專利名稱：生物反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物反應(yīng)器。
本發(fā)明具體涉及一種使用固定化活生物材料的生物反應(yīng)器。
本發(fā)明更具體涉及一種包括硅質(zhì)層的生物反應(yīng)器，所述硅質(zhì)層在存在或未存在支架材料和基質(zhì)的情況下能固定上述活生物材料。
已知可通過在基質(zhì)表面上沉積的硅質(zhì)層固定或截留生物材料，其中基質(zhì)容納有下文稱為“生物質(zhì)”的諸如酶，細(xì)菌，酵母，植物或動(dòng)物細(xì)胞的上述生物材料。
上述硅質(zhì)層應(yīng)具有以下特征a)固定上述生物質(zhì)以防止生物質(zhì)從基質(zhì)釋放進(jìn)入生物反應(yīng)器的液體培養(yǎng)基中。
b)保持生物質(zhì)的活性，使得在固定相與培養(yǎng)基之間進(jìn)行可控和確定的輸送，和c)是生物相容的，這樣活體動(dòng)物的體器官或體液就可與固定化生物質(zhì)接觸。
已知可通過溶膠-凝膠法固定生物質(zhì)，該方法在溶液中進(jìn)行，從液相中的金屬或烷氧化硅開始。
然而，該方法具有多個(gè)缺點(diǎn)，例如a)在許多生物系統(tǒng)中產(chǎn)生有毒的醇，b)所需pH也許不適合于活細(xì)胞或可加快某些生物活性酶變性，
c)所需攪拌操作對(duì)于對(duì)流體-機(jī)械應(yīng)力敏感的細(xì)胞系可能是有害的，d)某些實(shí)驗(yàn)步驟與所需的無菌環(huán)境不相容，和e)該方法不適用于那些需確定的結(jié)構(gòu)組織以避免功能喪失的生物質(zhì)。
為克服上述缺點(diǎn)，人們建議通過使用載有烷氧化硅氣體介質(zhì)的方法將截留的生物質(zhì)固定在基質(zhì)內(nèi)。
具體來說，US 5 998 162描述了通過與氣態(tài)烷氧化硅反應(yīng)將植物細(xì)胞固定在在細(xì)胞表面上獲得的硅質(zhì)層內(nèi)。上述固定化細(xì)胞在六個(gè)月后沒有從溶液中逃逸且保持其存活率，并產(chǎn)生了次生代謝物。可將上述固定化細(xì)胞用于制藥應(yīng)用。
WO 97/45537描述了通過與氣態(tài)烷氧化硅反應(yīng)由直接沉積在細(xì)胞表面上的硅質(zhì)層將動(dòng)物細(xì)胞截留。該方法無毒且存活細(xì)胞未經(jīng)介質(zhì)淋洗，同時(shí)不會(huì)由于介質(zhì)侵入而繁殖?？蓪⒔亓艏?xì)胞用于生物人造器官及所需產(chǎn)品。
然而，在某些情況下，人們已觀察到將硅質(zhì)層直接沉積在細(xì)胞表面上降低了效果和功能并污染活體動(dòng)物的體器官和/或體液以及使活生物質(zhì)的活力消失。
因此，本發(fā)明的發(fā)明人研究了上述現(xiàn)象并發(fā)現(xiàn)在某些情況下發(fā)揮效果和功能需要凝膠基質(zhì)中的生物質(zhì)成分之間自由接觸，同時(shí)上述污染是由于源自生物質(zhì)的病原物質(zhì)，而生物質(zhì)活力的消失是由于宿主生物體的體液的抗體所致。
確實(shí)，生物體的抗體能識(shí)別生物質(zhì)的異種動(dòng)物細(xì)胞表面上的表位，從而將其破壞。
因此，本發(fā)明要解決的主要問題是提供一種能防止上述不便的生物質(zhì)固定系統(tǒng)。
通過如本發(fā)明所附的權(quán)利要求書中列舉的生物反應(yīng)器及其制備方法解決了上述問題。
本發(fā)明的發(fā)明人通過進(jìn)一步研究指出，一方面，抗體和病原物質(zhì)具有大于150,000Da的分子量，同時(shí)另一方面，現(xiàn)有技術(shù)的硅質(zhì)層所具有的孔隙不能夠完全保留或排除上述分子。
因此本發(fā)明的首要目的在于提供一種能夠固定生物質(zhì)并選擇性阻斷分子量大于所選閾值的大分子的硅質(zhì)層的制備方法，該方法包括以下步驟a) 提供被選自(1)Si(OR)4，(2)SiH(OR)3，(3)R′Si(0R)3和(4)R′SiH(OR)2的烷氧化硅混合物飽和的載氣氣流，其中R和R′相同或不同，分別為烷基和/或芳基，其中所述氣流通過使載氣在20至180℃的溫度下鼓泡通過混合比為(1)40-85/(2)0-60/(3)0-60/(4)0-60(％v/v)，優(yōu)選混合比為(1)40-85/(2)0-50/(3)0-50/(4)0-50(％v/v)，更優(yōu)選混合比為(1)50-80/(2)0-20/(3)5-30/(4)5-30(％v/v)的上述烷氧化物的液體混合物制備，和b)將含生物質(zhì)的支持體在步驟a)的氣流中暴露預(yù)定時(shí)間，其中，選擇所述分子量閾值在10000道爾頓和150000道爾頓之間，在步驟a)中選擇(1)，(2)，(3)和(4)硅衍生物的混合比作為待阻斷大分子分子量的函數(shù)。
考慮到生物反應(yīng)器的預(yù)定特殊應(yīng)用，可根據(jù)不同情況選擇待阻斷大分子的分子量。
例如，阻斷分子量大于150,000道爾頓的大分子使得可排除源自宿主生物體體液的抗體和源自生物質(zhì)的病原體通過硅孔。這樣就防止體液與生物質(zhì)的相互傷害。70,000道爾頓的阻斷閾值也阻止了諸如C1s(90kD)，C1qINH(80kD)，C3bINA(80kD)，C9(80kD)和C3PA(80kD)的補(bǔ)體系統(tǒng)成分通過硅膜，從而防止發(fā)生補(bǔ)體的非抗體觸發(fā)活性。另一方面，70kD的阻斷閾值足夠大，使得大分子量物質(zhì)從生物質(zhì)擴(kuò)散至體液。上述物質(zhì)可以是諸如膠原蛋白，粘多糖或纖連蛋白的胞外基質(zhì)分子，它們對(duì)于移植應(yīng)用中的生物相容性是必不可少的。相反，90kD的阻斷閾值在阻止補(bǔ)體系統(tǒng)成分方面選擇性小，但允許更大量的物質(zhì)進(jìn)行交換。
通常，可將具有130kD至150kD阻斷閾值的硅質(zhì)膜用于工業(yè)規(guī)模的生物反應(yīng)器，其中必須最大限度的提高由生物質(zhì)產(chǎn)生的高分子量分子分泌并擴(kuò)散到培養(yǎng)基中。相反，當(dāng)生物質(zhì)產(chǎn)生低分子量分子并將低分子量分子從培養(yǎng)基中分離時(shí)也可以在工業(yè)型生物反應(yīng)器中再次使用10kD阻斷閾值。
本發(fā)明的硅質(zhì)層阻斷具有所選分子量閾值的大分子的能力取決于下述步驟a)中硅衍生物的混合物組分，將描述如下。
作為一般指導(dǎo)，硅衍生物中烷氧基的存在有助于交聯(lián)的形成，從而使所形成的硅膜中孔的尺寸減少。在混合物中引入相對(duì)于每個(gè)硅原子具有較少烷氧基的相對(duì)少量的硅衍生物(例如R′Si(OR)3或R′SiH(OR)2)會(huì)增大膜孔。
具體來說，Si(OR)4和R′SiH(OR)2混合比為75∶25至80∶20的二元混合物(A)會(huì)形成具有約90kD阻斷值的硅膜。通過向上述混合物中加入最高為約10％v/v的R′Si(OR)3替換相同量的Si(OR)4于是可得到Si(OR)4/R′SiH(OR)2)/R′Si(OR)3為65-78％/20-25％/1-10％的混合物(B)，將得到阻斷值最高為150kD的硅膜。
當(dāng)向上述硅衍生物的混合物中進(jìn)一步加入最高含量為約20％v/v的R′Si(OR)3并替換相同量的Si(OR)4時(shí)，膜的阻斷閾值逐漸降低至10kD。該結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于Si(OR)4/R′SiH(OR)2)/R′Si(OR)3的混合比為53-70％/20-25％/10-22％的混合物(C)。不受任何理論的限制，上述效果可能是由于疏水性增加和由于更大量的烷基(R′基團(tuán))所產(chǎn)生的阻礙，從而阻塞孔隙。
由上述討論清楚可知，通過例如上述具有合適組成的三元混合物(B)或三元混合物(C)(R′Si(OR)3含量不超過10％v/v)反應(yīng)可得到介于90kD和150kD之間的相同阻斷閾值。另外，通過二元混合物(A)也可以得到約90kD的阻斷值，而通過諸如R′Si(OR)3組分含量超過10％v/v的混合物(C)反應(yīng)可得到介于10kD和90kD之間的阻斷閾值。
優(yōu)選R為乙基或甲基，R′為甲基。
通常，步驟a)的載氣是空氣。
優(yōu)選對(duì)應(yīng)于每平方厘米暴露表面為1至100mL的總氣體，步驟a)的總氣體流量在暴露期間為0.05至10升/分鐘。
優(yōu)選步驟a)的飽和溫度為20至100℃。
通常，步驟b)的支持體為粘附于支架材料的基質(zhì)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，步驟b)的支持體為粘附于支架材料的微球形基質(zhì)。優(yōu)選微球的直徑為0.1至1.0mm。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，步驟b)的支持體為無支架材料的，優(yōu)選直徑為0.1至1mm的微球形基質(zhì)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，步驟a)是在承載于支架材料而無基質(zhì)的生物質(zhì)上進(jìn)行的。
基質(zhì)的典型實(shí)例為膠原蛋白凝膠，瓊脂，右旋糖苷，胨，海藻酸鹽，角叉藻聚糖和膠體。上述基質(zhì)可進(jìn)一步含有諸如鋇鹽的不透射線材料和/或諸如磁性顆粒及NMR位移試劑的NMR成像檢測(cè)促進(jìn)劑。
支架材料的典型實(shí)例是多孔紙張，玻璃纖維，織物，紡織纖維，多孔陶瓷，玻璃體，天然海綿和泡沫有機(jī)聚合物。特別優(yōu)選的支架材料是天然海綿。
優(yōu)選本發(fā)明硅質(zhì)層的厚度為0.01至10μm，更優(yōu)選為0.05至0.3μm。
優(yōu)選本發(fā)明硅質(zhì)層的臨界剪切稀化應(yīng)力高于10Pa，更優(yōu)選為12至20Pa。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種含硅質(zhì)層的生物反應(yīng)器，所述硅質(zhì)層能夠固定生物質(zhì)并選擇性阻斷分子量高于所選閾值的高分子，通過以混合比為(1)40-85/(2)0-60/(3)0-60/(4)0-60(％v/v)，優(yōu)選(1)40-85/(2)0-50/(3)0-50/(4)0-50(％v/v)，更優(yōu)選(1)50-80/(2)0-20/(3)5-30/(4)5-30(％v/v)混合選自(1)Si(OR)4，(2)SiH(OR)3，(3)R′Si(OR)3和(4)R′SiH(OR)2的烷氧化硅可獲得上述硅質(zhì)層，其中R和R′相同或不同，分別為烷基和/或芳基。
本發(fā)明的特殊方面是在該生物反應(yīng)器中使用固定化酶。在該情況下，所述硅質(zhì)層必須防止所述酶釋放進(jìn)入液體培養(yǎng)基中。通常，許多生物相關(guān)酶具有大于10,000Da的分子量。
因此，本發(fā)明提供了一種制備硅質(zhì)層的方法，所述硅質(zhì)層能夠固定生物質(zhì)，并選擇性阻斷分子量高于所選閾值的大分子，其中所述閾值選自10,000Da至150000Da，該方法包括以下步驟a)提供被選自(1)Si(OR)4，(2)SiH(OR)3，(3)R′Si(OR)3和(4)R′SiH(OR)2的烷氧化硅混合物飽和的載氣氣流，其中R和R′相同或不同，分別為烷基和/或芳基，其中通過使載氣在20至180℃的溫度下鼓泡通過混合比為(1)40-85/(2)0-60/(3)0-60/(4)0-60(％v/v)，優(yōu)選(1)40-85/(2)0-50/(3)0-50/(4)0-50(％v/v)，更優(yōu)選1)50-80/(2)0-20/(3)5-30/(4)5-30(％v/v)的上述烷氧化物的液體混合物制備所述氣流，和b)將含有生物質(zhì)的載體暴露在步驟a)的氣流中。
術(shù)語“生物質(zhì)”指的是能夠執(zhí)行生物類型功能的動(dòng)物或植物源生物材料。
“生物類型功能”的典型例子包括生產(chǎn)用于治療疾病的產(chǎn)品，生產(chǎn)諸如酶，生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子和激素的次生代謝物和蛋白質(zhì)。
上述生物質(zhì)的例子包括動(dòng)物和植物細(xì)胞，或初級(jí)細(xì)胞系，干細(xì)胞系和突變細(xì)胞系，其聚集體，酶和微生物，所有上述生物材料可以未經(jīng)過或經(jīng)過基因工程修飾。
能夠生產(chǎn)適于治療疾病的產(chǎn)品的生物質(zhì)的例子包括用于治療慢性疼痛，用阿黑皮素原基因轉(zhuǎn)染能夠產(chǎn)生β-內(nèi)啡肽的Neuro 2A細(xì)胞系(如Saiton，Y.et al.CELL Transport.1995，4 Suppl 1S13-7所述)；用于治療帕金森癥，能夠產(chǎn)生多巴胺的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞(ATCC CRL-1720)；用于治療阿爾茨海默氏癥，能夠產(chǎn)生神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的下頜下腺SCA-9 clone 15(ATCC CRL-1734)；用于治療腫瘤，能夠產(chǎn)生IL-2的人淋巴瘤H33HJ-JA1(ATCC CRL-8163)；用于治療垂體侏儒癥，能夠產(chǎn)生生長(zhǎng)激素的垂體GH3細(xì)胞(ATCCCCL-82.1)；用于治療血友病，能夠產(chǎn)生因子VIII的豬的初級(jí)肝細(xì)胞；用于治療哈格曼病癥，能夠產(chǎn)生因子XII的豬的初級(jí)肝細(xì)胞；用于治療貧血癥，能夠產(chǎn)生紅細(xì)胞生成素的豬初級(jí)腎細(xì)胞或Hep-G2細(xì)胞(如Mark A.Goldberg Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 847972-7976，1988中所述)；用于治療I型胰島素依賴性糖尿病，能夠產(chǎn)生胰島素的豬的胰島；在體外人造肝臟中所使用的豬初級(jí)肝細(xì)胞。
術(shù)語“生物反應(yīng)器”既是指本發(fā)明

圖1所述類型的設(shè)備，也是指通過本發(fā)明的硅質(zhì)層將生物質(zhì)固定在基質(zhì)上形成的生物單元。
因此，當(dāng)本發(fā)明的生物反應(yīng)器為生物單元時(shí)，它也可以是細(xì)胞尺寸的。
本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)本發(fā)明的生物反應(yīng)器的支持體為含生物質(zhì)而不含支架材料的微球形基質(zhì)時(shí)，可將所述生物反應(yīng)器直接注射到病人的器官中。
可直接注射本發(fā)明生物反應(yīng)器的器官的典型例子包括脊髓背根，腦髓，基底神經(jīng)節(jié)，梅納德氏(Meynert)基底核，外科手術(shù)摘除腫瘤的病灶，門靜脈，腹膜以及肝臟。
因此，本發(fā)明的另一目的是使用由上述方法得到的生物反應(yīng)器制備可注射的藥物組合物以執(zhí)行其生物類型功能。
通常，可將本發(fā)明生物的反應(yīng)器用作人造器官以整合或代替受損器官。
用以整合或代替受損人體器官的生物質(zhì)的例子包括用于受損胰腺例如胰島的胰細(xì)胞；用于受損肝臟的豬肝細(xì)胞；用于受損甲狀腺，甲狀旁腺和腎上腺的源自甲狀腺，甲狀旁腺，腦皮層和髓狀腎上腺的細(xì)胞。
本發(fā)明的可注射藥物組合物包括懸浮在常規(guī)生理溶液中的有效量的微球形生物反應(yīng)器。
本發(fā)明的可注射藥物組合物中微球形生物反應(yīng)器的含量可在相當(dāng)寬的范圍內(nèi)變化，這取決于許多已知因素，例如待治療疾病類型，疾病的嚴(yán)重程度，病人體重，日服藥劑型的次數(shù)和所選生物質(zhì)的效力。
然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地按常規(guī)確定其最佳量。
通常，本發(fā)明的可注射藥物組合物中微球形生物反應(yīng)器的含量為100-50.000個(gè)微球/每毫升生理溶液。
例如，當(dāng)本發(fā)明的微球形生物反應(yīng)器中含有胰島作為生物質(zhì)時(shí)，可注射藥物組合物中微球的含量為每千克體重含2000至25000個(gè)委微球，優(yōu)選每千克體重含10000個(gè)微球，其中每個(gè)微球含一個(gè)或多個(gè)胰島。
可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的已知技術(shù)制備本發(fā)明的可注射藥物組合物，其步驟包括混合，溶解和消毒。
另外，通過以下非限制性實(shí)施例中優(yōu)選實(shí)施方案的描述，本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)變得更加清晰。對(duì)于附圖，其中圖1是本發(fā)明生物反應(yīng)器(10)的示意性剖面圖。
圖1A是與圖1的生物反應(yīng)器(10)的入口區(qū)域19″相連的可拆除氣體供給設(shè)備19的示意性剖面圖。
圖2是承載在聚氨酯泡沫體上并用實(shí)施例2的硅質(zhì)層涂覆的蕓香(Ruta graveolens)細(xì)胞的顯微照片。
圖3是與從實(shí)施例3a的非固定化細(xì)胞所得蛋白質(zhì)相比，由硅質(zhì)層固定的Hep-G2細(xì)胞所得蛋白質(zhì)的分子量分布(從T1至T5)。
圖4A-4D是在直徑為500μm的Ca2±海藻酸鹽微球中Jurkat細(xì)胞的顯微照片。4C表示涂覆硅質(zhì)層的相同微球。4B表示無硅質(zhì)層并去除Ca2+的相同樣品。4D表示涂覆硅質(zhì)層但去除Ca2+的相同樣品(實(shí)施例6)。
圖5表示在對(duì)照(正方形點(diǎn))和二氧化硅涂覆(三角形點(diǎn))胰島上進(jìn)行的灌注實(shí)驗(yàn)。實(shí)線條跨過葡萄糖耐受期。
圖6表示移植有胰島的Sprague Dawley雄性大鼠的血糖水平。大鼠(每組6個(gè))接受約600個(gè)對(duì)照(圓點(diǎn))或涂覆硅質(zhì)層(正方形)的胰島。每個(gè)點(diǎn)是六個(gè)獨(dú)立測(cè)量值的平均值，每個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差低于平均值的15％。
圖1表示本發(fā)明的生物反應(yīng)器，包括容器11，具有入口和出口13，14的恒溫護(hù)套12，pH和溫度傳感器15，16，溶氧探針17，輔助端口18，可拆除頂部19，可拆除底部19″和氣體供給設(shè)備19。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，圖1的生物反應(yīng)器包括由無毒的生物相容材料如PyrexTM或不銹鋼制造的圓柱形容器11，護(hù)套12包裹著容器11，通過入口和出口13，14的熱流體循環(huán)對(duì)其進(jìn)行溫度控制?？蛇x擇性使用加熱/冷卻流體內(nèi)部蛇形管。將pH探針15，溫度傳感器16，溶氧探針17以及進(jìn)料和作業(yè)關(guān)閉期間收集樣品的端口18連接在容器11上。容器11具有的可拆除頂部19和可拆除底部19″通過O形圈(未表明)和/或插銷或螺栓(未表明)與容器密封連接。生物反應(yīng)器10包括使容器11保持水平或垂直放置，優(yōu)選由鋼制成的外殼。可將生物反應(yīng)器10，容器11，頂部19和底部19″打開以便操作者進(jìn)入內(nèi)部維護(hù)和手工作業(yè)。
將生物質(zhì)和諸如膠原蛋白，瓊脂，右旋糖苷，胨，海藻酸鹽，角叉藻聚糖或類似有機(jī)大分子的基質(zhì)化合物的懸浮液通過底部19″的合適開口加入到圓柱形容器11中，該懸浮液的濃度在低于40℃的溫度下產(chǎn)生固體基質(zhì)凝膠。上述基質(zhì)可進(jìn)一步含有諸如鋇鹽的不透射線材料和/或諸如磁性顆粒及NMR位移試劑的NMR成像檢測(cè)促進(jìn)劑。
通常，膠原蛋白的濃度為0.01至3％(w/v)，瓊脂的濃度為0.5至3％(w/v)。
或者，將諸如玻璃纖維，織物，普通纖維或織物，多孔陶瓷體，紙張，有機(jī)合成聚合物或天然聚合物的泡沫體和纖維素固體的多孔支架材料裝入容器11中，所有上述支架材料容納包括在上述基質(zhì)化合物中的生物質(zhì)。上述支架材料可選擇性填充容器11并用生物質(zhì)和基質(zhì)化合物的懸浮液浸透。
或者，在植物或酵母細(xì)胞的情況下，使用生物質(zhì)而不含有基質(zhì)化合物的懸浮液。
將上述填充好的容器11暴露于用本發(fā)明的氣態(tài)烷氧化硅混合物飽和的氣流中。通過與底部19″可拆除連接的氣體供給設(shè)備19提供上述氣流。
本發(fā)明的氣態(tài)烷氧化硅混合物在基質(zhì)凝膠的表面或生物質(zhì)表面上形成均勻且連續(xù)的硅質(zhì)層。烷氧化硅氣流的暴露時(shí)間取決于硅質(zhì)層的厚度(V.M.Sglavo et al.Mat.Science 34，3587 1999)。
硅質(zhì)層的厚度與暴露時(shí)間呈線形函數(shù)，直至每平方厘米的處理表面沉積最高為500μg的硅。由此得到的硅質(zhì)層提供了附著于基質(zhì)表面上的無機(jī)沉淀物，其獨(dú)立于基質(zhì)的化學(xué)組成，幾何形狀，或支架材料的存在。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法形成硅質(zhì)層時(shí)，生物反應(yīng)器的流動(dòng)相通過可拆除底部19″循環(huán)，后者裝配有使生物質(zhì)氧化的氣體擴(kuò)散器20。可使用上述流動(dòng)相進(jìn)料生物質(zhì)和回收產(chǎn)品。通過進(jìn)料泵(未表明)提供上述流動(dòng)相循環(huán)并通過可拆除頂部19使流動(dòng)相在封閉循環(huán)中移動(dòng)。
可拆除頂部19包括釋放烷氧化硅飽和氣流和硅質(zhì)層形成中的揮發(fā)性副產(chǎn)品的出口21。
或者，頂部19可包括用于流動(dòng)相循環(huán)的出口。在該實(shí)施方案中，上述出口可與一排提取器(未表明)連接以從流動(dòng)相中液/液和/或汽/液連續(xù)分離所需產(chǎn)品。或者使用與頂部19相連的貯存器置換生物反應(yīng)器不連續(xù)工作時(shí)用過的流動(dòng)相及其儲(chǔ)藏。
另外，頂部19可包括噴嘴22以形成基質(zhì)溶液的液滴。將氣態(tài)烷氧化硅混合物進(jìn)料到上述噴嘴22以在液滴上涂覆硅質(zhì)層。在該實(shí)施方案中，可拆除的底部19″可含有鼓泡裝置19以用包圍下落液滴的烷氧化硅飽和無毒氣流。
下面通過非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例11％瓊脂中用硅質(zhì)層固定的脲酶活性在水中將640U的脲酶(購自Sigma，純度99％)與20mL 1％(w/w)瓊脂(購自FMC，純度99％)混合。在無菌環(huán)境中將上述溶液傾入到直徑為30mm，高300mm的玻璃PyrexTM圓筒中。將圓筒的入口和蓋關(guān)閉，然后將其放入外殼中并保持容器在37℃恒溫浴中水平放置。通過外部電動(dòng)馬達(dá)使圓筒以5rpm的速率軸向轉(zhuǎn)動(dòng)直至在圓筒的內(nèi)壁形成0.7mm厚的凝膠。使圓筒的入口與飽和氣流相連，其中通過使氣流在80℃下鼓泡通過CH3SiH(OEt)2/Si(OEt)4體積比為25/75的液體溶液得到上述飽和氣流。其中載氣為空氣且流量為0.4升/分鐘。使所述氣流持續(xù)12分鐘。上述操作結(jié)束后，向上述圓筒中加入pH＝8.0的磷酸緩沖液，并在5rpm的轉(zhuǎn)速下于37℃存儲(chǔ)15小時(shí)。然后，收集緩沖液樣品；將含有同樣脲酶的0.7mm厚凝膠但未經(jīng)硅質(zhì)層涂覆的另一容器在pH＝8.0的條件下儲(chǔ)存15小時(shí)候后收集樣品。根據(jù)改進(jìn)的Lowry′s法(Peterson G.L.，Anal.Biochem.83346(1977))測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。在未經(jīng)硅質(zhì)層固定的生物反應(yīng)器中，樣品的蛋白質(zhì)含量相應(yīng)于從瓊脂凝膠中浸出100％脲酶。而使用硅質(zhì)固定層的生物反應(yīng)器中，樣品蛋白質(zhì)含量為0.7％(100％＝在未固定的樣品情況下測(cè)得的蛋白質(zhì)含量)。在1U游離或固定化脲酶中含5μg脲的起始情況下，通過檢測(cè)溶液中脲濃度隨時(shí)間的下降來測(cè)定脲酶的活性。其中用二乙酰一肟法(Ceriotti G.and Spadaro L.，Clin.Chim.Acta.115191965)測(cè)定脲的濃度。同時(shí)對(duì)下述溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)1.含有游離脲酶，2.在瓊脂中含有未經(jīng)硅質(zhì)層涂覆的脲酶，3.在瓊脂中含有經(jīng)硅質(zhì)層涂覆的脲酶。在例1和例2中酶的活性相同(相同的最大速率和相同的Michaelis-Menten常量)。在例3中，可觀察到活性明顯提高(最大速率與Michaelis-Menten常量提高80％)。
實(shí)施例2從通過硅質(zhì)層固定的蕓香細(xì)胞生產(chǎn)lignanic類藥物將如泡沫聚氨酯層的1cm厚(密度為0.1g/mL)海綿切成直徑3.0cm的圓片。用120℃蒸汽將圓片消毒并用每毫升含0.1g濕細(xì)胞團(tuán)的蕓香細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)基(1995年，源自苗芽)處理。上述培養(yǎng)基是添加有3％(w/v)蔗糖，2.6m克/升2，4-二氯苯氧乙酸，0.3m克/升激動(dòng)素，和0.3m克/升萘乙酸的Gamborg′s基部生長(zhǎng)B5溶液。用磷酸將pH調(diào)節(jié)至5.7。將懸浮液中的圓片在25℃無菌條件下用100rpm的轉(zhuǎn)動(dòng)搖床以12小時(shí)周期保持10天。然后將圓片取出，在30℃下懸掛在無菌罩中干燥2小時(shí)。每圓片體積中平均裝有0.3g濕細(xì)胞團(tuán)。將用金屬線相連的1000個(gè)圓片放入10L PyrexTM圓柱形玻璃生物反應(yīng)器中(直徑15mm，高57mm)。保持反應(yīng)器于垂直位置并從其底部入口用30℃干燥氣體(流量＝0.8升/分鐘)處理1小時(shí)，然后用5升/分鐘的飽和氣流處理80min，其中通過使氣流在75℃鼓泡通過CH3SiH(OEt)2和Si(OEt)4體積比為30/70的混合物得到上述飽和氣流。其中每2分鐘從底部入口進(jìn)氣改成從上部蓋進(jìn)氣，從而起到聯(lián)系上下側(cè)與氣流進(jìn)出的四路開關(guān)作用。然后立即用上述培養(yǎng)基填充該反應(yīng)器，30分鐘后改變上述培養(yǎng)基。通過MTT(Mossman T.J.Immunol，Methods 6555(1983))測(cè)定保留細(xì)胞存活率，固定化前測(cè)得的存活率為92％。
圖2的顯微照片詳細(xì)說明了在聚氨酯支架材料上用硅質(zhì)層固定的細(xì)胞。
通過圍繞反應(yīng)器的護(hù)套中恒溫水的循環(huán)保持溫度為23℃。通過排量為5L/hr的外部蠕動(dòng)泵提供介質(zhì)的循環(huán)。使液體通過4個(gè)液/液萃取器；優(yōu)選的萃取劑為氯代溶劑。底部入口區(qū)裝配有能提供10L/hr氣流的氣體擴(kuò)散器。氣體被運(yùn)送到頂部蓋并通過鼓泡進(jìn)入pH＝7.2的磷酸緩沖液進(jìn)行洗滌。在用于液體萃取的氯代溶劑中以及用于洗滌排放氣體的水溶液中觀察到lignanic類藥物的產(chǎn)生。通過用丁醇-乙酸乙酯萃取回收lignanic類產(chǎn)品，并用交聯(lián)葡聚糖色譜法和溶劑氯仿/甲醇體積比為9/1的HPLC(Jasco Model PU 1580)進(jìn)行分離。總產(chǎn)量為每天160mg。通過FAB質(zhì)譜進(jìn)行l(wèi)ignanic類產(chǎn)品的鑒定。所鑒定產(chǎn)品的主要成分為鬼臼脂素、山荷葉素和爵床定甲，其占總量的80％。將上述反應(yīng)器連續(xù)生產(chǎn)20周且每5天添加蔗糖以保持濃度為3％(w/v)。硅質(zhì)層固化16周后出現(xiàn)細(xì)胞死亡，20周后全部死亡。
實(shí)施例3由不同的烷氧化硅混合物所得硅質(zhì)層的分子阻斷a)在沉積于直徑為6cm的皮氏培養(yǎng)皿中的膠原蛋白層中培養(yǎng)Hep-G2細(xì)胞。通過于37℃加熱0.1％(w/v)的膠原蛋白溶液得到膠原蛋白基質(zhì)。培養(yǎng)基是添加有10％胎牛血清的Dulbecco氏改性Eagle培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞匯合成單層形態(tài)時(shí)，在細(xì)胞上涂覆50μm 0.1％(w/v)的膠原蛋白溶液層。固結(jié)后，通過臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞存活率為96％。將樣品用培養(yǎng)基處理后在含95％空氣和5％CO2的潮濕氣體中于37℃下儲(chǔ)存24小時(shí)。去掉培養(yǎng)基后將8個(gè)皮氏培養(yǎng)皿安裝在直徑70mm，高25mm的PyrexTM玻璃圓筒中。金屬框使培養(yǎng)皿之間相距1.5cm。根據(jù)實(shí)施例1進(jìn)行硅質(zhì)層沉積(圓筒中溫度＝30℃，暴露時(shí)間＝8分鐘，8個(gè)皮氏培養(yǎng)皿)。反應(yīng)之后，立即將樣品用特定培養(yǎng)基覆蓋，該培養(yǎng)基在3小時(shí)候被替換。Tiazolyl blue MTT檢測(cè)表明細(xì)胞存活率為95％。硅質(zhì)層涂覆18小時(shí)后，通過與50mM pH＝8.0的Tris-HCl(購自Sigma)，0.02％(w/v)NaN3和1μg/mL抑酶肽(購自Sigma)的溶液反應(yīng)，生物質(zhì)發(fā)生溶胞。24小時(shí)后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離法(Sambrook J.et al.“Molecular Cloninga laboratory manual”ColdSpring Harbour Laboratory Press 1989)分析上述溶液。將樣品于100℃下在1x SDS凝膠加樣緩沖液(50mM Tris-HCl，pH＝6.8，100mM二硫蘇糖醇，2％w/v SDS，0.1％(w/v)溴酚藍(lán)，10％(w/v)丙三醇)中變性3分鐘。層析試驗(yàn)是在180V下運(yùn)行的小型PROTEAN II設(shè)備Biorad(25mM Tris，250 mM甘氨酸，0.1％(w/v)SDS，pH＝8.3作為流動(dòng)相)上進(jìn)行45分鐘。接著將凝膠用50％(v/v)甲醇和12％(v/v)乙酸培養(yǎng)30分鐘，然后用10％(v/v)乙醇加5％v/v乙酸溶液洗滌三次，共5分鐘，接著用3.4mM鉻酸鉀和3.2mM硝酸溶液培養(yǎng)后再用二重蒸餾水洗滌三次。將樣品用12mM硝酸鹽溶液培養(yǎng)30分鐘。用0.28M Na2CO3和0.02％(w/v)甲醛溶液處理并用1％(v/v)醋酸溶液定影顯影蛋白質(zhì)帶。對(duì)于圖3，蛋白質(zhì)分布表示成涂覆有硅質(zhì)層并發(fā)生溶胞的5個(gè)樣品與沒有涂覆硅質(zhì)層但發(fā)生相似溶胞的2個(gè)對(duì)照樣品(C1，C2)的分子量函數(shù)。由覆層樣品得到的編號(hào)為T1至T5的蛋白質(zhì)分布表明沒有分子量高于90,000Da的痕量蛋白質(zhì)。
b)重復(fù)實(shí)施例3a的相同步驟，在硅質(zhì)層沉積時(shí)使用0.4升/分鐘的飽和氣流，其中通過使氣流在80℃下鼓泡通過CH3SiH(OEt)2/CH3Si(OEt)3/Si(OEt)4體積比為10/20/70的混合物得到上述飽和氣流。由溶胞后的涂層樣品得到的蛋白質(zhì)分布表明沒有分子量高于150,000Da的蛋白質(zhì)。
c)重復(fù)實(shí)施例3a的相同步驟，其中通過使氣流在75℃下鼓泡通過CH3SiH(OEt)2/CH3Si(OEt)3/Si(OEt)4體積比為20/20/60的混合物得到所述飽和氣流。由溶胞后的涂層樣品得到的蛋白質(zhì)分布表明沒有分子量高于10,000Da的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例4在1％瓊脂中用硅質(zhì)層固定的多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的活性原種多粘芽孢桿菌購自ATCC。在50mL由酵母提取物/酪蛋白/葡萄糖/蔗糖/NaCl/MgSO4＝2.5/2.5/8/2/1/0.5克/升的溶液構(gòu)成的培養(yǎng)基中接種部分上述菌種。懸浮液中被緩沖到pH＝7.3，然后補(bǔ)加1mLCaCl22H2O/FeSO47H2O/ZnSO4.7H2O/CuSO45H2O/MnSO44H2O＝1/1/1/0.5/4克/升的溶液。將懸浮液在27℃儲(chǔ)存3天。將上述5mL懸浮液用濃度為2.5/2.5/18/2/1/0.5克/升的上述化合物構(gòu)成的介質(zhì)稀釋，并補(bǔ)加胰化蛋白胨(2克/升)和硫酸銨(1克/升)，然后緩沖到pH＝7.3。將由此得到的懸浮液在攪拌下于27℃下儲(chǔ)存5天。向上述懸浮液中加入瓊脂至其濃度最高為1％(w/v)。將30L的懸浮液傾入到填充有5000個(gè)直徑為35mm，高10mm的玻璃棉圓片的直徑為20cm，高100cm的不銹鋼圓筒中，所述玻璃棉來自于密度為0.2克/毫升的織物。將上述圓片隨意放置在圓筒內(nèi)。將懸浮液放置30分鐘，然后從圓筒中噴出。將圓筒置于外殼中并使容器在5rpm的轉(zhuǎn)速下處于水平位置。將圓片用實(shí)施例2所述的烷氧化硅氣流處理6小時(shí)。用上述培養(yǎng)基填充到處于垂直方向的容器中。通過檢測(cè)8星期內(nèi)的葡萄糖的消耗量來測(cè)定生物質(zhì)的存活率。每天葡萄糖的消耗量為1.3克/升。通過每?jī)商焯砑悠咸烟潜３制咸烟堑脑紳舛葹?8克/升。
使用相同方法固定枯草芽孢桿菌。在上述兩種情況下，通過顯微鏡觀察揭示了在溶液中完全沒有微生物釋放。收集培養(yǎng)基的樣品以分別檢測(cè)多粘菌素和桿菌肽的濃度。通過多粘菌素敏感原種大腸桿菌(Escherichia coli)和桿菌肽敏感生物金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抗菌譜測(cè)定抗菌活性。用鹽水稀釋原始樣品以檢測(cè)在8周內(nèi)多粘菌素和桿菌肽的發(fā)展趨勢(shì)。
實(shí)施例5測(cè)定膠原蛋白上的0.1μm厚硅質(zhì)層的臨界剪切應(yīng)力通過流體機(jī)械實(shí)驗(yàn)測(cè)定膠原蛋白上的硅質(zhì)層的臨界剪切應(yīng)力。將120cm長(zhǎng)，8cm寬，2cm高的玻璃管與給水泵連接。從5升/分鐘的最小流量開始將水輸送到水平放置的玻璃管中。將由0.1％(w/v)溶液固結(jié)得到的0.1mm厚的膠原蛋白層沉積在管的基部，然后使水流增加至沖掉所述層。由相應(yīng)的臨界水流得到膠原蛋白的臨界剪切應(yīng)力為0.5Pa。根據(jù)實(shí)施例2所述方法處理3分鐘，將硅質(zhì)層沉積在膠原蛋白上后進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果臨界剪切應(yīng)力為15Pa。
實(shí)施例6含Jurkat細(xì)胞的海藻酸鹽微球的硅質(zhì)層涂層通過常規(guī)的氣體噴射擠出法(Lim F.and Sun A.M.Science，210908(1980))制造(含1×107細(xì)胞/毫升；～2,400細(xì)胞/微球)海藻酸鹽微球。將含有人淋巴細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞的海藻酸鹽溶液(1.5％w/v藻酸鈉在0.9％的NaCl溶液中)加入到無菌注射器管中并通過均勻驅(qū)動(dòng)推進(jìn)設(shè)備來操縱活塞。使無菌注射針(內(nèi)徑0.3mm，外徑0.5mm)與注射器連接并共軸置于氣體噴射擠出噴嘴(直徑0.65mm)中。在80℃下使氣流以0.4升/分鐘至0.8升/分鐘鼓入CH3SiH(OEt)2和Si(OEt)4(體積為25/75)的溶液中。
使上述有機(jī)硅烷飽和氣流進(jìn)入氣體噴射擠出噴嘴，以提供硅質(zhì)涂層并使硅酸鹽液滴從針尖滴下。微球直徑為0.2mm至0.8mm，這取決于上述氣流。將滴入到100mM氯化鈣溶液中的微球在該溶液中保持5分鐘，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI 1640)中。通過MTT試驗(yàn)測(cè)試細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示存活率超過80％。用佛波醇酯刺激裝入膠囊內(nèi)的Jurkat細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素2(IL-2)，其中白細(xì)胞介素2(IL-2)是分子量為15,000Da的淋巴因子。刺激24小時(shí)后，用人IL-2 ELISA檢測(cè)試劑盒(Sigma Chemical Company，Saint Louise，Missouri，USA，I-8273)檢測(cè)培養(yǎng)基周圍的IL-2水平(226pg/mL)。通過微球在軟化水中的滲透溶胞證明硅質(zhì)層的存在。
鈣離子的稀釋導(dǎo)致海藻酸鹽微球的破裂，從而使游離細(xì)胞釋放在溶液中(圖4B)。參照?qǐng)D4D，在用硅質(zhì)層涂覆微球的情況下，可以觀察到硅質(zhì)層的殘留部分和游離細(xì)胞。
實(shí)施例7涂覆有硅質(zhì)層的胰島按照標(biāo)準(zhǔn)方法從外科手術(shù)分離得到的Lewis大鼠胰腺中得到胰島。將200/300個(gè)胰島沉積在懸掛于1.5mL Swining過濾漏斗上的200目篩網(wǎng)上，并在80℃下通以0.1升/分鐘的CH3SiH(OEt)2和Si(OEt)4(體積比25/75的混合物)飽和氣流15秒鐘。
將胰島轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)中并在37℃下在5％CO2氣氛中培養(yǎng)24小時(shí)。在體外用帶有Hank′s平衡鹽溶液(HBSS，0.5毫升/分鐘)的灌注室測(cè)試胰島并進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)(在20Mm HBSS中由組分4至組分10，圖5中的實(shí)線條)以檢測(cè)胰島素的分泌。每2分鐘收集小份并通過ELISA裝置中的大鼠特異胰島素抗體試劑盒來檢測(cè)每一小份中胰島素的含量。覆層胰島的胰島素釋放趨勢(shì)與對(duì)照胰島相同(參見圖5)。根據(jù)文獻(xiàn)方法(Wang T.et al.Nature Biotechnology 15358(1997))進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)。
使用源自Lewis大鼠(重240g)的胰島，包括對(duì)照胰島及用本實(shí)施例前述的硅質(zhì)層涂覆的胰島，進(jìn)行雄性Sprague-Dawley大鼠(重280g)異源外科手術(shù)移植，其中通過對(duì)雄性Sprague-Dawley大鼠腹膜腔內(nèi)施加鏈脲菌素(6mg/100g)產(chǎn)生穩(wěn)定的糖尿病(血糖超過300mg/100mL)。在無菌手術(shù)室中通過氟烷麻醉對(duì)供體和受體大鼠進(jìn)行手術(shù)。將每只大鼠為約600個(gè)胰島移植入腎和腎上腺之間。手術(shù)后的護(hù)理包括注射胰島素以使大鼠和移植的胰島從手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)中恢復(fù)過來。為檢測(cè)血糖水平，在手術(shù)之前以及在術(shù)后前兩周每隔3至4天，兩周后每星期一次從對(duì)照和移植大鼠的尾部采集血樣(100μL)。如圖6所示，移植有未覆層胰島的對(duì)照動(dòng)物組(n＝6)在術(shù)后15天恢復(fù)到糖尿病的血糖水平(300mg/100mL)，而移植有用硅質(zhì)層涂覆胰島的動(dòng)物(n＝6)至移植后43天血糖量仍正常。
實(shí)施例8硅質(zhì)層的生物相容性a)體外生物相容性(i)補(bǔ)體激活。按照實(shí)施例3a所述步驟在皮氏培養(yǎng)皿中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。將0.5ml的無補(bǔ)體或用酵母聚糖活化的人血漿沉積在膠原蛋白層上。將樣品在37℃儲(chǔ)存30分鐘(Fushimi F.，NakayamaM.，Nishimura K.，Hiyoshi T.Artificial organs 22(10)821-826(1998))。通過溶液的ELISA分析檢測(cè)C5a水平測(cè)量用酵母聚糖處理的樣品，將其水平認(rèn)為是100％。在根據(jù)實(shí)施例3a(暴露時(shí)間6分鐘，6個(gè)皮氏培養(yǎng)皿)制備的涂有硅質(zhì)層的膠原蛋白中對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。C5a補(bǔ)體濃度為酵母聚糖處理樣品的5％。
(ii)激肽釋放酶活性。根據(jù)實(shí)施例3a所述步驟在皮氏培養(yǎng)皿中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。將0.5mL牛血漿溶液(含檸檬酸鹽并用60mLTris-HCl稀釋3至5倍)沉積在膠原蛋白層上。將樣品在4℃儲(chǔ)存60分鐘。用z-鐵-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素處理上清液，從而能夠檢測(cè)到由因子XII引起的從前激肽釋放酶到激肽釋放酶的轉(zhuǎn)換(Fushimi F.，Nakayama M.，Nishimura K.，Hiyoshi T.Artificial organs22(10)821-826(1998))。將上述分析得到的激肽釋放酶水平認(rèn)為是100％。在根據(jù)實(shí)施例8a(i)制備的涂有硅質(zhì)層的膠原蛋白中對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。激肽釋放酶水平是未覆層樣品的3％。
(iii)血小板粘附。根據(jù)實(shí)施例8a(i)(Fushimi F.，NakayamaM.，Nishimura K.，Hiyoshi T.Artificial organs 22(10)821-826(1998))進(jìn)行血小板在沉積于膠原蛋白基質(zhì)上的硅質(zhì)層上的粘附實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明了由于硅質(zhì)層血小板完全沒有活化。
(iv)紅細(xì)胞的溶血作用。根據(jù)已報(bào)道方法(Drabkin D.L.，AustinJ.H.J.Biol.Chem.98719(1932))，通過測(cè)量所保存血液樣品中血紅蛋白的分光光度濃度(λ＝540nm)來評(píng)價(jià)可能由于與硅質(zhì)層接觸或硅質(zhì)層釋放出有毒物質(zhì)所引起的紅細(xì)胞溶解，其中所述血液樣品與根據(jù)實(shí)施例8沉積在膠原蛋白基質(zhì)上的硅質(zhì)層接觸。在37℃3小時(shí)后沒有觀察到任何溶胞。
b)體內(nèi)的生物相容性通過在大鼠的后腿肌肉中注射硅處理的和標(biāo)準(zhǔn)的涂覆膠原蛋白的右旋糖苷微球(Cytodex，Pharmacia，直徑約100μm)評(píng)價(jià)體內(nèi)的生物相容性。
將各組微球放于220目不銹鋼篩網(wǎng)上，所述篩網(wǎng)在30mL圓柱形聚四氟乙烯反應(yīng)室內(nèi)且反應(yīng)室在篩網(wǎng)的相對(duì)兩側(cè)各有入口和出口。微球用實(shí)施例2所述飽和氣流處理30分鐘。然后收集處理后的微球并放入3mL無菌細(xì)胞培養(yǎng)基中，通過離心作用(200Xg 5分鐘)濃縮。將上述處理過的和對(duì)照微球再次懸浮于無菌磷酸鹽緩沖液(Ph＝7.4)中，濃度為6百萬微球/每毫升緩沖液。用無菌注射器在3組大鼠中注射50μL硅處理微球懸浮液，與上相似，用未處理微球注射三組大鼠作為對(duì)照，其中每組大鼠均為5只。在手術(shù)期間將全部大鼠麻醉。然后將大鼠處死進(jìn)行實(shí)地觀察并在注射后2周，4周和12周采集其組織。在微球注射和處死期間所有組均沒有出現(xiàn)發(fā)炎，疼痛或功能喪失的跡象。在試驗(yàn)?zāi)┢?，用過量麻醉劑將大鼠處死并采集其后腿肌肉作顯微鏡檢查和組織學(xué)分析。在所有動(dòng)物組的注射部位均沒有肉眼可見的感染，發(fā)炎，流血或纖維化跡象。隨后將5μm厚的組織切片經(jīng)Geimsa染色后肉眼觀察肌肉組織形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管在對(duì)照動(dòng)物中對(duì)照的未覆層微球周圍的組織中有纖維化反應(yīng)的痕跡，但在治療動(dòng)物組的注射部位沒有任何浮腫，蛋白質(zhì)溢出，白細(xì)胞滲透和纖維化疤痕組織形成的跡象。
權(quán)利要求
1.一種能夠固定生物質(zhì)且能夠選擇性阻斷分子量大于所選閾值的大分子的硅質(zhì)層的制備方法，該方法包括以下步驟a)提供被選自(1)Si(OR)4、(2)SiH(OR)3、(3)R′Si(OR)3和(4)R′SiH(OR)2的烷氧化硅混合物飽和的載氣氣流，其中R和R′相同或不同，分別為烷基和/或芳基，其中所述氣流通過將載氣在20至180℃的溫度下，優(yōu)選在20至100℃的溫度下鼓入混合比為(1)40-85/(2)0-60/(3)0-60/(4)0-60(％v/v)的上述烷氧化物的液體混合物制備，和b)將包含生物質(zhì)的支持體暴露于步驟a)的氣流下，其中上述所選分子量閾值選自10,000道爾頓到150,000道爾頓的范圍內(nèi)，且選擇步驟a)中硅衍生物(1)、(2)、(3)和(4)的比值作為待阻斷大分子的分子量的函數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中R是乙基或甲基，R′是甲基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中選擇步驟a)中硅衍生物(1)、(2)、(3)和(4)的比值以阻斷分子量大于10,000道爾頓的大分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中選擇步驟a)中硅衍生物(1)、(2)、(3)和(4)的比值以阻斷分子量大于70,000道爾頓的大分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中選擇步驟a)中硅衍生物(1)、(2)、(3)和(4)的比值以阻斷分子量大于90,000道爾頓的大分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中選擇步驟a)中硅衍生物(1)、(2)、(3)和(4)的比值以阻斷分子量大于150,000道爾頓的大分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2和6中任一項(xiàng)的方法，其中步驟a)中R′Si(OR)3衍生物的含量最高為約10％v/v，并將其加入以替代相同量的Si(OR)4。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中步驟a)中的硅衍生物是比值為65-79％/20-25％/1-10％v/v的Si(OR)4/R′SiH(OR)2/R′Si(OR)3。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中步驟a)中R′Si(OR)3衍生物的含量為約10％v/v到約20％v/v，并將其加入以替代相同量的Si(OR)4。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中步驟a)的硅衍生物是比值為53-70％/15-25％/10-22％v/v的Si(OR)4/R′SiH(OR)2/R′Si(OR)3。
11.根據(jù)權(quán)利要求1、2和5中任一項(xiàng)的方法，其中R′Si(OR)3衍生物的含量為0％。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法，其中對(duì)應(yīng)于每平方厘米暴露表面為1至100mL的總氣體，步驟a)的總氣體流量在暴露期間為0.05到10升/分鐘。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)的支持體是粘附于支架材料上的基質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)的支持體是優(yōu)選具有0.05至1.0mm直徑的微球形基質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中微球形基質(zhì)沒有支架材料。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)的支持體為無基質(zhì)的支架材料，并且生物質(zhì)被直接承載于所述支架材料上。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法，其中硅質(zhì)層厚度為0.01至10μm，優(yōu)選為0.05至0.3μm。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的方法，其中硅質(zhì)層具有高于10Pa的臨界剪切稀化應(yīng)力，優(yōu)選具有12至20Pa的剪切稀化應(yīng)力。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的方法，其中所述載氣為空氣。
20.一種生物反應(yīng)器，其包括通過由上述權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的方法獲得的硅質(zhì)層固定的生物質(zhì)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的生物反應(yīng)器，其中生物反應(yīng)器是人造器官或組織，或細(xì)胞聚集體，所述細(xì)胞聚集體也可是基因修飾的。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21的可移植生物反應(yīng)器，其中所述支持體是微球形基質(zhì)。
23.權(quán)利要求22的生物反應(yīng)器在制備用于執(zhí)行生物類型功能的可注射藥物組合物中的應(yīng)用。
24.一種可注射藥物組合物，其包括有效量的懸浮于生理溶液中的權(quán)利要求22的生物反應(yīng)器。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的可注射藥物組合物，其中微球的直徑為0.05至1.0mm。
26.根據(jù)權(quán)利要求24和26的可注射藥物組合物，其中微球的量為每毫升生理溶液含100至50,000個(gè)微球。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用固定化活生物材料的生物反應(yīng)器的制備方法，和涉及生物反應(yīng)器本身。具體來說，本發(fā)明涉及一種制備硅質(zhì)層的方法，所述硅質(zhì)層能夠固定生物質(zhì)且能夠選擇性阻斷分子量大于所選閾值的大分子。
文檔編號(hào)C12M1/42GK1615358SQ02827193
公開日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2002年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月18日
發(fā)明者詹尼·卡爾圖蘭, 羅伯托·達(dá)爾托索, 倫佐·達(dá)爾蒙特 申請(qǐng)人:希爾生物技術(shù)迪埃股份有限公司