專利名稱：用于體外分離和培養(yǎng)具有種系傳遞能力的胚胎干細(xì)胞(es)細(xì)胞系的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型組合物及其在多能干細(xì)胞和種系感受態(tài)胚胎干細(xì)胞的分離、維持或生長中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及用組合物培養(yǎng)產(chǎn)生的ES細(xì)胞以及這些ES細(xì)胞系在種系傳遞及制備基因改造的非人動(dòng)物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及新型組合物及其在成人干細(xì)胞(ASC)的分離、維持或生長中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞ES細(xì)胞系是從胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)中分離出的細(xì)胞系，這些細(xì)胞在特定條件下可以維持很多代，就是說以一定的時(shí)間間隔將這些細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)皿中其多能性不會(huì)丟失。它們能保持正常的核型，外源DNA可以重組(同源的或非同源的)到染色體DNA中，從而使目的基因穩(wěn)定整合。但是到目前為止，種系傳遞，即ES基因組傳遞到下一代也只在某些種系的鼠ES細(xì)胞系中完成。
鼠胚胎干細(xì)胞的首次分離是于1981年。從那以后，已建立了幾種ES細(xì)胞系，現(xiàn)在已被廣泛而成功地用于在鼠基因組內(nèi)導(dǎo)入靶向突變及其他基因修飾?，F(xiàn)在所用的大多數(shù)有種系形成能力的ES細(xì)胞系都來自于129品系，其他的ES細(xì)胞系來自于另外的幾個(gè)飼養(yǎng)品系(C57BL/6及其雜交品系)。而且，即使是129品系，ES細(xì)胞系最多也只能在30％的外植胚囊中獲得，成功率約為10％，與正常的水平接近。
制備嵌合動(dòng)物最常用的方法是將約10-15個(gè)分離的ES細(xì)胞注射到宿主胚泡的胚泡腔中，使這些細(xì)胞與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞混和。然后將所得到的嵌合胚泡移植到受體動(dòng)物體內(nèi)培養(yǎng)。另外，利用很早期(8-16個(gè)細(xì)胞)階段胚胎進(jìn)行二倍體凝集或四倍體凝集也可以作為ES細(xì)胞的宿主。簡言之，就是將ES細(xì)胞夾在無透明帶的早期胚胎之間，培養(yǎng)過夜，然后移植到孵育母體中。這種方法可用于制備嵌合的或完全是ES細(xì)胞來源的子代。
盡管這些年來ES細(xì)胞的培養(yǎng)及嵌合動(dòng)物的制備技術(shù)已有很大提高，但是ES細(xì)胞傳過幾代后其多能性常常降低，并且完全是ES細(xì)胞來源的胎兒(通過四倍體凝集制備)在出生后其存活率顯著降低。Nagy等，″Derivation of completely cell culturederived mice from early-passage embryonic stem cells″Proc Natl Acad Sci USA1993；908424-8，利用早期幾代來源的R1 ES細(xì)胞系與四倍體胚胎進(jìn)行電融合得到凝集體，然后獲得了完全是由ES細(xì)胞來源的小鼠。但是，這些R1 ES細(xì)胞一旦在體外擴(kuò)增培養(yǎng)就失去了其全能性，因?yàn)?4代以后來源的ES細(xì)胞所產(chǎn)生出的小鼠都無法生存到成年。而且，即使用早期幾代的細(xì)胞，許多ES-四倍體凝集體在發(fā)育成個(gè)體前也都死亡了。因此，想要利用晚期傳代的ES細(xì)胞得到發(fā)育正常的ES小鼠是很難實(shí)現(xiàn)的，利用基因改造的ES細(xì)胞制備ES細(xì)胞來源的小鼠好像也是不可能的。
最近，Eggan K等，″Hybrid vigor，fetal overgrowth，and viability of micederived by nuclear cloning and tetraploid embryo Complementation.Proc NatlAcad Sci 2001；986209-14證實(shí)現(xiàn)在的技術(shù)無法利用四倍體凝集的方法從飼養(yǎng)鼠品系的ES細(xì)胞獲得發(fā)育完全的子代。并且發(fā)現(xiàn)基因雜合現(xiàn)象是影響通過核克隆或四倍體胚胎互補(bǔ)制備的ES細(xì)胞來源的子代存活的一個(gè)關(guān)鍵因素。利用任何一種方法制備的培養(yǎng)的ES細(xì)胞來源的胎兒都會(huì)因?yàn)楹粑ソ叨趪a(chǎn)期死亡。與此相對應(yīng)的是，利用任何一種方法制備的F1 ES細(xì)胞來源的幼仔大多數(shù)(80-85％)都能存活到成年。但是在另一項(xiàng)研究中卻發(fā)現(xiàn)ES細(xì)胞來源小鼠的出生死亡率與所用的細(xì)胞系之間沒有明顯的相關(guān)關(guān)系。各種細(xì)胞系來源的小鼠都會(huì)出現(xiàn)出生后死亡現(xiàn)象，包括那些具有不同遺傳背景的細(xì)胞系。將1037個(gè)注射了各種來源ES細(xì)胞的四倍體胚胎移植后得到了34只完全ES細(xì)胞來源的仔鼠(3％)。但是只有13只(1％)仔鼠長到成年(AmanoT，Kato Y，Tsunoda Y.Comparison of heat-treated and tetraploid Blastocystsfor the production of completely ES-cell-derived mice.Zygote 2001；9153-7)。
已經(jīng)從小鼠之外的其他許多物種中分離出了假定的多能ES細(xì)胞，其中包括倉鼠、豬、羊、牛、水貂、大鼠、靈長類、人、雞、小猿、青鳉和男人(man)。但是只有幾個(gè)例子(豬、雞、青鳉)用這些細(xì)胞系通過重新注入胚泡培養(yǎng)出了嵌合體動(dòng)物，但是還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到種系傳遞。
從預(yù)先植入的兔胚泡中分離多能ES細(xì)胞系是Graves KH，Moreadith RW，″Derivation and characterization of putative pluripotential embryonic stemcells from preimplantation rabbit embryos″，Mol Reprod Dev 1993；36424-33報(bào)道的。這些細(xì)胞系可以分化成不同類型的細(xì)胞，分別屬于不同的所有三個(gè)胚層(用體外的標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)其多能性)。最近的研究表明，這些從Dutch Belted品系來源的細(xì)胞系在注射到受體New Zealand White品系的胚泡中可以生出具有明顯包被色的嵌合體，證明這些細(xì)胞在體內(nèi)也具有多能性。但是還無法達(dá)到種系傳遞。另外的試驗(yàn)表明嵌合體形成的頻率低以及無法達(dá)到種系傳遞可能是由于這些ES細(xì)胞經(jīng)過多次傳代后已丟失了多能性。
ES細(xì)胞在滋養(yǎng)層細(xì)胞存在的條件下可以維持在不分化的狀態(tài)，因?yàn)樽甜B(yǎng)層細(xì)胞可以產(chǎn)生各種阻止細(xì)胞分化的因子。研究表明有幾種細(xì)胞因子具有這種效應(yīng)DIA/LIF(分化抑制活性/白血病抑制因子)、白細(xì)胞介素-6聯(lián)合可溶性白細(xì)胞介素-6受體、白細(xì)胞介素-11、抑瘤蛋白M、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子和心臟營養(yǎng)蛋白?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)即使沒有滋養(yǎng)層細(xì)胞利用這類因子也可以至少將ES細(xì)胞維持幾代。除了小鼠以外，其他物種的ES細(xì)胞技術(shù)還處于發(fā)展之中，除了小鼠以外還沒有公開發(fā)表的數(shù)據(jù)報(bào)道能在其他任何物種中達(dá)到種系傳遞。
重組的白血病抑制因子(LIF)現(xiàn)在已被常規(guī)添加到培養(yǎng)介質(zhì)中用于體外培養(yǎng)從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離的胚胎干細(xì)胞(ES)。這種方法見于US 5,166,065，EP 0380646和WO9001541的權(quán)利要求，這些專利文獻(xiàn)中的方法也是從以前的文獻(xiàn)AU1988P109644(出版日期為1988年8月22日(51-53))發(fā)展而來的。重組鼠或人LIF蛋白的純化和cDNA的克隆是基于其能夠誘導(dǎo)鼠單核細(xì)胞系M1分化成成熟巨核細(xì)胞從而失去克隆形成能力。(重組)蛋白或cDNA(鼠或人突變株)見于US 5,187,077(以及其他幾個(gè)后續(xù)專利，直到2001年7月17日出版的US 6,261,548)和EP 285448，這些專利文獻(xiàn)也是根據(jù)1987年8月2日出版的文獻(xiàn)AU1987 PI1209發(fā)展而來的。
后來的實(shí)驗(yàn)證明LIF與以前所純化的蛋白和/或生物活性物質(zhì)具有一致性。Hozumi等人于1980-1986期間的研究純化出了同質(zhì)性的因子D，該因子能刺激鼠單核細(xì)胞系M1的分化并能抑制其增殖，Tomida M，Yamamoto-Yamaguchi Y，Hozumi M.Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemicM1 cells from conditioned medium or mouse fibroblast L929 cells.J Biol Chem1984；25910978-82)。隨后發(fā)現(xiàn)因子D cDNA與LIF的cDNA序列一致(Lowe DG，NunesW，Bombara M，McCabe S，Ranges GE，Henzel W，Tomida M，Yamamoto-YamaguchiY，Hozumi M，Goeddel DV.Genomic cloning and heterologous expression of humandifferentiation-stimulating factor.DNA 1989；8351-9)。在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中使用LIF是因?yàn)檠芯堪l(fā)現(xiàn)Buffalo大鼠肝細(xì)胞分泌的DIA(分化抑制活性蛋白)可以抑制鼠胚胎干細(xì)胞的分化。
隨后在cDNA水平和蛋白水平上確定了DIA和LIF的一致性(Smith AG，Heath JK，Donaldson DD，Wong GC，Moreau J，Stahl M，Rogers D.Inhibition of pluripotentialembryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.Nature 1988；336688-90；Smith AG，Nichols J，Robertson M，Rathjen PD.Differentiationinhibiting activity(DIA/LIF)and mouse development.Devel Biol 1992；151339-51.)。
在過去十年中重組DNA技術(shù)的進(jìn)展大大促進(jìn)了基因的分離和操作，任何能想到的新型構(gòu)建體都可以通過基因工程技術(shù)構(gòu)建出來，例如通過將一個(gè)基因的啟動(dòng)子與另一個(gè)基因的編碼序列相連接，或者通過位點(diǎn)特異性的突變技術(shù)。同樣，在胚胎操作領(lǐng)域的進(jìn)展方便了將這些新型外源基因轉(zhuǎn)移到內(nèi)源性染色體DNA內(nèi)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以通過下列方法制備將DNA注射到受精卵的原核內(nèi)、將多能胚胎干細(xì)胞(ES)注入(基因操作)到宿主“胚胎”內(nèi)、以及最近所普遍使用的通過核轉(zhuǎn)移將體細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到去核的卵母細(xì)胞內(nèi)。
通過對當(dāng)前技術(shù)的回顧分析發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在需要一種比較經(jīng)濟(jì)的組合物來使ES細(xì)胞在傳過多代后依然能夠維持其多能性及種系傳遞能力。另外還需要制備具有不同基因背景的轉(zhuǎn)基因鼠品系以及制備其他非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這些動(dòng)物可用于特定基因生物學(xué)效應(yīng)的研究、治療性基因產(chǎn)物的藥物制備、改良家畜的生產(chǎn)等。
使培養(yǎng)的干細(xì)胞保持未分化表型所遇到的困難并不局限在胚胎干細(xì)胞。不同譜系的成年干細(xì)胞也有失去其分化成不同細(xì)胞類型的能力的趨勢。對于造血干細(xì)胞來說維持其干細(xì)胞表型尤其困難。
造血干細(xì)胞(縮寫為HSC)是從外周血、臍帶血或骨髓中分離的細(xì)胞，這些細(xì)胞可以更新自身并且可以分化成各種特異的細(xì)胞。骨髓HSC可以從骨髓中動(dòng)員出來。HSC可能經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡，被稱為細(xì)胞調(diào)亡，通過這種過程細(xì)胞發(fā)生有害的自我毀滅或非必須的自我毀滅。據(jù)認(rèn)為在每10,000到15,000個(gè)骨髓細(xì)胞中約有1個(gè)干細(xì)胞。在血液中每100,000個(gè)血細(xì)胞約有1個(gè)干細(xì)胞(Stem cellsscientific progressand future research directions Jun 2001，NIH)。在過去30年中，造血祖細(xì)胞/干細(xì)胞的移植作為一種治療方案已取得了確實(shí)的臨床療效，并且已經(jīng)成為了一種治療多種惡性腫瘤、良性的血液疾病和發(fā)育不良而造成的血液系統(tǒng)疾病以及遺傳性疾病的標(biāo)準(zhǔn)方案(Dupont B.(1997)in Immunology Reviews，Vol.157，5-12.)。造血干細(xì)胞移植在下述治療方案中取得了特別成功的效果用高劑量的化療或放療摧毀體內(nèi)現(xiàn)存的病態(tài)血細(xì)胞或腫瘤，從而限制血液、間質(zhì)和免疫患者重新生成血液和免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。將供體的干細(xì)胞輸注到患者的靜脈內(nèi)，如果移植成功，供體的造血干細(xì)胞就能生長，從而恢復(fù)受體的骨髓及其血液形成功能。
雖然自體骨髓或外周血干細(xì)胞具有廣泛的用途，但是在許多情況下需要進(jìn)行同種異體移植，因?yàn)檫M(jìn)行自體干細(xì)胞移植時(shí)會(huì)有將惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)移到惡性疾病患者體內(nèi)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，另外，要找到白細(xì)胞抗原(HLA)一致性的同胞常常也很困難。對同種異體骨髓移植的主要限制在于缺少合適的HLA完全相匹配的供體，同時(shí)HLA不相配時(shí)容易發(fā)生移植物抗宿主免疫反應(yīng)。
由于胎盤血液，也就是大家所熟知的臍帶血(UCB)含有較多的HSC、與成年骨髓相比具有較多的髓樣前體細(xì)胞和紅系前體細(xì)胞、較大比例的未成熟克隆形成細(xì)胞、較小的傳播感染疾病的危險(xiǎn)以及較高比例的端粒酶，因此利用UCB可以解決許多問題(Mayani H，Lansdorp P.in(1998)Stem Cells.16，153-165)。第一例成功的移植發(fā)生于1988年的一個(gè)Fanconi貧血患者身上(Gluckman E等，(1989)in N.Engl.J.Med.，3211174-8)，結(jié)果證明人的UCB是一種適宜的HSC替代資源，這一結(jié)果促進(jìn)了在世界范圍內(nèi)建立大規(guī)模的臍帶血庫(Sirchia G.和Rebulla P.(1999)inHaematologica，84738-747)。臍帶血最主要的問題在于每個(gè)供體臍帶血平均只含有1.5×105個(gè)有核細(xì)胞，按常規(guī)來說也只有1/10的有核細(xì)胞能用于成人的骨髓移植(Fasouliotis S.和Schenker J.(1999).Eur.J.Obst.Gynecol.Reprod.Biol.913-25)。醫(yī)生很難從一個(gè)產(chǎn)婦的臍帶血中分離出超過幾百萬個(gè)UCB HCS，因此其數(shù)量太少而無法移植給成年人，成年人所需要的理想的移植數(shù)量為每公斤體重(b.w.)7百萬到1千萬個(gè)CD34+細(xì)胞，但是這些數(shù)量對于兒童來說是足夠的，盡管CD34+細(xì)胞輸注的數(shù)量與所得到的移植效率之間常常存在差異。最近有些作者建議移植的閾值應(yīng)為5×104CD34+CD38-細(xì)胞/KG b.w.，在這個(gè)閾值以下三線移植動(dòng)力學(xué)明顯變慢并且無法預(yù)測(Henon PH等，(2001)in J.Biol.Regul.Homeost.Agents.15，62-67)。這種較低數(shù)目的NC意味著臍帶血的廣泛應(yīng)用受到限制。因此干細(xì)胞研究所遇到的主要挑戰(zhàn)在于如何找到體外培養(yǎng)條件來改進(jìn)可移植HCS在體外的長期維持和擴(kuò)增。這種培養(yǎng)體系的建立是在體外操作和擴(kuò)增可移植HSC從而用于臨床的先決條件，如基因治療、腫瘤細(xì)胞凈化以及干細(xì)胞移植。
現(xiàn)在還需要適宜的實(shí)驗(yàn)室條件來刺激干細(xì)胞的擴(kuò)增而不使其丟失干細(xì)胞特性，這樣就可以增加一個(gè)供體來源的可移植細(xì)胞的數(shù)量供患者移植?，F(xiàn)在已經(jīng)證明HCS的擴(kuò)增存在問題，除了用于替代血液和免疫系統(tǒng)以外，科學(xué)家在擴(kuò)展其應(yīng)用時(shí)遇到了障礙。首先，HSC在體外無法增殖(復(fù)制自身)和分化(變成其他類型的專業(yè)化細(xì)胞)(Lagasse E.，Weissman IL.，(2001)in Immunity，14，425-436.)；其次，科學(xué)家們還沒有一個(gè)準(zhǔn)確的概念來判斷哪些是真正的干細(xì)胞。盡管還無法以繁殖的方式在體外無基質(zhì)的培養(yǎng)基中長期擴(kuò)增有集落形成能力的細(xì)胞，但是繼續(xù)探索控制造血干細(xì)胞增殖和分化的機(jī)制有利于開發(fā)出不僅可以擴(kuò)增前體細(xì)胞而且可以擴(kuò)增HSC的培養(yǎng)系統(tǒng)(Verfaillie C.(2002).in Nature immunol.3，314-317)。Lewis I.等，(2001)in Blood 97，3441-3449用含滋養(yǎng)層細(xì)胞和細(xì)胞因子的非接觸培養(yǎng)基擴(kuò)增HSC來源的CD34+細(xì)胞，結(jié)果表明這些擴(kuò)增的細(xì)胞移植到NOD/SCID(非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷)小鼠體內(nèi)后可以重新形成集落。Piacibello等，(1997)在Blood89，2644-2653發(fā)表的文章結(jié)果表明CD34+HSC來源的細(xì)胞在無細(xì)胞因子的培養(yǎng)基內(nèi)數(shù)量快速下降并且在三周內(nèi)死亡。Piacibello等，(1999)在Blood 93，11，3736-3749中描述CD34+HSC細(xì)胞在含有混合生長因子的無基質(zhì)擴(kuò)增基中最多可以擴(kuò)增到10周，并且移植到亞致死劑量照射的NOD/SCID小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)還有集落形成能力。因此依然需要找到新型的或替代的添加或不添加生長因子的培養(yǎng)基來擴(kuò)增成年干細(xì)胞或早期祖細(xì)胞如HSC。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于分離、維持或生長多能干細(xì)胞和哺乳動(dòng)物種系感受態(tài)胚胎干細(xì)胞的新型和超級組合物及其應(yīng)用。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，涉及用于分離、維持或生長多能干細(xì)胞和人或非人哺乳動(dòng)物種系感受態(tài)胚胎干細(xì)胞的組合物，所述組合物含有用于培養(yǎng)特定細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，其中，所述組合物中含有的白血病抑制因子(LIF)濃度低于2ng/ml，LIF的含量是通過免疫分析方法測定的，如利用能與兔和人LIF發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體的ELISA分析方法，例如抗人LIF的鼠單克隆抗體克隆9824.11。LIF的濃度優(yōu)選小于1ng/ml，更優(yōu)選的是小于0.5ng/ml、0.2ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml，最優(yōu)選的是小于0.02ng/ml，所用的分析方法如上所述。組合物可以包含基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，例如而不限于含高糖DMEM的培養(yǎng)基，其中還可以選擇添加一種或多種化合物，如非必須氨基酸、谷胺酰胺、還原劑、胎兒血清、新生兒血清或成年血清如胎牛血清。細(xì)胞的條件培養(yǎng)基來自永生成纖維細(xì)胞如兔成纖維細(xì)胞株Rab9(ATTC CRL-1414)。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面涉及用于分離、維持或生長多能干細(xì)胞和人或非人哺乳動(dòng)物種系感受態(tài)胚胎干細(xì)胞的組合物，所述組合物含有條件培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基是經(jīng)被編碼LIF的核苷酸序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞調(diào)節(jié)的。所述的核苷酸序列編碼哺乳動(dòng)物的LIF，優(yōu)選編碼兔的LIF。所述的核苷酸序列可以是cDNA序列，但是最好是哺乳動(dòng)物L(fēng)IF的基因組序列。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系最好能穩(wěn)定表達(dá)LIF編碼核苷酸序列。用于轉(zhuǎn)染LIF編碼核苷酸序列的細(xì)胞可以是任何哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，但是優(yōu)選成纖維細(xì)胞，更優(yōu)選的是兔成纖維細(xì)胞系，最優(yōu)選的是兔Rab9(ATCC CRL 1414)。本發(fā)明所用的轉(zhuǎn)染細(xì)胞是被兔LIF編碼基因組序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的兔Rab9成纖維細(xì)胞。這種細(xì)胞保藏在比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(Belgian Coordinated Collection of Microorganisms，Belgium)，保藏號(hào)為LMBP 5479CB。組合物可以包含基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，例如而不限于含高糖DMEM的培養(yǎng)基，其中還可以選擇添加一種或多種化合物，如非必須氨基酸、谷胺酰胺、還原劑、除胎牛血清之外的胎兒血清、新生兒血清或成年血清如胎馬血清、胎山羊血清、胎綿羊血清。
本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及用于分離、維持或生長多能干細(xì)胞和人或非人哺乳動(dòng)物種系感受態(tài)胚胎干細(xì)胞的組合物，所述組合物含有經(jīng)某些特定細(xì)胞條件培養(yǎng)基，其中，所述組合物添加了兔LIF、與兔LIF至少具有95％一致性的蛋白或其功能性衍生物。所述的蛋白可用適于蛋白表達(dá)的酵母進(jìn)行表達(dá)，如甲基營養(yǎng)酵母畢赤酵母，其中編碼所述蛋白的核苷酸序列可以選擇以便于得到最佳的序列用于酵母表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明所描述的兔LIF是用畢赤酵母細(xì)胞系表達(dá)的，該細(xì)胞系保藏在比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心，保藏號(hào)為MUCL-42925。
組合物可以包含基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，例如而不限于含高糖DMEM的培養(yǎng)基，其中還可以選擇添加一種或多種化合物，如非必須氨基酸、谷胺酰胺、還原劑、胎兒血清、新生兒血清或成年血清如胎牛血清。
本發(fā)明描述了這些組合物在擴(kuò)增非人哺乳動(dòng)物多能胚胎干細(xì)胞方面的應(yīng)用，這些細(xì)胞的來源包括而不限于小鼠，更優(yōu)選的是Mus musculus品系小鼠，如129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/DBA1LacJ、CD1、BALB/c、MRL，C57BL/6×CBA和有SwissWebster遺傳背景的小鼠。
本發(fā)明還涉及人或非人哺乳動(dòng)物的多能胚胎干細(xì)胞，這些細(xì)胞的來源包括而不限于小鼠，更優(yōu)選的是Mus musculus品系小鼠，如129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N、DBA1LacJ、CD1、BALB/c、MRL，C57BL/6×CBA和有Swiss Webster遺傳背景的小鼠，這些細(xì)胞在本發(fā)明的組合物中至少要培養(yǎng)1代。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中包括而不限于小鼠，更優(yōu)選的是Musmusculus品系小鼠，如129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N、DBA1LacJ、CD1、BALB/c、MRL，C57BL/6×CBA和有Swiss Webster遺傳背景的小鼠，這些小鼠都是利用在本發(fā)明的組合物中至少培養(yǎng)了1代的胚胎干細(xì)胞制備的。
本發(fā)明還涉及制備本說明書所描述的組合物、胚胎干細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。
本發(fā)明描述了兔細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基在擴(kuò)增胚胎干細(xì)胞和制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用，這種培養(yǎng)基可用于制備其他非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如非人靈長類動(dòng)物、豬、綿羊、牛、水貂、馬、山羊、綿羊、貓、犬、兔、大鼠、倉鼠以及鼠Mus Muculus之外的嚙齒類動(dòng)物。
本發(fā)明還描述了利用胚胎干細(xì)胞獲得30％或更高外植胚泡的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步描述了通過凝集細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞混和獲得成年后代的方法，其中，所述胚胎干細(xì)胞至少培養(yǎng)了16代。
本發(fā)明特別涉及用于分離、維持或生長多能干細(xì)胞和哺乳動(dòng)物種系感受態(tài)胚胎干細(xì)胞的新型組合物。組合物包含基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，例如而不限于含高糖DMEM的培養(yǎng)基、非必須氨基酸、谷胺酰胺、還原劑和胎牛血清或其類似物的組合物。所述組合物預(yù)先經(jīng)過穩(wěn)定的細(xì)胞系來調(diào)節(jié)，例如而不限于兔細(xì)胞系Rab9(ATCC CRL-1414)或類似細(xì)胞系，這些細(xì)胞系能夠分泌ES細(xì)胞生長和自我更新所必須的因子。未分化狀態(tài)的維持，如形態(tài)學(xué)及表面標(biāo)記指標(biāo)(存在堿性磷酸酶而缺乏波形蛋白和細(xì)胞角蛋白)，要比利用含鼠LIF或兔LIF的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)出來的細(xì)胞指標(biāo)重要。
這種組合物中可以選擇添加重組白血病抑制因子(LIF)，優(yōu)選本發(fā)明所描述的兔LIF(Rab-LIF)或購買的LIF。組合物中也可以包含抗生素，如青霉素/鏈霉素和胰島素。本發(fā)明還涉及用于體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞維持未分化狀態(tài)的新型兔LIF(Rab-LIF)以及編碼Rab-LIF的核苷酸序列。ES培養(yǎng)基中還可以含有其他組分，如白細(xì)胞介素、抑瘤蛋白、神經(jīng)營養(yǎng)因子、干細(xì)胞因子和成纖維細(xì)胞生長因子。這些因子較特殊的例子是白細(xì)胞介素11、人抑瘤蛋白M、人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、心臟營養(yǎng)蛋白、白細(xì)胞介素6及其受體以及人干細(xì)胞因子。本發(fā)明還涉及利用這些ES細(xì)胞進(jìn)行種系傳遞和制備經(jīng)基因改造的非人動(dòng)物。
本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的新型組合物分離、維持或生長原始生殖細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及用于哺乳動(dòng)物成年干細(xì)胞或早期祖細(xì)胞無基質(zhì)擴(kuò)增的組合物。例如造血干細(xì)胞和成年早期造血祖細(xì)胞，用于培養(yǎng)ASC的組合物包含成纖維細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基。成纖維細(xì)胞系優(yōu)選永生細(xì)胞系，更優(yōu)選的是兔的永生成纖維細(xì)胞系，最優(yōu)選的是Rab9(ATCC CRL1414)細(xì)胞系。用于培養(yǎng)ASC的組合物優(yōu)選不添加細(xì)胞因子和/或LIF的。
本發(fā)明還涉及利用組合物擴(kuò)增ASC或早期祖細(xì)胞，如HSC。這些HSC包括從臍帶血、胎盤血、外周血和骨髓中分離出的CD34+細(xì)胞。利用這種組合物，細(xì)胞的擴(kuò)增總量至少要達(dá)到25倍。利用所述組合物擴(kuò)增CD34+細(xì)胞至少可以擴(kuò)增3倍。利用這種組合物擴(kuò)增的細(xì)胞至少要培養(yǎng)15天，在LTC IC檢測中呈陽性反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)至少要增加15倍。
本發(fā)明還涉及擴(kuò)增哺乳動(dòng)物成年干細(xì)胞或早期祖細(xì)胞的方法，所述方法包括分離哺乳動(dòng)物成年干細(xì)胞或早期祖細(xì)胞以及在無基質(zhì)的條件下培養(yǎng)這些細(xì)胞，培養(yǎng)條件中包含本發(fā)明的用于培養(yǎng)ASC的組合物。該方法可用于培養(yǎng)造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞。該方法在ASC擴(kuò)增到至少25倍以前、有核細(xì)胞擴(kuò)增到至少10倍以前或者CD34+細(xì)胞擴(kuò)增到至少3倍以前都可以使用。該方法可以一直使用到使擴(kuò)增的細(xì)胞在LTC IC檢測中呈陽性反應(yīng)的數(shù)目增加到至少15倍以前。該方法可用于獲得擴(kuò)增的HSC細(xì)胞，這些擴(kuò)增的細(xì)胞可在經(jīng)亞致死劑量照射的NOD/SCID(非肥胖型/重癥聯(lián)合免疫缺陷)小鼠體內(nèi)形成集落。
本發(fā)明還涉及利用經(jīng)穩(wěn)定細(xì)胞系條件培養(yǎng)基擴(kuò)增骨髓、胎兒血、臍帶血和外周血來源的造血干細(xì)胞。組合物包含基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，例如而不限于含高糖DMEM的培養(yǎng)基、非必須氨基酸、谷胺酰胺、reducing agen和胎牛血清或其類似物的組合物。所述組合物預(yù)先經(jīng)過穩(wěn)定的細(xì)胞系來調(diào)節(jié)，例如而不限于兔細(xì)胞系Rab9(ATCC CRL-1414)或類似細(xì)胞系，這些細(xì)胞系能夠分泌造血干細(xì)胞生長和自我更新所必須的因子。
本發(fā)明參考下面的附圖來描述。
附圖簡述

圖1顯示的是兔LIF(Rab-LIF)cDNA的核苷酸序列[SEQ.ID.NO1]及其肽序列[SEQ.ID.NO2]。
圖2顯示的是能在畢赤酵母中達(dá)到最佳表達(dá)的兔LIF cDNA的核苷酸序列[SEQ.ID.NO3]和氨基酸序列[SEQ.ID.NO4]。
圖3顯示的是粘附的C57BL6/N小鼠胚泡的原代細(xì)胞(0代)，培養(yǎng)的條件分別為A)添加LIF(1000IU/ml)的濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基；B)添加Rab-LIF(10-20ng/ml)的濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基；C)經(jīng)Rab9成纖維細(xì)胞系調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；D)經(jīng)Rab9#19成纖維細(xì)胞系調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；E)濃縮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
圖4顯示的是在下列培養(yǎng)基中培養(yǎng)1代的ES細(xì)胞克隆的形態(tài)A)添加LIF(1000IU/ml)的濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基；B)添加Rab-LIF的濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基；C)經(jīng)Rab9成纖維細(xì)胞系調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；D)經(jīng)Rab9#19成纖維細(xì)胞系調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；E)濃縮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
圖5顯示的是HUC來源的CD34+細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中所擴(kuò)增出的有核細(xì)胞的生長曲線(用原始細(xì)胞群的溶脹因子表示)。圖例實(shí)線加正方形經(jīng)Rab9#19細(xì)胞條件培養(yǎng)基；實(shí)線加三角經(jīng)Rab9細(xì)胞條件培養(yǎng)基；實(shí)線加圓形基礎(chǔ)ES培養(yǎng)基；虛線加圓形加細(xì)胞因子的基礎(chǔ)ES培養(yǎng)基。
圖6HUC來源的CD34+細(xì)胞培養(yǎng)物在不同培養(yǎng)基中擴(kuò)增出的CD34+細(xì)胞(用原始CD34+細(xì)胞的溶脹因子表示)。圖例實(shí)線加正方形經(jīng)Rab9#19細(xì)胞條件培養(yǎng)基；實(shí)線加三角經(jīng)Rab9細(xì)胞條件培養(yǎng)基。
圖7HUC來源的CD34+細(xì)胞培養(yǎng)物在不同培養(yǎng)基中擴(kuò)增出的LTC-IC陽性細(xì)胞(用原始LTC-IC陽性細(xì)胞的溶脹因子表示)。圖例實(shí)線加正方形經(jīng)Rab9#19細(xì)胞條件培養(yǎng)基；實(shí)線加三角經(jīng)Rab9細(xì)胞條件培養(yǎng)基。
定義本發(fā)明的胚胎干細(xì)胞(縮寫為ES)是指從胚泡階段胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出的細(xì)胞或植入后胚胎的原始生殖細(xì)胞來源的細(xì)胞(原始生殖細(xì)胞或胚芽生殖細(xì)胞)。ES細(xì)胞可在特殊的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)許多代而不丟失其多能性。
本發(fā)明的多能是指干細(xì)胞能分化成不同類型的細(xì)胞和組織，其中包括能支持胚胎發(fā)育但其本身不能生成生殖細(xì)胞系(精細(xì)胞和卵細(xì)胞)的細(xì)胞和組織。
本發(fā)明的種系形成能力、全能性是指干細(xì)胞可以分化成各種類型的細(xì)胞和組織，其中包括生殖細(xì)胞(精細(xì)胞和流卵細(xì)胞)。
白血病抑制因子(LIF)是指一種哺乳動(dòng)物蛋白，最先由Gearing等，(1987)EMBO J.6，3995-4002克隆和測序，該因子可用于胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)來源的未分化胚胎干細(xì)胞的分離、維持或生長。LIF也指LIF的剪接變體和一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基突變、插入或被限制性酶切去除的變體，其中LIF變體與野生型LIF的序列一致性至少要有95％，并且能用于胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)來源的未分化胚胎干細(xì)胞的分離、維持或生長。
本文所用的LIF的功能片段是指N端或C端缺失的LIF蛋白，但該片段也能用于胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)來源的未分化胚胎干細(xì)胞的分離、維持或生長。
本發(fā)明的“非富含細(xì)胞因子和/或LIF”用于ASC是指維持或生長細(xì)胞的組合物不含額外的細(xì)胞因子或LIF。添加或富含意味著向組合物中補(bǔ)充蛋白形式的細(xì)胞因子或LIF。也可指通過短暫或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染用于預(yù)先調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的細(xì)胞來添加這些化合物。
本文所用的“成年干細(xì)胞”是指從哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離出來的多能成年干細(xì)胞，如嚙齒類動(dòng)物(如小鼠和大鼠)和靈長類動(dòng)物，尤其是人。成年干細(xì)胞可以來源于非胚胎器官或組織，但是具有被誘導(dǎo)分化成中胚層、外胚層和內(nèi)胚層起源的三種不同類型分化細(xì)胞中一種類型細(xì)胞的能力。能分離出成年干細(xì)胞的器官或組織的例子包括而不限于骨髓、臍帶血或胎盤。不同類型的成年干細(xì)胞可以分化出不同類型的細(xì)胞，例如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨髓基質(zhì)、骨骼肌、平滑肌、心肌、眼細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、造血細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元或少突膠質(zhì)細(xì)胞。
本發(fā)明的“早期成年祖細(xì)胞”是指丟失了其來源干細(xì)胞的一個(gè)或幾個(gè)標(biāo)記的細(xì)胞，但是還能夠分化成許多細(xì)胞系，雖然比其來源干細(xì)胞所能分化成的細(xì)胞系數(shù)目少。
“造血干細(xì)胞”(縮寫為HSC)是指從外周血、臍帶血或骨髓中分離出的能自我更新并且能分化成各種專業(yè)細(xì)胞的細(xì)胞。HSC可以增殖分化成紅系、中性粒-巨噬細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系以及淋巴造血系的細(xì)胞團(tuán)。HSC表達(dá)CD34、c-kit和thy1，不表達(dá)CD38。
細(xì)胞系的保藏表達(dá)兔LIF的畢赤酵母細(xì)胞系X33(RbL)于2000年7月5日由Thromb-X(Leopoldstraat 1,3000 Leuven，Belgium)保藏于比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCCM)，Mycothèque de I’Université Catholique de Louvain(MUCL)PlaceCroix duSud，B 1348 Louvain la Neuve，Belgium，保藏號(hào)為MUCL 42925。
表達(dá)兔LIF的兔成纖維細(xì)胞系(Rab9#19克隆)于2000年8月7日由Thromb-X(Leopoldstraat 1,3000 Leuven，Belgium)保藏于比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCCM)，Laboratorium voor Moleculaire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)Universiteit Gent，K.L.Ledeganckstraat 35,9000 Gent，Belgium，保藏號(hào)為LMBP5479CB。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及利用本文描述的組合物分離、維持或生長多能的和種系感受態(tài)哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞(ES)系，例如小鼠品系來源的細(xì)胞系。
這些經(jīng)改進(jìn)的培養(yǎng)條件可用于培養(yǎng)各種具有不同遺傳背景的鼠穩(wěn)定ES細(xì)胞，這些細(xì)胞具有出色的種系傳遞能力。該技術(shù)也可用于其他種類的非人哺乳動(dòng)物(兔、豬、牛等)，成為利用靶向性轉(zhuǎn)基因技術(shù)在非鼠類動(dòng)物中進(jìn)行添加功能或刪除功能的基礎(chǔ)。
組合物內(nèi)含有預(yù)先用穩(wěn)定的細(xì)胞系調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，這種細(xì)胞能分泌ES細(xì)胞生長和自我更新所必須的因子。純化的重組白血病抑制因子(LIF)也可以加到這些組合物中，例如以較低的濃度。
在一個(gè)實(shí)施方式中，基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基是含高糖的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基DMEM，添加了非必須氨基酸、谷氨酰胺、β-巰基乙醇和胎牛血清，穩(wěn)定細(xì)胞系是兔成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系Rab9(ATCC CRL-1414)。選擇添加的LIF最好是最新發(fā)現(xiàn)的兔LIF(Rab-LIF)，它可以幫助體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞保持未分化狀態(tài)，利用優(yōu)選的cDNA序列可以在畢赤酵母中表達(dá)這個(gè)因子。
細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中的LIF可通過定量的免疫分析方法如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、放射免疫計(jì)量分析法(IRMA)、熒光免疫分析法(FIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)或電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(ECL)利用抗LIF的抗體進(jìn)行測定。在本發(fā)明中利用抗兔LIF的單克隆抗體，如鼠抗人LIF單克隆抗體9824.11，進(jìn)行ELISA是優(yōu)選的分析方法。這種分析方法的一個(gè)例子就是Quantikine人LIF免疫分析法(Cat No DLF00，R&D Systems Minneapolis，MN，USA)。
本發(fā)明的組合物所含有的各組分的含量可以是變化的，只要其濃度足以使ES細(xì)胞在培養(yǎng)基中維持一個(gè)較長時(shí)期的未分化狀態(tài)就可以。本發(fā)明的組合物含有成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基，其中包括而不限于磷酸鹽緩沖液(PBS)、Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、Iscove改進(jìn)的Dulbecco培養(yǎng)基、McCoy 5A培養(yǎng)基、Eagle極限必需培養(yǎng)基(MEM)、RPMI 1640、培養(yǎng)基199、MCDB培養(yǎng)基、RPMI、Glasgow極限必需培養(yǎng)基Eagle(GMEM)、DMEM/F-12培養(yǎng)基、Hams F-10營養(yǎng)混合物、Leibovitz’sL15培養(yǎng)基、CMRL培養(yǎng)基、BGJb培養(yǎng)基、Eagle基本培養(yǎng)基(BME)、Brimster’s BMOC-3培養(yǎng)基、William培養(yǎng)基E和McCoy培養(yǎng)基或稍加改變的培養(yǎng)基等。在組合物中還可以加入還原劑如β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇。
在含有細(xì)胞條件培養(yǎng)基的組合物中，如果細(xì)胞未轉(zhuǎn)染編碼LIF的DNA則培養(yǎng)基中可以加入成年血清、新生兒血清或胎兒血清。但是如果細(xì)胞被編碼LIF的DNA轉(zhuǎn)染，則所加的血清成年血清或新生兒血清，或者除胎牛血清外的胎兒血清如胎馬血清、胎山羊或胎綿羊血清。
本發(fā)明的優(yōu)選組合物的組成如下每升成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系條件培養(yǎng)基中加入50-120ml胎牛血清、10-25ml非必須氨基酸、2-8μl β-巰基乙醇、0.5-2.5ml胰島素以及80-130ml基礎(chǔ)ES細(xì)胞培養(yǎng)基，其中優(yōu)選的是分別加入8ml胎牛血清、17ml非必須氨基酸、5μl β-巰基乙醇、1.25ml胰島素。
基礎(chǔ)ES細(xì)胞培養(yǎng)基含有400-600ml、優(yōu)選500ml高糖DMEM，0-15ml、優(yōu)選13ml青霉素/鏈霉素，10-15ml、優(yōu)選13ml非必須氨基酸，10-15ml、優(yōu)選13ml谷氨酰胺，5-10μl、優(yōu)選6.3μl β-巰基乙醇，50-100ml，優(yōu)選70ml胎牛血清，優(yōu)選7.4的中性pH值。
本發(fā)明還涉及分離和培養(yǎng)哺乳動(dòng)物ES細(xì)胞以獲得多能和種系感受態(tài)ES細(xì)胞的方法，其中哺乳動(dòng)物ES細(xì)胞的培養(yǎng)至少部分是用本發(fā)明及上面所描述的組合物。這種方法包括如下步驟a)培養(yǎng)胚泡階段胚胎細(xì)胞；b)培養(yǎng)分離出的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)；以及c)在本發(fā)明的組合物中定期傳代內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞優(yōu)選定期傳代至少8次。該方法還可以包括制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的步驟。
本發(fā)明還有一個(gè)方面涉及種系感受態(tài)胚胎干細(xì)胞(ES)。細(xì)胞系優(yōu)選小鼠的細(xì)胞系，但是其他動(dòng)物的細(xì)胞系也適用。如果是小鼠細(xì)胞系，則細(xì)胞系可來源于下列品系小鼠的細(xì)胞或組織129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1CaOla、C3H/HeN、C57BL/6Ola、FVB/N、DBA1LacJ、CD1、BALB/c、MRL，C57BL/6×CBA和有Swiss Webster遺傳背景的小鼠。小鼠細(xì)胞系優(yōu)選傳過11代或更多代依然具有種系傳遞能力的。本發(fā)明的胚胎干細(xì)胞(ES)系的特征是經(jīng)過至少10代的傳代后細(xì)胞依然具有三個(gè)胚層的克隆形成能力、堿性磷酸酶染色陽性以及細(xì)胞角蛋白18和波形蛋白染色陰性。這些胚胎干細(xì)胞系可用于制備嵌合的或ES細(xì)胞來源的動(dòng)物、通過同源重組或非同源重組進(jìn)行基因修飾、通過種系傳遞制備基因經(jīng)修飾的動(dòng)物、通過受體胚泡內(nèi)注射胚囊或二倍體、四倍體集合或核轉(zhuǎn)移制備嵌合動(dòng)物、或用于新型基因的研究及分離以及用于表達(dá)或過量表達(dá)目的基因。
本發(fā)明的組合物在維持不同品系小鼠來源的胚胎干細(xì)胞的表型上具有超強(qiáng)的能力。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)這些新型組合物的特性也適用于除胚胎干細(xì)胞外的其他干細(xì)胞。
因此，本發(fā)明涉及本文所描述的組合物在維持或生長成年干細(xì)胞和早期祖細(xì)胞中的應(yīng)用，例如HUC來源的CD34+細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，成年干細(xì)胞或早期成年祖細(xì)胞可在無基質(zhì)的條件下在本發(fā)明的組合物中維持或生長，所謂無基質(zhì)的條件是指細(xì)胞與滋養(yǎng)層細(xì)胞無直接或間接的接觸(無接觸培養(yǎng))。本發(fā)明用于擴(kuò)增ASC的組合物首先通過成纖維細(xì)胞的調(diào)節(jié)，較好的是用永生成纖維細(xì)胞，更好的是用永生兔成纖維細(xì)胞如Rab9細(xì)胞系(ATCC CRL-1414)。本發(fā)明的結(jié)果表面這些組合物比基礎(chǔ)ES培養(yǎng)基更適合擴(kuò)增和培養(yǎng)成年干細(xì)胞或早期祖細(xì)胞如HSC或造血前體細(xì)胞。組合物中還可以添加LIF(LIF蛋白質(zhì)，或者用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染細(xì)胞所產(chǎn)生的LIF)。但是在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，用于培養(yǎng)成年干細(xì)胞的組合物不含LIF。一方面，缺少LIF對ASC的增殖能力確實(shí)有影響，另一方面，已知LIF的存在會(huì)刺激細(xì)胞如HSC分化成髓系的細(xì)胞。因此不加LIF至少對維持HSC或早期造血祖細(xì)胞的未分化特性有正面的作用。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于培養(yǎng)ASC的組合物是非濃縮的，就是說沒有添加額外的細(xì)胞因子或生長因子。加到培養(yǎng)基中用于培養(yǎng)HSC或造血前體細(xì)胞的細(xì)胞因子或生長因子一般包括FLT3配基、IL-6(白細(xì)胞介素)、可溶性的IL-6受體、Tpo(血小板生成素)、SCF(干細(xì)胞因子)、白細(xì)胞介素-7、白細(xì)胞介素8、G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)、MIP-1α(巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α)、MCP(單核細(xì)胞趨化蛋白-1)、VEGF(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子)。根據(jù)本發(fā)明，在擴(kuò)增和培養(yǎng)成年干細(xì)胞或早期祖細(xì)胞如HSC或造血前體細(xì)胞時(shí)可以不用添加上述的細(xì)胞因子。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，培養(yǎng)ASC如HSC所用的組合物既不含LIF，也沒有添加細(xì)胞因子。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物用于維持成年干細(xì)胞和早期成年祖細(xì)胞的表型。作為一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明描述了組合物在一個(gè)較長時(shí)間內(nèi)保持造血干細(xì)胞來源的HUC(人臍帶血)的干細(xì)胞特性的適用性。
根據(jù)本發(fā)明，成年干細(xì)胞和/或早期祖細(xì)胞如HSC或早期造血前體細(xì)胞至少在分離并培養(yǎng)15天后還可以傳代，較好的是在至少培養(yǎng)30天后，更好的是至少培養(yǎng)60天、90天后，甚至180天后依然可以傳代。
根據(jù)本發(fā)明，成年干細(xì)胞和/或早期祖細(xì)胞如HSC或早期造血前體細(xì)胞至少可以擴(kuò)增10倍，較好的是至少可以擴(kuò)增25倍，更好的是至少可以擴(kuò)增40倍、甚至100倍，最好的至少可以擴(kuò)增1000倍。
根據(jù)本發(fā)明，CD34+成年干細(xì)胞和/或早期祖細(xì)胞如HSC或早期造血前體細(xì)胞至少可以擴(kuò)增5倍，較好的是至少可以擴(kuò)增10倍，更好的是至少可以擴(kuò)增50倍、甚至250倍，最好的至少可以擴(kuò)增1000倍。
根據(jù)本發(fā)明，成年干細(xì)胞和/或早期祖細(xì)胞如HSC或早期造血前體細(xì)胞的擴(kuò)增潛能至少可以擴(kuò)增5倍，較好的是至少可以擴(kuò)增15倍，更好的是至少可以擴(kuò)增50倍、甚至250倍，最好的至少可以擴(kuò)增1000倍，所用的分析方法如LTC IC法，該方法可以評價(jià)細(xì)胞擴(kuò)增為髓系祖細(xì)胞的能力。
這些擴(kuò)增的ASC如HSC在至少培養(yǎng)15天后移植到經(jīng)亞致死劑量照射的NOD/SCID小鼠體內(nèi)，較好的是至少培養(yǎng)28天，更好的是至少培養(yǎng)60天，最好的是至少培養(yǎng)90天。
按照本發(fā)明的方法培養(yǎng)的HSC細(xì)胞可連續(xù)變?yōu)榈诙鶱OD/SCID小鼠。
本發(fā)明用下列的實(shí)施例進(jìn)行解釋和說明，這些實(shí)施例并不意味著對本發(fā)明的范圍的限制。根據(jù)本發(fā)明，本名譽(yù)的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行修改和改進(jìn)。
實(shí)施例實(shí)施例1重組兔白血病抑制因子(Rab-LIF)的制備。
上述的參考方法和ES細(xì)胞培養(yǎng)基可以選擇地添加LIF，優(yōu)選重組Rab-LIF以輔助ES細(xì)胞保持未分化狀態(tài)以及獲得種系傳遞能力。在圖1中列出了Rab-LIF的核苷酸序列及其相應(yīng)的肽序列。
Rab-LIF可用多種方法制備，一般利用生物學(xué)家現(xiàn)有的多種分子生物學(xué)工具如表達(dá)載體中的一種來制備。根據(jù)這些方法，將編碼Rab-LIF蛋白的DNA分子與編碼轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子的DNA分子人工連接在一起構(gòu)建一個(gè)表達(dá)盒。然后將含有啟動(dòng)子、終止子盒Rab-LIF編碼DNA的DNA分子導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)制備Rab-LIF蛋白。優(yōu)選將編碼分泌信號(hào)的一段DNA連接到Rab-LIF編碼DNA上，這樣所表達(dá)的活性Rab-LIF就可以從細(xì)胞內(nèi)分泌出來。
啟動(dòng)子可以是組成的、可誘導(dǎo)的或組織特異性的，選擇何種啟動(dòng)子一般要根據(jù)制備Rab-LIF所需要的細(xì)胞以及在何種條件下表達(dá)。如本文實(shí)施例1所描述，重組Rab-LIF用畢赤酵母表達(dá)，因此編碼Rab-LIF的DNA分子要人工連接上酵母α因子信號(hào)肽序列和乙醇氧化酶1(AOX1)啟動(dòng)子。另外，編碼Rab-LIF的DNA還可以連接上適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、增強(qiáng)子或終止子(統(tǒng)稱為“調(diào)控序列”)以便于在原核細(xì)胞或高級的真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
重組Rab-LIF利用Invitrogen(Carlsbad，CA)的甲基營養(yǎng)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備。Rab-LIF基因是從兔基因組文庫Lambda DASH II(Stratagene，# 945950)中分離出來的，編碼成熟Rab-LIF蛋白的cDNA利用標(biāo)準(zhǔn)方法通過剪接重疊延伸多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(SOE-PCR)裝配。
Rab-LIF cDNA可作為模板進(jìn)行連續(xù)PCR和SOE-PCR反應(yīng)以便于通過密碼子選擇得到最適于在畢赤酵母中表達(dá)的基因。這種最佳的Rab-LIF cDNA顯示在圖2中。
PCR反應(yīng)的引物設(shè)計(jì)得使成熟的Rab-LIF序列正好和pPICZα載體(Invitrogen)內(nèi)的α因子分泌信號(hào)的閱讀框精確融合。這樣就可以從轉(zhuǎn)化的畢赤酵母培養(yǎng)上清中分離重組蛋白。這個(gè)引物還在成熟Rab-LIF編碼序列的前面引入了一個(gè)額外的丙氨酸密碼子(上述序列的下劃線部分)以便于Kex2處理α因子分泌信號(hào)。LY-RLIF-PD引物含Not I位點(diǎn)。產(chǎn)物純化后用XhoI和Not I消化，然后克隆到載體pPICZα的相應(yīng)位點(diǎn)上得到載體pPICZα-RLIF100。在這個(gè)載體中，Rab-LIF的表達(dá)是受乙醇氧化酶I(AOXI)強(qiáng)啟動(dòng)子控制的。
在轉(zhuǎn)化畢赤酵母前，載體pPICZα-RLIF100要先用BstX I在5’AOX1非翻譯區(qū)切開以使其線性化，這樣可以使表達(dá)模塊穩(wěn)定整合到AOX1位點(diǎn)上。所有在酵母上的操作還可以按照廠家的說明書進(jìn)行。最后選擇畢赤酵母轉(zhuǎn)化子X33(RbL)作為Rab-LIF酵母表達(dá)株存放于比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心，保藏號(hào)為MUCL42925。值得注意的是上述的表達(dá)盒是穩(wěn)定整合到染色體上的。X33(RbL)株于2000年7月5日存放于BCCM中心。在畢赤酵母中能達(dá)到最佳表達(dá)的核苷酸序列也是本發(fā)明的一部分。
Rab-LIF cDNA的核苷酸序列和氨基酸序列是以前所不曾報(bào)道的，顯示于圖1中。核苷酸序列是根據(jù)Sanger等人的標(biāo)準(zhǔn)方法確定的。
成熟Rab-LIF蛋白的核酸序列與人LIF序列(Gough等，1988，登錄號(hào)為M63420和J05436)和鼠LIF序列(Gearing等，1987，登錄號(hào)為M63419和J05435)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人LIF和兔LIF的核酸序列同源性達(dá)90％，鼠LIF和兔LIF的核酸序列同源性達(dá)77％。而在畢赤酵母中能達(dá)到最佳表達(dá)的cDNA與鼠LIF的同源性達(dá)到61％，與人LIF的同源性達(dá)到70％。
實(shí)施例2經(jīng)Rab9調(diào)整的ES細(xì)胞培養(yǎng)基的制備。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，連續(xù)4天收集經(jīng)融合的Rab9成纖維細(xì)胞單層培養(yǎng)物調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)ES細(xì)胞培養(yǎng)基，儲(chǔ)存起來用于ES細(xì)胞的培養(yǎng)。每天用25ml基礎(chǔ)ES細(xì)胞培養(yǎng)基更換15cm培養(yǎng)皿中的液體。4天后每只15cm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞按1∶4的比例傳代，傳代后的第一天將培養(yǎng)棄去。1升條件基礎(chǔ)ES培養(yǎng)基(4天收集液體的混合物)中加入80ml胎牛血清、17ml非必須氨基酸、20ml谷胺酰胺、6.3μl β-巰基乙醇、1.25ml胰島素和80ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH調(diào)整到7.4?；A(chǔ)培養(yǎng)基由下列組分構(gòu)成500ml高糖DMEM、70ml胎牛血清、13ml青霉素/鏈霉素、13ml谷胺酰胺、6.3μl β-巰基乙醇和13ml非必須氨基酸。濃縮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是指額外添加4％(V∶V)胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
在另外一個(gè)實(shí)施方式中，條件基礎(chǔ)ES培養(yǎng)基是用標(biāo)準(zhǔn)的方法如滾瓶、細(xì)胞工廠或生物反應(yīng)器大規(guī)模制備的。
實(shí)施例3鼠胚胎干細(xì)胞(ES)的分離和培養(yǎng)1.鼠品系和ES細(xì)胞ES細(xì)胞來源于下列商品化的鼠品系129/SvEvTaconic(Taconic，Germantown，NY，USA)；C57BL/6NTacfBr(Taconic)；BALB/cAnNTacfBr(Taconic)；DBA/2NTacfBR(Taconic)；C3H/HeNTac MTVfBe(Taconic)；FVB/NTacfBR(Taconic)；Tac(SW)fBR，Swiss Webster(Taconic)；129/SvJ(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine，USA)；C57BL/6J-HPRT<B-M3>(The Jackson Laboratory)；C57BL/6JOlaHsd(Harlan，Indianapolis，Indiana，USA)；CBA/CaOlaHsd(Harlan)；DBA/1OlaHsd(Harlan)；DBA1LacJ；CD1；BALB/c；MRL；C57BL/6×CBA。
2.鼠ES細(xì)胞的分離ES細(xì)胞可從3.5-4.5天大的胚泡階段的胚胎中分離。收集胚泡，然后接種到包被有被絲裂霉素阻滯的單層鼠胚胎成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的96孔板內(nèi)，每孔一個(gè)胚泡。胚泡附著在單層細(xì)胞上，每天用本發(fā)明的條件ES細(xì)胞培養(yǎng)基(見實(shí)施例2)、添加或不添加鼠LIF或Rab-LIF的基礎(chǔ)ES培養(yǎng)基、或者用能分泌內(nèi)源性Rab-LIF的Rab9#19細(xì)胞系(見下)調(diào)節(jié)的ES細(xì)胞培養(yǎng)基換液培養(yǎng)。
培養(yǎng)5-6天后，將長出的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)選擇地從(剩余的)滋養(yǎng)外胚層中取下，經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化后重新接種到包被有被絲裂霉素阻滯的鼠成纖維細(xì)胞的96孔板內(nèi)。隨后逐步將ES細(xì)胞接種到較大的培養(yǎng)皿中。利用本發(fā)明的條件ES細(xì)胞培養(yǎng)基ES細(xì)胞可以保持未分化狀態(tài)20代以上。
成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層取自交配后懷孕12.5天的小鼠的胚胎。將小鼠處死后取其子宮，放入含磷酸鹽緩沖液(PBS)的培養(yǎng)皿中，將胚胎從子宮中剪下來并將所有的膜去除。然后將胚胎轉(zhuǎn)入含PBS的另一個(gè)培養(yǎng)皿中，將胚胎的頭和內(nèi)部器官全部去除，然后用PBS洗滌以去除血液。
然后用2個(gè)胰島素注射器將胚胎磨碎并轉(zhuǎn)入到直徑為2-3mm的試管中，在胰蛋白酶-EDTA/MEM溶液(10/90 V/V)中4℃孵育2小時(shí)。懸液在于37℃孵育15分鐘，然后用5ml的移液管制備單細(xì)胞懸液，每180mm的培養(yǎng)皿接種5×106細(xì)胞，用25ml滋養(yǎng)層培養(yǎng)基培養(yǎng)。
滋養(yǎng)層培養(yǎng)基含有500ml Dulbecco極限必需培養(yǎng)基(DMEM)、10％胎牛血清(FCS)、13ml青霉素/鏈霉素、13ml谷胺酰胺、13ml非必須氨基酸和2.3μl β-巰基乙醇。培養(yǎng)基24小時(shí)更換一次以去除碎片。培養(yǎng)2-3天后成纖維細(xì)胞可以長成連續(xù)的細(xì)胞單層。然后用胰蛋白酶消化培養(yǎng)皿，將消化下的細(xì)胞接種到2個(gè)培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞長滿后，每個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞冷凍到2個(gè)小瓶中，-80℃保存過夜，第二天放入液氮中。
3.ES細(xì)胞的培養(yǎng)ES細(xì)胞在用絲裂霉素阻滯而發(fā)生有絲分裂停止的鼠胚胎成纖維細(xì)胞上可以長到亞融合狀態(tài)。培養(yǎng)皿置于39℃、含5％CO2的濕潤環(huán)境中培養(yǎng)。ES細(xì)胞每2-3天傳代一次，接種到新鮮制備的含滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中。ES細(xì)胞用條件ES培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天換液。
4.比較在本發(fā)明的一個(gè)方面，胚泡來自自然交配的C57BL/6N TacfBr鼠(Taconic)。胚泡用下列培養(yǎng)基培養(yǎng)a)濃縮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；b)添加鼠LIF(1000IU/ml)的濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基；c)添加Rab-LIF(10ng/ml)的濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基；d)添加Rab-LIF(20ng/ml)的濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基；e)經(jīng)如實(shí)施例2描述的Rab9成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；或f)經(jīng)Rab9#19成纖維細(xì)胞系調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(見下)。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基由下列組分構(gòu)成500ml高糖DMEM、70ml胎牛血清、13ml青霉素/鏈霉素、13ml谷胺酰胺、6.3μl β-巰基乙醇和13ml非必須氨基酸。濃縮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是指額外添加4％(V∶V)胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
用Rab9成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是按照實(shí)施例2的方法制備的。1升條件基礎(chǔ)ES培養(yǎng)基(4天收集液體的混合物)中加入80ml胎牛血清、17ml非必須氨基酸、20ml谷胺酰胺、6.3μl β-巰基乙醇、1.25ml胰島素和80ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH調(diào)整到7.4。這種條件培養(yǎng)基中Rab-LIF的水平(少于20pg/ml)利用檢測人LIF的R&D系統(tǒng)(Minneapolis，MN，USA)通過ELISA方法是無法檢測到的。
用Rab9#19成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是按照實(shí)施例2所描述的Rab9的方法制備的。1升條件基礎(chǔ)ES培養(yǎng)基(4天收集液體的混合物)中加入80ml胎牛血清、17ml非必須氨基酸、20ml谷胺酰胺、6.3μl β-巰基乙醇、1.25ml胰島素和80ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH調(diào)整到7.4。Rab9#19是被兔白血病抑制因子基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Rab9成纖維細(xì)胞，利用檢測人LIF的R&D系統(tǒng)(Minneapolis，MN，USA)通過ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞每天最多可以將30ng/ml的Rab-LIF分泌到培養(yǎng)基中。
胚泡附著在滋養(yǎng)層上。每天更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)大約1周后，將長出的ICM選擇地從滋養(yǎng)外胚層中取下，經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化后重新接種到包被有被絲裂霉素阻滯的鼠成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的96孔板內(nèi)。隨后逐步將ES細(xì)胞接種到較大的包被有滋養(yǎng)層測的培養(yǎng)皿中。經(jīng)過5-10次傳代后，計(jì)數(shù)每種條件下培養(yǎng)的已有的ES細(xì)胞數(shù)。ES細(xì)胞是否保持未分化狀態(tài)通過免疫組化染色觀察是否存在堿性磷酸酶(VectorLaboratories INC.，Burlingame，CA)或波形蛋白和細(xì)胞角蛋白(Dako A/S，Denmark)來判斷。只有那些含有90％以上未分化細(xì)胞的ES細(xì)胞系才繼續(xù)培養(yǎng)。
單純用濃縮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基無法分離ES細(xì)胞。長出的ICM在第一代之前或第一代期間就快速分化了(圖3E和圖4E)。
表I鼠C57BL6/N ES細(xì)胞的分離效率
當(dāng)鼠LIF或RabLIF加到濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中時(shí)，培養(yǎng)3代后ES細(xì)胞的分離效率大約可以提高到25％。利用鼠或兔的LIF分離ES細(xì)胞其效率是相似的。當(dāng)無內(nèi)源性LIF或額外添加LIF時(shí)，利用Rab9條件培養(yǎng)基可以使ES細(xì)胞的分離效率提高到大約50％。當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基用分泌內(nèi)源性Rab-LIF的Rab9#19細(xì)胞系進(jìn)行調(diào)節(jié)時(shí)可以得到相似的ES分離效率。
當(dāng)胚泡在經(jīng)Rab9或Rab9#19成纖維細(xì)胞系(圖3C和D)調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的生長速度加快。在添加鼠LIF或Rab-LIF的濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，可見內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的部分分化或throphectodermal細(xì)胞的過度生長(cfr圖3A和B)。
經(jīng)過一代以后，不同培養(yǎng)基中的ES細(xì)胞克隆就出現(xiàn)了形態(tài)學(xué)上的變化。添加鼠LIF或Rab-LIF的濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基(圖4A和B)中出現(xiàn)相當(dāng)扁平的ES克隆，而在經(jīng)Rab9或Rab9#19成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(圖4C和D)出現(xiàn)了三胚層的ES細(xì)胞克隆。如果用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，則經(jīng)過1代后所有的細(xì)胞都出現(xiàn)了分化(圖4A)。
上述結(jié)果是經(jīng)過3周培養(yǎng)后得到的初步結(jié)果。在幾個(gè)例子中ES細(xì)胞培養(yǎng)了3周到2個(gè)月。累計(jì)頻數(shù)總結(jié)在表II中。
表II經(jīng)2個(gè)月的培養(yǎng)后鼠C57BL6/N ES細(xì)胞分離的最終效率
在表II中，只有那些至少在10代內(nèi)能保持未分化狀態(tài)的ES細(xì)胞才被認(rèn)為是已經(jīng)建立的ES細(xì)胞系。
當(dāng)鼠LIF、10ng/mlRabLIF或20ng/mlRabLIF加到濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中時(shí)，ES細(xì)胞的分離效率分別為34％、38％和36％。利用鼠或兔的LIF分離ES細(xì)胞其效率是相似的。當(dāng)無內(nèi)源性LIF或額外添加LIF時(shí)，利用Rab9條件培養(yǎng)基可以使ES細(xì)胞的分離效率提高到51％。當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基用分泌內(nèi)源性Rab-LIF的Rab9#19細(xì)胞系進(jìn)行調(diào)節(jié)時(shí)ES的分離效率可以達(dá)到61％。這些差異(51％對61％)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2分析，P＝NS)。
5.其他實(shí)施方式在本發(fā)明的第二個(gè)例子中，胚泡分別來自于自然交配的FVB/NtacfBR(Taconic，Germantown，NY，USA)小鼠和BALB/cAnNTacfBr(Taconic)小鼠。胚泡用實(shí)施例II所描述的Rab9成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成如下500ml高糖DMEM、70ml胎牛血清、13ml青霉素/鏈霉素、13ml谷胺酰胺、6.3μl β-巰基乙醇和13ml非必須氨基酸。濃縮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是指額外添加4％(V∶V)胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
用Rab9成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是按照實(shí)施例II的方法制備的。1升條件基礎(chǔ)ES培養(yǎng)基(4天收集液體的混合物)中加入80ml胎牛血清、17ml非必須氨基酸、20ml谷胺酰胺、6.3μl β-巰基乙醇、1.25ml胰島素和80ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH調(diào)整到7.4。這種條件培養(yǎng)基中Rab-LIF的水平(少于20pg/ml)利用檢測人LIF的R&D系統(tǒng)(Minneapolis，MN，USA)通過ELISA方法是無法檢測到的。
表III從FVB/N和Balb/C小鼠中分離ES細(xì)胞的效率
胚泡附著在滋養(yǎng)層上。每天更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)大約1周后，將長出的ICM從滋養(yǎng)外胚層中取下，經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化后重新接種到包被有被絲裂霉素C阻滯的鼠成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的96孔板內(nèi)。隨后逐步將ES細(xì)胞接種到較大的包被有滋養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)2后，計(jì)數(shù)個(gè)月后，計(jì)數(shù)每個(gè)品系小鼠來源的已建立的ES細(xì)胞數(shù)。ES細(xì)胞是否具有未分化特征通過免疫化學(xué)染色觀察是否存在堿性磷酸酶(VectorLaboratories INC.，Burlingame，CA)或波形蛋白和細(xì)胞角蛋白(Dako A/S，Denmark)來判斷。只有那些在至少10代的培養(yǎng)期間保持未分化狀態(tài)(含有90％以上未分化細(xì)胞)的ES細(xì)胞系才被認(rèn)為是已經(jīng)建立的ES細(xì)胞系。
經(jīng)Rab9成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可用于從FVB/N和BALB/c品系小鼠中分離胚胎干細(xì)胞。經(jīng)過2個(gè)月的培養(yǎng)后，從FVB/N品系小鼠中建立了8個(gè)ES細(xì)胞系，從BALB/c品系小鼠中建立了15個(gè)ES細(xì)胞系。其總的分離效率分別為40％和44％。
實(shí)施例4制備嵌合的和ES細(xì)胞來源的動(dòng)物ES細(xì)胞克隆形成宿主胚胎的種系的能力可通過下列方法檢測將這些ES細(xì)胞注射到宿主胚泡內(nèi)、將ES細(xì)胞與桑葚胚期的二倍體胚胎或4細(xì)胞的四倍體胚胎聚集，然后按照標(biāo)準(zhǔn)方法將這些嵌合的試驗(yàn)胚胎植入到假孕的受體子宮內(nèi)。通過飼養(yǎng)所得到的嵌合子代可以檢測ES細(xì)胞基因組的種系傳遞能力。
1.ES細(xì)胞的胚泡注射
C57BL/6、FVB/N和BALB/c小鼠來源的ES細(xì)胞系克隆形成宿主胚胎的種系的能力通過下述過程檢驗(yàn)將這些培養(yǎng)了10代或至少10代的ES細(xì)胞注射到宿主胚泡中，然后按照標(biāo)準(zhǔn)方法將這些嵌合胚胎植入假孕的母鼠子宮內(nèi)。為了易于評價(jià)嵌合百分率(即ES細(xì)胞基因組在嵌合子代中所占的比例)，將具有彩色包被的ES細(xì)胞系(來自C57BL/6N)注射到Swiss Webster的胚泡中，而將具有白色絨毛的ES細(xì)胞系(來自BALB/c和FVB/N)與黑色的C57BL/6N胚泡嵌合。然后使高百分率的嵌合體與SwissWebster或C57BL/6N小鼠交配以檢測ES細(xì)胞基因組的種系傳遞能力，如果合適的話，可以在F1子代中分離出具有彩色包被的ES細(xì)胞系。
胚泡注射所用的是3.5天的胚泡，從超排卵母鼠的子宮內(nèi)收集胚泡，用M2培養(yǎng)基(Eurogentec，Seraing，Belgium)沖洗后用于注射。超排卵是通過給母鼠先注射7.5I.U.的孕馬血清絨毛膜促性腺激素(PMSG，Sigma，St.Louis，MO)，48小時(shí)后再注射7.5I.U.人絨毛膜促性腺激素(Pregnyl Organon，Oss，The Netherlands)誘導(dǎo)的。將收集的胚泡用M16培養(yǎng)基(Eurogentec)洗滌，然后再用M16培養(yǎng)基在39℃、5％CO2的空氣中培養(yǎng)。
在微注射前兩天將ES細(xì)胞接種到涂凝膠的空白培養(yǎng)皿上。在注射當(dāng)天，用0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA39℃消化培養(yǎng)皿約2分鐘。加入新鮮的條件細(xì)胞培養(yǎng)基，用移液管吹打以獲得單細(xì)胞懸液。離心(1100rpm/min，離心5min)后，將ES細(xì)胞重懸到新鮮的條件細(xì)胞培養(yǎng)基中，放到39℃的孵箱中孵育。
胚泡注射的過程如下將15-20個(gè)彩色鼠(C57BL/6)ES細(xì)胞注射到albino SwissWebster小鼠的胚泡中，或者將15-20個(gè)白色小鼠(FVB/N，BALB/c)的ES細(xì)胞注射到黑色C57BL/6N小鼠的胚泡內(nèi)。注射后將胚泡移植到與輸精管切除雄鼠交配后假孕2.5天的Swiss Webster母鼠子宮內(nèi)(每個(gè)子宮角7-8個(gè)胚泡)。
將11個(gè)不同C57BL/6N鼠的ES細(xì)胞系注射到Swiss Webster鼠胚泡中，每個(gè)C57BL/6N ES細(xì)胞系都能產(chǎn)生嵌合小鼠。將高百分率的嵌合體與Swiss Webster鼠交配后檢測其種系傳遞能力發(fā)現(xiàn)所有的C57BL/6N ES細(xì)胞系都具有種系傳遞能力。共有9株FVB/N ES細(xì)胞系和7株BALB/c ES細(xì)胞系注射到C57BL/6N胚泡中。對于FVB/N小鼠來源的和BALB/c來源的每個(gè)ES細(xì)胞系來說，在將胚泡移植到C57BL/6N小鼠體內(nèi)后都能生出嵌合小鼠。其中7株FVB/N ES細(xì)胞系和5株BALB/c ES細(xì)胞系具有種系傳遞能力。種系傳遞能力還用了其他的方法檢測。
表IV將C57BL/6N ES細(xì)胞注射到Swiss Webster胚泡內(nèi)制備嵌合小鼠，ES細(xì)胞是用Rab9成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基分離和培養(yǎng)的。
M通過雄性嵌合體進(jìn)行種系傳遞F通過雌性嵌合體進(jìn)行種系傳遞表Va將FVB/N ES細(xì)胞注射到C57BL/6胚泡內(nèi)制備嵌合小鼠，ES細(xì)胞是用Rab9成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基分離和培養(yǎng)的。
M通過雄性嵌合體進(jìn)行種系傳遞F通過雌性嵌合體進(jìn)行種系傳遞表Vb將BALB/c ES細(xì)胞注射到C57BL/6N胚泡內(nèi)制備嵌合小鼠，ES細(xì)胞是用Rab9成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基分離和培養(yǎng)的。
M通過雄性嵌合體進(jìn)行種系傳遞F通過雌性嵌合體進(jìn)行種系傳遞2.ES細(xì)胞的二倍體凝集二倍體凝集方法的操作過程如下Swiss Webster(白色變種)母鼠先注射孕馬血清絨毛膜促性腺激素，44-48小時(shí)后再注射5U的人絨毛膜促性腺激素使之超排卵。超排卵的Swiss Webster小鼠在交配后2.5天沖洗其輸卵管以收集8細(xì)胞晚期階段的二倍體胚胎。所檢測的所有ES細(xì)胞系來源的小鼠品系都是有顏色的，這樣便于鑒定嵌合子代。
利用Tyrode緩沖液處理這些8細(xì)胞階段的二倍體胚胎以去除其透明帶。無透明帶的胚胎洗滌后放入M16培養(yǎng)基中。然后使其與一團(tuán)ES細(xì)胞凝集，凝集物在M16的微滴中培養(yǎng)到胚泡階段，然后將其植入假孕2.5天的Swiss Webster母鼠的子宮角內(nèi)。
如果生出的子代鼠是黑色的(非白色)，則說明其是ES細(xì)胞來源的嵌合體。通過肉眼觀察，比較黑色鼠(來源于ES細(xì)胞)和白色鼠(來源于白色Swiss Webster胚胎)所占的比例就可以得出嵌合的百分率(來源于ES細(xì)胞的子代鼠所占比例)。
3.ES細(xì)胞的四倍體克隆完全由ES細(xì)胞來源的胚胎可以通過ES細(xì)胞與四倍體宿主胚胎的凝集來實(shí)現(xiàn)。2細(xì)胞胚胎與ES細(xì)胞進(jìn)行電融合然后再凝集為4細(xì)胞四倍體胚胎從而形成嵌合胚胎，然后再將其植入到假孕的受體內(nèi)。ES細(xì)胞無一例外的(幾乎所有的)發(fā)育成胚胎本身，而四倍體細(xì)胞則發(fā)育成胚胎的包膜。
為了便于區(qū)別ES和四倍體細(xì)胞，用于凝集的宿主胚胎來自ROSA26品系，該品系小鼠能夠全身表達(dá)LacZ，并且持續(xù)表達(dá)于整個(gè)發(fā)育階段直到成年。用人絨毛膜促性腺激素處理ROSA26小鼠使其超排卵，交配后36小時(shí)沖洗輸卵管以收集晚期2細(xì)胞胚胎。
實(shí)施例6體外擴(kuò)增臍帶血來源的造血干細(xì)胞1.臍帶血(UCB)的收集簽署知情同意書后，利用UCB庫的標(biāo)準(zhǔn)方法收集Gasthuisberg醫(yī)院(Leuven，Belgium)足月產(chǎn)婦的UCB。收集過程如下將含35ml枸櫞酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖-腺嘌呤(CPD-A)抗凝劑(Baxter Health Care，Deerfield，IL)的450ml標(biāo)準(zhǔn)采血袋的16號(hào)針頭插入到產(chǎn)婦胎盤的臍靜脈內(nèi)，通過壓力使UCB流到采血袋內(nèi)。不論何種情況，采集的UCB都必須在采集后24小時(shí)內(nèi)處理。每袋血都取幾個(gè)血樣分別進(jìn)行常規(guī)的血液學(xué)分析(Cell-Dyn 3500 System，Abbott)和造血祖細(xì)胞的免疫表型分析。
2.單核細(xì)胞(MNC)的分離和CD34+的純化單核細(xì)胞的分離方法如下將UCB的棕黃層按體積百分比稀釋到磷酸鹽緩沖液(PBS)(Gibco-BRL，Grand Island，NY))中，加入10ml LymphoprepTM(Nycomed，Oslo，Norway)后可以分層得到30ml部分。將這些樣品2000rpm離心20分鐘。收集已經(jīng)去除了紅細(xì)胞的富含白細(xì)胞的中間層細(xì)胞，洗滌后利用MACS CD34 Progenitor CellIsolation Kit(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)按照廠家的說明書通過免疫磁珠富集CD34+細(xì)胞。簡言之，MNC洗滌后重懸到添加0.5％BSA(Fraction V，Sigma)和2mMEDTA的無Ca2+和Mg2+離子的Dulbecco’s PBS中，然后在封閉試劑存在的條件下使細(xì)胞與連接有抗CD34抗體的MACS微珠共孵育。標(biāo)記的細(xì)胞通過30mm尼龍篩過濾，然后利用置于強(qiáng)磁場中的高梯度磁性分離柱進(jìn)行分離。磁性滯留細(xì)胞洗脫下來，然后通過流式細(xì)胞儀檢測其純度應(yīng)大于95％。
3.基質(zhì)滋養(yǎng)層鼠胎肝細(xì)胞系A(chǔ)FT024(由Theunissen博士惠贈(zèng))用添加20％FBS(HyClone，Logan，UT)、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素和150Mm 2-巰基乙醇(2-ME，SigmaDiagnostics，St Louis，MO)的Dulbecco modified Eagle medium(DMEM，Gibco-BRL，GrandIsland，NY)在33℃培養(yǎng)。將細(xì)胞分別傳代到150cm2的培養(yǎng)瓶和包被有0.1％凝膠(Speciality Media，Lavalette，NJ)的6孔或96孔培養(yǎng)板(Falcon，BectonDickinson Labware，NJ)中培養(yǎng)；待長滿后置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中使其停止生長。
4.造血干細(xì)胞的培養(yǎng)簡言之，將105富集的UCB CD34+細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)培養(yǎng)30天，其培養(yǎng)條件如下1)在無基質(zhì)細(xì)胞的空白孔內(nèi)，添加經(jīng)兔成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系Rab9(ATCC CRL-1414)條件培養(yǎng)基2)在無基質(zhì)細(xì)胞的空白孔內(nèi)，添加經(jīng)兔成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系Rab9#19(Rab9#19是被兔LIF基因組基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的兔成纖維細(xì)胞系Rab9)條件培養(yǎng)基3)在無基質(zhì)細(xì)胞空白孔內(nèi)，添加經(jīng)兔成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系Rab9#19(LMBP 5479CB)條件培養(yǎng)基4)在無基質(zhì)細(xì)胞空白孔內(nèi)，添加含胰島素的濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
5)在無基質(zhì)細(xì)胞空白孔內(nèi)，添加含胰島素、20ng/ml人Fl3配基(rhFlt3/Flk2)、20ng/ml重組人IL-6(rhIL-6)、200ng/ml重組人IL-6可溶性受體(rhIL-6 sR)和20ng/ml人血小板生成素(Tpo)的濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
細(xì)胞因子(人Flt3配基(rhFlt3/Flk2)，人重組IL-6(rhIL-6)，重組人IL-6可溶性受體(rhIL-6 sR)，重組人血小板生成素(Tpo)購自R&D Systems，Minneapolis，MN。
細(xì)胞每周更換兩次合適的新鮮培養(yǎng)基。每5天采集一些細(xì)胞樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)、表型分析和體外分析(LTC-IC)直到第50天。利用胎盤蘭排出法確定擴(kuò)增培養(yǎng)物中總的活細(xì)胞數(shù)。開始時(shí)是將105富集的UCB CD34+細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)培養(yǎng)30天。
細(xì)胞擴(kuò)增的結(jié)果見表VI和圖5。在無基質(zhì)細(xì)胞的空白孔中用Rab9條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)30天的培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)可以增加25倍。在無基質(zhì)細(xì)胞的空白孔中用Rab9#19條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞擴(kuò)增指數(shù)可達(dá)43。
在無基質(zhì)細(xì)胞的空白孔中用含胰島素而含有或不含有細(xì)胞因子混合物的濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞在15天后都發(fā)生了分化，全部丟失了其造血于細(xì)胞的表型。
表VI在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的有核細(xì)胞的擴(kuò)增指數(shù)(臍帶血樣品#40)
表VI和圖5說明HSC和HSP在無細(xì)胞因子的Rab9或Rab9#19條件培養(yǎng)基中生長得要比在分離和培養(yǎng)ES細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中好的多。LIF的存在有利于細(xì)胞的擴(kuò)增(Rab9與Rab9#19比較)。
5.熒光激活的細(xì)胞分選分離法(FACS)如上面所描述的首先分離出CD34+細(xì)胞，然后分別用FITC標(biāo)記的CD34抗體(克隆581，Pharmingen，San Jose，CA)和PE標(biāo)記的CD38抗體(克隆HIT2，Pharmingen，San Jose，CA)在室溫下標(biāo)記15-20分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞兩次，然后在配備488nm氬激光發(fā)射器的FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，San Jose，CA)進(jìn)行分析。用FITC和PE標(biāo)記的同種異型對照來設(shè)定分析基線。在培養(yǎng)期間每5天取一些樣品計(jì)數(shù)CD34+細(xì)胞和CD34+CD38-細(xì)胞的數(shù)量。
表VII和圖6表明經(jīng)過30天的培養(yǎng)后，在無基質(zhì)細(xì)胞空白孔內(nèi)用Rab9條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞其CD34+細(xì)胞的數(shù)量大約增加3倍。在無基質(zhì)細(xì)胞空白孔內(nèi)用Rab9#19條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞也能達(dá)到相似的效果。
無論是否存在細(xì)胞因子混合物，在無基質(zhì)的空白孔內(nèi)用添加胰島素的濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)都很難計(jì)數(shù)CD34+細(xì)胞和CD34+CD38-細(xì)胞，因?yàn)檫@些細(xì)胞在這種培養(yǎng)基中的擴(kuò)增能力很弱，無法達(dá)到流式細(xì)胞分析所要求的細(xì)胞數(shù)。
表VII30天的培養(yǎng)期內(nèi)CD34+細(xì)胞的數(shù)量(×105細(xì)胞)(臍帶血樣品#40)，bd檢測下限以下，無足夠的細(xì)胞用于分析。
6.LTC-IC測定原始細(xì)胞所占比率的最常用分析方法是長期培養(yǎng)起始細(xì)胞分析(LTC-IC)。通過LTC-IC試驗(yàn)原始的造血干細(xì)胞可在基質(zhì)上形成焦點(diǎn)區(qū)或“卵圓形區(qū)”。通過有限稀釋試驗(yàn)可以定量檢測這些區(qū)域內(nèi)的原始祖細(xì)胞數(shù)，這些原始祖細(xì)胞在造血支持基質(zhì)上培養(yǎng)5周后大部分會(huì)變成髓系細(xì)胞。經(jīng)過LTC-IC測定發(fā)現(xiàn)有部分CD34+細(xì)胞表達(dá)異源CD38分子。這種分析方法不能檢測祖細(xì)胞的自我更新能力、多系分化潛能及移植潛能(de Wynter E.，Ploemacher R.E.(2001)in J.Biol.Regul.Homeost.Agents，1523-7)。
從擴(kuò)增培養(yǎng)物中分離出CD34+細(xì)胞接種到AFT024包被的96孔板中，11復(fù)孔中設(shè)6個(gè)稀釋度。培養(yǎng)基為Iscoves modified Dulbecco medium(IMDM)添加12.5％FBS、12.5％馬血清(Stem Cell Technologies，Vancouver，Canada)、1000U/ml青霉素、1000U/ml鏈霉素、2ml L-谷氨酰胺(Gibco-BRL)和10-6ml氫化可的松。培養(yǎng)物培養(yǎng)5周，每周更換一半培養(yǎng)基。然后全部棄去培養(yǎng)基，換成甲基纖維素克隆培養(yǎng)基(MethoCultTMGF H4434，Stem Cell technologies)，該培養(yǎng)基含有1.12％甲基纖維素、IMDM、30％FBS、3U/ml促紅細(xì)胞生成素、50ng/ml重組人干細(xì)胞因子、10ng/mlrh GM-CSF、10ng/ml rh IL-3、10-4M 2-巰基乙醇。
在這種甲基纖維素培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后，觀察每個(gè)孔中是否長出了造血克隆，分別以陽性和陰性進(jìn)行計(jì)分。然后用Poisson統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法計(jì)算LTC-IC的頻率。
培養(yǎng)15天后，在無基質(zhì)細(xì)胞空白孔內(nèi)用不加細(xì)胞因子的Rab9條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞LTC-IC的數(shù)量增加18倍。而在無基質(zhì)細(xì)胞空白孔內(nèi)用不加細(xì)胞因子的Rab9#19條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞只有3.8。條件培養(yǎng)基中不含LIF有利于LTC-IC的長期擴(kuò)增。
無論是否存在細(xì)胞因子混合物，在無基質(zhì)的空白孔內(nèi)用添加胰島素的濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)都很難進(jìn)行LTC-IC計(jì)數(shù)分析，因?yàn)樵谶@些條件下很難獲得足夠的細(xì)胞。
表VIIILTC-IC擴(kuò)增指數(shù)(臍帶血樣品#23)，*由于生長數(shù)量少無法獲得足夠的細(xì)胞數(shù)。
表VIII和圖7的結(jié)果清楚地表明了LIF對擴(kuò)增細(xì)胞分化能力的影響。Rab9培養(yǎng)基由于缺少LIF所以能夠使細(xì)胞保持分化為髓系細(xì)胞的能力。結(jié)果還表明這種具有分離和培養(yǎng)ES細(xì)胞超級能力的新型Rab9培養(yǎng)基在促進(jìn)造血干細(xì)胞和干細(xì)胞前體細(xì)胞的生長以及維持其未分化狀態(tài)中也具有優(yōu)越的表現(xiàn)。
實(shí)施例8HSC的體內(nèi)集落形成能力分析HSC具有自我更新的能力、多系分化能力及在骨髓被毀宿主內(nèi)形成集落的能力。某些分析方法如長期培養(yǎng)起始細(xì)胞分析(LTC-IC)可以檢測細(xì)胞經(jīng)長期培養(yǎng)后形成髓系祖細(xì)胞的能力。但是，這些方法無法測定祖細(xì)胞的自我更新能力、多系形成能力及移植潛能。要評價(jià)人HSC的移植能力還需要移植模型?，F(xiàn)在已開發(fā)出幾種異種移植模型，其中包括人化的重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠、非肥胖型糖尿病(NOD)-SCID小鼠、Beige-Nude-Xid(BNX)小鼠和免疫前胎羊，如Lewis等，(2001)Blood 97，3441-3449所描述的NOD-SCID受體。NOD-SCID小鼠飼養(yǎng)在特殊的無病原的環(huán)境中，飲用的是酸化的水，吃的是經(jīng)高壓滅菌的食物。每周喂兩次每100ml含60mg甲氧芐啶和300mg磺胺甲基異惡唑(Hoffmann-La Roche，Nutley，NJ)的水。當(dāng)小鼠長到6-8周時(shí)，用Mark1銫輻射器以57cGy/min的強(qiáng)度照射300-325cGy。照射后24小時(shí)通過尾靜脈將UCB細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)。細(xì)胞的劑量為25-150×1030天的(即未培養(yǎng)的)CD341細(xì)胞或者同樣數(shù)量的7、14或28天的子代細(xì)胞。移植6周后將小鼠脫頸處死。用IMDM 20％FCS沖洗股骨和脛骨收集骨髓，然后利用這些從移植動(dòng)物體內(nèi)得到的細(xì)胞進(jìn)行二次移植試驗(yàn)或分析其表型。如果鼠骨髓中的CD451細(xì)胞含量超過2％，則將兩個(gè)股骨和2個(gè)脛骨的細(xì)胞移植到單個(gè)的次級鼠受體中。對供體細(xì)胞移植物的評價(jià)是通過檢測異硫氰酸熒光素(FITC)或peridinin葉綠素(PerCP)標(biāo)記的人特異性全白細(xì)胞抗原CD45(Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)來實(shí)現(xiàn)的。通過用抗人CD45 PerCP(Becton Dickinson)、抗鼠CD45 FITC(Pharmingen，San Diego，CA)和抗人CD3藻紅蛋白(PE)、CD14 PE、CD19 PE、CD33PE或CD34 PE(都來自BectonDickinson)將細(xì)胞染色來分析細(xì)胞的三色表型。應(yīng)用合適的同種異型對照。移植的人細(xì)胞在鼠體內(nèi)的克隆形成頻率定義為SRC，通過有限稀釋法計(jì)算。小鼠體內(nèi)輸注的細(xì)胞數(shù)和移植物數(shù)量逐漸增加，經(jīng)檢測人CD451細(xì)胞數(shù)超過0.5％。SRC頻率用Poisson統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算。
胎羊受體培養(yǎng)的細(xì)胞懸浮于Rab9細(xì)胞條件培養(yǎng)基中。50(X組)到100(I組)3 103未培養(yǎng)的CD341細(xì)胞或相同數(shù)目的培養(yǎng)7天(XI和II組)或14天(XII和III組)的子代細(xì)胞注射到預(yù)免疫(懷孕57-62天)的胎綿羊受體的羊膜泡內(nèi)。在某些試驗(yàn)中，抑制后60天處死動(dòng)物，分析骨髓中的人源細(xì)胞。BM也可以作為CD451細(xì)胞的來源進(jìn)行二次移植。
另外，也可以使動(dòng)物產(chǎn)仔，移植后6個(gè)月分析骨髓。對于二次移植來說，人CD451細(xì)胞是從移植后60天的I、II和III組的初級受體骨髓中分離出來的。每組中取兩只動(dòng)物分離CD451細(xì)胞，分析1其中CD341細(xì)胞的含量，然后注射到3只二級胚胎受體內(nèi)(I組、IV組、II組、V組、III組、VI組)。在移植后60天處死動(dòng)物，分析骨髓細(xì)胞中是否存在人源細(xì)胞。這些次級受體的骨髓作為CD451細(xì)胞的來源移植到三級受體體內(nèi)。移植后60天處死動(dòng)物，分析骨髓細(xì)胞中是否存在人源細(xì)胞。為了評價(jià)受體細(xì)胞移植的效果，從浙西移植了人源細(xì)胞的胎羊或新生羊中分離骨髓單核細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)分析其中是否存在人源細(xì)胞。主要步驟如下利用低滲溶液溶解骨髓中摻雜的紅細(xì)胞，從而分離出單核細(xì)胞。人CD3、CD20、CD33、CD34、CD45和血型糖蛋白A特異性的抗體(Becton Dickinson)連接上FITC或PE。每一樣品中標(biāo)記5-3 105細(xì)胞，與適當(dāng)?shù)姆墙Y(jié)合的同種異型對照相比較檢測每種抗原的表達(dá)情況?？梢詸z測到0.2％或更高的表達(dá)水平。另外，骨髓單核細(xì)胞用添加促紅細(xì)胞生成素(2IU/ml)、IL-3(5ng/mL)和GM-CSF(5ng/mL)的甲基纖維素(0.4-2 3 105細(xì)胞/ml)培養(yǎng)，檢測其中形成的人CFU-GM和CFU-Mix。
這些體內(nèi)分析試驗(yàn)是為了證明HSC在本發(fā)明的組合物中培養(yǎng)后依然具有長期植入能力。
序列表<110>斯路姆-X股份有限公司(Thromb-X)L.斯庫恩簡斯(Schoonjans，Luc)<120>用于體外分離和培養(yǎng)具有種系傳遞能力的胚胎干細(xì)胞(ES)細(xì)胞系的組合物<130>T 2267 PCT<150>PCT/BE01/00221<151>2001-12-21<150>UK 0220145.7<151>2002-08-30<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>609<212>DNA<213>兔(Oryctolagus cuniculus)<220>
<221>CDS<222>(1)..(609)<223>兔白血病抑制因子<400>1atg aag atc ttg gcg gca gga gtc gtg ccc ctg ctg ctg gtc ttg cac 48Met Lys Ile Leu Ala Ala Gly Val Val Pro Leu Leu Leu Val Leu His1 5 10 15tgg aaa ccc ggg gcg ggg agc ccc ctt ccc atc aac ccc gtc aac gcc 96Trp Lys Pro Gly Ala Gly Ser Pro Leu Pro Ile Asn Pro Val Asn Ala20 25 30acc tgc aac aca cac cac cca tgc ccc agc aac ctc atg agc cag atc 144Thr Cys Asn Thr His His Pro Cys Pro Ser Asn Leu Met Ser Gln Ile35 40 45agg agc cag ctg gca cag ctc aat ggc act gcc aac gcc ctc ttt att 192Arg Ser Gln Leu Ala Gln Leu Asn Gly Thr Ala Asn Ala Leu Phe Ile
50 55 60ctc tat tac aca gcc caa ggg gag ccg ttc ccc aac aac ctg gac aag 240Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys65 70 75 80ctg tgc ggc ccc aat gtg acg gac ttc ccg ccc ttc cac gcc aac ggc 288Leu Cys Gly Pro Asn Val Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly85 90 95acg gag aag gtc agg ctg gtg gag ctg tac cgc atc gtc gcc tac ctt 336Thr Glu Lys Val Arg Leu Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Ala Tyr Leu100 105 110ggc acc gcc ctg ggc aac atc acc cgg gac cag aag acc ctc aac ccc 384Gly Thr Ala Leu Gly Asn Ile Thr Arg Asp Gln Lys Thr Leu Asn Pro115 120 125acg gcg cac agc ctg cac agc aaa ctc aac gcc acg gcg gac acg ctg 432Thr Ala His Ser Leu His Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Thr Leu130 135 140cgg ggc ctg ctt agc aac gtg ctg tgc cgc ctg tgc agc aag tac cac 480Arg Gly Leu Leu Ser Asn Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His145 150 155 160gtg gcc cac gtg gac gtg gcc tat ggc ccg gac acc tcg ggc aag gac 528Val Ala His Val Asp Val Ala Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp165 170 175gtc ttc cag aag aag aag ctg ggg tgt cag ctg ctg gga aaa tac aag 576Val Phe Gln Lys Lys Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys180 185 190cag gtc atg gcc gtg ttg gcg cag gcc ttc tag 609Gln Val Met Ala Val Leu Ala Gln Ala Phe195 200<210>2<211>202<212>PRT<213>兔(Oryctolagus cuniculus)
<400>2Met Lys Ile Leu Ala Ala Gly Val Val Pro Leu Leu Leu Val Leu His1 5 10 15Trp Lys Pro Gly Ala Gly Ser Pro Leu Pro Ile Asn Pro Val Asn Ala20 25 30Thr Cys Asn Thr His His Pro Cys Pro Ser Asn Leu Met Ser Gln Ile35 40 45Arg Ser Gln Leu Ala Gln Leu Asn Gly Thr Ala Asn Ala Leu Phe Ile50 55 60Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys65 70 75 80Leu Cys Gly Pro Asn Val Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly85 90 95Thr Glu Lys Val Arg Leu Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Ala Tyr Leu100 105 110Gly Thr Ala Leu Gly Asn Ile Thr Arg Asp Gln Lys Thr Leu Asn Pro115 120 125Thr Ala His Ser Leu His Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Thr Leu130 135 140Arg Gly Leu Leu Ser Asn Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His145 150 155 160Val Ala His Val Asp Val Ala Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp165 170 175Val Phe Gln Lys Lys Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys180 185 190Gln Val Met Ala Val Leu Ala Gln Ala Phe195 200<210>3<211>543<212>DNA
<213>兔(Oryctolagus cuniculus)<220>
<221>CDS<222>(1)..(543)<223>經(jīng)優(yōu)化以在畢赤酵母中表達(dá)的兔白血病抑制因子<400>3gct cca ctt cca atc aac cca gtt aac gct acc tgc aac aca cac cac 48Ala Pro Leu Pro Ile Ash Pro Val Asn Ala Thr Cys Asn Thr His His1 5 10 15cca tgc cca tcc aac ttg atg agc cag atc cgt tcc cag cta gca cag 96Pro Cys Pro Ser Asn Leu Met Ser Gln Ile Arg Ser Gln Leu Ala Gln20 25 30ttg aat ggc act gcc aac gcc ttg ttc atc ttg tac tac aca gcc caa 144Leu Asn Gly Thr Ala Asn Ala Leu Phe Ile Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln35 40 45ggt gag cca ttc cca aac aac ctg gac aag ctg tgc ggc cca aat gtt 192Gly Glu Pro Phe Pro Asn Ash Leu Asp Lys Leu Cys Gly Pro Asn Val50 55 60acg gac ttc cca cca ttc cac gct aac ggt acc gag aag gtt aga cta 240Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly Thr Glu Lys Val Arg Leu65 70 75 80gtt gag ttg tac cgt atc gtg gct tac cta ggc acc gct ctg ggc aac 288Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Ala Tyr Leu Gly Thr Ala Leu Gly Asn85 90 95atc acc cgt gac cag aag acc cta aac cca acg gct cac agc ttg cac 336Ile Thr Arg Asp Gln Lys Thr Leu Asn Pro Thr Ala His Ser Leu His100 105 110agc aaa cta aac gcc acc gcg gac acg ttg cgt ggc ctg ctt agc aac 384Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Thr Leu Arg Gly Leu Leu Ser Asn115 120 125gtg ctg tgc cgc ctg tgc agc aag tac cac gtg gcc cac gtg gac gtg 432Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His Val Ala His Val Asp Val130 135 140
gca tat ggc cca gac acc tct ggc aag gac gtt ttc cag aag aag aag 480Ala Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp Val Phe Gln Lys Lys Lys145 150 155 160ttg ggt tgt cag ttg ttg ggt aaa tac aag cag gtc atg gcc gtg ttg 528Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys Gln Val Met Ala Val Leu165 170 175gct cag gcc ttc tag 543Ala Gln Ala Phe180<210>4<211>180<212>PRT<213>兔(Oryctolagus cuniculus)<400>4Ala Pro Leu Pro Ile Asn Pro Val Asn Ala Thr Cys Asn Thr His His1 5 10 15Pro Cys Pro Ser Asn Leu Met Ser Gln Ile Arg Ser Gln Leu Ala Gln20 25 30Leu Asn Gly Thr Ala Asn Ala Leu Phe Ile Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln35 40 45Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys Leu Cys Gly Pro Asn Val50 55 60Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly Thr Glu Lys Val Arg Leu65 70 75 80Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Ala Tyr Leu Gly Thr Ala Leu Gly Asn85 90 95Ile Thr Arg Asp Gln Lys Thr Leu Asn Pro Thr Ala His Ser Leu His100 105 110Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Thr Leu Arg Gly Leu Leu Ser Asn115 120 125Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His Val Ala His Val Asp Val
130 135 140Ala Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp Val Phe Gln Lys Lys Lys145 150 155 160Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys Gln Val Met Ala Val Leu165 170 175Ala Gln Ala Phe180
權(quán)利要求
1.一種用于分離、維持或生長哺乳動(dòng)物多能胚胎干細(xì)胞的組合物，所述組合物可使所述干細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)至少10代，所述組合物含有細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，其特征在于，所述組合物含有少于0.5ng/ml的白血病抑制因子(LIF)。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有的白血病抑制因子(LIF)濃度低于0.2ng/ml。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有的白血病抑制因子(LIF)濃度低于0.02ng/ml。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述組合物適用于選自靈長類動(dòng)物、豬、牛、馬、山羊、綿羊、貓、狗或兔的非人哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述組合物適用于選自嚙齒類動(dòng)物的非人哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是大鼠屬。
7.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是小鼠屬。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是具有下列遺傳背景的任何品系的小鼠品系129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/10la、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
9.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是具有下列遺傳背景的小鼠品系C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
10.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是具有129/SvEv或C57BL/6N遺傳背景的小鼠。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述LIF是人、鼠或兔的LIF。
12.一種用于分離、維持或生長哺乳動(dòng)物種系感受態(tài)胚胎干細(xì)胞的組合物，所述組合物含有細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，其特征在于，所述組合物含有的白血病抑制因子(LIF)濃度低于2ng/ml。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中，所述LIF是哺乳動(dòng)物的LIF，如人、鼠或兔的LIF。
14.如權(quán)利要求12或13所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有的白血病抑制因子(LIF)濃度低于0.2ng/ml。
15.如權(quán)利要求12或13所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有的白血病抑制因子(LIF)濃度低于0.02ng/ml。
16.如權(quán)利要求12-15中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物適用于選自靈長類動(dòng)物、豬、牛、馬、山羊、綿羊、貓、狗或兔的非人哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求12-15中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物適用于選自嚙齒類動(dòng)物的非人哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求17所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是大鼠屬。
19.如權(quán)利要求17所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是小鼠屬。
20.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是具有下列遺傳背景的任何品系的小鼠品系129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和SwissWebster。
21.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是具有下列遺傳背景的小鼠品系C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
22.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是具有129/SvEv或C57BL/6N遺傳背景的小鼠。
23.如權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，細(xì)胞的條件培養(yǎng)基來自永生成纖維細(xì)胞系。
24.如權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，細(xì)胞的條件培養(yǎng)基來自兔Rab9細(xì)胞系(ATCC目錄號(hào)CRL-1414)。
25.一種用于分離、維持或生長哺乳動(dòng)物多能胚胎干細(xì)胞的組合物，所述組合物可使所述的干細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)至少10代，所述組合物含有細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，所述細(xì)胞被編碼LIF的DNA轉(zhuǎn)染，其特征在于，所述組合物添加了除胎牛血清以外的血清，如胎馬血清、胎綿羊血清、胎山羊血清、新生的哺乳動(dòng)物血清、成年哺乳動(dòng)物血清或血清替代物。
26.如權(quán)利要求25所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物選自靈長類動(dòng)物、豬、牛、馬、山羊、綿羊、貓、狗或兔。
27.如權(quán)利要求25所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物選自嚙齒類動(dòng)物。
28.如權(quán)利要求27所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是大鼠屬。
29.如權(quán)利要求27所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是小鼠屬。
30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是具有下列遺傳背景的任何品系的小鼠品系129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和SwissWebster。
31.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是具有下列遺傳背景的小鼠品系C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
32.一種用于分離、維持或生長具有129/SvEv遺傳背景的鼠胚胎干細(xì)胞至少16代的組合物，所述的胚胎干細(xì)胞與四倍體胚胎凝集后可制備出成年非人哺乳動(dòng)物，所述組合物含有細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，所述細(xì)胞被LIF基因或LIF變體的基因轉(zhuǎn)染，其特征在于，所述組合物添加了除胎牛血清以外的血清，如胎馬血清、胎綿羊血清、胎山羊血清、新生的哺乳動(dòng)物血清、成年非人哺乳動(dòng)物血清或血清替代物。
33.一種用于分離、維持或生長非人哺乳動(dòng)物種系感受態(tài)胚胎干細(xì)胞的組合物，所述組合物含有細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，所述細(xì)胞被LIF基因或LIF變體的基因轉(zhuǎn)染，所述組合物添加了除胎牛血清以外的血清，如胎馬血清、胎綿羊血清、胎山羊血清、新生的哺乳動(dòng)物血清、成年哺乳動(dòng)物血清或血清替代物。
34.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物選自靈長類動(dòng)物、豬、牛、馬、山羊、綿羊、貓、狗或兔。
35.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物選自嚙齒類動(dòng)物。
36.如權(quán)利要求35所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是大鼠屬。
37.如權(quán)利要求35所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是小鼠屬。
38.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是具有下列遺傳背景的任何品系的小鼠品系129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和SwissWebster。
39.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是具有下列遺傳背景的小鼠品系C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
40.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是具有129/SvEv或C57BL/6N遺傳背景的小鼠品系。
41.如權(quán)利要求25-40中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是永生成纖維細(xì)胞。
42.如權(quán)利要求25-40中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是兔Rab9細(xì)胞。
43.如權(quán)利要求25-40中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述細(xì)胞被編碼非人哺乳動(dòng)物L(fēng)IF或LIF變體的DNA轉(zhuǎn)染。
44.如權(quán)利要求43所述的組合物，其中，所述細(xì)胞被編碼兔LIF或兔LIF變體的DNA轉(zhuǎn)染。
45.如權(quán)利要求43或44所述的組合物，其中，編碼LIF或LIF變體的轉(zhuǎn)染的DNA是基因組DNA。
46.如權(quán)利要求25-45中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述細(xì)胞系是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的。
47.如權(quán)利要求25-46中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述細(xì)胞系是Rab9克隆#19，該細(xì)胞系保藏在BCCM，保藏號(hào)為LMBP 5479 CB。
48.如上述任一權(quán)利要求所述的組合物，所述組合物添加了一種或多種選自白細(xì)胞介素、抑瘤蛋白、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、干細(xì)胞因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和心臟營養(yǎng)蛋白的化合物。
49.一種組合物，所述組合物含有經(jīng)Rab9成纖維細(xì)胞系調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基。
50.一種組合物，所述組合物含有被編碼LIF或LIF變體的DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，其中，所述被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是永生成纖維細(xì)胞。
51.如權(quán)利要求50所述的組合物，其中，所述DNA編碼兔LIF或兔LIF變體。
52.如權(quán)利要求50或51所述的組合物，其中，編碼LIF或LIF變體的轉(zhuǎn)染的DNA是基因組DNA。
53.如權(quán)利要求50-52中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述細(xì)胞系是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的。
54.如權(quán)利要求50所述的組合物，其中，所述細(xì)胞系是Rab9克隆#19，該細(xì)胞系保藏在BCCM，保藏號(hào)為LMBP 5479 CB。
55.一種分離、維持或生長非人哺乳動(dòng)物多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括在權(quán)利要求1-11或25-32中任一項(xiàng)所述的組合物中將細(xì)胞至少培養(yǎng)1代的步驟。
56.用權(quán)利要求55所述方法獲得的非人哺乳動(dòng)物多能胚胎干細(xì)胞。
57.一種分離、維持或生長非人哺乳動(dòng)物種系感受態(tài)胚胎干細(xì)胞的方法，所述方法包括在權(quán)利要求12-24或33-40中任一項(xiàng)所述的組合物中將細(xì)胞至少培養(yǎng)1代的步驟。
58.用權(quán)利要求57所述方法獲得的非人哺乳動(dòng)物種系感受態(tài)胚胎干細(xì)胞。
59.來自非人哺乳動(dòng)物的多能胚胎干細(xì)胞，所述非人哺乳動(dòng)物選自靈長類動(dòng)物、豬、牛、馬、山羊、綿羊、貓、狗、兔和嚙齒類動(dòng)物，如具有下列遺傳背景的大鼠和小鼠129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
60.來自非人哺乳動(dòng)物的多能胚胎干細(xì)胞，所述非人哺乳動(dòng)物選自具有下列遺傳背景的小鼠C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
61.來自非人哺乳動(dòng)物的種系感受態(tài)胚胎干細(xì)胞，所述非人哺乳動(dòng)物選自靈長類動(dòng)物、豬、牛、馬、山羊、綿羊、貓、狗、兔和嚙齒類動(dòng)物，如具有下列遺傳背景的大鼠和小鼠129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
62.來自非人哺乳動(dòng)物的種系感受態(tài)胚胎干細(xì)胞，所述非人哺乳動(dòng)物選自具有下列遺傳背景的小鼠C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
63.一種從胚胎干細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括在權(quán)利要求1-11或25-32中任一項(xiàng)所述的組合物中將細(xì)胞至少培養(yǎng)1代的步驟。
64.選自下列一組的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物靈長類動(dòng)物、豬、牛、馬、山羊、綿羊、貓、狗、兔和嚙齒類動(dòng)物，如具有下列遺傳背景的大鼠和小鼠129/SvEv、C57BL/6N、C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
65.選自具有下列遺傳背景的小鼠的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物C57BL/6J-HPRT、BALB/cAnN、CBA/CaOla、129/SvJ、DBA/2N、DBA/1Ola、C3H/HeN、C57BL/6JOla、FVB/N和Swiss Webster。
66.一種酵母表達(dá)載體，所述載體含有與啟動(dòng)子序列操作性相連的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼兔LIF或其變體，所述變體與兔LIF或其功能蛋白片段至少有95％的一致性。
67.如權(quán)利要求66所述的載體，其中，所述編碼兔LIF的核苷酸序列顯示在圖1[SEQ ID NO1]或圖2[SEQ ID NO3]中。
68.如權(quán)利要求67所述的載體，其中，所述編碼蛋白序列如圖1[SEQ ID NO2]或圖2[SEQ ID NO4]所描述。
69.如權(quán)利要求66-68中任一項(xiàng)所述的載體，其中，所述核苷酸序列與分泌信號(hào)序列融合在同一閱讀框內(nèi)。
70.如權(quán)利要求69所述的載體，其中，所述載體是pPICZα，分泌信號(hào)為α因子分泌信號(hào)。
71.被權(quán)利要求66-70中任一項(xiàng)所述的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。
72.如權(quán)利要求71所述的酵母細(xì)胞，其中，所述酵母細(xì)胞是甲基營養(yǎng)酵母如畢赤酵母。
73.如權(quán)利要求72所述的酵母，所述酵母已保藏在比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心，保藏號(hào)為MUCL-42925。
74.利用重組DNA技術(shù)在權(quán)利要求71-73中任一項(xiàng)所述的酵母細(xì)胞中表達(dá)兔LIF或與兔LIF或其功能蛋白片段一致性至少為95％的變體的方法。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中，表達(dá)的蛋白分泌到畢赤酵母生長培養(yǎng)基中。
76.一種組合物，所述組合物含有兔LIF或其變體，其中所述變體與兔LIF或其功能蛋白片段至少有95％的一致性。
77.純化的兔LIF或其變體，所述變體與兔LIF或其功能蛋白片段至少有95％的一致性。
78.一種用于分離、維持或生長非人胚胎干細(xì)胞的組合物，所述組合物含有純化的兔LIF或其變體，所述變體與兔LIF或其功能蛋白片段至少有95％的一致性。
79.一種用于無基質(zhì)擴(kuò)增哺乳動(dòng)物成年干細(xì)胞或早期祖細(xì)胞的組合物，所述組合物含有成纖維細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基。
80.如權(quán)利要求79所述的組合物，其中，所述成年干細(xì)胞是造血干細(xì)胞，早期成年祖細(xì)胞是造血前體細(xì)胞。
81.如權(quán)利要求70或80所述的組合物，其特征還在于，所述組合物是非富含細(xì)胞因子和/或LIF的。
82.如權(quán)利要求81或中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述成纖維細(xì)胞系是永生的。
83.如權(quán)利要求82所述的組合物，其中，所述永生成纖維細(xì)胞系是Rab9(ATCCCRL1414)細(xì)胞系。
84.如權(quán)利要求79-83中任一項(xiàng)所述的組合物在無基質(zhì)擴(kuò)增分離的哺乳動(dòng)物成年干細(xì)胞或早期祖細(xì)胞中的應(yīng)用。
85.如權(quán)利要求84所述的應(yīng)用，其中，所述成年干細(xì)胞是造血干細(xì)胞，早期成年祖細(xì)胞是造血前體細(xì)胞。
86.如權(quán)利要求85所述的應(yīng)用，其中，所述分離的造血干細(xì)胞或造血前體細(xì)胞是人CD 34+細(xì)胞。
87.如權(quán)利要求85或86所述的應(yīng)用，其中，所述造血干細(xì)胞或造血前體細(xì)胞分離自臍帶血、胎盤血、外周血和骨髓。
88.如權(quán)利要求85-87中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述細(xì)胞總數(shù)至少可擴(kuò)增25倍。
89.如權(quán)利要求85-87中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述CD34+細(xì)胞數(shù)至少可以擴(kuò)增3倍。
90.如權(quán)利要求85-87中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述擴(kuò)增的細(xì)胞至少培養(yǎng)15天。
91.如權(quán)利要求85-87中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，在LTC IC測定中呈陽性反應(yīng)的擴(kuò)增的細(xì)胞數(shù)至少要增加15倍。
92.一種擴(kuò)增哺乳動(dòng)物成年干細(xì)胞或早期祖細(xì)胞的方法，所述方法包括a)分離哺乳動(dòng)物成年干細(xì)胞或早期祖細(xì)胞；b)在無基質(zhì)的條件下用權(quán)利要求79-83中任一項(xiàng)所述的組合物培養(yǎng)細(xì)胞。
93.如權(quán)利要求92所述的方法，其中，所述成年干細(xì)胞是造血干細(xì)胞，早期成年祖細(xì)胞是造血前體細(xì)胞。
94.如權(quán)利要求92所述的方法，其中，采用培養(yǎng)步驟直到至少獲得25倍的擴(kuò)增。
95.如權(quán)利要求92所述的方法，其中，采用培養(yǎng)步驟直到有核細(xì)胞的數(shù)量至少擴(kuò)增10倍。
96.如權(quán)利要求92所述的方法，其中，在擴(kuò)增的細(xì)胞群中CD34+細(xì)胞的數(shù)量至少要擴(kuò)增3倍。
97.如權(quán)利要求92所述的方法，其中，擴(kuò)增的細(xì)胞群要至少培養(yǎng)15天。
98.如權(quán)利要求92所述的方法，其中，在LTC IC測定中呈陽性反應(yīng)的擴(kuò)增的細(xì)胞數(shù)至少要增加15倍。
99.如權(quán)利要求92所述的方法，其中，擴(kuò)增的細(xì)胞可在經(jīng)亞致死劑量照射的NOD/SCID(非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷)小鼠中重新形成集落。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于分離、維持或生長多能及具哺乳動(dòng)物種系感受態(tài)胚胎干細(xì)胞的方法。本發(fā)明的組合物是指含有下列成分的組合物1)經(jīng)表達(dá)有限量白血病抑制因子(LIF)的細(xì)胞系條件培養(yǎng)基，2)來自被哺乳動(dòng)物L(fēng)IF轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基，以及3)添加了重組兔LIF的培養(yǎng)基。本發(fā)明還描述了用于分離、維持或生長成年人干細(xì)胞和/或成年早期祖細(xì)胞的組合物，優(yōu)選在無基質(zhì)及不額外添加LIF和/或細(xì)胞因子或生長因子的條件下培養(yǎng)。本發(fā)明的培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)或制備現(xiàn)在還無法獲得的多能和具哺乳動(dòng)物種系感受態(tài)胚胎干細(xì)胞。本發(fā)明的培養(yǎng)基也可用于培養(yǎng)或制備成年人干細(xì)胞和/或成年早期祖細(xì)胞。本發(fā)明還涉及新型兔LIF、編碼兔LIF的核苷酸以及在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組兔LIF的方法。
文檔編號(hào)C12N1/19GK1620498SQ02828114
公開日2005年5月25日 申請日期2002年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月21日
發(fā)明者L·斯庫恩簡斯 申請人:斯路姆-X股份有限公司