專利名稱：組織改造雌性生殖器官的建造的制作方法
優(yōu)先權(quán)本發(fā)明要求2001年11月16日提交的名稱為組織改造雌性生殖器官的建造的美國臨時(shí)申請(qǐng)第60/331,503號(hào)的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域?yàn)榻M織工程，具體而言，為組織改造雌性生殖器官的構(gòu)造。本發(fā)明特別用于構(gòu)造組織改造的陰道、輸卵管、子宮、和子宮頸。
現(xiàn)有的多種病理性疾病都會(huì)影響外生殖器并要求進(jìn)行廣泛性外科手術(shù)干預(yù)(Hendren，H.W.(1998).泄殖腔畸形“Campbell’sUrology”7th ed.，Saunders，Philadelphia，1991-2001)。雄性生殖器重構(gòu)利用組織工程學(xué)獲得了最多目前報(bào)道的長期臨床成功以及對(duì)尿道重構(gòu)的確實(shí)適合性(Atala等，J.Urol.1621148-1151(1999)；Chen等，World J.Urol.18(1)67-70(2000))。當(dāng)然，其它疾病，像泄殖腔畸形和外翻可導(dǎo)致雄性和雌性的嚴(yán)重生殖器模糊。然而，缺乏有關(guān)雌性生殖器和陰道重構(gòu)的信息。
對(duì)于婦科患者而言，陰道、子宮頸、和子宮的先天性畸形具有很深刻的暗示。這些異常時(shí)常在青春期被檢測出來。為了進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，醫(yī)生需要徹底了解正常的胚胎學(xué)和性分化。雖然臨床經(jīng)驗(yàn)可幫助婦科醫(yī)生了解復(fù)雜的解剖學(xué)構(gòu)型，但是必需對(duì)有缺陷的每位個(gè)體進(jìn)行徹底評(píng)估，因?yàn)樯车阑儾⒎潜囟ㄗ裱魏我?guī)定和一致的模式。雌性生殖異常的例子包括模糊不清的生殖器、陰道和子宮閉鎖、梗阻性流出道疾病、子宮頸閉鎖、泌尿生殖竇痰病、和雄性化痰病(Edmonds，D.K.，Obstet Gynecol Clin North Am 27(1)49-62(2000))。生殖器畸形尤其會(huì)妨害患者和她的家庭，這是因?yàn)樗麄儾粌H具有生殖疾病，而且還具有嚴(yán)重的心理和性問題，這種問題不僅需要解決，而且要以敏感且鼓勵(lì)性的方式解決。更深一層的討論可在教科書中找到(Rock JA“苗勒氏管異常的外科手術(shù)”Te Linde’s OperativeGynecology(第8版)，由J Rock，J.Thompson.Philadelphia，Lippincott-Raven編輯，1997；Edmonds DK“性發(fā)育異常和它們的構(gòu)造上和下道”Pediatric and Adolescent Gynecology，由JSanfilippo，D Muram，P Lee，J Dewhurst.Philadelphia，W.B.Saunders編輯，1994；Jones HW Jr“先天性子宮陰道異常的構(gòu)造”Female Reproductive Surgery，由J Rock，A Murphy，HW Jones Jr.Baltimore，Williams&Wilkins編輯，1992)。
先天和后天的子宮畸形，如發(fā)育不全或再生障礙性子宮異常、癌癥、創(chuàng)傷、和嚴(yán)重的炎性疾病，占雌性不孕癥的較大比例。但用于子宮重構(gòu)的選擇有限。如果使用子宮外組織進(jìn)行重構(gòu)，則無法懷孕。已經(jīng)實(shí)驗(yàn)過使用合成生物材料進(jìn)行子宮組織替換，然而這些嘗試沒有成功，這很可能是由于子宮的復(fù)雜生理和功能特性(Jonkman等，ArtifOrgans，10475-80，1986))。
先天性雌性生殖器異常和泄殖腔畸形，如icornuate/中隔子宮、雙子宮、子宮頸和陰道閉鎖、梗阻性生殖道，可能還需要廣泛的外科手術(shù)構(gòu)造。經(jīng)常需要進(jìn)行外科手術(shù)是由于可獲得的天然組織量有限。目前，非-生殖道組織已經(jīng)用于陰道重構(gòu)，盡管存在很多相關(guān)并發(fā)癥。這些治療包括建造乙狀陰道的腹膜后sacropexy的經(jīng)腹方法，例如，在患有Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser綜合癥的患者中。然而，這些構(gòu)造有脫垂傾向，導(dǎo)致陰道“脫落”感、疼痛、白帶和性交困難，并需要進(jìn)行修復(fù)。其他患者，例如，陰道和子宮頸發(fā)育不全，但仍然具有功能性子宮內(nèi)膜的患者通常是通過進(jìn)行傳統(tǒng)的子宮切除，隨后構(gòu)造新陰道而治療的。這就需要陰道皮膚的移植，這種移植可能會(huì)愈合不好，并可能導(dǎo)致月經(jīng)失調(diào)。
目前，雌性生殖器官重構(gòu)所用的各種方法都使用的是非同源性組織來源。然而，非同源性組織用于雌性器官重構(gòu)的應(yīng)用與有限的功能性有關(guān)。因此，本領(lǐng)域仍然需要通過改造雌性生殖和生殖器組織來解決這些問題。
因此，仍然存在生產(chǎn)雌性生殖器官的需要，例如使用自體細(xì)胞生產(chǎn)生殖道的器官和組織。
發(fā)明概述本發(fā)明提供使用組織改造雌性生殖器官改善雌性生殖道先天性畸形和疾病的組合物及方法。這些組織改造雌性生殖器官可通過培養(yǎng)源于生殖道組織的細(xì)胞，如陰道上皮細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞、子宮頸上皮細(xì)胞、子宮上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞群體而產(chǎn)生。將培養(yǎng)細(xì)胞灌注在生物相容性性基質(zhì)上或生物相容性基質(zhì)中。本發(fā)明的方法可用于重構(gòu)雌性生殖器官，包括但不限制于，子宮頸、子宮、陰道、和輸卵管。
使用雌性生殖細(xì)胞，例如，子宮上皮細(xì)胞、陰道上皮細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞、和平滑肌細(xì)胞，例如子宮肌細(xì)胞的群體灌注生物相容性性基質(zhì)，之后它們發(fā)育成各自的生殖道組織層。因此，一方面，本發(fā)明提供一種重構(gòu)人造雌性生殖器官構(gòu)造的方法，即把培養(yǎng)的雌性生殖細(xì)胞的第一群體灌注到生物相容性基質(zhì)的一側(cè)中，這樣培養(yǎng)的雌性生殖細(xì)胞就可與生物相容性基質(zhì)粘附；然后培養(yǎng)生物相容性性基質(zhì)中的培養(yǎng)的雌性生殖細(xì)胞，直到培養(yǎng)的雌性生殖細(xì)胞產(chǎn)生第一雌性生殖組織層；將與培養(yǎng)的雌性生殖細(xì)胞第一群體不同的培養(yǎng)的雌性生殖細(xì)胞第二群體灌注到生物相容性性基質(zhì)的另一側(cè)，從而使培養(yǎng)的雌性生殖細(xì)胞第二群體與生物相容性性基質(zhì)粘附；并培養(yǎng)生物相容性基質(zhì)中的培養(yǎng)的雌性生殖細(xì)胞的第二群體，直到培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞產(chǎn)生不同于第一生殖組織層的第二雌性生殖組織層，由此建造雌性生殖器官構(gòu)造。
所述人造雌性生殖器官構(gòu)造還可通過在生物相容性性基質(zhì)同一側(cè)上培養(yǎng)生殖道細(xì)胞的第一和第二群體而建造。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雌性生殖器官構(gòu)造可通過使用雌性生殖細(xì)胞的一個(gè)群體，例如陰道上皮細(xì)胞建造。在另一實(shí)施方案中，所述雌性生殖器官構(gòu)造可通過使用雌性生殖細(xì)胞的至少2個(gè)不同群體，例如陰道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞而建造。在其它實(shí)施方案中，所述雌性生殖器官構(gòu)造可通過使用雌性生殖細(xì)胞的任何數(shù)目的不同群體，例如3個(gè)不同群體或更多群體而建造。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括這樣一種雌性生殖器官構(gòu)造，它是從雌性生殖細(xì)胞的至少一個(gè)群體和并非來源于雌性生殖細(xì)胞的另一群體，例如，來源于膀胱的平滑肌細(xì)胞而建造的。
另一方面，本發(fā)明提供一種重構(gòu)人造子宮構(gòu)造的方法，即把培養(yǎng)的子宮上皮細(xì)胞群體灌注到生物相容性性基質(zhì)的一側(cè)，這樣子宮上皮細(xì)胞與生物相容性基質(zhì)粘附；培養(yǎng)生物相容性基質(zhì)中的子宮上皮細(xì)胞，直到上皮細(xì)胞產(chǎn)生子宮上皮組織層，例如，子宮內(nèi)膜；將培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞，例如子宮肌細(xì)胞群體灌注到生物相容性基質(zhì)的另一側(cè)，這樣子宮肌細(xì)胞與生物相容性基質(zhì)粘附；并培養(yǎng)生物相容性基質(zhì)中的子宮肌細(xì)胞，直到子宮肌細(xì)胞產(chǎn)生子宮肌肉組織層，由此建造人造子宮。在另一實(shí)施方案中，人造子宮可通過將細(xì)胞接種在生物相容性基質(zhì)兩側(cè)上而建造。在另一實(shí)施方案中，人造子宮可通過鋪層培養(yǎng)細(xì)胞層而建造，例如，可將子宮上皮細(xì)胞接種在生物相容性基質(zhì)兩側(cè)上，然后接種平滑肌細(xì)胞，例如子宮肌細(xì)胞。另一實(shí)施方案中，可將子宮上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞同時(shí)接種在生物相容性基質(zhì)上。
另一方面，本發(fā)明提供一種重構(gòu)人造陰道構(gòu)造的方法，即把培養(yǎng)的陰道上皮細(xì)胞群體灌注到可生物降解基質(zhì)的一側(cè)，這樣陰道上皮細(xì)胞與生物相容性基質(zhì)粘附；培養(yǎng)生物相容性基質(zhì)中的陰道上皮細(xì)胞，直到陰道上皮細(xì)胞產(chǎn)生陰道上皮組織層；把培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞群體灌注到生物相容性基質(zhì)的另一側(cè)，這樣平滑肌細(xì)胞與生物相容性基質(zhì)粘附；培養(yǎng)生物相容性基質(zhì)中的平滑肌細(xì)胞，直到平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生平滑肌組織層，由此建造人造陰道。在另一實(shí)施方案中，人造陰道可通過在生物相容性基質(zhì)兩側(cè)接種細(xì)胞而建造。在另一實(shí)施方案中，人造陰道可通過鋪層培養(yǎng)細(xì)胞層而建造，例如將陰道上皮細(xì)胞接種在生物相容性基質(zhì)的兩側(cè)，然后接種平滑肌細(xì)胞。在另一實(shí)施方案，可將陰道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞同時(shí)接種在生物相容性基質(zhì)上。
生物相容性基質(zhì)可由不可降解或可降解的物質(zhì)組成。生物相容性基質(zhì)可形成三維支架。生物相容性基質(zhì)還可由去細(xì)胞化的(decellularized)器官物質(zhì)組成。當(dāng)在生物相容性基質(zhì)中生長時(shí)，增殖細(xì)胞成熟并適當(dāng)分離形成與在體內(nèi)找到的相應(yīng)物類似的組織。在其它實(shí)施方案中，雌性生殖系統(tǒng)的一部分可用人造雌性生殖器官代替。
另一方面，本發(fā)明提供一種通過植入人造雌性生殖器官而治療患有生殖疾病患者的方法，所述人造雌性生殖器官是如下形成的將培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞第一群體灌注到生物相容性基質(zhì)的一側(cè)，這樣培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞與生物相容性基質(zhì)粘附；培養(yǎng)生物相容性基質(zhì)中的培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞，直到培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞產(chǎn)生第一雌性生殖組織層；將與培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞第一群體不同的培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞的第二群體灌注到生物相容性基質(zhì)的另一側(cè)，這樣培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞第二群體與生物相容性基質(zhì)粘附；并培養(yǎng)生物相容性基質(zhì)中的培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞的第二群體，直到培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞產(chǎn)生不同于第一生殖組織層的第二雌性生殖組織層；并監(jiān)測生殖器官疾病患者是否適應(yīng)。所述人造雌性生殖器官或組織結(jié)構(gòu)顯示出天然雌性生殖器官的順應(yīng)性和脈管系統(tǒng)。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，所述人造雌性生殖器官是人造陰道。在另一實(shí)施方案中，所述人造雌性生殖器官是人造子宮。在另一實(shí)施方案中，所述人造雌性生殖器官是人造子宮頸。在另一實(shí)施方案中，所述人造雌性生殖器官是輸卵管。
另一方面，本發(fā)明提供一種人造雌性生殖器官，它包括一個(gè)用可生物降解基質(zhì)制成的三維支架，該生物降解基質(zhì)是用培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞的至少一個(gè)群體灌注的，產(chǎn)生至少一層雌性生殖組織層，從而建造雌性生殖器官構(gòu)造。在另一實(shí)施方案中，所述人造雌性生殖器官構(gòu)造含有培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞的至少兩個(gè)不同群體，從而產(chǎn)生至少兩種不同的雌性生殖組織層。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩種不同的雌性生殖組織層是在生物降解基質(zhì)的同一側(cè)上產(chǎn)生的。在另一實(shí)施方案中，兩種不同的雌性生殖組織層是在生物降解基質(zhì)的兩個(gè)不同側(cè)面上產(chǎn)生的。在另一實(shí)施方案中，將第一和第二細(xì)胞群體灌注到分開的基質(zhì)層中或基質(zhì)層上，且將這些基質(zhì)層在灌注后結(jié)合在一起。
另一方面，本發(fā)明提供一種篩選調(diào)節(jié)雌性生殖細(xì)胞的化合物的方法。該方法包括提供一種可植入的生物相容性基質(zhì)，該基質(zhì)已經(jīng)用雌性生殖細(xì)胞群體和平滑肌細(xì)胞群體灌注，這樣雌性生殖細(xì)胞群體與形成具有正常子宮組織順應(yīng)性的組織結(jié)構(gòu)的肌細(xì)胞群體粘附；使人造雌性生殖器官與供試化合物庫接觸；從供試化合物庫選擇可調(diào)節(jié)雌性生殖細(xì)胞的目標(biāo)化合物。所述化合物可以是化學(xué)品或藥物，它可能是細(xì)胞毒性的，治療性的，影響胚胎的植入，或調(diào)節(jié)收縮。
附圖簡述

圖1是表示植入6周后，正常和組織改造(TE)陰道在不同水平電刺激下的激發(fā)電位的曲線圖；圖2A是描述正常子宮組織對(duì)電場刺激的反應(yīng)的曲線圖；圖2B是描述正常子宮組織對(duì)卡巴膽堿(CA)和阿托品(AT)藥物刺激的反應(yīng)的曲線圖2C是描述正常子宮組織對(duì)脫羥腎上腺素(PE)和酚妥拉明(PL)藥物刺激的反應(yīng)的曲線圖；圖2D是描述細(xì)胞接種的子宮植入組織對(duì)電場刺激(100v；1ms)的反應(yīng)的曲線圖；圖2E是描述細(xì)胞接種的子宮植入組織對(duì)卡巴膽堿(CA)和阿托品(AT)藥物刺激的反應(yīng)的曲線圖；圖2F是描述細(xì)胞接種的子宮植入組織對(duì)脫羥腎上腺素(PE)和酚妥拉明(PL)藥物刺激的反應(yīng)的曲線圖；圖3A是表示植入1、3、和6個(gè)月后，子宮細(xì)胞接種構(gòu)造的最大張應(yīng)力的曲線圖；和圖3B是表示植入1、3、和6個(gè)月后，子宮細(xì)胞接種構(gòu)造的最大拉伸應(yīng)變的曲線圖。
詳述本發(fā)明涉及雌性生殖器官或組織結(jié)構(gòu)的重構(gòu)，修復(fù)，增大或替換。本發(fā)明的實(shí)際操作采用組織改造方法，包括細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞擴(kuò)增，在生物基質(zhì)上進(jìn)行細(xì)胞接種，以及用于進(jìn)行組織替換的體內(nèi)構(gòu)造植入。
為了更容易理解本發(fā)明，定義了一些術(shù)語這里所用的術(shù)語“粘附”是指細(xì)胞與三維支架直接粘連，或細(xì)胞自身與其它細(xì)胞粘附。
這里所用的術(shù)語“生物相容性基質(zhì)”、“生物相容性基底”、“聚合物支架”是指適合植入到受治療者中、其上面可沉積細(xì)胞群體的物質(zhì)。一旦植入到受治療者中，生物相容性底物不會(huì)引起毒性或有害作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物相容性基底是表面可被塑造成需要進(jìn)行替換的器官的聚合物。所述聚合物還可被塑造成需要進(jìn)行替換的器官的一部分。在另一實(shí)施方案中，生物相容性基底可以是去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，生物相容性基質(zhì)是一種三維支架，包括生物相容性基質(zhì)，例如聚乙醇酸的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，或通過除去所有細(xì)胞物質(zhì)而使器官去細(xì)胞化后留下的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。這種復(fù)合三維支架可提供使細(xì)胞與它粘附，并在它上面生長的支持構(gòu)架。然后，細(xì)胞的培養(yǎng)的群體在三維支架上生長，其提供細(xì)胞-細(xì)胞相互作用所需的精確間隙距離。如此即可提供一種類似體內(nèi)天然器官的重構(gòu)器官。這種三維支架是用培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞的至少一個(gè)群體灌注的，該群體生長并發(fā)育，從而提供雌性生殖道組織層。在另一實(shí)施方案中，所述生物相容性基質(zhì)是生物可降解的。生物相容性聚合基質(zhì)的非限制性例子可從下列物質(zhì)形成，這些物質(zhì)選自，但不限制于，纖維素醚，纖維素，纖維素酯，氟化聚乙烯，聚-4-甲基戊烯，聚丙烯腈，聚酰胺，聚酰胺酰亞胺，聚丙烯酸酯，聚苯并噁唑，聚碳酸酯，聚氰基芳基醚，聚酯，聚酯碳酸酯，聚醚，聚醚醚酮，聚醚酰亞胺，聚醚酮，聚醚砜，聚乙烯，聚氟代烯烴，聚乙醇酸，聚酰亞胺，聚烯烴，聚噁二唑，聚苯醚，聚苯硫醚，聚丙烯，聚苯乙烯，聚硫化物，聚砜，聚四氟乙烯，聚硫醚，聚三唑，聚氨酯，聚乙烯基化合物，聚偏二氟乙烯，再生纖維素，聚硅氧烷，脲-甲醛聚合物，及其共聚物和物理混合物。所述聚合基質(zhì)可用生物相容性及生物降解的定形物質(zhì)涂覆。在一個(gè)實(shí)施方案中，定形物質(zhì)可以是液體共聚物。在另一實(shí)施方案中，所述共聚物是聚-DL-丙交酯-共-乙交酯。
這里所用的術(shù)語“去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)”是指一種三維生物學(xué)排列(例如，器官，或器官的一部分)，它是通過除去全部細(xì)胞和組織內(nèi)容物，留下復(fù)合基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的方法產(chǎn)生的。器官的專門組織結(jié)構(gòu)是提供與器官有關(guān)的特定功能的實(shí)質(zhì)。器官的支持纖維網(wǎng)是基質(zhì)。絕大多數(shù)器官都具有由支持專門組織的非專門結(jié)締組織構(gòu)成的基質(zhì)構(gòu)架。去細(xì)胞化過程可除去所述的，專門組織留下結(jié)締組織復(fù)合三維網(wǎng)。結(jié)締組織基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)主要由膠原組成。術(shù)語“去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)”包括除去細(xì)胞和組織物質(zhì)的整個(gè)器官。術(shù)語“去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)”還包括已經(jīng)除去細(xì)胞和組織物質(zhì)的器官結(jié)構(gòu)的一部分。去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)提供了一種上面可灌注不同細(xì)胞群體的生物相容性基底。去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)可以是剛性、或半-剛性的，具有改變它們形狀的能力。例如，去細(xì)胞化的子宮能夠使子宮擴(kuò)張，但在生產(chǎn)后即恢復(fù)到它的原始形狀。去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)的例子包括，但不限制于，去細(xì)胞化的子宮、陰道、子宮頸、卵巢、和輸卵管。
這里所用的術(shù)語“雌性生殖器官”和“雌性生殖組織”包括與生殖有關(guān)的所有器官或組織。這些包括但不限于陰道、子宮、卵巢、輸卵管、和子宮頸。
在這里交換使用的術(shù)語“雌性生殖細(xì)胞群體”和“雌性生殖細(xì)胞”是指源于雌性生殖系統(tǒng)任何部位的細(xì)胞。雌性生殖系統(tǒng)包括能夠使雌性產(chǎn)卵(卵細(xì)胞)、性交、營養(yǎng)和受精卵著床直到它完全發(fā)育、并生產(chǎn)的器官。雌性生殖細(xì)胞群體可來源于如陰道、子宮頸、子宮、輸卵管、和卵巢器官。該術(shù)語用于指代細(xì)胞混合物，包括來源于雌性生殖系統(tǒng)的所有細(xì)胞。該術(shù)語還可用于指代來源于雌性生殖系統(tǒng)其中一個(gè)部位的分離的亞群體，例如，只有陰道細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的單一群體。細(xì)胞的分離的亞群體可來源于器官的任何部位，例如子宮內(nèi)膜、子宮肌層、和子宮外膜(見Gray’s解剖學(xué)藥物和手術(shù)的解剖學(xué)基礎(chǔ)，38th ed.Churchill Livingstone Eds.H.Gray，L.H.Bannister，M.Berry，P.L.Williams 1996)。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的亞群體是細(xì)胞的同種亞群體。在一個(gè)實(shí)施方案中，雌性生殖細(xì)胞群體是指基本為陰道、子宮頸、子宮、卵巢、或輸卵管上皮細(xì)胞的細(xì)胞群體。在另一實(shí)施方案中，雌性生殖細(xì)胞群體是指基本為平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞群體，例如子宮肌層。雌性生殖系統(tǒng)細(xì)胞可通過采集受治療者的活組織檢查樣品而得到。雌性生殖系統(tǒng)細(xì)胞可來源于干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、兒童干細(xì)胞、胎兒干細(xì)胞、成人干細(xì)胞、天然細(xì)胞、核移植、及parathenogenesis。細(xì)胞分選技術(shù)可用于將健康細(xì)胞與病態(tài)細(xì)胞分離開來。細(xì)胞分選技術(shù)，例如，F(xiàn)ACS還可用于分離細(xì)胞的亞群體。
這里所用的術(shù)語“陰道上皮細(xì)胞群體”或“陰道上皮細(xì)胞”是指來源于陰道的細(xì)胞或雌性陰道的天然細(xì)胞。陰道上皮細(xì)胞包括子宮內(nèi)膜細(xì)胞。陰道上皮細(xì)胞包括復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞。
這里所用的術(shù)語“子宮上皮細(xì)胞群體”和“子宮上皮細(xì)胞”是指來源于雌性子宮的細(xì)胞或雌性子宮的天然細(xì)胞，包括子宮頸中的所有細(xì)胞。子宮上皮細(xì)胞包括子宮內(nèi)膜細(xì)胞。子宮上皮細(xì)胞包括單層柱狀細(xì)胞，它可以是纖毛和非纖毛柱狀細(xì)胞。
這里所用的術(shù)語“子宮頸上皮細(xì)胞群體”和“子宮頸上皮細(xì)胞”是指來源于雌性子宮頸的細(xì)胞或雌性子宮下部的天然細(xì)胞。子宮頸上皮細(xì)胞包括子宮內(nèi)膜細(xì)胞。子宮頸上皮細(xì)胞包括柱狀細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞。子宮頸上皮細(xì)胞包括纖毛和非纖毛柱狀細(xì)胞。
這里所用的術(shù)語“輸卵管上皮細(xì)胞群體”和“輸卵管上皮細(xì)胞”是指來源于雌性輸卵管的細(xì)胞或雌性輸卵管的天然細(xì)胞。輸卵管上皮細(xì)胞包括子宮內(nèi)膜細(xì)胞。輸卵管上皮細(xì)胞包括柱狀細(xì)胞，它可以是纖毛和非纖毛柱狀細(xì)胞。
在細(xì)胞群體同質(zhì)性范圍內(nèi)，所用術(shù)語“基本上”是指超過50％的細(xì)胞來源于同一細(xì)胞群體，例如，陰道上皮細(xì)胞。優(yōu)選，70％的細(xì)胞來源于同一細(xì)胞群體。更優(yōu)選，85％的細(xì)胞來源于同一細(xì)胞群體，甚至更優(yōu)選超過95％、96％、97％、98％和99％的細(xì)胞來源于同一細(xì)胞群體。
這里所用的術(shù)語“多層”是指包含多層相互層壓的同種培養(yǎng)細(xì)胞群體的排列。產(chǎn)生“多層”的方法包括使一層細(xì)胞群體沉積在表面，例如生物相容性基底上。將沉積的細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到它們發(fā)育并增殖產(chǎn)生具有所需表型和形態(tài)學(xué)的細(xì)胞第一單層。一旦第一單層達(dá)到所需的細(xì)胞密度，同一細(xì)胞群體的第二層在第一單層上沉積。在可供給第二細(xì)胞層和第一單層營養(yǎng)的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二層沉積的細(xì)胞，直到第二層的細(xì)胞發(fā)育并增殖到所需細(xì)胞密度，從而產(chǎn)生具有所需表型和形態(tài)學(xué)細(xì)胞的雙層。同一細(xì)胞群體的第三層沉積在雙層上，在供給雙層和第三層細(xì)胞營養(yǎng)的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)胞，直到第三層的細(xì)胞發(fā)育并增殖到所需密度，產(chǎn)生具有所需表型和形態(tài)學(xué)的三層。重復(fù)該過程，直到產(chǎn)生含有多層同源細(xì)胞群體的多層。多層的特征是它與體內(nèi)器官等價(jià)實(shí)質(zhì)組織的形態(tài)學(xué)和功能特征非常類似。例如，含有平滑肌細(xì)胞群體的多層可能具有陰道或子宮的平滑肌組織，即子宮肌層的功能特征。
這里所用術(shù)語“偶聯(lián)”是指彼此接觸的兩個(gè)不同細(xì)胞群體之間的密切相互作用。這些相互作用包括細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、生長、發(fā)育、和增殖。負(fù)責(zé)組織發(fā)育、修復(fù)和維持的細(xì)胞行為很大程度上是通過細(xì)胞與它們微環(huán)境成分之間的相互作用調(diào)節(jié)的。這些相互作用是由結(jié)合生長因子、酶的細(xì)胞表面分子，和誘導(dǎo)應(yīng)答的其它分子介導(dǎo)的，其導(dǎo)致細(xì)胞表型改變。這些相互作用還可導(dǎo)致新細(xì)胞的產(chǎn)生，其能夠產(chǎn)生具有獨(dú)特的、不同于各不同細(xì)胞群體功能性的細(xì)胞物質(zhì)。
這里所用的術(shù)語“嵌合界面”是指在兩個(gè)不同細(xì)胞群體之間形成的邊界。
這里所用的術(shù)語“間質(zhì)生物物質(zhì)”是指細(xì)胞物質(zhì)在嵌合界面上的形成，兩種不同細(xì)胞群體在嵌合界面上相互接觸。廣義的術(shù)語“間質(zhì)生物物質(zhì)”包括當(dāng)兩種或多種不同細(xì)胞群體相互接觸時(shí)，任何新的細(xì)胞物質(zhì)的形成。新細(xì)胞物質(zhì)與在器官的正常體內(nèi)細(xì)胞發(fā)育中產(chǎn)生的功能等價(jià)細(xì)胞物質(zhì)類似。例如，在人造陰道、輸卵管、或子宮的重構(gòu)中，彼此相互接觸的兩種不同細(xì)胞群體是平滑肌細(xì)胞群體，例如，子宮肌層，和上皮細(xì)胞群體。在這兩個(gè)群體的界面上產(chǎn)生的“間質(zhì)生物物質(zhì)”因此與粘膜下層的類似。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物相容性基質(zhì)降解形成粘膜下層。
這里所用的術(shù)語“功能等價(jià)物”是指一種結(jié)構(gòu)，例如，通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的人造器官，它們以和天然器官相同、或相似的方式發(fā)揮作用，例如，人造陰道具有與體內(nèi)陰道相同的功能特性。
這里所用的術(shù)語“調(diào)節(jié)化合物”是指引起細(xì)胞活性改變的化合物。這種改變可以是毒性的，例如，誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)的過早收縮，或有益的，例如，加強(qiáng)胚胎植入。所述改變可改變細(xì)胞功能，例如，誘導(dǎo)收縮、增殖、編程性細(xì)胞死亡。所述調(diào)節(jié)劑還可增加，降低，升高或抑制涉及靶基因或靶蛋白的過程或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，從而導(dǎo)致細(xì)胞活性改變。
這里所用的術(shù)語“個(gè)體”是指能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的任何活的生物。術(shù)語個(gè)體包括，但不限制于，人，除人以外的靈長類動(dòng)物，如黑猩猩，和其它猿及猴；飼養(yǎng)動(dòng)物，如牛、綿羊、豬、山羊和馬；馴養(yǎng)的哺乳動(dòng)物，如狗和貓；實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，包括嚙齒類動(dòng)物，如小鼠，大鼠和豚鼠等。該術(shù)語不指示特定的年齡或性別。因此，成年和新生的個(gè)體，以及胎兒都包括在內(nèi)。
本發(fā)明提供用于重構(gòu)人造雌性生殖器官的組合物和方法。人造雌性生殖器官的構(gòu)造包括將培養(yǎng)雌性生殖細(xì)胞的至少一個(gè)群體灌注到生物相容性基質(zhì)中，如此培養(yǎng)的雌性生殖細(xì)胞與生物相容性基質(zhì)粘附，并形成至少一個(gè)雌性生殖組織層。培養(yǎng)的雌性生殖細(xì)胞的其它群體可與生物相容性基質(zhì)粘附，并被培養(yǎng)產(chǎn)生人造雌性器官或組織結(jié)構(gòu)。
I.解剖學(xué)a.陰道陰道是一種肌管，順復(fù)層鱗狀上皮排列，與子宮頸和外陰粘膜在組織學(xué)方面類似，并將子宮頸(子宮下部，或子宮)與肌體外部連接在一起。陰道或產(chǎn)道不包括腺或毛囊，但個(gè)體細(xì)胞、隱窩，可產(chǎn)生粘液。粘液有助于阻止細(xì)菌進(jìn)入子宮，還可在卵子將要受精時(shí)，幫助精子進(jìn)入子宮。表層沒有角質(zhì)化。兒童和絕經(jīng)后婦女的陰道非常相似，其上皮層薄，容易受損傷并易受各種感染。正常成人的陰道含有類白喉的德得來氏桿菌，和厭氧的鏈球菌。這種菌叢可將陰道細(xì)胞的糖原轉(zhuǎn)化成乳酸，從而維持陰道的酸性pH并促進(jìn)正常分泌。在月經(jīng)期，陰道具有被稱作皺褶的橫襞。絕經(jīng)后，在無雌激素的情況下，陰道壁變薄并萎縮，反映出缺少雌激素，就像兒童時(shí)期所見到的那樣。成人陰道的深度為12-13cm。
陰道上皮對(duì)激素敏感。隨著細(xì)胞中糖原的積聚，雌激素可刺激上皮的增殖和成熟。上皮中糖原的存在構(gòu)成Schiller試驗(yàn)的基礎(chǔ)。給上皮提供Lugol’s溶液(強(qiáng)碘)。糖原與碘結(jié)合，產(chǎn)生深棕褐色。沒有染色(陽性試驗(yàn))表示異常上皮，如瘢痕組織，柱狀上皮(腺病)，和瘤形成或前體損害。然而，孕激素會(huì)抑制上皮的成熟。
陰道是一種部分萎陷的管狀結(jié)構(gòu)，它從外陰前庭延伸至子宮。前后壁彼此接觸，但在尖端，陰道圍繞著外子宮頸和穹隆樣隱窩，也被稱作fornices，將陰道和子宮頸分開。后穹窿比前穹窿更深。尿道和膀胱的基底在陰道的前面，而直腸在它的后面。陰道的血液有兩個(gè)主要的供給來源子宮和陰部的動(dòng)脈。內(nèi)陰動(dòng)脈從下到上供給陰道。常常是子宮動(dòng)脈分支的陰道動(dòng)脈，和子宮動(dòng)脈自身供給陰道的上部位置。
成年婦女的子宮肌層通常要經(jīng)歷自發(fā)的節(jié)律性收縮。去生殖腺者的子宮則失去了這種節(jié)律收縮性。當(dāng)雌激素水平較高時(shí)，子宮肌層常常會(huì)出現(xiàn)肥大，絕經(jīng)之后出現(xiàn)子宮萎縮。子宮內(nèi)膜通?？煞从炒萍に睾驮型乃?。雌激素引起子宮內(nèi)膜及其血管的增殖。孕酮可將增殖子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化成分泌子宮內(nèi)膜，具有促進(jìn)可能植入的腺和基質(zhì)特征。子宮內(nèi)膜的活組織檢查可準(zhǔn)確解釋卵巢激素的產(chǎn)生。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于構(gòu)造實(shí)施例1-3所描述的人造陰道。所述人造陰道是正常陰道的功能等價(jià)物。該人造陰道包含正常陰道的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和生理學(xué)。人造陰道是如下產(chǎn)生的提供一種生物相容性基質(zhì)，將第一細(xì)胞群體灌注在生物相容性基質(zhì)上或生物相容性基質(zhì)中，第一細(xì)胞群體基本為陰道上皮細(xì)胞群體，將細(xì)胞類型不同于第一細(xì)胞群體的第二細(xì)胞群體，例如平滑肌細(xì)胞，灌注在生物相容性基質(zhì)上或生物相容性基質(zhì)中；培養(yǎng)生物相容性基質(zhì)中的細(xì)胞群體。
b.子宮頸子宮頸是子宮的下部。子宮頸是一種用復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞覆蓋的纖維肌肉器官。子宮頸的部分陰道開始于在陰道穹窿，并在子宮頸內(nèi)道入口處的外子宮頸口終止。這種鱗柱接合點(diǎn)是鱗狀上皮細(xì)胞癌起源的最常見位點(diǎn)。子宮頸內(nèi)道排列的是柱狀上皮，而順類似上皮排列的葡萄狀腺是在纖維肌性基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的。這種腺，如果被阻塞，可在子宮頸表面上形成納博特氏囊腫。未經(jīng)產(chǎn)的子宮頸口是圓形的，但生產(chǎn)將其改變?yōu)樗椒较蚱教沟目凇Ｗ訉m頸是婦女生殖惡性腫瘤的第二個(gè)最常見的位置。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于構(gòu)造人造子宮頸。該人造子宮頸是正常子宮頸的功能等價(jià)物。該人造子宮頸包含正常子宮頸的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和生理學(xué)。人造子宮頸可如下產(chǎn)生提供一種生物相容性基質(zhì)，將第一細(xì)胞群體灌注在生物相容性基質(zhì)上或生物相容性基質(zhì)中，第一細(xì)胞群體基本為子宮頸上皮細(xì)胞群體，將細(xì)胞類型不同于第一細(xì)胞群體的第二細(xì)胞群體，例如平滑肌細(xì)胞，灌注在生物相容性基質(zhì)上或生物相容性基質(zhì)中；培養(yǎng)生物相容性基質(zhì)中的細(xì)胞群體。
c.輸卵管輸卵管起自子宮側(cè)緣的上部，高于圓韌帶的附件，并且是開放的。遠(yuǎn)端傘部通往腹腔，近端通往子宮腔。輸卵管是由單層下柱狀上皮排列形成的，有些有纖毛，以分支或葉狀方式排列。該結(jié)構(gòu)分為有間隙、峽狀、壺腹?fàn)?、和傘狀部分。壁較薄，在闊韌帶的上緣內(nèi)有兩層肌肉層和一層腹膜外層。
輸卵管上皮還可反映周期性改變、成熟過程中的卵巢激素變化，和退行變化。輸卵管肌肉系統(tǒng)具有幫助輸卵管轉(zhuǎn)運(yùn)的內(nèi)在蠕動(dòng)作用。某些輸卵管細(xì)胞纖毛的作用也涉及轉(zhuǎn)運(yùn)。雌激素似乎可影響這些活性。
輸卵管與任何一側(cè)上子宮的上部連接，長約10cm。輸卵管是較為狹窄的肌管，可作為卵子從卵巢移動(dòng)到子宮的通道。每個(gè)月在排卵時(shí)，由卵巢釋放出成熟的卵子。傘部，輸卵管末端的邊緣，將卵子牽引到輸卵管中。每個(gè)輸卵管是由上百萬個(gè)被稱作纖毛的微毛排列形成的，它們可有節(jié)奏地將卵子向前推進(jìn)。概念上，精子對(duì)卵子的授精通常是在輸卵管中發(fā)生的。然后，受精卵移動(dòng)到子宮，在那里，它植入到子宮壁。輸卵管還可執(zhí)行其它功能，包括營養(yǎng)腔中的卵子和早期胚胎。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于構(gòu)造實(shí)施例4中描述的人造輸卵管。該人造輸卵管是正常輸卵管的功能等價(jià)物。該人造輸卵管包含正常輸卵管的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和生理學(xué)。人造輸卵管可如下生產(chǎn)提供一種生物相容性基質(zhì)，將第一細(xì)胞群體灌注在生物相容性基質(zhì)上或生物相容性基質(zhì)中，第一細(xì)胞群體基本為輸卵管細(xì)胞群體，將細(xì)胞類型不同于第一細(xì)胞群體的第二細(xì)胞群體，例如平滑肌細(xì)胞，灌注在生物相容性基質(zhì)上或生物相容性基質(zhì)中；并培養(yǎng)生物相容性基質(zhì)中的細(xì)胞群體。
d.卵巢正常卵巢是白色、杏仁狀的結(jié)構(gòu)，大小為2×3×3cm，位于闊韌帶的后表面上，在輸卵管下方。卵巢可產(chǎn)生卵子(卵細(xì)胞)，即雌性的生殖細(xì)胞，并產(chǎn)生激素。神經(jīng)、淋巴管和血管在與闊韌帶連接處，即門進(jìn)入卵巢。卵巢的外側(cè)由漏斗骨盆韌帶提供支持，其延伸至骨盆側(cè)壁，中間由子宮-卵巢韌帶支持延伸到子宮。卵巢具有皮質(zhì)和髓質(zhì)。生殖上皮，一種單層的立方形細(xì)胞，覆蓋了壓縮的纖維組織，白膜。卵泡源于卵巢皮質(zhì)內(nèi)，由基礎(chǔ)胚胎補(bǔ)體組成；生產(chǎn)后，不再形成新的卵泡。卵巢的髓質(zhì)部分被血管、淋巴管、神經(jīng)、和結(jié)締組織占據(jù)，含有午非氏體前體的殘留物。卵巢是一種內(nèi)分泌腺和生殖器官。卵泡旁粒層細(xì)胞產(chǎn)生雌激素，且在排卵和黃體形成之后，產(chǎn)生孕激素。雄激素是由基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的，特別是在門中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于構(gòu)造人造卵巢。該卵巢是正常卵巢的功能等價(jià)物。人造卵巢包含正常卵巢的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能、和生理學(xué)。
e.子宮子宮是由腺粘膜排列形成的雌性生殖道的肌器官，其具有專門的血管形成。這種中空的梨形器官位于膀胱和直腸間插入的骨盆腔中。沒有懷孕的婦女子宮長度約為8cm，重30-100g。輸卵管和子宮頸管與子宮腔連接，子宮腔是由子宮內(nèi)膜排列形成的。膨脹的上部被稱作體。體的肌肉非常發(fā)達(dá)，因此可擴(kuò)張容納正在發(fā)育的嬰兒?？拷鼉筛斅压芘c子宮連接處的區(qū)域常被稱作基底。除了下面的前部之外，子宮基底被腹膜覆蓋，在那里，膀胱與下面的子宮部分鄰接，腹膜顯現(xiàn)出來，并與闊韌帶的襞側(cè)面連接?；紫旅娴氖湛s部分被稱作峽，其下面有一個(gè)被稱作子宮頸的圓柱形部分。該器官從內(nèi)到外各層分別為粘膜(子宮內(nèi)膜)，肌層(子宮肌層)，和絨膜(子宮外膜)。血清雌二醇和孕酮水平的波動(dòng)可引起所有這三層經(jīng)歷連續(xù)的結(jié)構(gòu)性周期改變。子宮是由骨盆內(nèi)筋膜和纖維肌肉組織在闊韌帶基礎(chǔ)上的側(cè)面壓縮支持的。圓韌帶提供側(cè)面支持，子宮膀胱襞提供前面的支持。
子宮內(nèi)膜大約5mm厚，但會(huì)隨著漱素周期而變化。該層是由凹入形成管狀子宮腺的分泌單層柱狀上皮排列形成的。某些有纖毛的柱狀細(xì)胞還可被發(fā)現(xiàn)作為上皮的一部分。子宮內(nèi)膜由上層功能組成，其在每次月經(jīng)過程中脫落。營養(yǎng)表面子宮內(nèi)膜中大量毛細(xì)血管床的卷曲或螺旋狀動(dòng)脈可供給兩層的血管形成。雖然腺和腔的上皮彼此鄰接，且通過光學(xué)和電子顯微鏡觀察，在形態(tài)學(xué)方面類似(Davies等，Am.J.Ahat.137(4)423-445(1973)；Davies等，Am.J.Ahat.142(3)335-365(1975))，但它們對(duì)激素刺激的反應(yīng)不同。
子宮上皮是由靜止和增殖亞群體組成的，其對(duì)雌激素和孕酮表現(xiàn)出不同的增殖反應(yīng)(Conti等，Endocinology 114(2)345-351(1984))。施用雌激素導(dǎo)致靜止腺細(xì)胞重新回到細(xì)胞循環(huán)中，并降低腔細(xì)胞損失的速率。孕酮可通過縮短腺和腔中的細(xì)胞周期長度來誘導(dǎo)增殖速率加速(Nawaz等，Am.J.Pathol.127(1)51-59(1987))。
子宮內(nèi)膜基質(zhì)類似間充質(zhì)，包含具有大量卵形核的星形細(xì)胞。由于蛻膜轉(zhuǎn)化，據(jù)信基質(zhì)細(xì)胞在植入和妊娠維持方面起作用，這是通過胚泡的營養(yǎng)、內(nèi)分泌腺分泌(催乳激素)，和胚胎保護(hù)而達(dá)到的。子宮肌層由4層組成。由于復(fù)雜的互連束，這些層不能很清楚地分開，它們上面散布有大量結(jié)締組織。這4層很容易識(shí)別粘膜下層包括具有縱纖維的粘膜下的薄層。血管層包含很多大型血管，可賦予它海綿狀的外觀，纖維是圓形、斜的。血管上層的纖維主要是圓形、縱向的。絨膜下層由較薄的縱肌肉層組成。腹膜由單層的扁平細(xì)胞組成，其圍繞在輸卵管和子宮周圍。該薄層還可起神經(jīng)和血管上的鞘的作用。圍繞在子宮周圍并側(cè)面伸向骨盆壁的腹膜部分被稱作子宮外膜(Baez和Atala，“Uertus”，組織工程學(xué)方法Academic Press 2002(1189-1194)。
供給陰道、子宮、輸卵管和卵巢的動(dòng)脈血通過4對(duì)動(dòng)脈卵巢動(dòng)脈，子宮動(dòng)脈，陰道動(dòng)脈，和內(nèi)陰動(dòng)脈。子宮、子宮頸、和上部陰道位于膀胱的后面，其通過膀胱子宮襞與子宮分開。在該腹膜襞下，膀胱通過蜂窩組織與子宮頸和上部陰道連接。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于構(gòu)造實(shí)施例5和6中描述的人造子宮。該人造子宮是正常子宮的功能等價(jià)物。該人造子宮包含正常子宮的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能、和生理學(xué)。該人造子宮可如下生產(chǎn)提供一種生物相容性基質(zhì)，將第一細(xì)胞群體灌注在生物相容性基質(zhì)上或生物相容性基質(zhì)中，第一細(xì)胞群體基本為子宮上皮細(xì)胞群體，將細(xì)胞類型不同于第一細(xì)胞群體的第二細(xì)胞群體，例如平滑肌細(xì)胞，灌注在生物相容性基質(zhì)上或生物相容性基質(zhì)中；并培養(yǎng)生物相容性基質(zhì)中的細(xì)胞群體。
(f)雌性生殖系統(tǒng)的功能生殖年齡的雌性重復(fù)經(jīng)歷間隔約為1個(gè)月的激素活性周期。每個(gè)周期，婦女的肌體都要準(zhǔn)備可能的妊娠。術(shù)語月經(jīng)是指子宮內(nèi)層的周期性脫落。平均月經(jīng)周期約為28天，發(fā)生下列階段卵泡期，排卵期(排卵)，和黃體期。有4種主要的激素、即可刺激或調(diào)節(jié)細(xì)胞或器官活性的化學(xué)品，涉及月經(jīng)周期促卵泡激素(FSH)，促黃體生成激素(LH)，雌激素和孕酮。
第一期，卵泡期，在月經(jīng)周期的第一天開始，即月經(jīng)開始那天。在此期間，促卵泡激素(FSH)和促黃體生成激素(LH)是由位于腦基底的垂體釋放的。這些激素在血液中移動(dòng)至卵巢。在那里，該激素刺激大約15-20個(gè)卵子的生長，每個(gè)卵子都位于其各自的卵泡中。卵泡是一種小的充滿液體的囊泡，可容納卵子并支持負(fù)責(zé)卵子生長和營養(yǎng)卵子的細(xì)胞。FSH和LH還可使卵泡增加雌激素的產(chǎn)生。
隨著雌激素水平在自然月經(jīng)周期中的升高，垂體產(chǎn)生較少的FSH。激素的平衡可使肌體限制完全成熟的卵泡數(shù)。隨著卵泡期的發(fā)展，一個(gè)卵巢中一個(gè)卵泡變得更占優(yōu)勢，并繼續(xù)成熟。該占優(yōu)的卵泡抑制所有其它的卵泡，終止其生長并退化。發(fā)育中的卵泡可產(chǎn)生其自身的激素，包括雌激素。
第二期，排卵期，或排卵，是月經(jīng)周期的中點(diǎn)，通常在婦女下一次月經(jīng)周期開始前約2周。在此期間，雌激素的升高引發(fā)LH從垂體大量釋放。從而引起占優(yōu)的卵泡自卵巢釋放其卵子。隨著卵子的釋放，其被稱作排卵，它被輸卵管末端的手指樣突出(傘部)捕獲。傘部將卵子集中到輸卵管中。還是在此期間，婦女的子宮頸粘液增加，其準(zhǔn)備接受和營養(yǎng)男人的精子(雄性生殖細(xì)胞)。粘液還可幫助精子通過子宮頸管移動(dòng)。
第三期，黃體期在排卵后立即開始。一旦它釋放其卵子，空的卵泡就會(huì)發(fā)育成被稱作黃體的新結(jié)構(gòu)(因此稱作黃體期)。黃體分泌雌激素和孕酮。孕酮為子宮準(zhǔn)備植入受精卵所需的豐富內(nèi)層。如果卵子已經(jīng)由男人的精子授精，那么受精卵(胚胎)將通過輸卵管移動(dòng)，從而植入到子宮中，并進(jìn)行妊娠。如果卵子沒有受精，它就會(huì)穿過子宮。無需支持妊娠，子宮內(nèi)層損壞并脫落，下一個(gè)月經(jīng)周期開始。
II.生物相容性基底在本發(fā)明的其中一方面，所述人造雌性器官借助于支持結(jié)構(gòu)，如聚合結(jié)構(gòu)，生物相容性基質(zhì)，或去細(xì)胞化的器官。
a.聚合結(jié)構(gòu)生物相容性基底是指對(duì)生物功能沒有毒性或損傷作用的物質(zhì)?？缮锝到馐侵缚杀换颊呒◇w吸收或降解的材料?？缮锝到獠牧系睦影?，例如，可吸收的縫線。用于形成可生物降解結(jié)構(gòu)的代表性材料包括天然或合成的聚合物，例如，膠原、聚(α酯)如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚原酸酯和聚酐以及它們的共聚物，其以可控速率通過水解而被降解并重吸收。這些物質(zhì)提供可降解性，易處理性，大小和構(gòu)型的最大控制。優(yōu)選的可生物降解聚合物材料包括聚乙醇酸和聚polygalactin，它們可被研制成可吸收的合成縫線材料。聚乙醇酸和聚polygalactin纖維可由制造商提供使用。其它生物降解材料包括纖維素醚，纖維素，纖維素酯，氟化聚乙烯，酚醛聚合物，聚-4-甲基戊烯，聚丙烯腈，聚酰胺，聚酰胺酰亞胺，聚丙烯酸酯，聚苯并噁唑，聚碳酸酯，聚氰基芳基醚，聚酯，聚酯碳酸酯，聚醚，聚醚醚酮，聚醚酰亞胺，聚醚酮，聚醚砜，聚乙烯，聚氟代烯烴，聚酰亞胺，聚烯烴，聚噁二唑，聚苯醚，聚苯硫醚，聚丙烯，聚苯乙烯，聚硫化物，聚砜，聚四氟乙烯，聚硫醚，聚三唑，聚氨酯，聚乙烯基化合物，聚偏二氟乙烯，再生纖維素，聚硅氧烷，脲-甲醛，或這些物質(zhì)的共聚物或物理混合物。所述物質(zhì)可用適宜的抗菌劑浸漬，并用彩色添加劑著色，從而提高可見度并有助于手術(shù)過程。
在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞與聚合物的粘附是通過用化合物，如基膜成分，瓊脂，瓊脂糖，明膠，阿拉伯膠，膠原，如I，II，III，IV，和V型膠原，纖連蛋白，層粘連蛋白，糖胺聚糖，其混合物，和其它具有與細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生物基質(zhì)分子類似性質(zhì)的親水和肽粘附物質(zhì)涂覆聚合物而提高的。所有聚合物必需滿足為隨后生長和增殖的細(xì)胞提供適宜支持所需的機(jī)械和生化參數(shù)。此外還可將因子，包括營養(yǎng)物，生長因子，分化或去分化的誘導(dǎo)劑，分泌產(chǎn)物，免疫調(diào)制劑，炎癥抑制劑，退行因子，提高或使淋巴網(wǎng)或神經(jīng)纖維向內(nèi)生長的生物活性化合物，和藥物摻入到基質(zhì)中或與基質(zhì)聯(lián)合提供。同樣，還可合成含有肽，如附著肽RGD(Arg-Gly-Asp)的聚合物用于形成基質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，生物相容性聚合物是polyglactin和聚乙醇酸。Polyglactin被研制成可吸收的合成縫線材料，一種乙交酯和丙交酯的90∶10共聚物，由Vicryl制造的編織可吸收縫線(EthiconCo.，Somerville，N.J.)(Craig P.H.，Williams J.A.，DavisK.W.等Polyglactin 910與聚乙醇酸合成可吸收縫線的生物學(xué)比較，Surg.141；1010，(1975))。Polyglactin和聚乙醇酸纖維可由制造商提供使用。生物相容性聚合物可使用下列方法成型，如，溶劑澆鑄，壓模，縫合，拉絲，形成網(wǎng)眼，瀝濾，編織和涂覆。在溶劑澆鑄法中，可將一種或多種聚合物溶于適當(dāng)溶劑，如二氯甲烷中的溶液澆鑄為分支模型浮雕結(jié)構(gòu)。溶劑蒸發(fā)后，獲得一層薄膜。在壓模法中，以30,000磅/平方英寸的壓力將聚合物壓成適當(dāng)?shù)男螤?。拉絲法包括自熔融的聚合物拉絲，形成網(wǎng)眼包括通過將纖維壓縮成氈樣材料而形成網(wǎng)狀物。在瀝濾法中，將含有兩種物質(zhì)的溶液涂成與基質(zhì)最終形狀接近的形狀；接著，用溶劑溶解其中一種成分，導(dǎo)致孔的形成。(見Mikos，US 5,514,378，其引入此處作為參考)。在成核作用中，使基質(zhì)形狀的薄膜與放射性裂變產(chǎn)物接觸，建造放射性損害物質(zhì)的軌跡。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物相容性基質(zhì)可以是由纖維組成的可生物降解聚合物網(wǎng)。
聚碳酸酯板可用酸或堿蝕刻，將放射性-損害物質(zhì)的軌跡變成孔。最后，使用激光成型，并穿過多種物質(zhì)灼燒出單個(gè)的洞，形成具有均勻孔徑的基質(zhì)結(jié)構(gòu)。涂覆是指用物質(zhì)，如液態(tài)共聚物(聚-D，L-丙交酯共-乙交酯(PLGA，50∶50)80mg/ml二氯甲烷或氯仿(5％w/v))涂覆或滲透聚合結(jié)構(gòu)，從而改變其機(jī)械性能。涂覆可以一層或多層進(jìn)行，直到獲得所需的機(jī)械性能。這些成型技術(shù)可聯(lián)合使用，例如，可將聚合基質(zhì)編織、壓模并膠粘在一起。
此外，可將通過不同方法成型的不同聚合材料連接在一起，形成復(fù)合形狀。復(fù)合形狀可以是層狀結(jié)構(gòu)。例如，可將聚合基質(zhì)與一種或多種相同或不同組成的聚合基質(zhì)粘附在一起，形成多層假體陰道結(jié)構(gòu)。粘附可通過任何適宜的方法進(jìn)行，如用液體聚合物膠粘、裝訂，縫合、或這些方法的組合。此外，聚合基質(zhì)還可形成實(shí)心的塊狀物，并利用激光或其它標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械技術(shù)成型為所需的終形式。激光成型是指使用激光除去材料的方法。
聚合物可使用機(jī)械性能，如拉伸強(qiáng)度和應(yīng)力來表征。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用聚乙醇酸(PGA)作為生物材料。PGA已經(jīng)廣泛用于組織改造。PGA支架可很容被處理成各種三維結(jié)構(gòu)，并為細(xì)胞的支持和轉(zhuǎn)運(yùn)提供最佳方式(Christenson L，Mikos AG，Gibbons DF等用于組織改造的生物材料概述，Tissue Eng.3(1)71-73；討論73-76頁，1997)。如實(shí)施例2和3所示，已經(jīng)成功在PGA構(gòu)造上共同培養(yǎng)了陰道上皮和平滑肌細(xì)胞。實(shí)施例5和6舉例說明PGA可用于建造人造子宮。
在植入之前、用培養(yǎng)的細(xì)胞涂覆生物相容性基底之前或之后，可用因子，如血管生成因子、細(xì)胞因子、胞外基質(zhì)成分、和其它生物活性物質(zhì)或藥物處理生物相容性基底，例如，從而在植入后促進(jìn)新組織的形成和促進(jìn)移植物愈合。還可將因子，包括藥物摻入到生物相容性基底中，或與生物相容性基底聯(lián)合提供。生長因子和其它添加劑(例如，表皮生長因子(EGF))，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，肝素-結(jié)合表皮-樣生長因子(HBGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，細(xì)胞因子，基因，蛋白等)可以超出這種生長因子的任何量(如果加入的話)加入，如果使用的是加入的細(xì)胞，可通過在聚合基質(zhì)上接種細(xì)胞而產(chǎn)生。優(yōu)選這種添加劑的量足以促進(jìn)新的雌性器官形成，如促進(jìn)新的陰道組織形成。其它有用的添加劑包括抗細(xì)菌和抗真菌劑，以通過抑制感染而促進(jìn)愈合。
一種優(yōu)選的支持基質(zhì)是由交叉絲組成的，一旦植入細(xì)胞支持基質(zhì)，其可通過使?fàn)I養(yǎng)物穿過較短距離擴(kuò)散而使細(xì)胞存活。
可將生物相容性基質(zhì)制成具有可控的孔結(jié)構(gòu)，使?fàn)I養(yǎng)物從培養(yǎng)基到達(dá)沉積的細(xì)胞群體，但防止培養(yǎng)的細(xì)胞穿過孔遷移。在體外，細(xì)胞粘附和細(xì)胞存活力可使用掃描電子顯微鏡、組織學(xué)以及放射性同位素定量評(píng)估而測定。
生物相容性基質(zhì)可被制成任何數(shù)量的所需構(gòu)型，從而滿足任何數(shù)量的整個(gè)系統(tǒng)，幾何或空間限制。例如，在使用聚合基底構(gòu)造雌性生殖器官時(shí)，可將基底制成與器官，例如陰道或子宮的全部或一部分一致的維數(shù)和形狀。生物相容性基質(zhì)可被制成不同的大小，從而與不同大小患者的陰道或子宮一致。聚合基底還可被制成滿足患者的特殊需要，例如，具有不同腹腔空間的殘疾患者可能需要重構(gòu)適合該空間的陰道或子宮。
在其它實(shí)施方案中，生物相容性基質(zhì)用于處理肌體中的層狀結(jié)構(gòu)，如輸卵管。在那些應(yīng)用中，所述聚合基底可被制成中空的管。
b.去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)生物結(jié)構(gòu)，例如，整個(gè)器官，或器官的一部分可通過除去器官的全部細(xì)胞和組織內(nèi)容物而被去細(xì)胞化。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，去細(xì)胞化的雌性生殖器官或組織，如陰道、子宮、輸卵管、和子宮頸可用于本發(fā)明中。去細(xì)胞化的方法包括一系列連續(xù)的提取。這種提取方法的其中一個(gè)重要特征在于可避免阻礙或破壞生物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的粗提。第一步包括除去細(xì)胞碎片，并溶解細(xì)胞膜。接著溶解核的胞質(zhì)成分，一種核成分。
優(yōu)選，生物結(jié)構(gòu)，例如器官，是使用溫和的機(jī)械破裂方法，通過除去器官周圍的細(xì)胞膜和細(xì)胞碎片而去細(xì)胞化的。所述溫和的機(jī)械破裂方法必須是以破壞細(xì)胞膜。然而，去細(xì)胞化的方法應(yīng)避免損害或阻礙生物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。溫和的機(jī)械破裂方法包括刮擦器官或組織的表面，振搖器官或組織，或在適宜體積的液體，例如蒸餾水中攪動(dòng)器官或組織。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，溫和的機(jī)械破裂方法包括在適宜體積的蒸餾水中攪動(dòng)器官或組織，直到細(xì)胞膜破裂，且已經(jīng)除去器官的細(xì)胞碎片。在另一實(shí)施方案中，器官或組織暴露于低滲條件下，從而使血細(xì)胞溶解，而保留細(xì)胞基質(zhì)。
除去細(xì)胞膜后，再除去生物結(jié)構(gòu)的核及胞質(zhì)成分。這可在不使基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)破裂的情況下，通過溶解細(xì)胞及核成分而進(jìn)行。為了使核成分溶解，可使用非離子型洗滌劑或表面活性劑。非離子型洗滌劑或表面活性劑的例子包括，但不限制于，Triton系列，從Rohm and Haas ofPhiladelphia，Pa.商購，包括Triton X-100，Triton N-101，TritonX-114，Triton X-405，Triton X-705，和Triton DF-16，可從多家銷售商購得；吐溫系列，如單月桂酸酯(Tween 20)，單棕櫚酸酯(Tween40)，單油酸酯(Tween 80)，和聚氧乙烯-23-十二烷基醚(Brij.35)，聚氧乙烯醚W-1(Polyox)等，膽酸鈉，脫氧膽酸鹽，CHAPS，皂苷，正癸基β-D-吡喃葡萄糖苷，正庚基β-D吡喃葡萄糖苷，正-辛基α-D-吡喃葡萄糖苷和Nonidet P-40。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，屬于上述分類和銷售商的化合物描述可商業(yè)獲得，并在“化學(xué)分類，乳化劑和洗滌劑”，McCutcheon′s，Emulsifiers and Detergents，1986，North American andInternational Editions，McCutcheon Division，MC PublishingCo.，Glen Rock，N.J.，U.S.A.和Judith Neugebauer，A Guideto the Properties and Uses of Detergents in Biology andBiochemistry，Calbiochem.R.，Hoechst Celanese Corp.，1987中找到。在優(yōu)選實(shí)施方案中，非離子型表面活性劑是Triton系列，優(yōu)選Triton X-100。
非離子型洗滌劑的濃度可根據(jù)所要去細(xì)胞化的生物結(jié)構(gòu)類型而改變。例如，對(duì)于柔弱的組織，例如血管而言，應(yīng)降低洗滌劑的濃度。非離子型洗滌劑的優(yōu)選濃度為約0.001-約2.0％(w/v)。更優(yōu)選，約0.05-約1.0％(w/v)。甚至更優(yōu)選約0.1％(w/v)-約0.8％(w/v)。這些的優(yōu)選濃度范圍約0.001-約0.2％(w/v)，特別優(yōu)選約0.05-約0.1％(w/v)。
細(xì)胞骨骼成分，包括密集的胞質(zhì)絲網(wǎng)，胞間復(fù)合物和尖端微細(xì)胞結(jié)構(gòu)可使用堿性溶液，如氨水溶解。包括銨鹽或其衍生物的其它堿性溶液也可用于溶解細(xì)胞骨骼成分。其它適宜銨溶液的例子包括硫酸銨，醋酸銨和氨水。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用氨水。在一個(gè)實(shí)施方案中，溫和堿是氫氧化物或非氫氧化物堿。非氫氧化物堿的非限制性例子包括醋酸，苯甲酸，丙酸和苯酚的銨或鈉鹽或它們的衍生物。氫氧化物堿的非限制性例子包括氨水，三甲銨氫氧化物，三乙銨氫氧化物，一乙醇銨氫氧化物，和芐銨氫氧化物。
堿性溶液，例如氨水的濃度，可根據(jù)所要去細(xì)胞化的生物結(jié)構(gòu)的類型而改變。例如，對(duì)于柔弱的組織，例如輸卵管而言，應(yīng)降低洗滌劑的濃度。優(yōu)選的濃度范圍是約0.001-約2.0％(w/v)。更優(yōu)選，約0.005-約0.1％(w/v)。甚至更優(yōu)選約0.01％(w/v)-約0.08％(w/v)。
去細(xì)胞化的器官可通過本領(lǐng)域已知的任何方式脫水，如烘焙，冷凍干燥，低壓升華干燥法(lyphylization)。去細(xì)胞化的器官可在脫水過程中被固定在元件上。
去細(xì)胞化的、脫水的結(jié)構(gòu)可在適宜的溫度下貯藏，直到需要使用。使用前，可將去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)在適宜的等滲緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)基中平衡。適宜的緩沖液包括，但不限制于，磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)，生理鹽水，MOPS，HEPES，Hank’s平衡鹽溶液等。適宜的細(xì)胞培養(yǎng)基包括，但不限制于，RPMI 1640，F(xiàn)isher’s，Iscove’s，McCoy’s，Dulbecco’s培養(yǎng)基等。
III.培養(yǎng)細(xì)胞組織改造可為攻克缺少局部組織的疾病提供一種解決方法。在實(shí)驗(yàn)室中，自表型正常的自體衍生細(xì)胞成功建造預(yù)制器官可導(dǎo)致正常的功能發(fā)展。在實(shí)施例2和3中，本發(fā)明的方法和組合物可用于證實(shí)體外培養(yǎng)的陰道細(xì)胞可用于體內(nèi)建造重構(gòu)的、能生長發(fā)育的陰道組織。
本發(fā)明描述用于雌性器官重構(gòu)的組合物和方法。通常，本發(fā)明提供含有至少2種不同細(xì)胞群體的多細(xì)胞器官。該器官構(gòu)造包括源自第一細(xì)胞群體的細(xì)胞第一培養(yǎng)群體，和源自不同于第一細(xì)胞群體的第二細(xì)胞群體的細(xì)胞第二培養(yǎng)群體，其中第二細(xì)胞群體通過嵌合界面與第一細(xì)胞群體偶聯(lián)，產(chǎn)生一種構(gòu)造，該構(gòu)造是天然生物結(jié)構(gòu)的功能等價(jià)物。
本發(fā)明還提供使用器官形狀的生物相容性基底生產(chǎn)人造雌性器官的方法，即在生物相容性基底的一個(gè)區(qū)域上建造源自第一細(xì)胞群體的細(xì)胞第一培養(yǎng)群體，使第一培養(yǎng)細(xì)胞群體與生物相容性基底粘附；建造源自不同于第一細(xì)胞群體的第二細(xì)胞群體的細(xì)胞的第二培養(yǎng)細(xì)胞群體，使第二細(xì)胞群體通過嵌合界面與第一細(xì)胞群體偶聯(lián)，這樣所述構(gòu)造在植入后，可提供天然生物結(jié)構(gòu)的功能等價(jià)物，由此產(chǎn)生人造雌性器官構(gòu)造。
(a)細(xì)胞采集大量容易獲取的組織來源的可用性對(duì)于涉及動(dòng)物模型和組織改造的任何實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的成功是必需的。重構(gòu)的人造雌性器官可以是同種異體的，細(xì)胞群體源自受治療者的自身組織。例如，陰道上皮細(xì)胞可源自受治療者陰道并在體外培養(yǎng)。
重構(gòu)的人造雌性生殖器官還可以是異種的，細(xì)胞群體源自不同于受治療者的哺乳動(dòng)物種類。例如，所述的不同的細(xì)胞可源自哺乳動(dòng)物，如猴，狗，貓，小鼠，大鼠，母牛，馬，豬，山羊和綿羊的器官。
這種器官可通過適宜的活組織檢查或在尸體解剖后獲得。尸體器官可用于提供內(nèi)皮細(xì)胞和元件。分離的細(xì)胞優(yōu)選通過活組織檢查從受治療者獲得的自體細(xì)胞。例如，手臂，前臂，或下肢骨骼肌的活組織檢查樣品，或皮下注射少量利多卡因進(jìn)行局部麻醉區(qū)域的平滑肌活組織檢查樣品，并在培養(yǎng)時(shí)擴(kuò)增?；罱M織檢查可使用活組織檢查針，一種快速作用的針獲得，從而使過程快速且簡單。然后按照實(shí)施例所述，擴(kuò)增并培養(yǎng)骨骼肌或平滑肌的較小活組織檢查核心。源自親緣關(guān)系或相同物種其它供體的細(xì)胞也可在適當(dāng)?shù)拿庖咭种葡聭?yīng)用。
子宮內(nèi)膜細(xì)胞可從子宮活組織檢查樣品或子宮切除樣品獲得。應(yīng)當(dāng)將活組織檢查樣品立即轉(zhuǎn)移到運(yùn)送培養(yǎng)基DMEM/P-12(Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基，含有Ham’s F-12營養(yǎng)培養(yǎng)基)中。4℃時(shí)，直徑超過2cm的活組織檢查樣品可在該培養(yǎng)基中保持可見達(dá)3天。在實(shí)施例部分中，新西蘭白兔是陰道組織的極好來源，它可通過在采集組織過程中較好暴露的簡單、中線、經(jīng)腹方法采集。兔子的陰道具有充足的大小和周長，可在每次過程中，產(chǎn)生極好的組織。將采集的樣品運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室的無菌培養(yǎng)基中，開始分離各組織層的過程。
(b)細(xì)胞分離和培養(yǎng)Freshney，Culture of Animal Cells.A Manual of BasicTechnique，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，1987，Ch.9，pp.107B126和Fauza等(1998)J.Ped.Surg.33，7-12討論了用于分離和培養(yǎng)細(xì)胞的方法將其引入此處作為參考。細(xì)胞還可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)分離。例如，組織或器官可被機(jī)械解聚和/或用消化酶和/或螯合劑處理，削弱相鄰細(xì)胞之間的連接，從而將組織分散成單個(gè)細(xì)胞的混懸液，而不會(huì)使細(xì)胞破裂。醇離解可通過切碎組織，并用任意數(shù)量的消化醇單獨(dú)或聯(lián)合處理切碎的組織而完成。這些包括但不限制于胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，膠原酶，彈性酶，和/或透明質(zhì)酸酶，DNA酶，鏈霉蛋白醇，和分散酶。機(jī)械破裂也可通過各種方法完成，包括但不限制于，剖擦器官的表面，使用研磨機(jī)，攪拌器，篩網(wǎng)，勻漿器，壓榨細(xì)胞，或insonators等。組織解聚技術(shù)的概述見Freshney，(1987)，Culture of Animal Cells.A Manual of BasicTechnique，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.9，pp.107-126。
優(yōu)選的細(xì)胞類型包括，但不限制于，子宮上皮細(xì)胞，子宮肌細(xì)胞，陰道上皮細(xì)胞，子宮頸上皮細(xì)胞，輸卵管上皮細(xì)胞，子宮上皮細(xì)胞，卵巢上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，人陰道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞是分開的。在其它實(shí)施方案中，人子宮頸上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞是分離的。在其它實(shí)施方案中，人輸卵管上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞是分離的。在其它實(shí)施方案中，人卵巢上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞是分離的。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，人子宮上皮細(xì)胞和子宮肌細(xì)胞是分離的。
一旦已經(jīng)將組織分解成單個(gè)細(xì)胞的混懸液，那么可將混懸液分離成亞群體，從而獲得細(xì)胞元件。這一點(diǎn)還可使用細(xì)胞分離的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來完成，包括但不限制于，特殊細(xì)胞類型的克隆和選擇，多余細(xì)胞的選擇性破壞(消極選擇)，基于混合群體中不同細(xì)胞可凝集性的分離，凍融過程，混合群體中細(xì)胞的不同粘著性，過濾，常規(guī)的區(qū)帶離心，離心淘析(反流離心)，單位重力分離，逆流分布，電泳和熒光活化細(xì)胞分選(見，例如Freshney，(1987)Culture of Animal Cells.AManual of Basic Techniques，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.11和12，137-168頁)。例如，內(nèi)皮細(xì)胞可通過熒光活化細(xì)胞分選而富集。
(c)細(xì)胞擴(kuò)增分離的細(xì)胞可體外培養(yǎng)，從而增加可注入到三維支架中的細(xì)胞數(shù)。同種異體細(xì)胞，更優(yōu)選自體細(xì)胞的使用可防止組織排斥。然而，如果在植入重構(gòu)的人造器官后，受治療者出現(xiàn)了免疫應(yīng)答，那么可用免疫抑制劑，如環(huán)孢菌素或FK506治療受治療者，從而降低排斥的可能性。在某些實(shí)施方案中，可將嵌合細(xì)胞，或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞灌注到三維支架上。
在涂覆基因物質(zhì)前，可轉(zhuǎn)染分離的細(xì)胞。有效的基因物質(zhì)可以是，例如，能夠減少或消除宿主免疫應(yīng)答基因序列。例如，可抑制細(xì)胞表面抗原，如I類和II類組織適合性抗原的表達(dá)。從而減少移植細(xì)胞被宿主排斥的機(jī)會(huì)。此外，轉(zhuǎn)染也可用于基因送遞。在灌注到三維支架中前，陰道上皮細(xì)胞可用特殊的基因轉(zhuǎn)染。人造重構(gòu)器官可攜帶宿主或重構(gòu)人造器官長期存活所需的基因信息。
在生物相容性基質(zhì)上生長的雌性生殖道細(xì)胞可被基因工程改造產(chǎn)生對(duì)移植有益的基因產(chǎn)物，例如，抗炎因子，例如，抗-GM-CSF，抗-TNF，抗-IL-1，和抗-IL-2?？蛇x擇性地，內(nèi)皮細(xì)胞可被基因工程改造為“敲除”促進(jìn)炎癥的天然基因產(chǎn)物，例如GM-CSF，TNF，IL-1，IL-2的表達(dá)，或“敲除”MHC的表達(dá)，從而降低排斥的風(fēng)險(xiǎn)。此外，內(nèi)皮細(xì)胞還可被基因工程改造用于基因療法中，調(diào)節(jié)患者的基因活性水平，幫助或改善組織移植結(jié)果。
用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，聚乙二醇對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造的方法，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法都可使用。這些包括使用表達(dá)載體，其可轉(zhuǎn)運(yùn)并在細(xì)胞中表達(dá)核酸分子。(見Geoddel；Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990))。
經(jīng)由常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)，可將載體DNA引入到原核生物或真核生物細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的適宜方法可見Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)，和其它實(shí)驗(yàn)室教科書。
細(xì)胞在三維支架中的生長可通過加入，或用蛋白(例如，膠原，彈性纖維，網(wǎng)狀纖維)，糖蛋白，糖胺聚糖(例如，硫酸類肝素，軟骨素-4-硫酸鹽，軟骨素-6-硫酸鹽，硫酸皮膚素，硫酸角蛋白等)，細(xì)胞基質(zhì)，和/或其它物質(zhì)涂覆三維支架而提高。
在將雌性生殖道細(xì)胞灌注或鋪層后，應(yīng)將三維支架在適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。很多商購的培養(yǎng)基，如RPMI 1640，F(xiàn)isher培養(yǎng)基，Iscove培養(yǎng)基，McCoy培養(yǎng)基，Dulbecco培養(yǎng)基等都適合使用。還應(yīng)當(dāng)定期更換培養(yǎng)基，從而除去使用過的培養(yǎng)基，減少釋放的細(xì)胞，并加入新鮮的培養(yǎng)基。重要的是，使雌性生殖道細(xì)胞生長至雌性生殖道組織層發(fā)育的階段。
可將生長因子和調(diào)節(jié)因子加入到培養(yǎng)基中，從而提高，改變或調(diào)節(jié)培養(yǎng)物中的增殖和細(xì)胞成熟及分化。細(xì)胞在培養(yǎng)物中的生長和活性可受到各種生長因子，如胰島素，生長激素，生長調(diào)節(jié)素，集落刺激因子，紅細(xì)胞生成素，表皮生長因子，肝紅細(xì)胞生成因子(hepatopoietin)，和肝細(xì)胞生長因子的影響。調(diào)節(jié)增殖和/或分化的其它因子包括前列腺素，白介素，和天然存在的抑素。
本發(fā)明在生物相容性基質(zhì)上生長的細(xì)胞在多層中生長，該多層可形成類似體內(nèi)生理?xiàng)l件的細(xì)胞基質(zhì)。具有至少一層雌性生殖組織層的三維支架可支持不同類型細(xì)胞的增殖和眾多其它不同組織的形成。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，其中一個(gè)細(xì)胞群體可以是內(nèi)皮細(xì)胞群體。血管生成是一種新血管發(fā)育的過程，且在雌性生殖周期，例如，排卵，月經(jīng)和胎盤發(fā)育中起重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞群體可用于刺激血管形成。
當(dāng)人造重構(gòu)的雌性生殖器官被用于體內(nèi)移植或植入時(shí)，它可優(yōu)選從將要接受移植或植入的個(gè)體獲得雌性生殖細(xì)胞，例如，陰道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。該方法可能對(duì)于移植和/或移植物抗宿主痰病的免疫排斥特別有利。
一旦灌注在生物相容性基質(zhì)上，雌性生殖細(xì)胞將在基質(zhì)上增殖并發(fā)育，形成雌性生殖組織層。在體外培養(yǎng)過程中，雌性生殖細(xì)胞發(fā)育并分化，產(chǎn)生雌性生殖組織層，它能夠支持其它細(xì)胞的生長并產(chǎn)生具有與體內(nèi)類似結(jié)構(gòu)相似形態(tài)學(xué)的結(jié)構(gòu)。所產(chǎn)生的雌性生殖組織的生理學(xué)類似正常雌性生殖組織的生理學(xué)。例如，人造雌性器官對(duì)激素敏感。
青春期時(shí)，下丘腦增加促性腺激素釋放素(GnRH)的釋放。然后垂體前葉產(chǎn)生促性腺激素，促卵泡成熟激素(FSH)和促黃體素(LH)，由GnRH和卵巢激素雌激素和孕酮控制。FSH刺激卵泡的發(fā)育。LH引起排卵。這些促性腺激素刺激性激素、雌激素和孕激素的產(chǎn)生。促性腺激素與卵巢激素的相互作用可控制生殖周期。促黃體素(LH)的突然增加致使成熟的卵泡釋放卵子。卵子釋放后，破裂的卵巢卵泡發(fā)育成黃體，然后分泌雌激素和孕酮。這些卵巢激素對(duì)于子宮內(nèi)膜內(nèi)層的維持非常重要，胚泡本身即植入在子宮內(nèi)膜內(nèi)層。在一個(gè)實(shí)施方案中，人造雌性生殖器官是能夠?qū)に刈鞒龇磻?yīng)的人造子宮。在另一實(shí)施方案中，人造子宮能夠?qū)π约に刈鞒龇磻?yīng)并產(chǎn)生性激素，如雌激素和孕酮。在另一實(shí)施方案中，人造子宮能夠激素調(diào)節(jié)周期事件，例如，構(gòu)造并使子宮內(nèi)膜內(nèi)層脫落，使子宮準(zhǔn)備接受受精胚胎。在另一實(shí)施方案中，人造子宮能夠植入胚泡并支持正在生長的胎兒。人造子宮可被植入到自體受治療者中。例如，可從植入人造雌性器官的同一受治療者培養(yǎng)細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，人造子宮可用于支持同種受治療者外部的胎兒生長。因此，人造子宮可用于支持胎兒在體外生長?？蛇x擇性地，人造子宮可被植入到異種受治療者中。
在另一實(shí)施方案中，人造陰道具有與正常陰道類似的、對(duì)激素和感覺刺激的反應(yīng)。人造陰道的細(xì)胞能夠產(chǎn)生粘液。人造陰道包括對(duì)激素敏感的陰道上皮。雌激素可刺激陰道上皮的增殖和成熟，而孕激素則抑制上皮的成熟。人造陰道能夠收縮。
在另一實(shí)施方案中，人造輸卵管類似正常輸卵管的生理學(xué)。人造輸卵管對(duì)激素敏感，且能夠蠕動(dòng)。人造輸卵管能夠?qū)⒙炎訌穆殉策\(yùn)送到子宮，而且是精子對(duì)卵子授精的位置。
培養(yǎng)時(shí)，再建造體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境對(duì)于重構(gòu)特定的雌性生殖器官而言非常重要。體內(nèi)使用前，雌性生殖細(xì)胞的生長程度可根據(jù)所重構(gòu)的雌性生殖器官類型而改變。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在灌注培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞，例如陰道上皮細(xì)胞之前，可用例如膠原對(duì)三維支架進(jìn)行預(yù)處理，從而提高雌性生殖道細(xì)胞與三維支架的粘附。在另一實(shí)施方案中，可向支架或雌性生殖細(xì)胞中加入各種因子，它們選自營養(yǎng)物，生長因子，細(xì)胞因子，胞外基質(zhì)成分，分化誘導(dǎo)劑，分泌產(chǎn)物，免疫調(diào)制劑，可提高或使細(xì)胞網(wǎng)或神經(jīng)纖維生長的生物活性化合物。
可使用放在三維支架一定位置的針將培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞灌注到生物相容性基質(zhì)中，或鋪層到支架上。在將其放到支架中，或支架上以前，通過體外培養(yǎng)到所需的細(xì)胞密度而使雌性生殖道細(xì)胞擴(kuò)增。實(shí)施例2和3證實(shí)本發(fā)明如何用于體內(nèi)建造重構(gòu)陰道組織。實(shí)施例5和6證實(shí)本發(fā)明如何用于體內(nèi)建造重構(gòu)子宮組織。培養(yǎng)的上皮和平滑肌細(xì)胞類型可維持正常的表型表達(dá)，并繁殖成一個(gè)適合組織替換的大細(xì)胞庫。細(xì)胞接種的聚合物支架將形成管狀化的陰道和子宮組織，它們具有與天然陰道和子宮類似的表型和功能性。本發(fā)明可用于獲得臨床使用的管狀化改造的陰道、子宮、輸卵管和子宮頸組織。
(d)組織加工和細(xì)胞培養(yǎng)按照本領(lǐng)域已知的方法加工并培養(yǎng)組織。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用含有乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)進(jìn)行若干次洗滌循環(huán)?？蓪悠贩旁诟蓛舻呐囵B(yǎng)基貯器中，直到開始顯微解剖的過程。
各種商業(yè)制造的培養(yǎng)基都可用于上皮和平滑肌細(xì)胞的生長。在優(yōu)選實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞使用補(bǔ)充了10％胎牛血清的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM/FBS)，而陰道上皮細(xì)胞(keratinocytes)是在專門用于keritinocytes的沒有血清的培養(yǎng)基中生長的，其中補(bǔ)充了牛垂體的提取物和表皮生長因子(K-SFM)。
很多技術(shù)都可用于分離并培養(yǎng)上皮細(xì)胞，例如，子宮內(nèi)膜細(xì)胞，這些技術(shù)包括基于酶消化和機(jī)械離解的方法(Watson等，J Reprod.Fertil.101(2)415-420(1994)；Akoum等，J.Reprod.Med.41(8)551-561(1996)；Barberini等，Cell Tissue Res.190(2)207-222(1978)；Bentin-Ley等，J.Reprod.Fertil.101(2)327-332(1994))。同源細(xì)胞群體可在其中細(xì)胞基本為單一細(xì)胞群體的情況下建造。在優(yōu)選實(shí)施方案中，上皮和平滑肌細(xì)胞分開生長，各細(xì)胞類型的分離包括外植法或酶消化中的任一方法。這些方法的描述見下列參考文獻(xiàn)，將其整體引入此處作為參考Williams等，Methods Mol.Biol.5139-149(1989)；Baez，C.E.和Atala，A.“Uterus”InMethods of Tissue Engineering.Academic Press1189-1194(2002)；De Filippo，R.E.和Atala，A.“表皮細(xì)胞培養(yǎng)陰道細(xì)胞重構(gòu)”，Methods of Tissue Engineering.AcademicPress 273-275(2002)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，外植法用于分離細(xì)胞。外植法開始先在環(huán)路放大的條件下，用無菌器械小心地進(jìn)行顯微解剖，分離上皮和血清肌肉層。在一個(gè)實(shí)施方案中，將陰道去管狀化(detubularizing)成扁平節(jié)段，從而有助于解剖。將組織的一小部分單獨(dú)放在培養(yǎng)皿上，使它們干燥并與表面粘附。37℃下，將組織切片與適宜培養(yǎng)基在空氣和5％CO2中培養(yǎng)，直到足量的祖代細(xì)胞集落自組織島發(fā)育，這通常要花費(fèi)大約5-7天。外植體可通過輕輕吸出而除去，定期替換培養(yǎng)基以維持細(xì)胞。
在另一實(shí)施方案中，酶消化用于分離細(xì)胞。培養(yǎng)的雌性生殖道細(xì)胞很容易通過將作為細(xì)胞來源的適宜器官或組織解聚而分離。這可使用本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行。例如，組織或器官可被機(jī)械解聚和/或用消化酶和/或螯合劑處理，減弱相鄰細(xì)胞之間的連接，從而能夠?qū)⒔M織分散成單個(gè)細(xì)胞的混懸液，而沒有明顯的細(xì)胞破裂。酶解離可通過切碎組織，并用任意數(shù)量的消化酶單獨(dú)或聯(lián)合處理切碎組織而完成。這些包括，但不限制于，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，膠原酶，彈性酶，和/或透明質(zhì)酸酶，DNA酶，鏈霉蛋白酶和分散酶。機(jī)械破裂也可通過各種方法完成，包括但不限制于，使用研磨機(jī)，攪拌器，篩網(wǎng)，勻漿器，壓榨細(xì)胞，或insonators等(見，例如Freshney，(1987)Culture of Animal Cells.A Manual of Basic Technique，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.9，pp.107-126)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，酶消化法已經(jīng)用于加工和培養(yǎng)上皮細(xì)胞。上皮細(xì)胞的挑剔性有時(shí)使它們很難大量生長。然而，使用酶消化已可成功獲得大量集落。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將粉末形式的IV型膠原酶和分散酶，一種中性蛋白酶結(jié)合，并用K-SFM混懸。然后將這種膠原酶-培養(yǎng)基溶液過濾，以確保無菌。將陰道、子宮、子宮頸、或輸卵管樣品切成若干較大的碎片，浸入到酶溶液中，用力振搖。輕輕吸出，將細(xì)胞-流體混懸液轉(zhuǎn)移到另一無菌試管中，低速旋轉(zhuǎn)離心。最后，除去上清液，將細(xì)胞顆粒狀物重懸浮在培養(yǎng)基中并分配到培養(yǎng)皿中。
(e)細(xì)胞擴(kuò)增可使用本領(lǐng)域熟知的細(xì)胞擴(kuò)增法。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞的傳代是通過先除去培養(yǎng)基，然后用PBS-EDTA洗滌細(xì)胞而進(jìn)行的。用胰蛋白酶-EDTA溶液培養(yǎng)細(xì)胞，并在顯微鏡下監(jiān)測，直至觀察到細(xì)胞分離。將細(xì)胞-胰蛋白酶溶液輕輕吸到無菌試管中，該無菌試管中裝有含血清的培養(yǎng)基，從而滅活胰蛋白酶。將細(xì)胞低速旋轉(zhuǎn)離心。用新鮮培養(yǎng)基把細(xì)胞顆粒狀物重懸浮至預(yù)定體積，將它們等分到若干培養(yǎng)皿中進(jìn)行擴(kuò)增。
IV.細(xì)胞特征描述將組織分解為單個(gè)細(xì)胞的混懸液后，將混懸液分級(jí)成亞群體，從中獲得雌性生殖道細(xì)胞?？色@得同源細(xì)胞群體，其中每個(gè)細(xì)胞群體基本含有相同的細(xì)胞，例如陰道上皮細(xì)胞群體。這還可使用細(xì)胞分離的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行，這些技術(shù)包括但不限制于，特定細(xì)胞類型的克隆和選擇，多余細(xì)胞的選擇性破壞(消極選擇)，基于混合群體中不同細(xì)胞可凝集性的分離，凍融過程，混合群體中細(xì)胞的不同粘著性，過濾，常規(guī)的區(qū)帶離心，離心淘析(反流離心)，單位重力分離，逆流分布，電泳和熒光活化的細(xì)胞分選(見，例如Freshney，(1987)Culture ofAnimal Cells.A Manual of Basic Techniques，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.11和12，137-168頁)。例如，平滑肌細(xì)胞可通過熒光活化細(xì)胞的分選而富集，上皮細(xì)胞可被分解用于平滑肌細(xì)胞的收集。
細(xì)胞可通過使用特殊的分化標(biāo)記來描述。子宮內(nèi)膜上皮的標(biāo)記包括角蛋白中間絲，胞質(zhì)內(nèi)糖原，孕酮受體，和雌激素受體(Centola等，In Vitro 20(6)451-4612(1984)；Cooke等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(7)2109-2113(1986)；Johnson等，Biol.Reprod.61(5)1324-1330(1999)；Kirl等，14(8)651-662(1978)；Merviel等，Biol.Cell.53(3)636-646(1995)；Osteen等，F(xiàn)ertil.Steril.52(6)965-972(1989)；Schatz等，Biol.Reprod.62(3)691-697(2000).細(xì)胞角蛋白中間絲(Bongo等，Hum.Reprod.3(6)705-713(1988)；Classen-Linke等，Cell Tissue Res.287(1)171-185(1997)；Gerschenson等，Pathol.Res.Pract.174(3)285-296(1982))最常用于特性描述。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞可用細(xì)胞特異性抗體描述。即把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到分室載玻片上培養(yǎng)，用4％緩沖甲醛固定，并加工。使細(xì)胞與施加到細(xì)胞表面的抗原-特異性初級(jí)抗體接觸。細(xì)胞特異性抗體的非限制性例子是廣泛反應(yīng)性抗-細(xì)胞角蛋白和抗-平滑肌α-肌動(dòng)蛋白抗體。陰性對(duì)照可用普通血清代替初級(jí)抗體處理。陽性對(duì)照由接觸抗原的細(xì)胞組成。用磷酸鹽緩沖生理鹽水洗滌后，用生物素化的次級(jí)抗體培養(yǎng)分室載玻片，并再次洗滌。加入底物后，還可加入過氧化物酶試劑，在抗體沉積處見到棕色沉淀物。復(fù)染色可用Gill’s蘇木精進(jìn)行。
可使用本領(lǐng)域熟知的任意類型的分子特性描述。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用目標(biāo)區(qū)域抗體，利用蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)行分子水平的細(xì)胞特性描述。例如，單克隆抗體α-肌動(dòng)蛋白，肌球蛋白，和細(xì)胞角蛋白AE1/AE3可用于比較體外培養(yǎng)的細(xì)胞和對(duì)照組的蛋白表達(dá)，從而證實(shí)上皮和平滑肌細(xì)胞系的維持。將細(xì)胞在冷的溶解緩沖液中勻化，收集可溶性蛋白的上清液?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何蛋白定量方法。例如，BioRad DC蛋白測定試劑盒可用于量化蛋白樣品。將等濃度的蛋白上樣，在SDS-PAGE凝膠上分離，4℃下使用初級(jí)抗體作為探針雜交過夜。過氧化物-接合的抗-小鼠次級(jí)抗體是復(fù)合的，可用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測。還可相伴進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，以進(jìn)一步限定細(xì)胞類型。
V.多層a.在去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)上形成多層在一個(gè)實(shí)施方案中，不同的培養(yǎng)的細(xì)胞群體可用于在生物相容性基質(zhì)或去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)，例如去細(xì)胞化的器官，或器官的一部分上產(chǎn)生不同的多層。使用在去細(xì)胞化的器官三維基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)一定位置包埋的針將第一同源細(xì)胞混懸液灌注到去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)中。灌注的細(xì)胞在基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的三維空隙間分布并生長，產(chǎn)生包裹基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞層。灌注第一同源細(xì)胞混懸液后，37℃下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)去細(xì)胞化的器官，直到細(xì)胞發(fā)育并增殖，以產(chǎn)生與去細(xì)胞化的器官基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)粘附的培養(yǎng)的細(xì)胞第一群體的單層。一旦建立了單層，再次將第一同源細(xì)胞混懸液灌注到單層上的去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)中。培養(yǎng)去細(xì)胞化的器官，直到細(xì)胞發(fā)育并增殖，以在第一單層上產(chǎn)生細(xì)胞的第二單層，由此產(chǎn)生雙層。重復(fù)該過程，直到產(chǎn)生第一同源細(xì)胞群體的多層。
第一多層與體內(nèi)器官等價(jià)實(shí)質(zhì)組織的功能性和形態(tài)學(xué)類似。例如，對(duì)于去細(xì)胞化的子宮而言，第一細(xì)胞群體是平滑肌細(xì)胞群體。將平滑肌細(xì)胞混懸液灌注到子宮，陰道，輸卵管或子宮頸中，直到形成平滑肌組織的多層，其具有與子宮，陰道，輸卵管或子宮頸的平滑肌組織(即子宮肌層)類似的功能性。
建造第一多層后，使用不同于第一細(xì)胞群體的第二培養(yǎng)細(xì)胞群體建造第二多層。將第二同源細(xì)胞群體的細(xì)胞混懸液灌注到去細(xì)胞化的器官的第一多層上。灌注的細(xì)胞沿著第一多層分布，培養(yǎng)去細(xì)胞化的器官，直到第二細(xì)胞群體的細(xì)胞發(fā)育并增殖成第一單層。一旦建立了第一單層，再次將第二同源細(xì)胞群體灌注到第一單層上的去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)中。培養(yǎng)去細(xì)胞化的器官，直到細(xì)胞發(fā)育并增殖，以在第一單層上產(chǎn)生第二單層，由此產(chǎn)生雙層。重復(fù)該過程，直到產(chǎn)生第二同源細(xì)胞群體的第二多層。
第二多層與體內(nèi)器官等價(jià)實(shí)質(zhì)組織的功能和形態(tài)性類似。例如，子宮，陰道，輸卵管或子宮頸的第二多層是上皮多層，其與子宮，陰道，輸卵管或子宮頸的上皮組織(即，粘膜)的形態(tài)和功能性類似。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到可產(chǎn)生很多異源多層，從而建造人造雌性生殖器官。每個(gè)多層都包含多層同源細(xì)胞群體，但該多層的細(xì)胞群體是不同的。在一個(gè)實(shí)施方案中，人造器官包括至少約5個(gè)多層。在另一實(shí)施方案中，人造器官包括至少約4個(gè)多層。在另一實(shí)施方案中，人造器官包括至少約3個(gè)多層。在優(yōu)選實(shí)施方案中，人造器官包括至少約2個(gè)多層。
嵌合界面是在兩個(gè)或多個(gè)異源多層彼此相互接觸的地方產(chǎn)生的。從而使未受阻的相互作用在多層的細(xì)胞之間發(fā)生。不同細(xì)胞群體之間的廣泛相互作用導(dǎo)致間質(zhì)生物物質(zhì)的產(chǎn)生，其不同于多層的各層。因?yàn)閮蓚€(gè)不同細(xì)胞群體之間的相互作用沒有受到結(jié)構(gòu)屏障，如生物相容性基底(例如，聚合物)的阻礙，因此嵌合界面上的細(xì)胞可恢復(fù)更自然的形狀和構(gòu)型。通過在嵌合界面提供更有益于體內(nèi)器官的微環(huán)境，嵌合界面的細(xì)胞更自然地發(fā)育并產(chǎn)生生長因子和其它蛋白，促進(jìn)正常的分裂和分化。這可導(dǎo)致間質(zhì)生物物質(zhì)的產(chǎn)生，提供獨(dú)特的生物和功能性，從而建造更類似體內(nèi)那些器官的人造器官。例如，平滑肌多層與人造子宮，陰道，輸卵管或子宮頸上皮多層的相互作用產(chǎn)生一個(gè)嵌合界面，從而導(dǎo)致產(chǎn)生類似體內(nèi)子宮，陰道，輸卵管或子宮頸粘膜下層的細(xì)胞層。粘膜下層提供與平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞相比獨(dú)特的功能性，其中當(dāng)完全發(fā)育時(shí)，粘膜下層可為平滑肌細(xì)胞供給血液。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，當(dāng)含有不同細(xì)胞群體的兩個(gè)或更多異源多層相互作用時(shí)，所產(chǎn)生的任何間質(zhì)生物物質(zhì)都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。所產(chǎn)生的不同間質(zhì)生物物質(zhì)取決于異源多層中的細(xì)胞類型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可將附加膠原層加入到去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面，從而建造平滑表面，如國際PCT
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