整個為雙鏈，可以包括5`-或3`-端突出，突出末端可為1至5個核苷酸，優(yōu)選為1至3個核苷酸，更優(yōu)選為2個核苷酸。況且，最優(yōu)選的例子中包括在每一條多核苷酸鏈的3`末端有2個核苷酸的3`端突出結構。雙鏈多核苷酸意指多核苷酸其中部分互補而產生雙鏈，也可以在通過自退火而發(fā)生自互補的單鏈多核苷酸情形。自互補的單鏈多核苷酸的例子包括那些反向重復等。
進一步，DNA和RNA的混合物、DNA鏈和RNA鏈的雜交體、DNA和RNA的嵌合體等均可使用。DNA鏈和RNA鏈組成的雜交體可以是任何一種，只要能夠在轉染受體時，靶基因可以受到抑制即可，但優(yōu)選有義鏈為DNA而反義鏈為RNA。同時，DNA和RNA的嵌合體也可以是任何一種，只要在用其轉染受體時，靶基因可以受到抑制即可。為提高雙鏈多核苷酸的穩(wěn)定性，優(yōu)選地盡可能多地包含DNA。然而，本發(fā)明嵌合體類型的雙鏈多核苷酸中，優(yōu)選地，在發(fā)生表達抑制的范圍內適當?shù)販y定對于抑制靶基因表達而必需是RNA的序列，按如下描述對靶基因表達抑制程度進行分析。因此，也可以鑒定出在RNAi方法中的RNA的功能域。作為一個用于確定的優(yōu)選地嵌合類型的例子，例如其中雙鏈多核苷酸的上游部分區(qū)域是RNA。此處，上游部分區(qū)域意指有義鏈的5`側的和反義鏈的3`側。上游部分區(qū)域優(yōu)選地指上述雙鏈多核苷酸的上游末端開始的9至13個核苷酸的區(qū)域。此外，嵌合類型雙鏈多核苷酸的優(yōu)選例子包括長19至21個核苷酸的雙鏈核苷酸，其中上游一半?yún)^(qū)域是RNA，其余部分是DNA。況且，用這種雙鏈多核苷酸，對靶基因表達的抑制效果高于整個反義鏈都是RNA。
制備雙鏈多核苷酸的方法并不特別局限于但優(yōu)選地是利用已知的化學合成方法。在化學合成中，分別合成能夠互補的單鏈多核苷酸，再通過適當?shù)姆绞竭M行退火而獲得雙鏈。退火方法的具體例子包括將合成的單鏈多核苷酸優(yōu)選地以至少約3∶7的摩爾比進行混合，更優(yōu)選以約4∶6，最優(yōu)選基本上等摩爾量進行混合(例如摩爾比為約5∶5)，加熱到雙鏈能夠相互分開的溫度后，再逐漸冷卻。如果需要，退火后的雙鏈多核苷酸通過已知的常用方法進行純化。純化方法的例子包括通過瓊脂糖凝膠電泳進行確認，任選地去除所保留的單鏈多核苷酸，例如用合適的酶進行降解去除。
此外，在制備的單鏈多核苷酸具有反向重復的情況下，即單鏈多核苷酸能夠自互補時，可用化學合成等方法制備多核苷酸，然后通過與上述相同的方式對自互補進行退火。
(2)用雙鏈多核苷酸轉染細胞、組織或單個生物體，和抑制靶基因的表達用由此制備的雙鏈多核苷酸轉染的受體，只要其靶基因在細胞中能夠轉錄成RNA或翻譯成蛋白質。具體地說，本發(fā)明所用的受體是指細胞、組織或單個生物體。
本發(fā)明所用的細胞可以是生殖細胞或體細胞、全能型或多能型細胞、分裂細胞(dividing cell)或非分裂細胞、薄壁組織細胞或上皮細胞等。具體地說，所述細胞可以是未分裂細胞如干細胞、來自于器官或組織的細胞或其分裂的細胞。所述組織包括單細胞胚或組成性細胞(constitutional)、或多細胞胚、胚胎組織等。此外，上述分裂細胞包括脂肪細胞、纖維原細胞、肌細胞、心肌細胞(cardiomyocytes)、內皮細胞、神經元、神經膠質細胞、血細胞、巨核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性細胞、嗜堿粒細胞、肥大細胞、白細胞、粒細胞、角質化細胞、軟骨細胞、骨細胞、破骨細胞、肝細胞、及內分泌或外分泌腺的細胞。作為這些種類細胞的具體例子，如CHO細胞(RIKEN Cell bank)、果蠅S2細胞(Schneider，I.等，J.Embryol.Exp.Morh，27，353-365(1972))、人Hela細胞(ATCCCCL-2)、人HEK293細胞(ATCCCRL-1573)等是優(yōu)選的。
此外，本發(fā)明用作受體的單個生物體具體包括植物、動物、原生動物(protozoan)、細菌、病毒或真菌的單個生物體。植物可以單子葉、雙子葉或裸子植物；動物可以是脊椎動物或無脊椎動物。本發(fā)明中作為受體的優(yōu)選細菌是那些在農業(yè)或工業(yè)中利用的微生物，及那些對于植物或動物的致病性的微生物。真菌包括霉菌和酵母形態(tài)的。脊椎動物的例子包括魚和哺乳動物，如牛、山羊、豬、綿羊、倉鼠、小鼠、大鼠、猴和人；無脊椎動物包括線蟲和其它蠕蟲、果蠅和其它昆蟲。
將雙鏈多核苷酸轉染進入到受體的方法，包括如果受體是細胞或組織則可采用磷酸鈣法、電穿孔法、脂轉染法、病毒感染法、浸泡于雙鏈核苷酸溶液中、轉化等方法。此外，轉染胚胎的方法，可采用如微注射、電穿孔法、病毒感染等。如果受體是植物，可采用注射或灌注到植物的孔腔(cavity)、間質細胞中等或者采用噴霧的方法。如果受體是動物個體，可采用系統(tǒng)轉染如口服、體表(topical)、腸胃外(包含皮下、肌內和靜脈內施用)、經陰道的、經直腸的、鼻內、經眼的(transocular)或腹膜內注射、或電穿孔法或病毒感染等方法。作為口服轉染方法，雙鏈多核苷酸可直接與用于生物的食品進行混合。此外，對單個生物體的轉染中，例如可通過給予包埋的長期釋放制劑等或通過轉染受體攝取雙鏈多核苷酸。
用于轉染的雙鏈多核苷酸的量可依據(jù)受體和靶基因來進行合適的選擇，但轉染的多核苷酸地量優(yōu)選地足以使每一個細胞至少有一個拷貝。具體地說，當受體是人培養(yǎng)細胞，并采用磷酸鈣法時，例如，量優(yōu)選為0.1到1000nM。
此處，兩種或更多種類型的雙鏈多核苷酸可以同時進行轉染。在這種情況下，通過用多核苷酸進行轉染后，期望對細胞、組織或單個生物體中的兩個或更多個靶基因的表達進行抑制(這種受體以下稱為“轉染的受體”)。
在本發(fā)明中，“靶基因表達的抑制”不僅僅指完全抑制，也指mRNA或蛋白的表達量的抑制率為20％或更高。靶基因表達受抑制的程度，可以通過比較用雙鏈多核苷酸轉染和未轉染的受體中靶基因的RNA量積累或編碼產生的蛋白質量來確定。mRNA量可以通過已知常規(guī)的方法來進行測定。具體地說，可采用Northern雜交分析、定量反轉錄PCR、原位雜交等。況且，產生的蛋白質量可通過Western印跡分析或對靶基因編碼的酶活性來確定。
(3)通過在轉染的受體中抑制基因表達來分析基因功能的方法通過分析被轉染受體的表型改變以作為本發(fā)明的雙鏈多核苷酸轉染受體后而抑制基因表達的結果，因而可以通過雙鏈多核苷酸的轉染來鑒定靶基因的功能。
此處，靶基因可以是功能已知的或在受體中功能未知的。相應于靶基因的雙鏈多核苷酸的制備可按上述(1)中所描述的方法進行，并按類似于上述(2)中描述的方式以轉染進入到受體中。在轉染的受體中分析改變的表型并沒有特別地限制，舉例來說，包括生物體的性質如轉染的受體的形態(tài)、轉染的受體中物質的含量、轉染受體分泌物質的量、轉染受體物質的動態(tài)變化、轉染受體之間的附著性、轉染受體的遷移性或轉染受體的壽命。如果靶基因在其它生物體中功能是已知的，優(yōu)選分析與其功能相關的表型。作為一種分析表型變化的手段之一，在分析轉染的受體的形態(tài)改變情況下，可以能夠利用顯微檢測或目視檢測。此外，當以mRNA作為轉染受體中物質時，可采用分析其含量的方法包括Northern雜交、定量反轉錄PCR、原位雜交等。在蛋白質情況時，可采用分析其含量的方法包括用靶基因編碼的蛋白質作為抗原與相應抗體進行Western印跡、測定靶基因編碼蛋白的酶活性。如果通過分析由于靶基因的表達受到抑制而僅在轉染受體中出現(xiàn)表型改變，這可以鑒定出靶基因的功能。
(4)用雙鏈多核苷酸轉染而抑制靶基因的表達，賦予細胞、組織或單個生物體以特定性能利用本發(fā)明雙鏈多核苷酸轉染而抑制靶基因的表達，可以賦予細胞、組織或單個生物體以特定性能。所謂特定性能指轉染受體中由于靶基因表達受到抑制后出現(xiàn)的特性。此處，靶基因可以是這樣的基因，它通過抑制其表達賦予轉染受體的特性已被弄清楚、或者它的功能或在轉染受體中的功能是未知的。在靶基因的功能是未知的情況下，通過對用雙鏈多核苷酸轉染后的受體所呈現(xiàn)的表型中選擇預期表型，獲得賦予了預期特性的轉染受體。
賦予給轉染受體的預期特性的具體例子包括胞內生產性功能、抑制胞外分泌的功能、細胞或DNA損傷的修復功能、對特定疾病的抗性功能等。具體地說，如果轉染受體是植物個體等，靶基因包括與果實成熟有關的酶、植物結構蛋白、致病性等相關基因。
當靶基因表達被抑制后具有對特定疾病的抗性功能時，是指特定蛋白的表達量增加將導致特定疾病的發(fā)生，其靶基因包括編碼該上述蛋白的基因、或編碼了能夠控制該上述蛋白表達的蛋白基因等。作為一個具體地例子，靶基因是導致癌癥/腫瘤表型停滯(retention)所必需的基因，其受體是腫瘤細胞、腫瘤組織等。
既然針對靶基因的雙鏈多核苷酸能夠抑制靶基因編碼的蛋白質的表達，該多核苷酸可以用作治療或預防與靶基因相關聯(lián)的疾病。所述雙鏈多核苷酸用作上述藥物制劑的活性成分，所述多核苷酸可以單獨使用但也可與藥物學可接受的載體一起制備藥物組合物劑型。所述活性成分相對于此時載體的重量比為1至90％。此外，這種藥物制劑可通過不同的方式進行給藥，所述給藥方式包括口服片劑、膠囊劑、顆粒劑、粉劑、糖漿等、或者非腸道給藥如注射、滴注、脂質體、栓劑等。此外，可根據(jù)癥狀、年齡、體重等來選擇合適地給藥方式。
用針對這種基因的雙鏈多核苷酸轉染的受體的選擇依賴于與抑制該基因的表達相關的預期表型。而且，用于轉染的雙鏈多核苷酸中，連接有編碼特定遺傳標記如熒光蛋白的序列時，可以基于與雙鏈多核苷酸一起轉染的熒光蛋白表達量的抑制程度來進行篩選。其中，當作為靶基因的是具有癌抑制功能的基因時，用于篩選的細胞特征包括惡性腫瘤特征，如生長能力的增加、細胞粘著性的降低或細胞的游動性(遷移)增加等。此外，當用作靶基因的是控制生物節(jié)律的基因時，可用于篩選的細胞特性包括晝夜節(jié)律的消失等。進一步，當涉及由環(huán)境誘變導致作為DNA損傷的修復的基因用作靶基因時，用于篩選的細胞特性包括表現(xiàn)出對突變的敏感性等。
可根據(jù)適合每種受體的本領域已知的克隆技術，以建立和獲得篩選的轉染受體為系。具體而言，當受體是細胞時，轉染受體的細胞系可采用常規(guī)培養(yǎng)細胞的建立細胞系方法如有限稀釋法、或利用藥物抗性標記的方法等來建立和獲得。本發(fā)明中可得到的轉染受體，其中被賦予了特定功能可以是增加了產生或分泌一種有用物質的效率的細胞系、對細胞或DNA等環(huán)境因子提供損傷有更高的敏感性的細胞系、或者呈現(xiàn)與疾病相關特性的作為治療疾病的模型。
其中，獲得作為治療疾病模型的細胞系的方法作為本發(fā)明一個具體應用的例子?？蛇x擇基因表達量降低或缺乏該基因將導致疾病的那些基因作為靶基因。具體地說，例如Alzheimer病的PS1基因、著色性干皮綜合癥(Xeroderma Pigmentosum Syndrome)中的XPA/XPD/XPF/XPG基因和DNA聚合酶η基因、結腸癌中的APC基因、乳癌中的BRCA1/BRCA2基因、糖尿病中的INS/INSR基因等。
例如用包含與至少部分人基因的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的DNA和RNA的雙鏈多核苷酸轉染來源于人的培養(yǎng)細胞，即可以獲得人疾病模型細胞。
進而，將待測物質與賦予了特定特性的細胞、組織或單個生物體接觸，分析與基因相關的疾病的癥狀是否出現(xiàn)或特性改變是否表現(xiàn)，也可能篩選出用于治療和/或預防上述疾病的物質。
通過上述篩選選擇出的物質作為上述藥物制劑的活性成分時，該物質可單獨使用但也可與藥物學可接受的載體一起制備藥物組合物劑型。所述活性成分相對于此時載體的重量比為1至90％。此外，這種藥物制劑可通過不同的方式進行給藥，所述給藥方式包括口服片劑、膠囊劑、顆粒劑、粉劑、糖漿等、或者非腸道給藥如注射、滴注、脂質體、栓劑等。此外，可根據(jù)癥狀、年齡、體重等來選擇合適地給藥方式。
(5)用指示基因表達量受抑制的程度作為指標進行初步篩選的使用方法在上述(1)至(4)中描述的本發(fā)明方法是用包括與靶基因的至少部分核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的DNA和RNA的雙鏈多核苷酸轉染受體的方法。然而，在本發(fā)明方法中，進一步的轉染是用(a)包含編碼了指示蛋白的DNA的表達載體，(b)包括與編碼指示蛋白的至少部分核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的DNA和RNA的雙鏈多核苷酸，并利用指示蛋白所產生的信號量作為度量對轉染受體進行初步篩選，只有其中基因表達受到抑制的轉染受體被分析，因此可以進行有效率的分析。
作為本發(fā)明進一步的具體例子，下面描述以來源于脊椎動物的培養(yǎng)細胞用作受體，熒光蛋白作為指示蛋白。來源于脊椎動物的培養(yǎng)細胞用包含編碼熒光蛋白的DNA的表達載體進行轉染，并對細胞進行培養(yǎng)，繼而以特定強度或更高的指示蛋白所產生的信號量來對細胞進行篩選。在這里選擇出的細胞進一步用包括與編碼指示蛋白的至少部分DNA的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的DNA和RNA的雙鏈多核苷酸進行轉染，培養(yǎng)細胞，繼而以指示蛋白產生的熒光減弱的程度來分析指示基因表達受抑制的程度。
由于這種各初步篩選確證了雙鏈多核苷酸對受體的轉染以及在轉染受體中靶基因表達出現(xiàn)的抑制，指示蛋白應當是顯示蛋白量與所產生的信號適量之間相關聯(lián)的那些蛋白。這種蛋白具體地例子包括熒光素酶蛋白。
進而，在測定靶基因表達受抑制的程度時，或基于指示蛋白的表達量而計算出靶基因編碼的蛋白量。
(6)本發(fā)明的試劑盒的應用用于進行上述(1)至(5)中描述的方法的試劑盒包含雙鏈多核苷酸、含有編碼指示蛋白的DNA的載體，包含與指示基因的至少部分核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的DNA和RNA的雙鏈多核苷酸，如酶和緩沖液的試劑、用于轉染多核苷酸的試劑等。在本發(fā)明中，試劑盒并不必需包含所有這些試劑，而只要能夠用于上面描述的方法，則試劑盒可以是包含上述試劑的任何組分之間的組合。
實施例下面通過實施例來對本發(fā)明進行更詳細地描述，但下述實施例應當解釋成有助于獲得對本發(fā)明更具體的理解，因此本發(fā)明的范圍不受下面實施例的任何限制。
實施例1將雙鏈DNA-RNA雜交體轉染到CHO-KI細胞而抑制靶基因的表達(1)DNA-RNA雜交體雙鏈多核苷酸的制備靶基因是Photinus pralis的熒光素酶基因(P.pyralis luc基因登錄號U47296)，pGL3-對照載體(Promega生產)用作包含該靶基因的表達載體。在所述載體中，P.pyralis luc基因片斷位于SV40和多聚腺苷信號序列之間。Renilla reniformis的熒光素酶基因作為指示基因，pRL-TK(Promega生產)用于含有該基因的表達載體。
在該實施例中，用于制備雙鏈多核苷酸的有義鏈的21個核苷酸，如SEQID NO1(DNA)或SEQ ID NO2(RNA)所示。而反義鏈由SEQ ID NO3(DNA)或SEQ ID NO4(RNA)表示。利用這些序列，按圖1所示方法制備DNA或RNA的嵌合型單鏈多核苷酸。通過Hitachi Instruments Service Co.Ltd委托Genset K.K.合成的這些多核苷酸。有義鏈多核苷酸的序列相應于P.pyralisluc基因(總長度為1653個堿基對)的第38至58位核苷酸，其是pGL3-對照載體中的靶基因。
用于抑制P.pryalis luc基因的雙鏈RNA、雙鏈DNA和雙鏈DNA-RNA雜交體通過有義鏈FLs1(RNA)或DELs1(DNA)與反義鏈Fla2(RNA)或DELa2(DNA)退火制備而成。退火是將存在于10mM Tris-HCl(pH 7.5)和20mM NaCl反應液中的有義單鏈多核苷酸和反義單鏈多核苷酸于90℃加熱2分鐘，進而于37℃溫育1小時，后將其靜置冷卻到室溫。這樣，有義鏈和反義鏈經退火形成雙鏈多核苷酸。通過2％瓊脂糖凝膠于TBE緩沖液中進行電泳來分析雙鏈多核苷酸是否形成。在上述條件下，幾乎每一個單鏈多核苷酸都被退火形成雙鏈多核苷酸。
(2)將靶基因、指示基因和雙鏈多核苷酸轉染至培養(yǎng)細胞CHO-KI(RIKEN Cell Bank)用作培養(yǎng)細胞，其培養(yǎng)基是Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Gibco BRL生產)中附加失活的10％牛胎血清(Mitsubishi KaseiCorporation生產)、作為抗生素的10單位/ml青霉素(Meiji生產)和50μg/ml鏈霉素(Meiji生產)。細胞在含5％CO2的條件下于37℃進行培養(yǎng)。
CHO-KI細胞以0.3×106細胞/ml的濃度涂布于24孔平板。1天后，用磷酸鈣沉淀法(Saibo Kogaku Handbook，edited by Toshio Kuroki等，Youdosha(1992))將1.0μg pGL3對照載體DNA、0.5μg pRL-TK DNA及0.01、0.1、1、10或100nM的每一種雙鏈多核苷酸對細胞進行轉染。
(3)測定培養(yǎng)細胞中的基因表達20小時后，收集按上述實施例1(2)制備的細胞，并用Dual-LuciferaseReporter Assay System(Promega生產)對兩種類型的熒光素酶(Photinus pyralisluc和Renilla reniformis luc)蛋白的表達量(熒光素酶活性)進行測定。熒光的測定采用Lumat LB9507光度計(EG&G Berthold)。
轉染進CHO-KI細胞中的基因表達被DNA-RNA雜交體類型的雙鏈多核苷酸所抑制(圖2)。所有的值表明，相對于指示基因的表達量(熒光素酶的酶活性)，所有的值顯示靶基因產物沒有活性。這里顯示的是三次實驗的平均值，圖中的垂直條代表著標準差。與沒有用雙鏈多核苷酸轉染的對照組相比，在添加100nM雙鏈多核苷酸時，雙鏈RNA進行轉染的組中可觀察到對靶基因的表達抑制率達96％，而在具有有義鏈DNA及反義鏈RNA的雙鏈多核苷酸轉染的組中可觀察到80％抑制率。也就是說，即使雙鏈多核苷酸中的有義鏈為DNA，而當反義鏈為RNA時，在CHO-KI細胞中也可觀察到對基因表達的抑制，雖然其抑制效果相對于雙鏈RNA而言要弱一些。
實施例2將DNA-RNA嵌合型雙鏈多核苷酸轉染果蠅S2細胞，以抑制靶基因的表達(1)DNA-RNA嵌合型雙鏈多核苷酸的制備Photinus pyralis的熒光素酶基因(P.pyralis luc基因登錄號U47296)用作靶基因。而Renilla reniformis的熒光素酶基因用作指示基因。此外，表達載體采用描述于實施例1中的表達載體。
在該實施例中，用于制備雙鏈多核苷酸的是有義鏈的21個核苷酸，如SEQ ID NO1(DNA)或SEQ ID NO2(RNA)所示。而反義鏈由SEQ IDNO3(DNA)或SEQ ID NO4(RNA)表示。利用這些序列，按圖1所示方法制備含DNA或RNA的嵌合型單鏈多核苷酸。通過Hitachi Instruments ServiceCo.Ltd委托Genset K.K.合成這些多核苷酸。
用于抑制P.pryalis luc基因的DNA-RNA嵌合型雙鏈多核苷酸通過有義鏈FLs1(單鏈RNA)分別與反義鏈Fla2-1、Fla2-2、Fla2-3、Fla2-4、Fla2-5、Fla2-6、Fla2-7、Fla2-8、Fla2-9、Fla2-10(DNA-RNA嵌合型單鏈多核苷酸)經退火制備而成。有義單鏈RNA和反義DNA-RNA-嵌合型單鏈多核苷酸的退火反應按實施例1中描述的類似方式進行。通過2％瓊脂糖凝膠于TBE緩沖液中進行電泳來分析雙鏈多核苷酸的形成。
(2)將靶基因、指示基因和DNA-RNA嵌合型雙鏈多核苷酸轉染培養(yǎng)細胞果蠅S2細胞(Schneider I.等，J.Embryol.Exp.Morph.，27，353-365(1972))作為培養(yǎng)細胞，其培養(yǎng)基是Schneider改良Eagle培養(yǎng)基(Gibco BRL生產)中附加失活的10％牛胎血清(Mitsubishi Kasei Corporation生產)、作為抗生素的10單位/ml青霉素(Meiji生產)和50μg/ml鏈霉素(Meiji生產)。細胞在含5％CO2的條件下于25℃進行培養(yǎng)。
S2細胞以1.0×106細胞/ml的濃度涂布于24孔平板。1天后，用磷酸鈣沉淀法(Saibo Kogaku Handbook，edited by Toshio Kuroki等，Youdosha(1992))將1.0μg pGL3對照載體DNA、0.05μg pRL-TK DNA及100nM的每一種雙鏈多核苷酸對細胞進行轉染。
(3)測定培養(yǎng)細胞中的基因表達20小時后，收集按上述實施例2(2)制備的細胞，并用Dual-LuciferaseReporter Assay System(Promega生產)對兩種類型的熒光素酶(Photinus pyralisluc和Renilla reniformis luc)蛋白的表達量進行測定。熒光的測定采用LumatLB9507光度計(EG&G Berthold)。
轉染進S2細胞中的基因表達被長21個核苷酸的DNA-RNA嵌合型雙鏈多核苷酸所抑制(圖2)并制備使得有義鏈固定為RNA，而反義鏈是DNA和RNA的嵌合型多核苷酸(圖3)。所有確定的值作為相對于指示基因表達量(熒光素酶活性)與靶基因產物的相對活性，且其值顯示的是三次實驗的平均值和標準差。與沒有用雙鏈多核苷酸轉染的對照組相比，反義鏈為Fla2、Fla2-2、Fla2-3、Fla2-8或Fla2-9的雙鏈多核苷酸強烈抑制了基因的表達，分別達約96％、92％、94％，91％或96％。具有Fla2-5反義鏈的多核苷酸顯示了相對較強的抑制率即73％。Fla2-1、Fla2-4、Fla2-6、Fla2-7或Fla2-10反義鏈的多核苷酸沒有抑制效果或即使能夠觀察到也是極弱的抑制效果。顯示了強抑制效果的雙鏈多核苷酸的一個共同特性是從反義鏈序列的5`端開始第13和14位的兩個核苷酸是RNA(UA)。另一方面，顯示很弱抑制效果的雙鏈多核苷酸中，其反義鏈序列上的這兩個相應的核苷酸是DNA(TA)。因此，在該利用了S2細胞的實施例中，表明這兩個核苷酸是結構域所必需的并足以顯示強的RNAi效果。
在本實施例中，甚至在其中反義序列上包含這個區(qū)域的部分保留為RNA而其它部分用DNA取代的雙鏈多核苷酸進行轉染也可以觀察到RNAi效果。21個核苷酸的雙鏈多核苷酸可根據(jù)本實施例和其它技術所用方法來鑒定或預測對于RNAi效果必需和足夠的區(qū)域來進行制備，將保持含該區(qū)域部分為RNA而其它部分用DNA取代被認為能夠通過RNAi效果而抑制靶基因的表達。
實施例3將DNA-RNA嵌合型雙鏈多核苷酸轉染人Hela細胞和人HEK293細胞，以抑制基因的表達(1)DNA-RNA嵌合型雙鏈多核苷酸的制備P.pyralis luc基因用作靶基因，pGL3-對照載體(Promega生產)用于構建包含該基因的表達載體。此外，Renilla reniformis的luc基因用作指示基因，而pRL-TK(Promega生產)用于構建包含該基因的表達載體。
在該實施例中，用于制備雙鏈多核苷酸的是有義鏈的21個核苷酸，如SEQ ID NO1(DNA)或SEQ ID NO2(RNA)所示。而反義鏈由SEQ IDNO3(DNA)或SEQ ID NO4(RNA)表示。利用這些序列，按圖1所示方法制備DNA或RNA的嵌合型單鏈多核苷酸。通過Hitachi Instruments Service Co.Ltd委托Genset K.K.合成這些多核苷酸。有義鏈多核苷酸相應于P.pyralisluc基因(總長度為1653個堿基對)的第38至58位核苷酸，其是pGL3-對照載體中的靶基因。
用于抑制P.pryalis luc基因的DNA-RNA嵌合型雙鏈多核苷酸通過有義鏈FLs1-1或FLs1-2(DNA-RNA嵌合型單鏈多核苷酸)與反義鏈Fla2(單鏈RNA)經退火制備而成。有義DNA-RNA-嵌合型單鏈多核苷酸和反義單鏈RNA的退火反應按實施例1中描述的類似方式進行。通過2％瓊脂糖凝膠于TBE緩沖液中進行電泳來分析雙鏈多核苷酸產物。
(2)將靶基因、指示基因和DNA-RNA嵌合型雙鏈多核苷酸轉染培養(yǎng)細胞將描述于上述(1)中的pGL3-對照載體用作表達靶基因的重組表達載體，描述于上述(1)中的pRL-TK用作表達指示基因的表達載體。人Hela細胞(ATCCCCL-2)、人HEK293細胞(ATCCCRL-1573)用作培養(yǎng)細胞。其培養(yǎng)基應用Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Gibco BRL生產)中附加失活的10％牛胎血清(Mitsubishi Kasei Corporation生產)、作為抗生素的10單位/ml青霉素(Meiji生產)和50μg/ml鏈霉素(Meiji生產)。細胞在含5％CO2的條件下于37℃進行培養(yǎng)。
Hela細胞、HEK293細胞分別以0.5×106細胞/ml和0.25×106的濃度涂布于24孔平板。1天后，用磷酸鈣沉淀法(Saibo Kogaku Handbook，edited byToshio Kuroki等，Youdosha(1992))將1.0μg pGL3對照DNA、1.0μg pRL-TKDNA及100nM的每一種雙鏈多核苷酸對細胞進行轉染。
(3)測定培養(yǎng)細胞中的基因表達正如實施例1，在20小時后，收集按上述實施例3(2)制備的細胞，并用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega生產)對兩種類型的熒光素酶(Photinus pyralis luc和Renilla reniformis luc)蛋白的表達量進行測定。熒光的測定采用Lumat LB9507光度計(EG&G Berthold)。
轉染進Hela細胞、HEK293細胞中的基因表達被長21個核苷酸的DNA-RNA嵌合型雙鏈多核苷酸所抑制(圖4)，并制備以使得雙鏈的反義鏈固定為RNA，而有義鏈是DNA和RNA的嵌合型多核苷酸。所有確定的值作為相對于指示基因(熒光素酶活性)與靶基因產物的相對活性，且其值顯示的是三次實驗的平均值和標準差。與沒有用雙鏈多核苷酸轉染的對照組相比，有義鏈為FLs1-2的雙鏈多核苷酸進行轉染的組中顯示了基因表達的強烈抑制，達90％(Hela細胞)或95％(HEK293細胞)，這與用雙鏈RNA進行轉染的抑制效果相當。在FLs1-2中，其序列的5`區(qū)域的12個核苷酸是RNA，而其它區(qū)域的核苷酸是DNA。因此，在使用Hela細胞和HEK293細胞的本實施例中，表明當反義鏈固定為RNA時，在有義鏈中的整個12個核苷酸或其部分是結構域所必需的并足以顯示強的RNAi效果。
實施例4將DNA-RNA嵌合型雙鏈多核苷酸轉染人CHO-K1細胞，以抑制基因的表達(1)DNA-RNA嵌合型雙鏈多核苷酸的制備P.pyralis luc基因用作靶基因，pGL3-對照載體(Promega生產)用于包含該基因的表達載體。此外，Renilla reniformis的luc基因用作指示基因，而pRL-TK(Promega生產)用于包含該基因的表達載體。
在該實施例中，用于制備雙鏈多核苷酸的是有義鏈的21個核苷酸，它分別相應于P.pyralis luc基因(總長度為1653個堿基對)的第8至28位(8-28)核苷酸、第38至58位(38-58)和第1087至1107位(1087-1107)，其是pGL3-對照載體中的靶基因。
在這些序列中，8-28位的有義鏈如SEQ ID NO5(DNA)或SEQ IDNO6(RNA)所示，相應的反義鏈如SEQ ID NO7(DNA)或SEQ ID NO8(RNA)所示。38-58位的有義鏈如SEQ ID NO1(DNA)或SEQ ID NO2(RNA)所示，相應的反義鏈如SEQ ID NO3(DNA)或SEQ ID NO4(RNA)所示。此外，1087-1107位的有義鏈如SEQ ID NO9(DNA)或SEQ ID NO10(RNA)所示，相應的反義鏈如SEQ ID NO11(DNA)或SEQ ID NO12(RNA)所示。
關于這些序列，制備了有義和反義鏈的上游一半?yún)^(qū)域(10至13個核苷酸)均是RNA的序列(C)、有義和反義鏈的上游一半?yún)^(qū)域(10至13個核苷酸)均是DNA的序列(D)、反義鏈是RNA而有義鏈的上游一半?yún)^(qū)域(10至13個核苷酸)是RNA的序列(E)、有義鏈為RNA而反義鏈的上游一半?yún)^(qū)域(10至13個核苷酸)是DNA的序列(F)。通過Hitachi Instruments Service Co.Ltd委托Genset K.K.合成這些多核苷酸，形成嵌合型多核苷酸后，通過退火而將其制備成雙鏈多核苷酸。有義和反義嵌合型單鏈多核苷酸的退火反應按實施例1中描述的類似方式進行。通過2％瓊脂糖凝膠于TBE緩沖液中進行電泳來分析雙鏈多核苷酸產物。
(2)將靶基因、指示基因和DNA-RNA嵌合型雙鏈多核苷酸轉染培養(yǎng)細胞將描述于上述(1)中的pGL3-對照載體用作表達靶基因的重組表達載體，描述于上述(1)中的pRL-TK用作表達指示基因的表達載體。人CHO-K1細胞(ATCCCCL-61)、用作培養(yǎng)細胞。Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(GibcoBRL生產)中附加失活的10％牛胎血清(Mitsubishi Kasei Corporation生產)、作為抗生素的10單位/ml青霉素(Meiji生產)和50μg/ml鏈霉素(Meiji生產)作為培養(yǎng)基。細胞在含5％CO2的條件下于37℃進行培養(yǎng)。
CHO-K1細胞以0.3×106細胞/ml的濃度涂布于24孔平板。1天后，用磷酸鈣沉淀法(Saibo Kogaku Handbook，edited by Toshio Kuroki等，Youdosha(1992))將1.0μg pRL-TK DNA、及10nM或100nM的每一種DNA-RNA嵌合型雙鏈多核苷酸對細胞進行轉染。
(3)測定培養(yǎng)細胞中的基因表達正如實施例1，在20小時后，收集按上述實施例4(2)制備的細胞，并用Dual-Luciferase Reporter Assay System對兩種類型的熒光素酶蛋白的表達量進行測定。熒光的測定采用Lumat LB9507光度計。
雙鏈多核苷酸的結構和用它們轉染的細胞相對于對照(未用雙鏈多核苷酸轉染的細胞)的熒光素酶活性的比例顯示于圖5。在圖中，空白的正方形代表RNA鏈，而填充的正方形代表DNA鏈。從圖中可明顯得知，任何堿基序列的多核苷酸中，轉染到CHO-Kl細胞中的基因的表達被每一個具有21個核苷酸的雙鏈多核苷酸所抑制，其中至少多核苷酸的上游一半?yún)^(qū)域是RNA(圖5(A)，(C)和(E))。
21個核苷酸的雙鏈多核苷酸可根據(jù)本實施例和其它技術的方法來鑒定或預測對于顯示RNAi效果必需和足夠的區(qū)域來進行制備，保持含該區(qū)域的部分為RNA而其它部分用DNA取代被認為能夠通過RNAi效果而抑制靶基因的表達。
對本發(fā)明已詳細地并通過具體實施例進行了描述，對本領域技術人員而言明顯可進行許多改變和更改而仍然屬于本發(fā)明的精神和范圍之內。
本發(fā)明以于2001年11月21日提出的日本專利申請No:2001-355896為基礎，在此將其全部內容引入作為參考。
工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，提供了一種利用培養(yǎng)細胞、組織或單個生物體而直接分析人或其它生物的基因功能的方法。而且，根據(jù)利用指示基因的方法，通過初步篩選，甚至可以在呈現(xiàn)弱RNAi效果的細胞中選出呈現(xiàn)特別高強度的RNAi效果的細胞，而能有效地進行分析。
作為用于相同目的的常規(guī)發(fā)明技術，通常會考慮利用雙鏈RNA進行轉染的RNAi方法，但問題是RNA極容易被核糖核酸酶所降解，尤其是以單鏈形式存在時，因而導致生產成本過高。在本發(fā)明中待轉化多核苷酸不限于全部的RNA。因此，在本發(fā)明中，利用包含DNA和RNA的多核苷酸，尤其是DNA鏈和RNA鏈的雜交體多核苷酸或DNA-RNA嵌合型多核苷酸，而使多核苷酸作為用于轉染物質的穩(wěn)定性得到增強，也降低了生產成本。因此，根據(jù)本發(fā)明，可將多核苷酸本身制成用于治療疾病的藥物制劑。此外，相對于RNA，可以對DNA作許多方面的修飾如熒光標記、生物素標記、氨基化、磷酸化和硫醇化等。因此，當用作藥物因子或試劑時，通過這種修飾可賦予合適于目的的功能。
序列表<110>三菱化學株式會社(MITSUBISHI CHEMICAL CORPORATION)<120>抑制基因表達的方法<130>P-43361<140>JP 2001-355896<141>2001-11-21<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<400>1cattctatcc gctggaagat g 21<210>2<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<400>2cauucuaucc gcuggaagau g 21<210>3
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<400>3tcttccagcg gatagaatgg c21<210>4<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<400>4ucuuccagcg gauagaaugg c21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<400>5acgccaaaaa cataaagaaa g21<210>6<211>21<212>RNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<400>6acgccaaaaa cauaaagaaa g21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<400>7ttctttatgt ttttggcgtc t 21<210>8<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<400>8uucuuuaugu uuuuggcguc u 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的
<400>9ggtaaagttg ttttattttt t 21<210>10<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<400>10gguaaaguug uuuuauuuuu u 21<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<400>11aaaatggaac aactttaccg a 21<210>12<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<400>12aaaauggaac aacuuuaccg a 2權利要求
1.一種抑制靶基因表達的方法，其包括用雙鏈多核苷酸轉染細胞、組織或單個的生物體，該雙鏈多核苷酸包含具有至少與靶基因的部分核苷酸序列基本上相同的多核苷酸序列的DNA和RNA。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中雙鏈多核苷酸包含自我互補的單鏈。
3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中雙鏈多核苷酸是DNA鏈和RNA鏈的雜交體。
4.根據(jù)權利要求3的方法，其中DNA鏈和RNA鏈的雜交體包含有義鏈DNA和反義鏈RNA。
5.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中雙鏈多核苷酸是DNA和RNA嵌合體。
6.根據(jù)權利要求1-5中任一項的方法，其中在雙鏈多核苷酸中，至少多核苷酸的上游部分區(qū)域是RNA。
7.根據(jù)權利要求6的方法，其中上游部分區(qū)域由9到13個核苷酸組成。
8.根據(jù)權利要求1至6中任一項的方法，其中雙鏈多核苷酸由19至25個核苷酸組成，并且至少多核苷酸上游一半?yún)^(qū)域是RNA。
9.根據(jù)權利要求1至8中任一項的方法，其中靶基因有多個。
10.一種分析基因功能的方法，包括由于通過權利要求1至9中任一項所述方法抑制靶基因表達，分析細胞、組織或單個生物體所顯現(xiàn)的表型變化。
11.一種賦予細胞、組織或單個生物體以特定特性的方法，包括利用權利要求1至9中任一項所述方法抑制靶基因的表達。
12.根據(jù)權利要求11的方法所得到的細胞、組織或單個生物體。
13.一種篩選用于預防和/或治療與靶基因相關疾病的試劑的方法，包括將待測物質加入到根據(jù)權利要求12所述的細胞、組織或單個生物體中，并進而分析所賦予細胞、組織或單個生物體的特性改變。
14.一種用于預防和/或治療與靶基因相關疾病的試劑，包含根據(jù)權利要求13的方法所獲得的物質作為活性成分。
15.一種產生預防和/或治療與靶基因相關疾病的試劑的方法，包括根據(jù)權利要求13的方法所選擇出的物質制成藥物制劑。
16.一種根據(jù)權利要求1至9中任一項的方法，進一步的包括用包含編碼指示蛋白的DNA的表達載體轉染細胞、組織或單個生物體，繼而選擇和分析具有特定強度或更高強度的指示蛋白所產生的一定信號量的細胞、組織或單個生物體。
17.一種根據(jù)權利要求1至9中任一項的方法，進一步的包括用包含編碼指示蛋白的DNA的表達載體和包含與該DNA的至少部分核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的雙鏈RNA轉染細胞、組織或單個生物體，繼而選擇和分析指示蛋白所產生的信號量減弱的細胞、組織或單個生物體。
18.根據(jù)權利要求16或17的方法，其中指示蛋白是其中該蛋白的量與該蛋白所產生的信號的量之間成比例變化的蛋白。
19.根據(jù)權利要求16至18中任一項的方法，其中指示蛋白是熒光素酶。
20.一種在RNAi方法中鑒定RNA的功能區(qū)域的方法，包括(i)制備具有與靶基因的至少部分核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列之雙鏈多核苷酸，包括DNA和RNA嵌合體；(ii)用該雙鏈多核苷酸轉染細胞、組織或單個的生物體；(iii)在轉染的細胞、組織或單個的生物體中測定靶基因的表達受到抑制的程度，和(iv)鑒定對于抑制靶基因表達而必需是RNA的序列。
21.根據(jù)權利要求20的方法，其中的雙鏈多核苷酸中的任一條鏈是RNA鏈。
22.在權利要求1至11、13及15至21任一項的方法中使用的雙鏈多核苷酸。
23.一種預防和/或治療與靶基因相關疾病的試劑，至少包括根據(jù)權利要求22的的雙鏈多核苷酸。
24.一種用于實施權利要求1至11、13及15至21中任一項方法的試劑盒，至少包括根據(jù)權利要求22的雙鏈多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抑制靶基因表達的方法，包括用包含與至少部分靶基因的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的DNA和RNA的雙鏈多核苷酸轉染細胞、組織或單個的生物體。
文檔編號C12N15/113GK1612930SQ0282699
公開日2005年5月4日 申請日期2002年11月21日 優(yōu)先權日2001年11月21日
發(fā)明者程久美子, 梶隆英, 上田龍, 西鄉(xiāng)薰 申請人:三菱化學株式會社, 西鄉(xiāng)薰