專利名稱：轉(zhuǎn)基因生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因生物(transgenic organism)的方法。
背景技術(shù)：
將基因或者其它DNA序列導(dǎo)入到生物體比如哺乳動(dòng)物的胚系(germline)或者體細(xì)胞是近期生物學(xué)技術(shù)的最大進(jìn)展之一。這樣的動(dòng)物稱作是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。當(dāng)涉及到胚系改變時(shí)，基因操作的結(jié)果將被哺乳動(dòng)物的后代所繼承，這些動(dòng)物后代的所有細(xì)胞都遺傳有導(dǎo)入的基因，在某些情況以缺失DNA作為其遺傳組成部分。對(duì)于研究胚胎發(fā)育、分化過程中的基因調(diào)節(jié)，研究原癌基因的功能和免疫系統(tǒng)中復(fù)雜的細(xì)胞間相互接觸來說，轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物提供了一種手段。整體哺乳動(dòng)物是操作指導(dǎo)復(fù)雜生物學(xué)過程的基因的最終分析系統(tǒng)。此外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為表達(dá)有用的重組蛋白和建立人類遺傳性疾病的精確動(dòng)物模型提供了令人振奮的可能性。
通常，通過兩種方法中的一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過在胚胎干細(xì)胞中以同源重組的方式靶向插入DNA序列，這是勞動(dòng)密集型且耗時(shí)的過程；或者通過受精卵前核注射，其中DNA的整合是隨機(jī)的，并且可能會(huì)導(dǎo)致一連串DNA的插入，這些DNA不穩(wěn)定，在隨后的細(xì)胞分化過程中重新分布或被刪除。WO99/51755討論了使用包含編碼至少一個(gè)核酶之核酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。沒有公開在具體的實(shí)施例中使用逆轉(zhuǎn)錄病毒的內(nèi)容。雖然也提到提到了使用腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、皰疹單純病毒或者痘苗病毒的可能性。然而，沒有使用這些病毒的具體實(shí)施例。
因此，近些年人們建議使用逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行基因治療。重要的是，逆轉(zhuǎn)錄病毒是生活周期不同于裂解性病毒的RNA病毒。從這方面說，當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞時(shí)，其基因組轉(zhuǎn)化為DNA的形式。換句話說，逆轉(zhuǎn)錄病毒是經(jīng)過DNA中間體進(jìn)行復(fù)制的感染實(shí)體。稍后將介紹逆轉(zhuǎn)錄病毒感染等的更多細(xì)節(jié)。
有許多逆轉(zhuǎn)錄病毒，舉例來說包括鼠白血病病毒(MLV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、鳥髓細(xì)胞瘤病病毒-29(MC29)和鳥骨髓成紅血細(xì)胞增多癥病毒(AEV)。
還有一種慢病毒家族，包括人免疫缺陷病毒(HIV)和馬感染性貧血病毒(EIAV)。下文將闡述進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的詳細(xì)列表可見于Coffin等的著作(“逆轉(zhuǎn)錄病毒”，1997年，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社J M Coffin，S M Hughes，HE Varmus 758-763頁)。
我們可以從本技術(shù)領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)一些逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)。舉例來說，HIV病毒的細(xì)節(jié)可以從NCBI基因庫中檢索得到(基因組注冊(cè)號(hào)AF033819)。
上面已經(jīng)指出，人們對(duì)建立基于小的逆轉(zhuǎn)錄病毒亞群慢病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)有相當(dāng)大的興趣。這一興趣首先起源于使用基于HIV的載體將抗HIV治療性基因定位到HIV易感細(xì)胞的想法，其次來自于一預(yù)言因?yàn)槁《灸軌蚋腥痉欠至鸭?xì)胞(Lewis和Emerman，1993，病毒雜志，68，510)，所以基于這些病毒的載體系統(tǒng)將可以轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞(如Vile和Russel，1995歐洲醫(yī)學(xué)公告，51，12)。已經(jīng)構(gòu)建了基于HIV的載體系統(tǒng)(Buchschacher和Panganiban，1992年，病毒雜志，66卷，2731頁)，且已經(jīng)用于轉(zhuǎn)導(dǎo)CD4+細(xì)胞，還如期轉(zhuǎn)導(dǎo)了非分裂細(xì)胞(Naldini等，1996年科學(xué)272，263)。此外，慢病毒載體可以使目的基因非常穩(wěn)定的長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)。轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠神經(jīng)細(xì)胞后可以出現(xiàn)至少3個(gè)月時(shí)間的高表達(dá)?；贛LV的載體僅使目的基因表達(dá)6周。
迄今為止，構(gòu)建的基于HIV的載體在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中形成了一種整合的前病毒，前病毒末端含有HIV的LTRs序列。這限制了這些載體的使用，因?yàn)槿绻皇褂昧藘?nèi)部啟動(dòng)子，LTRs必須用作為插入基因的表達(dá)信號(hào)。使用內(nèi)部啟動(dòng)子有顯著的缺點(diǎn)。在逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR序列中插入附加的啟動(dòng)子會(huì)引起不可預(yù)知的結(jié)果，這一點(diǎn)已經(jīng)有文獻(xiàn)詳細(xì)闡述(Bowtell等，1988，病毒雜志，62，2464；Correll等，1994，血液雜志84，1812；Emerman和Temin，1984，細(xì)胞，39，459；Ghattas等，1991年，分子細(xì)胞生物學(xué)雜志，11，5848；Hantzopoulos等，1989；PNAS 86，3519；Hatzoglous等，1991，生化雜志，266，8416；Hatzogous等，1988，生化雜志，263，17798；Li等，1992，人類基因治療，3，381；McLachlin等，1993病毒學(xué)195，1；Overell等，1988，分子細(xì)胞生物學(xué)，8，1803；Scharfman等，1991，PNAS 88，4626；Vile等，1994基因治療，1,307；Xu等，1989，病毒學(xué)，171，331；Yee等，1987，PNAS 84，5197)。涉及的因素包括兩種啟動(dòng)子的相對(duì)位置和定位、啟動(dòng)子的特性、表達(dá)基因和任何可能被采納的選擇操作。內(nèi)部啟動(dòng)子可以影響包裝細(xì)胞株轉(zhuǎn)導(dǎo)的效價(jià)和整合載體的穩(wěn)定性。
HIV和其他慢病毒的LTRs對(duì)基因表達(dá)具有病毒特異性要求。例如，在病毒Tat蛋白缺失情況下，HIV的LTR并不活化(Cullen 1995 AIDS9，S19)。因此，需要通過改表基因表達(dá)要求的途徑來修飾LTRs。特殊情況下，對(duì)于一些基因治療的應(yīng)用可能還需要組織特異性基因表達(dá)信號(hào)。
HIV載體有一系列的明顯的缺點(diǎn)，這可能會(huì)限制其在一些疾病中的治療應(yīng)用。HIV-1具有成為人病原體的缺點(diǎn)，帶有潛在的原癌蛋白和序列。包裝細(xì)胞過程中產(chǎn)生的載體顆粒導(dǎo)入細(xì)胞表達(dá)HIV gag-pol蛋白，導(dǎo)入患者體內(nèi)將引起血清轉(zhuǎn)化，這是一危險(xiǎn)因素。因?yàn)檫@些原因，有必要發(fā)展不會(huì)將HIV蛋白導(dǎo)入患者體內(nèi)的基于慢病毒的載體。
已經(jīng)提出了使用MLV來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。然而，使用這一技術(shù)產(chǎn)生的表達(dá)水平令人失望。
仍然很有必要建立一種可以有效地產(chǎn)生且其中轉(zhuǎn)基因受到調(diào)節(jié)的疾病模型。
本方面的各方面克服了這些困難。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的一種方法，該方法包括向細(xì)胞中導(dǎo)入含有目的核苷酸(NOI)的非靈長(zhǎng)類慢病毒表達(dá)載體。
本發(fā)明提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的有效方法，該方法克服了和使用靈長(zhǎng)類慢病毒相關(guān)的潛在困難。
優(yōu)選的是非靈長(zhǎng)類慢病毒表達(dá)載體來自于EIAV、FIV、BIV、CAEV或者M(jìn)VV，而其中EIAV是最為優(yōu)選的。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)載體可以在體內(nèi)或者離體(ex vivo)導(dǎo)入。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行體外導(dǎo)入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞存在于子宮中(in utero)。
已經(jīng)建立了外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物胚系的幾種方法。該技術(shù)使不同胚系的細(xì)胞混合生成嵌合體，使多能細(xì)胞如ES細(xì)胞成為發(fā)育胚胎，微注射DNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞。大多數(shù)這些技術(shù)都基本需要分離受精卵或者早期胚胎；將之體外培養(yǎng)；然后重新放回母體使胚胎進(jìn)一步發(fā)育。在ES細(xì)胞中通過同源重組的方法靶向性插入基因和來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是勞動(dòng)密集型且耗時(shí)的過程，從細(xì)胞核注射開始算起周期為8至9周。
本發(fā)明該實(shí)施方案的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是不需要進(jìn)行分離操作，體外培養(yǎng)，然后再植入。本發(fā)明還避免了勞動(dòng)密集型且耗時(shí)的操作。
事實(shí)上，大規(guī)模的基因測(cè)序程序之后，可以獲得許多功能未知的基因。為了從新的基因組靶點(diǎn)開發(fā)治療產(chǎn)品，有必要將生物學(xué)和基因序列信息相對(duì)應(yīng)。本發(fā)明提供了一種有效率且有效地驗(yàn)證靶點(diǎn)的體內(nèi)方法。
我們也發(fā)現(xiàn)了使用本發(fā)明可以得到產(chǎn)物的良好表達(dá)水平，尤其是使用EIAV載體的表達(dá)水平高于使用MLV載體的表達(dá)水平。這一嗲令人驚奇。
本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是其效率。通過使用一種載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，如果需要數(shù)代培養(yǎng)以有效率地產(chǎn)生受調(diào)節(jié)的敲除疾病模型。因此，本發(fā)明滿足了這一長(zhǎng)遠(yuǎn)需要，雖然在當(dāng)時(shí)該問題的解決還不明顯。
本發(fā)明這一方面的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其靈活性；慢病毒載體可以在生物發(fā)育的整個(gè)過程中導(dǎo)入。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞是一圍產(chǎn)期細(xì)胞，該圍產(chǎn)期細(xì)胞可能是胚胎細(xì)胞。在該實(shí)施方案的一個(gè)特定方面中，胚胎細(xì)胞位于子宮中。然而，該方法可以應(yīng)用于任何細(xì)胞，如體細(xì)胞，也可應(yīng)用于能夠?qū)е屡呦蹈淖兊娜魏渭?xì)胞。這些細(xì)胞包括生殖細(xì)胞(germ cell)，但是本發(fā)明還能應(yīng)用于直接或者間接參與配子形成或受精的細(xì)胞。我們還包括不經(jīng)過直接受精而獲得的等效細(xì)胞，如通過細(xì)胞核移植技術(shù)獲得的等效細(xì)胞。
優(yōu)選的是，該細(xì)胞是卵母細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、卵子細(xì)胞、ES細(xì)胞、卵子(blastocyte)、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、精子或者精原細(xì)胞。
當(dāng)試圖獲得胚系改變時(shí)，應(yīng)該了解到越早轉(zhuǎn)導(dǎo)越好，因?yàn)檫@樣轉(zhuǎn)導(dǎo)生殖細(xì)胞成功的機(jī)會(huì)較大。
使用慢反應(yīng)病毒載體的一個(gè)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)是可以轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞或者慢分裂細(xì)胞，比如卵母細(xì)胞和精子形成細(xì)胞。
接下來，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法。該方法包括向非分裂細(xì)胞中導(dǎo)入包含NOI的慢病毒表達(dá)載體。慢病毒表達(dá)載體可以來自于非靈長(zhǎng)類慢病毒，還可以來自于靈長(zhǎng)類慢病毒，如HIV。
本發(fā)明該方面的另一優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞不需要進(jìn)行受精后轉(zhuǎn)導(dǎo)。
我們所指的非分裂細(xì)胞包括具備分裂能力但是在某一特定時(shí)期不分裂的細(xì)胞。
該方法并不局限于特定的細(xì)胞種類，但是細(xì)胞優(yōu)選是真核細(xì)胞，例如動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物；或者酵母細(xì)胞。本發(fā)明可應(yīng)用的細(xì)胞種類包括鼠細(xì)胞；人類細(xì)胞；豬細(xì)胞；牛細(xì)胞；猿細(xì)胞；綿羊細(xì)胞；馬細(xì)胞；鳥細(xì)胞，諸如家禽、尤其是雞的細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞或者爬行動(dòng)物或者魚類的細(xì)胞。細(xì)胞可以來自于線蟲或者果蠅。
在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞來自于人類以外的生物。
優(yōu)選的是，慢病毒表達(dá)載體是假型載體(pseudotyped)。
優(yōu)選的是，慢病毒表達(dá)載體不包括任何附屬性的功能基因。
NOI可以可操縱地和組成性啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子相連接。
優(yōu)選的是，NOI編碼并能夠表達(dá)治療性的蛋白質(zhì)，或者編碼反義寡聚核酸或者編碼核酶。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，NOI能夠產(chǎn)生一種使靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默的RNA分子。本發(fā)明的這一方面中，我們提供了一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法，該方法包括向細(xì)胞中導(dǎo)入慢病毒表達(dá)載體，該載體包括能夠產(chǎn)生使靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默之RNA分子的NOI。
優(yōu)選的是，NOI能產(chǎn)生短RNA、siRNA、短發(fā)卡RNA和微RNA或者I型內(nèi)含子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，短RNA、siRNA、短發(fā)卡RNA和微型RNA的表達(dá)受一種RNA聚合酶啟動(dòng)子的四環(huán)素應(yīng)答衍生物調(diào)節(jié)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法中包括轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠表達(dá)一種蛋白質(zhì)，優(yōu)選優(yōu)選治療性蛋白質(zhì)的至少一個(gè)NOI，以及編碼能夠?qū)е掳谢蜣D(zhuǎn)錄后沉默之RNA分子的至少一個(gè)NOI。能夠表達(dá)一種蛋白質(zhì)，優(yōu)選優(yōu)選治療性蛋白質(zhì)的至少一個(gè)NOI，以及編碼能夠?qū)е掳谢蜣D(zhuǎn)錄后沉默之RNA分子的至少一個(gè)NOI可以存在于同一慢病毒表達(dá)載體中，也可以存在于不同的慢病毒表達(dá)載體中。
慢病毒表達(dá)載體可以通過各種方便的途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入靶細(xì)胞，例如臍帶細(xì)胞、胎盤、羊水；或者直接進(jìn)入器官，比如子宮、性腺、大腦、腎臟、肝臟、心臟、骨髓、血液、中樞神經(jīng)系統(tǒng)或者肺。
一只基因敲除小鼠基因表達(dá)降低是致死性的，因此這引出了用作疾病模型的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)量的問題。在本發(fā)明的方法中，NOI能通過操作和組織特異性或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子連接。在一個(gè)特定的發(fā)育階段或者一種特異的組織需要消除基因表達(dá)的時(shí)候，此點(diǎn)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
NOI以結(jié)構(gòu)組織特異性或者可調(diào)節(jié)的方式在轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)?？梢员磉_(dá)NOI的細(xì)胞種類包括任何器官和組織的細(xì)胞，比如所述生物大腦、腎臟、肝臟、心臟、骨髓、血液、中樞神經(jīng)系統(tǒng)或者肺的細(xì)胞。NOI還可以在生物的特定發(fā)育階段表達(dá)。
如上討論，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述NOI編碼能夠使靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默的RNA，如短RNA、siRNA、短發(fā)卡RNA或者微RNA。
本發(fā)明還涉及到來源于這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以用作蛋白質(zhì)生產(chǎn)，如治療蛋白(例如胰島素)的生產(chǎn)，這和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在動(dòng)物模型中的使用一樣有前景。
在本發(fā)明中的一個(gè)特定方面中，提供了一種轉(zhuǎn)基因鳥類的卵。因此根據(jù)本發(fā)明中的這一方面，提供了一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鳥類和/或者轉(zhuǎn)基因鳥類卵的方法，該方法中包括在鳥類細(xì)胞中導(dǎo)入含有NOI的慢病毒表達(dá)載體。在這一情況，NOI編碼一種蛋白，該蛋白可以潔凈而有效地從表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)基因卵中獲得。
然而我們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到由于卵的大小所限，在卵中所產(chǎn)生蛋白質(zhì)的體積有限。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使一個(gè)或多個(gè)卵固有編碼蛋白的基因沉默，可能會(huì)增加NOI介導(dǎo)的蛋白質(zhì)表達(dá)。這些固有蛋白表達(dá)可以通過本發(fā)明的方法下調(diào)，例如使用編碼能夠使天然卵基因沉默之RNA分子的慢病毒表達(dá)載體。一種能表達(dá)蛋白質(zhì)的NOI和一種能產(chǎn)生使卵靶基因沉默之RNA分子的NOI可以存在于相同的慢病毒載體中，也可以存在于不同的慢病毒表達(dá)載體中。在本發(fā)明這一方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，能表達(dá)蛋白質(zhì)的NOI置于受啟動(dòng)子控制的區(qū)域中，而這一啟動(dòng)子是卵所固有的，比如溶菌酶啟動(dòng)子。
因此本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因生物或者轉(zhuǎn)基因生物卵，其包括能表達(dá)蛋白質(zhì)，優(yōu)選治療性蛋白質(zhì)的至少一種NOI，以及編碼能夠使卵固有靶基因沉默之RNA分子的NOI。如上討論，第二種NOI可以編碼能夠使靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默的RNA，如短RNA、siRNA、短發(fā)卡RNA或微RNA。
轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用(PTGS)由雙鏈dsRNA介導(dǎo)，是細(xì)胞固有的、用以控制外源基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的防御機(jī)制。舉例來說，轉(zhuǎn)座子或病毒等一些DNA元件可以隨機(jī)整合引起dsRNA表達(dá)，dsRNA進(jìn)而激活序列特異性的同源單鏈mRNA或者病毒基因RNA降解。沉默作用稱作RNA干擾(RNAi)。RNAi的機(jī)制包括將長(zhǎng)dsRNAs加工成21～25個(gè)核苷酸(nt)RNAs的兩倍體。這些產(chǎn)物稱作小干擾RNA或者小沉默RNAs(siRNAs)，它們是mRNA降解的序列特異性介質(zhì)。除了siRNAs，短RNAs的表達(dá)也可以改變剪切(“外顯子跳躍(exon-skipping)”)或者多聚腺苷酸化，或者抑制翻譯。
雖然病毒載體是體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的有效工具，但由于參與轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用的RNA分子較短，使用常規(guī)的表達(dá)序列盒難以進(jìn)行這些RNA分子的轉(zhuǎn)錄。另一個(gè)問題是，應(yīng)用病毒載體，例如慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)上述針對(duì)某一基因、編碼一種重要生理功能的產(chǎn)物的RNA，由此生成的轉(zhuǎn)基因生物可能會(huì)在發(fā)育過程中死亡。本發(fā)明的一個(gè)方面通過提供一種載體，該載體中多核苷酸(如siRNA)的轉(zhuǎn)錄能被適應(yīng)酶所調(diào)節(jié)，因此克服了這一問題。事實(shí)上，本發(fā)明的這一方面并不局限于涉及慢病毒載體的方法，這構(gòu)成了本發(fā)明獨(dú)立的一個(gè)方面。
本發(fā)明的第二方面中，提供了包含第一核苷酸序列的載體，其中所述的第一核苷酸序列包括(a)編碼適應(yīng)酶(aptazyme)的第二核苷酸序列；和(b)可以產(chǎn)生多聚核苷酸的第三核苷酸序列；此處(a)和(b)可操縱性地相連接，其中適應(yīng)酶能夠活化，切割第一核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄本，從而形成多聚核苷酸序列。
換句話說，構(gòu)建了一種包括核酸序列的載體，其中所述的核酸序列包括(c)編碼適應(yīng)酶的第一核苷酸序列；和(d)可以產(chǎn)生多聚核苷酸的第二核苷酸序列；此處(a)和(b)可操縱性地相連接，其中適應(yīng)酶能夠活化，切割核酸序列的轉(zhuǎn)錄本，從而形成多聚核苷酸序列。
優(yōu)選的是，所述載體是病毒載體。
在本發(fā)明這一方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，多聚核苷酸是能夠調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的RNA分子，優(yōu)選選自siRNA、短發(fā)卡RNA、微RNA、反義RNA和核酶。
適應(yīng)酶是具有別構(gòu)效應(yīng)的核酶。該酶是核酸分子，可以形成能結(jié)合許多配體的結(jié)構(gòu)，所述的配體包括蛋白質(zhì)和藥物分子。將核酶例如錘頭狀核酶的一個(gè)螺旋替換為適應(yīng)酶，配體存在或不存在條件下導(dǎo)致該酶構(gòu)象改變，從而有可能形成能夠切割底物(可以是其自身)的催化性RNA。已經(jīng)有人報(bào)道了(Soukup和Breaker 1999)受黃素單核苷酸(FMN)誘導(dǎo)或抑制的適應(yīng)酶，還有人報(bào)道了(Piganaeu等2000年)受強(qiáng)力霉素抑制的適應(yīng)酶。
本發(fā)明的另一個(gè)獨(dú)立方面是適應(yīng)酶誘導(dǎo)的切割可以被用來直接調(diào)節(jié)NOI的表達(dá)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了一種包括第一條核苷酸序列的載體，其中所述的第一條核苷酸序列包括(a)編碼適應(yīng)酶的第二核苷酸序列；和(b)含有一個(gè)NOI的第三核苷酸序列；
其中(a)和(b)可操縱性地相連接，其中適應(yīng)酶能夠活化，切割第一核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄本，從而使NOI的表達(dá)受到抑制。
換句話說，本發(fā)明提供了一個(gè)包含核酸序列的載體，此處的核酸序列包括(c)編碼適應(yīng)酶的第一核苷酸序列；和(d)包括NOI的第二核苷酸序列；此處(a)和(b)可以通過操作連接，其中適應(yīng)酶能夠活化，切割核酸序列的轉(zhuǎn)錄本，從而NOI的表達(dá)受到抑制。
優(yōu)選的是，所述載體是病毒載體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，由上述載體編碼的適應(yīng)酶活化，從而切割第一核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，切割位點(diǎn)位于第三核苷酸序列轉(zhuǎn)錄本內(nèi)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的第三方面，該載體編碼的NOI編碼一種治療性蛋白質(zhì)。
本發(fā)明第二和第三方面的一個(gè)實(shí)施方案中，適應(yīng)酶結(jié)合配體后活化。
本發(fā)明第二和第三方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，適應(yīng)酶結(jié)合配體后失活。
本發(fā)明第二和第三方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，載體還包括第四核苷酸序列，該核苷酸序列編碼一種能和適應(yīng)酶結(jié)合的配體。編碼配體的核苷酸序列可操縱性地和啟動(dòng)子連接。
該配體選自多肽和其片段、線性肽、環(huán)肽和其編碼核苷酸、包括低分子量有機(jī)或者無機(jī)化合物的合成和天然化合物以及抗體。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明這些方面中使用的配體選自FMN、強(qiáng)力霉素和VEGF、四環(huán)素或者葡萄糖。
本發(fā)明的第二和第三方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，(a)和(b)可操縱性地和啟動(dòng)子連接。優(yōu)選的啟動(dòng)子選自RNA聚合酶III(U6)啟動(dòng)子，例如U6啟動(dòng)子和常規(guī)的RNA聚合酶II啟動(dòng)子。
啟動(dòng)子可操縱性地和至少一個(gè)拷貝的四環(huán)素應(yīng)答元件(TRE)如Tet操縱子的相連接，從而使第一核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄受四環(huán)素調(diào)節(jié)因子、四環(huán)素或者其衍生物調(diào)節(jié)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的第二和第三方面，該載體包括編碼四環(huán)素調(diào)節(jié)因子的第五核苷酸序列。
雖然我們優(yōu)選在盡量降低適應(yīng)酶活性以及自身切割所致載體基因組不必要的破壞條件下構(gòu)建載體，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體以分裂內(nèi)含子載體(split intron vector)的構(gòu)型存在。這樣可以確保適應(yīng)酶的完整序列僅存在于原病毒編碼的轉(zhuǎn)錄本中，而不出現(xiàn)在載體顆粒的RNA基因組中。抑制病毒RNA基因組中具有潛在活性之適應(yīng)酶形成的另一個(gè)手段是使用一種啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子的3’末端序列可以和適應(yīng)酶的一部分進(jìn)行堿基配對(duì)，從而形成發(fā)卡以阻止病毒RNA基因組中活化適應(yīng)酶的形成。分裂內(nèi)含子載體的細(xì)節(jié)在WO99/15683中有描述。
根據(jù)本發(fā)明第二和第三方面，載體可以來自于任何合適的病毒，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒載體、皰疹載體、痘病毒載體、細(xì)小病毒載體或者桿狀病毒(baculoviral)載體。
本發(fā)明的第四方面中，提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法，該方法使用本發(fā)明第二和第三方面中的載體。
根據(jù)本方面的第五方面，提供了按照本發(fā)明的一些方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了轉(zhuǎn)基因生物，所述轉(zhuǎn)基因生物通過本發(fā)明中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞產(chǎn)生或獲得。
根據(jù)本發(fā)明的的第七方面，提供了轉(zhuǎn)基因生物，其中NOI在造血細(xì)胞(包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞或者這些細(xì)胞的祖細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)元、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、腎臟、肝臟、心臟或肺臟細(xì)胞中表達(dá)。
本發(fā)明的另一方面中，提供了根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物，此處NOI在輸卵管細(xì)胞、生殖道細(xì)胞、白蛋白、造血細(xì)胞(包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞或者這些細(xì)胞的祖細(xì)胞)內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)元、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、腎臟、肝臟、心臟或肺臟細(xì)胞中表達(dá)。
現(xiàn)在將通過非限制性的實(shí)施例方式，參考附圖來描述本發(fā)明的各種優(yōu)選特征和實(shí)施方案附圖簡(jiǎn)述

圖1所示為子宮注射EIAV慢病毒后的肝臟和組織組織學(xué)，以及胎兒靜脈內(nèi)注射后3、7、14、28、79天和6個(gè)月后對(duì)β半乳糖苷酶標(biāo)記基因進(jìn)行染色的鼠肝臟切片。
圖2所示為子宮注射EIAV慢病毒后的組織和組織學(xué)，以及胎兒靜脈內(nèi)注射后3、7、14、28、79天和6個(gè)月后對(duì)β半乳糖苷酶標(biāo)記基因進(jìn)行染色的鼠肝臟、心臟、骨骼肌、肺、腦和腎臟切片。
圖3所示為胎兒脊內(nèi)注射表達(dá)核定位LacZ的EIAV病毒載體7天后對(duì)β半乳糖苷酶標(biāo)記基因進(jìn)行染色的鼠背根神經(jīng)節(jié)。
圖4所示為胎兒脊內(nèi)注射表達(dá)核定位LacZ的EIAV病毒載體數(shù)天后對(duì)β半乳糖苷酶標(biāo)記基因進(jìn)行染色的鼠背根神經(jīng)節(jié)切片。
圖5所示為胎兒靜脈內(nèi)注射表達(dá)核定位LacZ的EIAV病毒載體7天后對(duì)β半乳糖苷酶標(biāo)記基因進(jìn)行染色的鼠肝臟切片。
圖6所示為胎兒靜脈內(nèi)注射表達(dá)核定位LacZ的EIAV病毒載體7天對(duì)β半乳糖苷酶標(biāo)記基因進(jìn)行染色的鼠腎血管小球及其切片。
圖7所示為胎兒靜脈內(nèi)注射表達(dá)核定位LacZ的EIAV病毒載體7天后對(duì)β半乳糖苷酶標(biāo)記基因進(jìn)行染色的鼠胰腺及其切片。
圖8所示為胎兒肌肉注射表達(dá)核定位LacZ的EIAV病毒載體7天后對(duì)β半乳糖苷酶標(biāo)記基因進(jìn)行染色的鼠骨骼肌切片。
圖9所示為胎兒腹腔注射表達(dá)LacZ的EIAV病毒載體兩周后對(duì)β半乳糖苷酶標(biāo)記基因進(jìn)行染色的鼠膈膜及其橫切片。
圖10所示為胎兒肌肉注射表達(dá)LacZ的EIAV病毒載體兩周后對(duì)β半乳糖苷酶標(biāo)記基因進(jìn)行染色的鼠小腿及其切片。
圖11所示為在胸內(nèi)和腹膜內(nèi)注射EIAV病毒載體96小時(shí)后，β半乳糖苷酶催化的X-Gal顯色。圖11A所示為去除內(nèi)臟的矢狀面。圖11B所示為切除膈膜的正面。
圖12所示為EIAV基因組大小的示意圖。這可以應(yīng)用于本發(fā)明中的轉(zhuǎn)染。發(fā)生轉(zhuǎn)染時(shí)，3’LTR末端將拷貝到5’LTR。
圖13所示為pONY8.1G的核酸序列。
圖14所示為pONY8.4CG的核苷酸序列。
圖15所示為pONY8.1GCZ的核苷酸序列。
圖16所示為應(yīng)用于本發(fā)明中的一個(gè)載體的雜合U3區(qū)示意圖。
圖1 7所示為這一雜合LTR的核苷酸序列。
圖18所示為pONY8.1ZHyb的核苷酸序列。
圖19所示為pONY8.1ZHyb的一個(gè)示意圖。
圖20(a)-(c)所示為用作RNAi應(yīng)用的表達(dá)盒。
圖21(a)所示為一種用于在介導(dǎo)適應(yīng)酶調(diào)節(jié)siRNA基因沉默化過程的表達(dá)盒。
圖21(b)所示為圖24a表達(dá)盒的轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)。
圖22所示為一種用于通過siRNAs缺氧誘導(dǎo)VEGF沉默的表達(dá)盒。
圖23(a)所示為含有一個(gè)RNA聚合酶II啟動(dòng)子和表達(dá)適應(yīng)酶調(diào)節(jié)短發(fā)卡的表達(dá)盒。
圖23(b)所示為含有一個(gè)RNA聚合酶II啟動(dòng)子的表達(dá)盒和表達(dá)適應(yīng)酶調(diào)節(jié)反義siRNA的表達(dá)盒。
圖24(a)所示為用于介導(dǎo)適應(yīng)酶調(diào)節(jié)胰島素表達(dá)的表達(dá)盒。
圖24(b)所示為用于介導(dǎo)適應(yīng)酶調(diào)節(jié)因子IX表達(dá)的表達(dá)盒。
圖25(a)所示為一種避免RNA基因組自身剪切的分裂內(nèi)含子策略的示意圖。
圖25(b)所示為一種用于分裂內(nèi)含子的表達(dá)盒。
圖26所示為一種避免RNA基因組自身剪切的雙發(fā)卡策略的示意圖。
發(fā)明詳述此處提及的技術(shù)通常都是本領(lǐng)域所熟知的，具體可以參考Sambrook等編撰的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)》(1989)和Ausubel等撰寫的John Wiley & Sons出版的《(分子生物學(xué)簡(jiǎn)明手冊(cè)》(1999)。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及利用非靈長(zhǎng)類慢病毒表達(dá)載體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因生物或轉(zhuǎn)基因生物一部分的方法。更具體地說，本發(fā)明的這一方面涉及慢病毒載體在基因治療和建立疾病模型中的有效應(yīng)用。疾病模型，如基因敲除小鼠的建立大大有益于基因功能的研究，建立遺傳性疾病的哺乳動(dòng)物模型方面尤其具有相關(guān)性。
基因治療包括任意一種或多種一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)，如對(duì)靶細(xì)胞中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的進(jìn)行添加、替換、缺失、補(bǔ)充和操作。如果靶位點(diǎn)是靶細(xì)胞，那么細(xì)胞可以是組織或者器官的一部分。有關(guān)基因治療的一般技術(shù)參見《分子生物學(xué)》(Ed Robert Meyers，PubVCH，如556-558)。
進(jìn)一步舉例來說，基因治療還提供了一種方法，通過這種方法，可以應(yīng)用任何一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列，如基因來置換或補(bǔ)充有缺陷的基因；去除致病基因及其產(chǎn)物；按次序增加新基因，例如用以產(chǎn)生一種更為有利的表型；可以在分子水平操作細(xì)胞以治療癌癥(Schmidt-Wolf和Schmidt-Wolf，1994，血液學(xué)年報(bào)69273-279)或者其他病情，例如免疫、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)、炎性或者感染性疾病；可以操作抗原和/或?qū)塍w內(nèi)引起免疫應(yīng)答-例如基因疫苗。
轉(zhuǎn)基因生物是其細(xì)胞的至少一種細(xì)胞中含有目的核苷酸序列(NOI)。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞是胚系細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞是體細(xì)胞。更具體的是，NOI已通過實(shí)驗(yàn)法，例如使用cDNA技術(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
NOI通常指的是“轉(zhuǎn)基因”，即以能夠確保其功能的方式插入細(xì)胞的一個(gè)基因。當(dāng)基因插入胚系細(xì)胞時(shí)，必須象正?；蛞粯影l(fā)揮功能、復(fù)制并轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明包括嵌合體(chimeras)和鑲嵌體(mosaics)。
“嵌合體”是一種由遺傳上不同的細(xì)胞的混合體組成的生物。
“鑲嵌體”是第一次細(xì)胞分裂后將轉(zhuǎn)基因整合入基因組的生物。因?yàn)椴煌?xì)胞具有不同的整合位點(diǎn)，該生物是鑲嵌體。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物優(yōu)選是一種多細(xì)胞的真核生物，如動(dòng)物或者植物或真菌或諸如酵母之類的單細(xì)胞真核生物。
然后生物優(yōu)選是一種動(dòng)物，更優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的第一方面使用非靈長(zhǎng)類慢病毒表達(dá)載體。
如本領(lǐng)域所熟知的，載體是一種可以促使基因從一種環(huán)境轉(zhuǎn)移進(jìn)入另一種環(huán)境的工具。根據(jù)本發(fā)明，舉例來說，應(yīng)用于重組DNA技術(shù)中的一些載體能夠使DNA片段之類的實(shí)體(例如異源DNA片段，例如異源cDNA片段)轉(zhuǎn)移進(jìn)入宿主細(xì)胞，使含有DNA片段的載體得以復(fù)制。舉例來說，在重組DNA技術(shù)中使用的載體包括但不僅限于質(zhì)粒、染色體、人工染色體或者病毒。
“表達(dá)載體”表示一種能夠在體內(nèi)或體外/離體表達(dá)的一種構(gòu)建體。
本發(fā)明的一些方面中使用的慢病毒載體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂的靶細(xì)胞。該特征的優(yōu)點(diǎn)是由于新鮮分離的卵母細(xì)胞是沉默的，使用慢病毒可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而逆轉(zhuǎn)錄病毒則不能。
在本發(fā)明的方法中使用的一個(gè)典型載體中，至少可以從病毒中去除一個(gè)或者多個(gè)對(duì)于復(fù)制來說關(guān)鍵的蛋白質(zhì)編碼區(qū)部分。這使地病毒病毒載體具有復(fù)制缺陷。病毒基因組部分還替換為編碼候選調(diào)節(jié)性部分的文庫，該候選調(diào)節(jié)性部分可操縱性地和載體基因組中調(diào)控性的控制區(qū)以及報(bào)道部分相連，以產(chǎn)生包含候選調(diào)節(jié)性部分的載體，其中所述的候選調(diào)節(jié)性部分能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂的靶細(xì)胞和/或?qū)⑵浠蚪M整合到宿主細(xì)胞中。
優(yōu)選的是，能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂或者慢分裂細(xì)胞的病毒載體是慢病毒載體。
慢病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒大家族中的一部分。慢病毒的詳細(xì)列單參考Coffin等(《逆轉(zhuǎn)錄病毒》1997冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社J M Coffin，S M Hughes，H E Varmus 758-763頁)。簡(jiǎn)單的說，慢病毒可以分為靈長(zhǎng)類和非靈長(zhǎng)類。舉例來說，靈長(zhǎng)類慢病毒包括但不僅限于人自身免疫缺陷綜合征(AIDS)的致病因子——人免疫缺陷病毒(HIV)和猴免疫缺陷病毒(SIV)。非靈長(zhǎng)類慢病毒包括原型“慢病毒”梅迪病毒(VMV)、相關(guān)羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)和近期描述的貓免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
慢病毒家族和其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的區(qū)別在于慢病毒既能感染分裂細(xì)胞也能感染非分裂細(xì)胞(Lewis等，1992，EMBO.J 113053-3058；Lewis和Emerman，1994，病毒學(xué)雜志.68510-516)。相比之下，其他慢病毒如MLV不能感染非分裂細(xì)胞或者慢分裂細(xì)胞，這些細(xì)胞如肌、腦、肺、肝等組織的細(xì)胞。
本發(fā)明一些方面中使用的“非靈長(zhǎng)類載體”指載體來源于最初不感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物，尤其是人類的病毒。因此，非靈長(zhǎng)類病毒載體包括感染非靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物的載體，這些非靈長(zhǎng)類動(dòng)物如狗、羊、馬、爬行動(dòng)物、鳥和昆蟲。
此處使用的慢病毒或者慢病毒載體至少包含一種衍生自慢病毒的組成部分。優(yōu)選的是，所述的組成部分參與載體感染細(xì)胞、表達(dá)基因或復(fù)制的生物學(xué)機(jī)制。所使用的“衍生”(derivable)表述的意義不是一般的意義，是該序列沒有必要從慢病毒中獲取，而是能夠從其衍生而來。舉例來說，該序列可以合成得到或者通過使用重組DNA技術(shù)獲取。
非靈長(zhǎng)類慢病毒可以是慢病毒家族的任何成員，其本質(zhì)上并不感染靈長(zhǎng)類，包括有貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)，羊關(guān)節(jié)腦炎病毒(CAEV)、Maedi綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎病毒(MVV)或者馬感染性的貧血病毒(EIAV)。優(yōu)選的非靈長(zhǎng)類慢病毒是一種EIAV。馬感染性貧血病毒感染所有的馬，導(dǎo)致血漿病毒血癥和血小板減少(Clabough等，1991，病毒雜志，656242-6251)。病毒復(fù)制受單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞這一過程控制。
在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒載體源自于EIAV。在本發(fā)明中特別優(yōu)選使用的EIAV具有最簡(jiǎn)單的慢病毒基因結(jié)構(gòu)。除了gag、pol和env基因，EIAV編碼三種其他基因tat、rev和S2。Tat作為病毒LTR的轉(zhuǎn)錄活化因子(Derse和Newbold，1993，病毒學(xué)，194530-536；Maury等，1994，病毒學(xué)，200632-642)；Rev通過rev-應(yīng)答元件(RRE)控制和調(diào)節(jié)病毒基因的表達(dá)(Martarano等，1994，病毒學(xué)雜志，683102-3111)。這兩種蛋白作用的機(jī)制被公認(rèn)為和靈長(zhǎng)類病毒的機(jī)制相似(Martano等，引文同上)。S2的功能不詳。此外，還分離得到一個(gè)EIAV蛋白Ttm，它是由tat基因的第一個(gè)外顯子與env基因編碼跨膜蛋白的啟始序列拼接所編碼的。
除了蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，非靈長(zhǎng)類慢病毒還包括第四個(gè)由pol基因編碼的dUTPase，這可能在慢病毒感染某些非分裂型細(xì)胞時(shí)起作用。
本發(fā)明該方面的病毒RNA由一個(gè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)子可以是病毒或者非病毒來源的，但必須能控制在真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)。在啟動(dòng)子上游或者下游可以隨意地選用增強(qiáng)子。RNA轉(zhuǎn)錄在多聚腺苷酸化位點(diǎn)中止，該位點(diǎn)可以由慢病毒3’LTR或一種不同的多聚腺嘌呤信號(hào)提供。
因此，本發(fā)明使用的DNA轉(zhuǎn)錄元件包括啟動(dòng)子和隨意地選用的增強(qiáng)子，該元件能夠調(diào)節(jié)控制非靈長(zhǎng)類慢病毒載體基因組的表達(dá)。
此處描述的轉(zhuǎn)錄件包括含有能夠得以轉(zhuǎn)錄之序列的核酸區(qū)域。因此，根據(jù)該定義，這些序列包括編碼mRNA、tRNA和rRNA的序列。該序列可以在啟動(dòng)子的正義方向或者反義方向上?？梢愿鶕?jù)人們所熟知的技術(shù)，使用反義構(gòu)建體來抑制細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)基因表達(dá)。例如，核酸可以是核糖核酸(RNA)或者脫氧核糖核酸(DNA)或者其類似物。編碼mRNA的序列可選性地包括一些或者所有5’和/或者3’端被轉(zhuǎn)錄但不被翻譯的旁側(cè)序列；或者相反，和翻譯編碼序列相關(guān)的序列。該序列甚至可選性地包括和轉(zhuǎn)錄序列相關(guān)的轉(zhuǎn)錄控制序列；例如轉(zhuǎn)錄中止信號(hào)、多聚腺苷酸化位點(diǎn)和下游增強(qiáng)子元件。核酸可以包括cDNA或者基因組DNA(可包括內(nèi)含子)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的基本結(jié)構(gòu)是一個(gè)5’LTR和3’LTR，在兩者之間或其內(nèi)部存在能使病毒基因組被包裝的包裝信號(hào)、引物結(jié)合位點(diǎn)、使病毒基因組整合入宿主細(xì)胞基因組的整合位點(diǎn)和編碼包裝成分的gag、pol和env基因——這些多肽是病毒顆粒裝配所必需的。更復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒具有其它的特征，例如HIV中的rev和RRE序列，兩者可以使整合的原病毒RNA轉(zhuǎn)錄本從核到被感染靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被有效地轉(zhuǎn)運(yùn)。
在原病毒中，這些基因位于長(zhǎng)末端重復(fù)區(qū)(LTRs)的旁側(cè)。LTRs控制原病毒整合和轉(zhuǎn)錄。LTRs也作為增強(qiáng)子-啟動(dòng)子序列能控制病毒基因的表達(dá)。由于一種psi序列定位于5’基因組末端的存在，逆轉(zhuǎn)錄病毒RNAs可發(fā)生包裝。
LTRs本身是與U3、R和U5三個(gè)元件序列完全相同的。U3源自于RNA 3’末端的單一序列。R來自于RNA兩端的重復(fù)序列。U5來自于RNA 5’末端的單一序列。這三個(gè)元件的大小在不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒間有變化。
在一個(gè)缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組中，gag、pol和env可以缺失或者沒有功能。RNA兩端的R區(qū)域是重復(fù)序列。U5和U3分別表示RNA基因組5’和3’末端的單一序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，優(yōu)選使用的載體是重組非靈長(zhǎng)類慢病毒載體。
“重組慢反應(yīng)病毒載體”(RLV)表示一種含有足夠的逆轉(zhuǎn)錄病毒遺傳信息的載體，在包裝成分存在時(shí)RNA基因組能包裝感染靶細(xì)胞的病毒顆粒。靶細(xì)胞的感染包括逆轉(zhuǎn)錄和靶細(xì)胞基因組的整合。RLV含有通過載體進(jìn)入靶細(xì)胞的非病毒編碼序列。RLV在靶細(xì)胞中不能獨(dú)立復(fù)制產(chǎn)生感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。RLV通常缺乏功能性的gag-pol和/或者env基因和/或者其他復(fù)制必需的基因。本發(fā)明的載體可以構(gòu)建為分裂內(nèi)含子載體。分裂內(nèi)含子載體在PCT專利申請(qǐng)WO99/15683中有描述。
優(yōu)選的是，本發(fā)明中慢病毒載體有一個(gè)最小病毒基因組。
如此處所使用的“最小病毒基因”意味著病毒載體經(jīng)過操作以致于去除非必需元件而保留必需元件，以提供感染、轉(zhuǎn)導(dǎo)的必需的功能和遞送目的核苷酸序列進(jìn)入靶宿主細(xì)胞。這個(gè)策略的更多細(xì)節(jié)可參見我們的WO98/17815。
本發(fā)明使用的最小慢病毒基因組包括(5’)R-U5-一個(gè)或多個(gè)第一核苷酸序列-U3-R(3’)。然而，在宿主/包裝細(xì)胞用于產(chǎn)生慢病毒基因組的質(zhì)粒載體還包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制序列，這些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制序列可操縱性地和慢病毒基因組相連并控制基因組在宿主/包裝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。這些調(diào)節(jié)序列可以是和轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列相關(guān)的自身序列，如5’U3區(qū)域；或者它們可以是象另一病毒啟動(dòng)子那樣的異源啟動(dòng)子，例如CMV啟動(dòng)子。一些慢病毒基因組為了高效地產(chǎn)生病毒需要另外的的序列。例如，對(duì)于HIV來說優(yōu)選包括rev和RRE序列。然而，對(duì)rev和RRE的必要條件可以通過密碼子優(yōu)化減少或者消除。這個(gè)策略的更多細(xì)節(jié)可參見我們的W001/79518。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，慢病毒載體是自身不能激活的載體。
舉例來說，通過去除轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或者同時(shí)去除3’LTR U3區(qū)域的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子已構(gòu)建了自身不能激活的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。經(jīng)過一輪的載體逆轉(zhuǎn)錄和整合之后，這些改變可以拷貝到5’和3’LTRs并產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)錄的非活化原病毒。(Yu等，1986，Proc Natl Acad Sci，833194-3198；Dougherty和Temin，1987，Proc Natl Acad Sci，841197-1201；Hawley等，1987，Proc Natl Acad Sci，842406-2410；Yee等，1987，ProcNatl Acad Sci，919564-9568)。然而，這些載體內(nèi)部的啟動(dòng)子到LTRs仍將被轉(zhuǎn)錄活化。這種策略已被用于消除在病毒LTRs中的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子對(duì)內(nèi)置基因轉(zhuǎn)錄作用的影響。這些影響包括增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄(Jolley等，1983，Nucleic Acids Res，111855-1872)或者轉(zhuǎn)錄抑制(Emerman和Temin，1984，Cell，39449-467)。這種策略也可以用來消除從3’LTR進(jìn)入基因組DNA的下游轉(zhuǎn)錄。(Herman和Coffin，1987，Science，236845-848)。這在人類基因治療方面引起了特別的關(guān)注，它對(duì)阻止內(nèi)源性癌基因偶然的活化極其重要。
在我們的WO99/32646中，我們給出了可以方便應(yīng)用于本發(fā)明的特征細(xì)節(jié)。具體地說，非靈長(zhǎng)類慢病毒基因組(1)優(yōu)選包括缺失的gag基因，其中g(shù)ag基因中的缺失去除了gag編碼序列中約350或354個(gè)核苷酸下游的一個(gè)或者多個(gè)核苷酸；(2)優(yōu)選具有非靈長(zhǎng)類慢病毒基因組中不存在的一個(gè)或多個(gè)附屬基因；(3)優(yōu)選缺乏tat基因，但包括5’LTR末端和gag ATG之間的前導(dǎo)序列；和(4)(1)、(2)和(3)的組合。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，慢病毒載體包括(1)、(2)和(3)的所有特征。
非靈長(zhǎng)類慢病毒載體可以是靶向載體?！鞍邢蜉d體”指的是一種載體，該載體感染/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞或者在宿主和/或靶細(xì)胞中表達(dá)的能力僅限于宿主生物體內(nèi)特定的細(xì)胞類型，通常是共同或者相似表型的細(xì)胞。
使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行基因治療的靶細(xì)胞包括但不僅限于造血細(xì)胞(包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞或者任意這些細(xì)胞的祖細(xì)胞)；內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞或者神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)元、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、腎臟、肝臟、心臟和肺細(xì)胞。
載體可以是含有任何分子的假型載體，這些分子包括但不局限于VSV-G、rabies、Mokola、MuLV、LCMV、Sendai和Ebola的包膜糖蛋白(野生型或者人工改造的變體或者嵌合體)。
雖然本發(fā)明的第一方面為使用慢病毒載體的一種方法，本發(fā)明的其他方面可以使用其他的病毒表達(dá)載體。根據(jù)這些方面的病毒載體包括但不局限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)載體、皰疹病毒載體、痘病毒載體、細(xì)小病毒載體或者桿狀病毒載體。
本發(fā)明這些方面中使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來自于或可來自于任何合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒。已鑒定到了大量不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒。這些例子包括鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人T細(xì)胞淋巴病毒(HTLV)、鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR-MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、鳥髓細(xì)胞瘤病病毒-29(MC29)和鳥骨髓成紅血細(xì)胞增多癥病毒(AEV)。逆轉(zhuǎn)錄病毒的詳細(xì)列表可參見Coffin等，1997年的《逆轉(zhuǎn)錄病毒》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社J M Coffin，S M Hughes，H E Varmus，758-763頁。
逆轉(zhuǎn)錄病毒可以廣泛地分為兩大類型，即“簡(jiǎn)單型”和“復(fù)雜型”。逆轉(zhuǎn)錄病毒可以進(jìn)一步分作7類。其中5類是帶有原癌基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒。其余的兩類是慢病毒和泡沫病毒。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒的綜述文獻(xiàn)參見Coffin等1997年的著作(同上)。
腺病毒是雙鏈線性DNA病毒，不需要經(jīng)過RNA中間體。有50余種不同的人類血清型腺病毒，根據(jù)遺傳序列同源性分為6個(gè)亞家族。腺病毒的靶點(diǎn)是呼吸系統(tǒng)和胃腸道的上皮細(xì)胞，通常引起較輕的癥狀。血清型2和5(95％序列同源性)通常是腺病毒載體系統(tǒng)中最常用到的，通常和年輕人上呼吸道感染相關(guān)。
病毒基因表達(dá)可以分為早期(E)和晚期(L)階段。晚期階段定義為病毒DNA復(fù)制的開始。腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白通常在晚期階段合成。腺病毒感染后，受多數(shù)血清型病毒感染的宿主細(xì)胞mRNA和蛋白的合成受到抑制。腺病毒2和5的裂解周期非常有效率，導(dǎo)致每個(gè)感染細(xì)胞中大約10000個(gè)病毒顆粒形成，同時(shí)和合成過量的、并不裝配入病毒顆粒的病毒蛋白和DNA。早期腺病毒轉(zhuǎn)錄是一系列復(fù)雜的相關(guān)生化事件，但是其在DNA復(fù)制之前實(shí)現(xiàn)了必要的病毒RNA的合成。
在所有腺病毒亞家族中，腺病毒基因組結(jié)構(gòu)相似；對(duì)于研究的每一種血清型來說，特定的功能通常發(fā)生在同樣的位置上。早期胞漿信使RNA和四種明確的、不相鄰近的病毒DNA區(qū)相互補(bǔ)。這些區(qū)域命名為E1-E4。早期轉(zhuǎn)錄本分類為立即早期(E1a)、晚早期(E1b、E2a、E2b、E3和E4)和立即區(qū)域。
早期基因在感染后約6～8小時(shí)表達(dá)，并從基因元件E1-4中的7個(gè)啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄。
腺病毒可以通過去除E1基因從而用于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體，E1基因?qū)τ贓2、E3和E4啟動(dòng)子的誘導(dǎo)非常重要。E1復(fù)制缺陷病毒可以在含有E1多肽的、諸如人胚腎細(xì)胞系293之類的細(xì)胞系中復(fù)制。一種或多種治療基因能夠通過重組而取代E1基因。E1啟動(dòng)子或者一種異種啟動(dòng)子啟動(dòng)子啟動(dòng)基因表達(dá)。
通過缺失某些或者所有的E4開放閱讀框(ORFs)已構(gòu)建了毒性較弱的腺病毒載體。然而，即使DNA仍保持，某些第二代載體似乎不會(huì)引起基因長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)。因此，一個(gè)或者幾個(gè)E4 ORFs的功能似乎是增強(qiáng)從病毒攜帶的至少某些病毒啟動(dòng)子的表達(dá)。
構(gòu)建嚴(yán)重缺陷的病毒的另一種侯選方法是徹底去除病毒的核心組分而僅保留對(duì)于病毒復(fù)制所必需的末端重復(fù)序列。“去除的”“取出(gutted)”或者“非完全去除的”“未取出(gutless)”病毒和存在于293細(xì)胞中的第一代輔助病毒能夠形成高滴度的病毒，但很難從輔助病毒中分離“去除的”病毒載體。
在鑒定候選基因調(diào)節(jié)因子(moieties)方面，腺病毒載體具有優(yōu)于其他基因治療載體系統(tǒng)的，其原因如下腺病毒是雙鏈DNA無包膜的病毒，能夠在體內(nèi)外轉(zhuǎn)導(dǎo)很多類型的人源或者非人源的細(xì)胞。這些細(xì)胞包括呼吸道上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞和有絲分裂后終端分化細(xì)胞，比如神經(jīng)元。
腺病毒載體也能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞。這對(duì)于諸如囊性纖維化之類的疾病非常重要，在這些囊性纖維化疾病中，肺上皮中受感染細(xì)胞具有低周轉(zhuǎn)速度。事實(shí)上，正進(jìn)行利用腺病毒介導(dǎo)囊性纖維化轉(zhuǎn)運(yùn)(CFTR)方法導(dǎo)入囊性纖維化成年患者肺部的試驗(yàn)。
病毒或者腺病毒基因組中的外源基因表達(dá)不需要一種復(fù)制型的細(xì)胞。腺病毒載體通過受體介導(dǎo)的胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，腺病毒載體就很少整合入宿主染色體。腺病毒載體以線性基因組游離于(不依賴于宿主基因組)宿主細(xì)胞核中行使功能。因此，重組腺病毒的使用可以減少基因隨機(jī)整合進(jìn)入宿主基因組的問題。
根據(jù)本發(fā)明的許多方面可以使用痘病毒載體，由于大的DNA片段易于被克隆到痘病毒基因中，并且已有重組減毒的牛痘突變體的文獻(xiàn)報(bào)道(Meyer等，1991，J.Gen Virol.721031-1038，Smith和Moss 1983Gene，2521-28)。
痘病毒載體例如但不局限于兔痘病毒Upton等，J.Virology 60920(1986)(shope纖維瘤病毒)；羊痘病毒屬Gershon等J.Gen Virol.70525(1989)(肯亞綿羊-1)；正痘病毒屬Weir等J.Virology 46530(1983)(牛痘)；Esposito等，Virology 135561(1984)(猴痘和天花病毒)；Hruby等，PNAS，803411(1983)(牛痘)；Kilpatrick等Virology 143399(1985)(Yaba猴腫瘤病毒)；禽痘病毒Binns等，J.Gen Virol.691275(1988)(禽痘)；Boyle等，Virology 156355(1987)(禽痘)；Schnitzlein等J.Virological Method，20341(1988)(禽痘，鵪鶉痘)；昆蟲痘(Lytvyn等，J.Gen Virol.733235-3240(1992)。
痘病毒在真核細(xì)胞中被廣泛地用作目的基因的表達(dá)載體。具體地說，它們?cè)诙喾N宿主細(xì)胞中易于克隆和繁殖的特征導(dǎo)致痘病毒載體廣泛應(yīng)用于表達(dá)外源蛋白的載體和傳送疫苗抗原的工具(Moss，B.1991，Science，2521662-7)。
根據(jù)本發(fā)明一些方面所使用的痘病毒包括但不僅限于重組痘病毒載體，例如禽痘病毒(FPV)、昆蟲痘病毒；牛痘病毒，例如NYVAC、金絲雀痘病毒，MVA或者其他非復(fù)制病毒載體系統(tǒng)，如WO 95/30018中所描述的例子。還描述了至少一種免疫逃避基因缺失了的痘病毒載體(參見WO 00/29428)。
如上所示，本發(fā)明的方法中使用的核苷酸序列插入載體中并通過操作與控制序列相連結(jié)，而控制序列通過宿主細(xì)胞可表達(dá)編碼序列，也就是說載體是一表達(dá)載體。重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的NOI可以被分泌或者保存在細(xì)胞內(nèi)，這取決于所使用的序列和/或載體。
異源基因NOI可以是一個(gè)野生型基因的任意一種等位變體，或者可以是一種變突基因?！盎颉币馑际前ㄖ辽倌鼙晦D(zhuǎn)錄的核苷酸序列。因此，編碼mRNA、tRNA、和rRNA的序列包括在這個(gè)定義之中。相對(duì)于啟動(dòng)子這些序列可以位于正義或者反義鏈中。根據(jù)人們熟知的技術(shù)反義結(jié)構(gòu)來抑制細(xì)胞中的某一基因的表達(dá)。例如，核苷酸可以是核糖核酸(RNA)或者脫氧核糖核酸(DNA)或者它們的任意類似物。編碼mRNA的序列可以選擇性地包括一部分或者所有的5’和/或者3’轉(zhuǎn)錄但不被翻譯的旁側(cè)序列，或相反，和能翻譯的編碼序列相連接。它可以進(jìn)一步選擇性地包括與轉(zhuǎn)錄序列相關(guān)的轉(zhuǎn)錄控制序列，例如轉(zhuǎn)錄中止信號(hào)、多聚腺苷酸化位點(diǎn)和下游增強(qiáng)子元件。核酸可以包括cDNA或者基因組DNA(可以包含內(nèi)含子)。然而，通常指的是使用cDNA，因?yàn)樗恍枰コ齼?nèi)含子并可以高效表達(dá)。
合適的NOI編碼序列包括那些治療性的和/或者診斷性的應(yīng)用，例如但不局限于編碼細(xì)胞因子、趨化因子、激素、抗體、工程化的免疫球蛋白樣分子、單鏈抗體、融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、免疫調(diào)節(jié)分子、反義RNA、靶蛋白的陰性突變體、毒素、引起條件反應(yīng)的毒素(conditional toxin)、抗原、腫瘤抑制因子蛋白和生長(zhǎng)因子、膜蛋白、血管活化(vasoactive)蛋白和多肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物(例如設(shè)有一個(gè)相關(guān)的報(bào)道基團(tuán))。這些編碼序列可以通過操作與合適的啟動(dòng)子相連。該啟動(dòng)子可以是使核酶表達(dá)的啟動(dòng)子，或者是另一個(gè)或多個(gè)不同的啟動(dòng)子。
本發(fā)明中使用的用于治療和預(yù)防癌癥的NOIs包括NOIs編碼蛋白。這些蛋白質(zhì)破壞靶細(xì)胞(例如一種核糖體毒素)，作為腫瘤抑制因子(例如野生型p53)、抗腫瘤免疫機(jī)制的活化因子(例如細(xì)胞因子、協(xié)同刺激分子和免疫球蛋白)、血管生成抑制劑；或者這些蛋白質(zhì)提高藥物的敏感性(例如前藥活化酶)，通過體內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞間接刺激靶細(xì)胞的破壞(例如，強(qiáng)抗原刺激免疫系統(tǒng)或者轉(zhuǎn)變一種前體細(xì)胞成分成為毒性物質(zhì)從而破壞靶細(xì)胞(例如一種前藥激活酶))。編碼蛋白也能破壞靜止腫瘤細(xì)胞(例如利用分泌的抗腫瘤抗體-核糖體毒素融合蛋白)，編碼蛋白間接刺激靜止腫瘤細(xì)胞的破壞(例如細(xì)胞因子刺激免疫系統(tǒng)或者促凝血蛋白引起局部血管阻塞)或者轉(zhuǎn)變一種前體細(xì)胞成分成為毒性物質(zhì)從而破壞靜止腫瘤細(xì)胞(例如活化前藥成為可擴(kuò)散藥物的酶)。
NOIs可以用于編碼反義轉(zhuǎn)錄本或者干擾腫瘤生存所必需的基因表達(dá)的核酶(例如干擾伯基特淋巴瘤myc的異常轉(zhuǎn)錄或者干擾慢性髓樣淋巴瘤bcr-abl的轉(zhuǎn)錄)。也觀察了這些NOIs的聯(lián)合使用。
關(guān)于治療性基因性質(zhì)的更詳細(xì)資料參見WO95/21927和WO98/15294。
用于治療或者預(yù)防缺血性心臟病的NOIs包括編碼血纖維蛋白溶酶原活化因子的NOIs。用于治療和預(yù)防風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和腦型瘧的NOIs包括編碼抗炎蛋白、作用于腫瘤壞死因子(TNF)α的抗體和抗粘附分子(例如抗體分子或者粘附分子的特異性受體)的基因。
用于治療缺氧的NOIs的例子可參見WO95/21927。
NOI編碼序列可以編碼融合蛋白或者一編碼序列中的一個(gè)片段。
作為在靶組織中選擇性表達(dá)的可替換方案，或者與之同時(shí)進(jìn)行的方案，NOI或者NOIs可以編碼前藥激活酶或者酶，如果不用一種或多種作用于一種酶或多種酶的前藥對(duì)個(gè)體進(jìn)行處理，這些酶就沒有重要作用或有害效應(yīng)。在存在活化NOI的情況下，對(duì)患者進(jìn)行適當(dāng)?shù)那八幹委熆梢越档湍[瘤生長(zhǎng)或者存活。
前藥激活酶可以在腫瘤位點(diǎn)釋放進(jìn)行癌癥治療。在每個(gè)病例中，一種合適的前藥與合適的前藥活化酶聯(lián)合用于患者治療。合適的前藥通過和載體連接進(jìn)行給藥。舉例來說，前藥包括依托泊甙磷酸鹽(和堿性磷酸酶聯(lián)合)、5-氟胞嘧啶(和胞嘧啶脫氨酶聯(lián)合)、阿霉素-N-對(duì)羥基酚乙酰胺(和青霉素-V-酰胺酶聯(lián)合)、對(duì)-N-二(2-氯乙烯基)氨基苯甲酰谷氨酰胺(和羧肽酶G2聯(lián)合)、頭孢菌素氮芥氨基甲酸鹽(和β-內(nèi)酰胺酶聯(lián)合)、SR4233(和P450還原酶聯(lián)合)、更昔洛韋(ganciclovir，和HSV胸腺嘧啶激酶聯(lián)合)；芥子氣(mastard)前藥和硝基還原酶聯(lián)合；以及環(huán)磷酰胺(和P450聯(lián)合)。
舉例來說，本發(fā)明使用的合適前藥活化酶包括激活5-氟尿嘧啶前藥capcetabine和furtulon的胸腺嘧啶磷酸化酶；來自單純皰疹病毒的激活更昔洛韋的胸腺嘧啶激酶；激活前藥環(huán)磷酰胺成為DNA破壞物的細(xì)胞色素P450；和激活5-氟胞嘧啶的胞嘧啶脫氨酶。優(yōu)選使用人源性的酶。
用于治療或預(yù)防缺血性心臟病的合適NOIs包括編碼血纖維蛋白溶酶原活化因子的NOIs。用于治療或預(yù)防風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或者腦型瘧疾的合適NOIs包括編碼抗炎蛋白、作用于腫瘤壞死因子(TNF)α的抗體和抗粘附分子(例如抗體分子或者粘附分子的特異性受體)的基因。
NOIs編碼的表達(dá)產(chǎn)物可以是細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)。作為可替代方案，NOI表達(dá)產(chǎn)物不分泌而在細(xì)胞內(nèi)活化。在任一種情況下，優(yōu)選NOI表達(dá)產(chǎn)物顯示一種旁觀效應(yīng)或者一種遠(yuǎn)端旁觀效應(yīng)；即細(xì)胞中形成的表達(dá)產(chǎn)物導(dǎo)致鄰近的或者遠(yuǎn)端的(如轉(zhuǎn)移的)的細(xì)胞死亡，這些細(xì)胞都具有一種共有的表型。
諸如編碼細(xì)胞因子的NOIs可以應(yīng)用于巨噬細(xì)胞或者其他造血細(xì)胞。這些細(xì)胞因子引起含有治療性NOI的造血干細(xì)胞后續(xù)分化(HSCs)。合適的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子包括但不僅限于ApoE、Apo-SAA、BDNF、Cardiotrophin-1、EGF、ENA-78、Eotaxin、Eotaxin-2、Exodus-2、FGF-酸性、FGF-堿性、纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子-10、FLT3配體、Fractalkine(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、胰島素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-10、角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(KGF-2)、KGF、Leptin、LIF、淋巴毒素、Mullerian抑制物、單核集落抑制因子、單核細(xì)胞趨化蛋白、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髓原祖抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、Neurturin、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、干細(xì)胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘤壞死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNIL-1、TPO、VEGF、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ和HCC1。
對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選一些細(xì)胞因子聯(lián)合作用。具體地說，包括IL-3、IL-6和CSF聯(lián)合應(yīng)用以維持和擴(kuò)充干細(xì)胞數(shù)。對(duì)于體外分化，可以增加諸如如GM-CSF和G-CSF細(xì)胞因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化，或者增加GM-CSF和G-CSF來獲得中性粒細(xì)胞。當(dāng)來自患者的工程化細(xì)胞再次導(dǎo)入患者體內(nèi)，然后患者的自身機(jī)制允許這些細(xì)胞或者分化的細(xì)胞后代遷移進(jìn)入到諸如腫瘤侵襲的區(qū)域，。
作為可替代方案，另一種NOI可以是自殺基因，在外源物質(zhì)存在情況下該基因表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞破壞。自殺基因的一個(gè)例子包括單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)，能夠殺死更昔洛韋治療后的被感染的細(xì)胞和靜止細(xì)胞。
作為可替代方案，另一種NOI可以是一種靶蛋白(例如干細(xì)胞因子受體的抗體(WO-A-92、17505；WO-A-9221766))。舉例來說，重組體(ecotropic)逆轉(zhuǎn)錄病毒顯示一種存在于HSCs(例如CD34或者干細(xì)胞因子)表面的受體抗體(或者生長(zhǎng)因子或者多肽)，這種抗體可以通過體外病毒和骨髓共孵育或者通過靜脈注射病毒運(yùn)輸進(jìn)入這些細(xì)胞。
NOIs也可以包括標(biāo)記基因(例如編碼β-半乳糖苷酶或者綠色熒光蛋白的基因)、或者調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)的基因。此外，NOIs可以包括編碼融合蛋白伴侶(partners)的序列并與編碼目的蛋白的序列形成一個(gè)通讀框。融合蛋白配體的例子包括GAL4、6xHis和β-半乳糖苷酶的DNA結(jié)合或者轉(zhuǎn)錄激活域。增加NOIs編碼的靶蛋白的靶序列可以使表達(dá)的融合蛋白定位于特定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)或者進(jìn)入分泌途徑。這樣的靶序列已經(jīng)在該領(lǐng)域被廣泛地被描述。
在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明至少一種NOI通過操作與細(xì)菌HRE元件相連接并編碼諸如FNR的氧感應(yīng)細(xì)菌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。這樣的構(gòu)建體在缺氧時(shí)可以提供一個(gè)自身調(diào)節(jié)系統(tǒng)，由HRE構(gòu)建體表達(dá)的細(xì)菌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白將增加和進(jìn)一步增加HRE構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄和其他HRE構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，NOI編碼核酶。核酶是RNA分子，可以在細(xì)胞內(nèi)催化特定的化學(xué)反應(yīng)且不需要特別的蛋白質(zhì)參與。舉例來說，I型核酶以內(nèi)含子的形式存在，能夠調(diào)節(jié)自身剪切前體RNA的剪切。其他核酶衍生于自身剪接RNA結(jié)構(gòu)，它們是病毒RNA分子的復(fù)制必需的。象蛋白質(zhì)酶一樣，核酶可以折疊成二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)并形成底物和諸如金屬離子輔因子的特異結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)構(gòu)的例子包括錘頭結(jié)構(gòu)、發(fā)卡或者莖環(huán)、假結(jié)體(pseudoknot)和已描述過肝炎δ抗基因組核酶。
每種核酶含有一個(gè)識(shí)別和結(jié)合靶RNA識(shí)別位點(diǎn)的基元(motif)。該基元形成以一種或者多種“結(jié)合臂”但通常形成兩種“結(jié)合臂”。錘頭狀核酶中結(jié)合臂是螺旋I和螺旋III的旁側(cè)序列，螺旋I和螺旋III與螺旋II相鄰。結(jié)合臂長(zhǎng)度可以變化，通常在6-10個(gè)核苷酸之間，但也可以更短或者更長(zhǎng)。
旁側(cè)序列的長(zhǎng)度能夠影響剪切的速度。舉例來說，已發(fā)現(xiàn)旁側(cè)序列核苷酸總數(shù)從20個(gè)降低到12個(gè)能增加核酶剪切HIV序列的的周轉(zhuǎn)速度(turnover rate)達(dá)10倍(Goodchild JVK，1991 Arch Biochem Biophys284386-391)。錘頭狀核酶的螺旋II中催化基元在一個(gè)稱作剪切位點(diǎn)的區(qū)域剪切靶RNA。對(duì)一個(gè)含有合適剪切位點(diǎn)的核酶來說，核酶是否會(huì)剪切任意的給定RNA取決于核酶的識(shí)別位點(diǎn)存在與否。
每個(gè)類型核酶識(shí)別自身的剪切位點(diǎn)。錘頭狀核酶的剪切位點(diǎn)含有位于其上游的核苷酸堿基三聯(lián)體GUX，其中G是鳥嘌呤，U是尿嘧啶，X是任意的核苷酸堿基。發(fā)卡狀核酶含有BCUGNYR的剪切位點(diǎn)，其中B是除腺嘌呤外任意的的核苷酸堿基，N是任意核苷酸，Y是胞嘧啶或者胸腺嘧啶，R是鳥嘌呤或者腺嘌呤。發(fā)卡核酶的剪切發(fā)生于剪切位點(diǎn)中的G和N之間。
關(guān)于核酶更詳細(xì)的描述參見“分子生物學(xué)和生物技術(shù)”(Ed.RAMeyers，1995，VCH出版社，831-8320頁和“逆轉(zhuǎn)錄病毒”(Ed.JMCoffin等，1997，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，683頁)。
核酶可以在所有細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，但僅在靶基因轉(zhuǎn)錄本存在的細(xì)胞中起作用。
作為替代直接抑制組分結(jié)合的選擇方案，該組分可以抑制一個(gè)發(fā)明多肽的生物可利用量。舉例來說，這可以通過在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性、翻譯或者翻譯后穩(wěn)定性抑制該組分的表達(dá)。舉例來說這種物質(zhì)的可以是抑制mRNA生物合成的反義RNA或者雙鏈干擾RNA序列。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，NOI包括一種siRNA。雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)是一種保守的細(xì)胞內(nèi)保護(hù)機(jī)制，可以控制外源基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)座子元件或者病毒的隨機(jī)整合引起dsRNA表達(dá)，dsRNA激活序列特異性的同源單鏈mRNA的降解或者病毒基因組RNA的降解。沉默作用是大家知道的RNA干擾(RNAi)。RNAi的機(jī)制涉及長(zhǎng)dsRNAs加工成為21～25個(gè)核苷酸(nt)RNAs復(fù)合體的過程。這些產(chǎn)物稱為小干擾或者沉默RNAs(siRNAs)，siRNAs是序列特異性的mRNA降解調(diào)節(jié)子。在不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，已發(fā)現(xiàn)大于30bp dsRNA激活干擾素應(yīng)答反應(yīng)，這導(dǎo)致蛋白合成中止和非特異性mRNA降解(Stark等1998)。然而，能用21nt的siRNA復(fù)合體激活該應(yīng)答反應(yīng)(Elbashir等2001年，Hutvagner等2001年)，可在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用于基因的功能分析。
在一實(shí)施方案中，一種諸如U6的RNA聚合酶III啟動(dòng)子的活性受四環(huán)素調(diào)節(jié)，可用于調(diào)節(jié)siRNA的表達(dá)(Ohkawa等，2000)。
在另一實(shí)施方案中，NOI包括一種微型RNA。微型RNAs是生物體自身的一個(gè)大家族的小RNAs，至少某些微型RNA調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。微型RNA家族的組成成員是let-7和lin-4。Let-7基因編碼小的、高度保守的RNA種類，在蠕蟲發(fā)育過程中調(diào)節(jié)內(nèi)源性蛋白編碼基因的表達(dá)?；罨腞NA種類開始被轉(zhuǎn)錄成～70nt的前體，在轉(zhuǎn)錄后加工形成成熟的～21nt的形式。Let-7和lin-4被轉(zhuǎn)錄成為發(fā)卡RNA前體，RNA前體在Dicer酶的作用下形成成熟的形式(Lagos-Quintana等，2001年)。
在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，NOI包括一個(gè)以發(fā)卡形式存在的雙鏈干擾RNA。短發(fā)卡可以由諸如U6的簡(jiǎn)單啟動(dòng)子啟始表達(dá)。在另一備選實(shí)施方案中，有效的RNAi可以通過合并的兩個(gè)U6啟動(dòng)子介導(dǎo)調(diào)節(jié)，其中一種表達(dá)正義鏈區(qū)，另一種表達(dá)該靶序列的同一序列的反向互補(bǔ)序列。這在實(shí)例9中有描述。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以通過使用兩個(gè)反向的的啟動(dòng)子從表達(dá)盒的正向鏈和互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)錄靶序列的正義和反義區(qū)來介導(dǎo)有效的或者雙鏈干擾RNA。這些實(shí)施方案將在實(shí)例9中進(jìn)一步描述。
在另一實(shí)施方案中，NOI可以編碼短RNA，可以改變剪接方向(外顯子跳躍)或者多腺苷酸化或者抑制翻譯。在肌肉萎縮癥的病例中，與沒有破壞翻譯閱讀框(Becker肌肉萎縮癥)相比，肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(dystrophin)基因的移碼突變導(dǎo)致嚴(yán)重的Duchenne肌肉萎縮癥(DMD)。已發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)外顯子46跳躍的反義序列能有效地修復(fù)DMD患者肌細(xì)胞中的內(nèi)源性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因的表達(dá)(van Deutekom等2001)。通過反義寡核苷酸靶向結(jié)合到E-選擇素的3’腺苷酸化位點(diǎn)改變其隱含的上游位點(diǎn)的多聚腺苷酸化作用，由此產(chǎn)生含有少數(shù)不穩(wěn)定序列的轉(zhuǎn)錄本，從而增加mRNA穩(wěn)定性和改變蛋白質(zhì)表達(dá)(Vickers等2001年)。用這樣的方法，反義序列可用于增加mRNA的豐度。也能夠通過反義寡核苷酸靶向結(jié)合到至關(guān)緊要的翻譯啟始位點(diǎn)，在此情況下mRNA豐度增加但蛋白質(zhì)水平下降。
NOI通?？墒芤环N啟動(dòng)子或一種啟動(dòng)子和增強(qiáng)子表達(dá)調(diào)節(jié)元件的表達(dá)控制。增強(qiáng)子和/或者啟動(dòng)子在缺氧或者缺血或者低糖環(huán)境可以優(yōu)選活化；于是NOI在諸如腫瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)或者其他缺血部位的特定靶組織中優(yōu)選表達(dá)。因此，可以減少或者去除NOI對(duì)接受治療的患者的重要生物作用或者有害作用。賦與調(diào)節(jié)作用的的增強(qiáng)子元件或者其它元件可以存在多個(gè)拷貝。同樣或除此之外，增強(qiáng)子和/或者啟動(dòng)子可以優(yōu)選激活一種或多種特異的細(xì)胞種類——例如巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或者這兩種細(xì)胞中的一種或多種細(xì)胞。更多的例子包括呼吸道上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞和諸如巨噬細(xì)胞和神經(jīng)元的有絲分裂后末期分化的非復(fù)制細(xì)胞。
“可操縱性連接”意思是所描述的成分以其預(yù)期的方式在一定的相互關(guān)系中行使功能。一個(gè)文庫中所包含的一種調(diào)節(jié)序列通過“可操縱性連接”與一種報(bào)道序列連接，在與對(duì)照序列相同的條件下核酸報(bào)道序列得以表達(dá)。
“啟動(dòng)子”使用了該領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)含義。舉例來說，即是Jacob-Monod基因表達(dá)理論中的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。
“增強(qiáng)子”是指除轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物之外的其它蛋白組分所結(jié)合的一個(gè)DNA序列，可促進(jìn)其相關(guān)的啟動(dòng)子控制的起始轉(zhuǎn)錄。
在原代靶細(xì)胞中，在生成二級(jí)運(yùn)輸系統(tǒng)的條件下，編碼二級(jí)傳輸系統(tǒng)之翻譯單位的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子組成的轉(zhuǎn)錄單元優(yōu)選具有強(qiáng)活性，或者能夠強(qiáng)誘導(dǎo)。啟動(dòng)子和/或者增強(qiáng)子活性可以組成性生效，或者受組織特異性限制或者時(shí)間限制。舉例來說，時(shí)間限制性的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子是那些缺血和/或者缺氧反應(yīng)的應(yīng)答元件，諸如缺氧應(yīng)答元件或者grp78或grp94基因的啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子。一種優(yōu)選使用的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子組合是人巨細(xì)胞病毒(hCMV)主要立即早期(MIE)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，諸如CMV的強(qiáng)組成啟動(dòng)子或者諸如PGK的管家基因啟動(dòng)子和Tet-調(diào)節(jié)系統(tǒng)的組合使用可用于控制基因表達(dá)。除了Tet系統(tǒng)以外，其它的可誘導(dǎo)系統(tǒng)包括金屬硫蛋白、hsp68、lacZ、SV40 T抗原系統(tǒng)。
可通過兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系使用反式活化因子，一個(gè)是在啟動(dòng)子“a”控制下表達(dá)NOI的轉(zhuǎn)基因系，另一個(gè)是表達(dá)啟動(dòng)子“a”的反式作用因子“b”的轉(zhuǎn)基因系。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所使用的是FLP重組酶系統(tǒng)。在組合的情況下，無活性的轉(zhuǎn)基因通過酵母FLP重組酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问?。在本方案中也可以使用噬菌體Pl Cre重組酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)能使基因在特定的細(xì)胞或者組織和在生物發(fā)育的特定階段沉默。
應(yīng)用諸如β-肌動(dòng)蛋白、鼠金屬硫蛋白、HMGCR和組蛋白H4管家基因的啟動(dòng)子可以獲得通用的表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明的優(yōu)選啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子。即它們能控制NOI在一種組織中轉(zhuǎn)錄而在其它組織中很大程度上保持“沉默”。
“組織特異性”指的是一種啟動(dòng)子，其活性并不僅限于單一的組織類型，而是表現(xiàn)出選擇性，即在一些組織中活化、其他一些組織中活化較低或沉默的。
由特定的啟動(dòng)子控制的NOI表達(dá)水平可以通過操縱啟動(dòng)子區(qū)域來調(diào)節(jié)。舉例來說，啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)具有不同的基因調(diào)節(jié)活性。這些不同區(qū)域的活性可用含有不同突變體的載體構(gòu)建體有代表性地評(píng)估，而這些突變體則含有缺失特定區(qū)域的啟動(dòng)子(即缺失分析)。舉例來說，該方法可用于鑒定組成啟動(dòng)子組織特異性的最小區(qū)域。
在本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用中，以上所述的許多組織特異性啟動(dòng)子非常有用。在多數(shù)實(shí)例中，這些啟動(dòng)子可易于酶解為適于克隆到侯選載體中的限制性內(nèi)切酶消化片段?？商娲姆椒ㄊ抢镁酆厦告湻磻?yīng)擴(kuò)增得到啟動(dòng)子片段。通過在引物5’端引入限制酶切位點(diǎn)是擴(kuò)增片段易于克隆。
適于心臟特異性表達(dá)的啟動(dòng)子包括衍生于鼠心臟α-肌球蛋白重鏈(MHC)基因的啟動(dòng)子。適于血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子包括Et-1啟動(dòng)子和von Willebrand因子啟動(dòng)子。
適于前列腺特異性表達(dá)的啟動(dòng)子包括腺血管舒緩素-1(hklk2)基因和前列腺特異性抗原(hklk3)的5’旁側(cè)序列。
細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的例子包括諸如CSF-1啟動(dòng)子-增強(qiáng)子的巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子或者衍生于甘露糖受體基因啟動(dòng)子-增強(qiáng)子的元件(Rouleux等1994 Exp Cell Res 214113-119)。在可替代的方法中，可使用優(yōu)選在中性粒細(xì)胞中活化的啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子元件，或者一種諸如IL-2基因增強(qiáng)子的淋巴特異性增強(qiáng)子。
此外，NOI可利用一個(gè)或多個(gè)具有發(fā)育調(diào)節(jié)表達(dá)作用的序列控制。NOIs可在轉(zhuǎn)基因生物體或其后代的發(fā)育過程中的一個(gè)特定階段激活。
適應(yīng)酶可以調(diào)節(jié)NOI轉(zhuǎn)錄。NOI和適應(yīng)酶的連接可以激活轉(zhuǎn)錄本的剪切，從剪切的轉(zhuǎn)錄本中釋放NOI使其得以表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，從包含siRNA、短發(fā)卡RNA、微RNA和反義RNA的群體中選擇NOI。舉例來說，在短發(fā)卡編碼的siRNA 5’引入適應(yīng)酶能夠控制轉(zhuǎn)錄本自身剪切的誘導(dǎo)(或抑制)，短發(fā)卡能與適應(yīng)酶結(jié)構(gòu)分離，由此而激活沉默。適應(yīng)體(aptamer)的特異性配體可以體外提供、體內(nèi)表達(dá)或者從同一個(gè)載體表達(dá)獲得。舉例來說，一種表達(dá)受缺氧反應(yīng)元件(HRE)控制表達(dá)的蛋白質(zhì)配體僅在缺氧條件下才合成，如果這能激活適應(yīng)酶的剪切反應(yīng)，釋放一個(gè)靶向結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的短發(fā)卡結(jié)構(gòu)，那么VEGF的表達(dá)在缺氧條件將被特異性地下調(diào)。這將有助于治療包括增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜炎在內(nèi)的一系列疾病。在可替代的方法中，適應(yīng)體的配體可以是VEGF本身。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，適應(yīng)酶誘導(dǎo)的剪切可以直接調(diào)節(jié)一種NOI的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，適應(yīng)酶的使用包含了NOI的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。通過增加或者消除能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本剪切的合適配體，適應(yīng)酶可以被激活(或者抑制)，因此NOI的表達(dá)受抑制。舉例來說，適應(yīng)酶可以在轉(zhuǎn)錄本中編碼甲硫氨酸的密碼子處剪切，或者剪切轉(zhuǎn)錄本的UTR，這導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本缺乏cap和/或者多聚腺嘌呤尾，隨后轉(zhuǎn)錄本在翻譯前將被降解。
如果諸如因子IX之類的治療基因水平太高，這提供了一種阻斷NOI合成的方法。轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可用這樣的方式進(jìn)行工程化的自身調(diào)節(jié)。舉例來說，可以設(shè)計(jì)成適應(yīng)酶的活性是受葡萄糖結(jié)合的調(diào)節(jié)，因此僅當(dāng)高血糖水平時(shí)才可能高水平表達(dá)胰島素。如果血糖水平下降到臨界值，隨后適應(yīng)酶被活化，胰島素轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄本降解。一種受強(qiáng)力霉素調(diào)節(jié)的適應(yīng)酶可通過給予強(qiáng)力霉素調(diào)節(jié)NOIs體內(nèi)和體外的表達(dá)。
Tet調(diào)節(jié)系統(tǒng)可以用于控制適應(yīng)酶的表達(dá)，提供更水平的控制。當(dāng)強(qiáng)力霉素消除時(shí)，在Tet抑制蛋白存在的條件下Tet操縱子序列插入到啟動(dòng)子的下游可抑制轉(zhuǎn)錄，從而抑制重新轉(zhuǎn)錄。因?yàn)樵趶?qiáng)力霉素消除時(shí)適應(yīng)酶是活化的，任何存在的轉(zhuǎn)錄本將被剪切和破壞。
轉(zhuǎn)基因敲除小鼠技術(shù)的發(fā)展極其有助于基因功能的研究，這和基因疾病的哺乳動(dòng)物模型有著特殊的相關(guān)性。然而，當(dāng)前的技術(shù)限制于某些病例。舉例來說，具有重要醫(yī)學(xué)的許多基因是生存所必需的。在這樣的病例中，小生命在胚胎發(fā)育過程中或者出生后死亡。本發(fā)明提供了敲除調(diào)節(jié)性基因的有效的轉(zhuǎn)基因方法，目的蛋白的產(chǎn)生可以是生命體停止在特定的發(fā)育階段，促進(jìn)了成年哺乳動(dòng)物疾病模型的建立。然后轉(zhuǎn)基因生物能夠利用一種或者多種表型進(jìn)行篩選。常用的表型篩選方法包括眼底照相術(shù)、血壓、行為分析、X射線熒光鏡透視檢查、雙能量X射線吸收比色法(DEXA)、CAT掃描、全血計(jì)數(shù)(CBC)、尿液分析、血壓化學(xué)、胰島素水平、葡萄糖耐受量、熒光活化細(xì)胞分選(FACS)、組織病理學(xué)、表達(dá)數(shù)據(jù)和發(fā)育生物學(xué)。本發(fā)明的方法在時(shí)序基因調(diào)節(jié)有益的許多領(lǐng)域以及驗(yàn)證基因組計(jì)劃中的假定藥物靶點(diǎn)方面將有著廣泛的應(yīng)用。
本發(fā)明可以用于調(diào)節(jié)和人類疾病相關(guān)的基因表達(dá)。一個(gè)并非窮舉的基因列表如下所示(包括基因的同源物)和癌癥相關(guān)的基因包括但不僅限于Cdh3、Ncam、Akp2、Asgr2、Bax、Bmp4、Ccnd1、Cd38、Cdc37、Cdkn1a、Cdkn1b、Cdkn1c、Csk、Epas1、Fgf2、Grpr、HBV、Igf1、Inhbb、Inpp5d、IRS1、Itga5、Kcna1、lacZ、Map2k4、Mdm2、Njkbia、Ngfb、Oxt、Pemt、Plp、Shh、Src、Stat5a、Tcfap2a、Trp53、Blmh、Cd152、Cmkar2、Cmkbr5、Csf1、Csf3、Egfr、Gzmb、Ifng、Ifngr、IGFBP3、Il1r1、Il1rap、Il2、Il2ra、Il2rb、Il2rg、Il4、Il4ra、Il5、Il6、Il7r、Il10、Il12a、Il12b、Il12rb1、Il12rb2、IRS1、Kdr、Lifr、Lta、Ncam、Ntf3、Ntf5、Ntrk1、Ntrk2、Ntrk3、Ph、Prlr、Scya3、Smst、Tgfa、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Tnf、Tnfrsf1a、Tnfrsf1b、Tnfrsf5、Apc、Prkdc、TAg、Amh、Kit、Kit1、Ter、Fech、hr、Atm、E2f1、Hoxl1、Apc、Cdh3、Erbb2、Hras、Met、Notch4、PIP、PyVT、Tag、Wnt1、Madh3、Nf1、Ptch、Rb1、Odc、Bcl3、Fos、Fyn、Jun、Kras2、luc、Mos、Myc、Rab3a、Rela、Yes、Cd44、Mgmt、Plg、Ahr、Pgy2、Rag1、Btk、Igh-6、Jak3、Tcra、Tcrb、Tcrd、Ttp53、Ttpa、Vhlh和Wt1。
和糖尿病、肥胖癥相關(guān)的基因包括但不僅限于Ins2、Ins1、H2-Ea、H2-Ab1、Ifng、Prkdc、B2m、Rag1、Lep、Lepr、Cpe、Gck、Irs1、Irs2、Irs3、Irs4、Slc2a1、Cre、Dgat、tub、Pcsk2、Insr、Nos1、Nos3、Tnf、B2m、Thy1、Pomc、Ppara和Csf2。
和心血管系統(tǒng)疾病相關(guān)的基因包括但不僅限于Acact、Alox15、Apoa2、Apob、Apoe、Ath1r、Cdkn1a、Cyp7a1、Epas1、Lcat、Ld1r、Pemt、Soat1、fld、hr、Ace、Adra1b、Adrb2、Adrbk1、Anx6、Atp7a、Cdh2、Evi1、Fn1、Gja1、Itga4、Jup、Kif3a，Nf1，Nos3，Nppa，Thra，Vcam1，Wt1，Agt，Bdkrb2，Bmp4，Drd3，Kcna1，Npr3，Ren，Apoc1，Apoc2，Apoc3，Apoa1，Cetp，Hp1，Lipc，Srb1，Adra2a，Agtr1a，F(xiàn)gf2，Tnf，Asgr2，Lrpap1，Vld1r，Col3a1和Plg。
和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病相關(guān)的基因包括但不僅限于Cpe、fld、Insr、Lep、Lepr、tub、Acact、acd、Cacnb4、Crh、Foxn1、gl、Bmp4、Csf1、dwg、fsn、Hcph、Kit、Kit1、Mitf、oc、Phex、Prlr、Sparc、Grpr、Amh、Ar、Cga、Fshb、jsd、Ghrhr、Hmgic、Myo5a、Nr5a1、Oxt、p、Pit1、Prop1、Smst、Agt、Igf1、Gck、Pcsk2、Egfr、Foxn1、Mc1r、Tgfa、Thrb、Tshr和Ttr。
和凋亡相關(guān)的基因包括但不僅限于Fas、Ngfr、Tnfrsf1a、Tnfrsf1b、Bax、Bcl2、E2f1、Mdm2、Pcc、Rb1、Trp53、Bdnf、Fas1、Gzmb、Ntf3、Nt5、Pfp、Tag和Tnf。
和免疫、炎癥相關(guān)的基因包括但不僅限于Cd1、Cd3e、Cd3z、Cd4、Cd44、Cd5、Cd8a、Cd8b、Cd14、Cd152、Cd28、Cd38、Fcer1g、Fcgr2a、Fcgr2b、Fcgr3、Gpi1、H2-Aa、H2-DMa、H2-Eb1、H2-Eb2、H2、Hc、Icam1、Igh-1、Igh-5、Igh、Igk-C、Igl-1、Igl-5、Itga4、Itga5、Itgb2、Itgp、Lyst、Mar1、Ncam、PCC、Pep3、Ptprc、Ptprcap、PVR、Sele、Sell、Selp、Spn、Tapbh、Tcra、Tcrb、Tcrd、Thy1、Tlx1、Tnfrsf5、Tnfrsf6、Tnfsf5、Bmp4、Cmkar2、Cmkbr5、Csf1、Csf3、Egfr、Gzmb、Ifng、Ifngr、Il1r1、Il1rap、Il2、Il2ra、Il2rb、Il2rg、Il4、Il4ra、Il5、Il6、Il7r、Il10、Il12a、Il12b、Il12rb1、Il12rb2、Il15ra、Irs1、Itgb7、Kdr、Kitl、Lifr、Lta、Map2k4、Ntf3、Ntf5、Ntrk1、Ntrk3、Ph、Scya3、Smst、Tgfa、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Tnf、Tnfrsf1a、Tnfrsf1b、A、Atm、C3、C4、Cacnb4、Cd80、Cd86、Dh、Dsg3、Eef1a2、gl、hr、Lama2、Lbp、Lep、Lepr、Mitf、Pit1、Prop1、Scn8a、Abcb2、Ada、B2m、Bcl2、Bcl3、Btk、C2ta、Foxn1、H2-Ab1、Hcph、Igh-6、Igh-J、Ii、Jak3、Kit、Lck、Ltb、Lyn、Njkb1、Nfkbia、Pfp、Pnlliprp2、Prkdc、Ptprcap、Rag1、Relb、Stat4、Stat6、Tlr4、Alox5、Alox5ap、Alox15、Bdkrb2、Blmh、Bmp6、Cmo、Crh、Nos2、Ptgs2、Vr1、Bax、E2f1、Inpp5d、Rb1、Stat5a、Trp53、Fyn和Irf1。
和神經(jīng)生物學(xué)相關(guān)的基因包括但不僅限于Apoe、Atm、Bdnf、Cdk5、Chrna7、Cmkar4、Cstb、Gad2、Gfap、Gria2、Grik2、HD、Hdh、Nos1、Ntf3、Penk-rs、Prkcc、Psen1、Snca、Tnf和Vr1。
除了已描述的治療基因或者基因和表達(dá)調(diào)節(jié)元件之外，傳輸系統(tǒng)可以包括其它的有效遺傳元件或者基因的表達(dá)調(diào)節(jié)或者含有啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、翻譯起始信號(hào)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)、剪切和多聚腺苷酸化作用信號(hào)的基因?？赏ㄟ^結(jié)合諸如WPRE的元件來提高表達(dá)水平。
根據(jù)本發(fā)明，通過運(yùn)輸系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)囊粋€(gè)或者多個(gè)或者更多的治療基因可以單獨(dú)使用，也可以結(jié)合其他治療或者其他治療成分共同使用。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明第一個(gè)方面是一個(gè)或者多個(gè)靶核苷酸序列(NOI)導(dǎo)入到載體的克隆位點(diǎn)。這樣的治療基因可以由逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR中的啟動(dòng)子啟始表達(dá)，或者由導(dǎo)入克隆位點(diǎn)靶基因內(nèi)在的啟動(dòng)子啟始表達(dá)。
舉例來說，本發(fā)明的運(yùn)輸系統(tǒng)可以用于傳輸一個(gè)或者多個(gè)NOI(s)，有助于治療在WO98/05635中列出的疾病。為了便于參考，現(xiàn)在提供部分列表癌癥、炎癥或炎癥疾病、皮膚疾病、發(fā)燒、心血管效應(yīng)、出血、凝固和急性階段反應(yīng)、惡病質(zhì)、厭食癥、急性感染、HIV感染、休克、移植排斥反應(yīng)、自身免疫疾病、再灌注損傷、腦膜炎、偏頭痛、阿司匹林依賴性抗血栓，腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和擴(kuò)散、血管再生、轉(zhuǎn)移、惡化、腹水和惡性胸膜滲出；大腦缺血、缺血性心臟病、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、哮喘、多發(fā)性硬化癥、神經(jīng)退變(neurodegenration)、老年癡呆、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、脈管炎、克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎；牙周炎、牙齦炎；牛皮癬、過敏性皮炎、慢性潰瘍、大皰性表皮松解癥；角膜潰瘍、視網(wǎng)膜病和外科傷口愈合；鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、濕疹、過敏反應(yīng)；再狹窄、充血性心力衰竭、子宮內(nèi)膜異位、動(dòng)脈粥樣硬化或內(nèi)膜硬化。
除此之外還有，或者作為一個(gè)替代方案，本發(fā)明的運(yùn)輸系統(tǒng)可以用于傳輸一個(gè)或者多個(gè)NOI(s)，有助于治療在WO98/07859中列出的疾病。為了便于參考，現(xiàn)在提供部分列表細(xì)胞因子和細(xì)胞增值/分化活性；免疫抑制劑或者免疫活化(舉例來說，治療免疫缺陷包括HIV病毒的感染；淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)；治療癌癥和許多自身免疫疾病，以及抑制移植排斥或者誘導(dǎo)腫瘤免疫)；造血作用調(diào)節(jié)，舉例來說，骨髓疾病的治療或者淋巴疾病的治療；促進(jìn)骨、軟骨、跟腱、韌帶和神經(jīng)組織的生長(zhǎng)，舉例來說，用于治愈創(chuàng)傷、治療燒傷、潰瘍和牙周疾病和神經(jīng)退變；卵泡刺激激素的抑制或者活化(受精能力調(diào)節(jié))；趨化性/趨化動(dòng)力學(xué)(chemotactic/chemokinetic)(舉例來說，動(dòng)員特異性細(xì)胞遷移到受損傷或者感染部位)；止血和溶解血栓的活性(舉例來說，用于治療血友病和中風(fēng))；抗炎活性(舉例來說，用于治療敗血病休克或者克羅恩氏病)；用作抗菌劑；諸如新陳代謝或者行為的調(diào)節(jié)子；用作止痛劑；治療特異性缺陷疾病；用于牛皮癬治療，用作人類或者獸醫(yī)的藥。
除此之外還有，或者作為一個(gè)替代方案，本發(fā)明的運(yùn)輸系統(tǒng)可以用于傳輸一個(gè)或者多個(gè)NOI(s)，有助于治療在WO98/09985中列出的疾病。為了便于參考，現(xiàn)在提供部分列表巨噬細(xì)胞抑制的和/或者T細(xì)胞抑制的活性和抗炎活性；抗免疫活性，舉例來說，對(duì)細(xì)胞和/或者體液免疫應(yīng)答的抑制效應(yīng)，包括和炎癥無關(guān)的應(yīng)答；抑制巨噬細(xì)胞活性和T細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)成分和連接蛋白，以及上調(diào)T細(xì)胞的fas受體表達(dá)；抑制有害的免疫反應(yīng)和包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的關(guān)節(jié)炎炎癥、與超敏性相關(guān)的炎癥、過敏反應(yīng)、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、膠原疾病和其他自身免疫疾病、與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈粥樣硬化性的心臟病、再灌注損傷、心搏停止、心肌梗塞、血管炎癥疾病、呼吸道窘迫綜合癥或者其它與心肺有關(guān)的疾病、和消化性潰瘍相關(guān)的炎癥、潰瘍性結(jié)腸炎和其他胃腸道疾病、肝纖維化、肝硬化或者其他肝臟疾病、甲狀腺炎或者其他腺體疾病、腎小球腎炎或者其他腎和泌尿疾病、耳炎或者其他耳鼻咽喉疾病、皮炎或者其他皮膚病、牙周疾病或者其他牙病、睪丸炎或者其他附睪炎、不育、orchidal trauma或者其他免疫相關(guān)testicular疾病、胎盤功能障礙、胎盤功能不全、習(xí)慣性流產(chǎn)、驚厥、預(yù)驚厥和其他免疫和/或炎癥相關(guān)婦科疾病、后眼色素層炎、中眼色素層炎、前眼色素層炎、結(jié)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、眼色素層鞏膜炎、視神經(jīng)炎、諸如視網(wǎng)膜炎或者囊樣斑疹水腫的眼球內(nèi)炎癥、交感神經(jīng)性眼炎、鞏膜炎、色素性視網(wǎng)膜炎，變質(zhì)樣干酪疾病(degenerative fondus)的炎癥成分、眼部創(chuàng)傷的炎癥成分、感染引起的眼部炎癥、增值性玻璃體-視網(wǎng)膜病變、急性缺血視神經(jīng)障礙、諸如青光眼過濾手術(shù)后的過度結(jié)疤、眼部移植的免疫和/或者炎癥反應(yīng)和其它免疫和炎癥相關(guān)眼部疾病、自身免疫相關(guān)的炎癥或者病癥或者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或者其他器官的紊亂、免疫和/或者有益的炎癥抑制、帕金森癥、并發(fā)癥和/或者治療帕金森病的不良反應(yīng)、AIDS-相關(guān)癡呆復(fù)合癥、HIV-相關(guān)的腦病、Devic病、sydenham舞蹈病、Alzheimer病和其他退行性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病癥或紊亂、stokes的炎癥成分、小兒麻痹后(post-polio)綜合癥、精神紊亂的免疫和炎癥成分、脊髓炎、腦炎、亞急性致硬化腦炎、腦脊髓炎、急性神經(jīng)病、亞急性神經(jīng)病、慢性神經(jīng)病、Guillaim-Barre綜合癥、sydenham舞蹈病、重癥肌無力、大腦假性腫瘤、唐氏綜合征、huntington病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、中樞神經(jīng)系統(tǒng)壓迫或中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷或中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染產(chǎn)生的炎癥成分、肌萎縮和營(yíng)養(yǎng)不良產(chǎn)生的炎癥成分以及相關(guān)疾病的炎癥和免疫、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的病癥或紊亂、創(chuàng)傷后炎癥、敗血病休克、感染性疾病、外科炎癥并發(fā)癥或者副作用、骨髓移植或者其他移植并發(fā)癥和/或副作用、諸如病毒載體引起基因治療的炎癥和/或免疫并發(fā)癥和副作用，或者AIDS相關(guān)的炎癥，限制或抑制體液和/或者細(xì)胞免疫應(yīng)答，通過降低單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)治療或改善單核細(xì)胞或諸如白血病的白細(xì)胞增值病，預(yù)防和/或者治療在自身或者人造的細(xì)胞、組織和器官移植病例中的移植排斥，這些細(xì)胞、組織和器官包括角膜、骨髓、器官、晶體、心臟起搏器、自身的或者人造的皮膚組織。
本發(fā)明的方法所治療的對(duì)象可以是動(dòng)物受試者。優(yōu)選的受試者是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選是人。
本發(fā)明也提供了一種利用基因療法治療患者的藥物組合物。本發(fā)明中的這些組合物包括一種有治療效應(yīng)的的運(yùn)輸系統(tǒng)，同時(shí)可選擇性地包括一種或者多種可以運(yùn)輸?shù)闹委熜缘暮?或者診斷性的NOI(s)。因?yàn)檫\(yùn)輸系統(tǒng)是一種病毒運(yùn)送系統(tǒng)，可用一種替代的方法，包括一種由產(chǎn)生的或同種方式獲得的病毒顆粒。藥物組合物可用于人或動(dòng)物。通常，內(nèi)科醫(yī)生將要特地確定適合于每個(gè)病人的有效劑量，有效劑量將隨年齡、重量、和特殊個(gè)體而改變。
這些組合物可選擇性地包括制藥上允許的的載體、稀釋劑、賦形劑或者佐劑?？筛鶕?jù)給藥的具體途徑和標(biāo)準(zhǔn)的制藥準(zhǔn)則選擇制藥載體、賦形劑或者稀釋劑。藥物組合物可以包括載體，或除了載體之外還可以包括賦形劑或者稀釋劑、任何合適的粘合劑、滑潤(rùn)劑、懸浮劑、包衣成分、增溶劑和其他可幫助或者促進(jìn)病毒進(jìn)入靶位點(diǎn)的載體成分，以上成分可幫助或者促進(jìn)病毒進(jìn)入靶位點(diǎn)(如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng))。
根據(jù)給藥部位，利用一種或多種給藥方式施用藥物組合物吸入、以栓劑或者子宮托的形式、局部性地用藥以洗液、溶液、乳劑、軟膏或者撲粉的形式、依靠皮膚貼片(skin patch)、口腔給藥以含有諸如淀粉或者乳糖的賦形劑的片劑形式、或者僅以膠囊或胚珠的形式或者膠囊或胚珠和賦形劑混合、或者以酏劑(elixirs)、溶液或者含有香味或色素成分的懸浮液的形式給藥，或者可通過諸如腔內(nèi)(intracavernosally)、靜脈、肌內(nèi)或者皮下注射給藥。對(duì)于胃腸道以外給藥，這些成分最好使用包括其它成分的無菌水溶液形式，舉例來說，足夠的鹽或者單糖能保持溶液和血液等滲。對(duì)于口腔或者舌下給藥，這些成分可以片劑或者錠劑(lozenges)的方式給藥，錠劑可用常規(guī)方式配制。
根據(jù)本發(fā)明，通過運(yùn)輸系統(tǒng)運(yùn)送一個(gè)或者多個(gè)治療基因可單獨(dú)使用或者與其它治療或者其它治療成分組合使用。
本發(fā)明中的非靈長(zhǎng)類慢病毒載體顆粒是在合適的生產(chǎn)細(xì)胞中產(chǎn)生的。生產(chǎn)細(xì)胞通常是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但也可以是昆蟲細(xì)胞。一種生產(chǎn)細(xì)胞可以是含有病毒結(jié)構(gòu)基因并整合進(jìn)入其基因組的包裝細(xì)胞。然后，編碼載體基因組的核苷酸轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，從而產(chǎn)生感染性的、復(fù)制缺陷載體的病毒顆粒。作為可替代方案，編碼載體基因組和結(jié)構(gòu)成分的核苷酸序列可共轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細(xì)胞，和/或者利用一個(gè)或多個(gè)存在于諸如質(zhì)粒、腺病毒載體、皰疹病毒載體上的核苷酸序列可以共轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細(xì)胞，或者用已知的方法運(yùn)送功能DNA進(jìn)入靶細(xì)胞。
本發(fā)明的載體，舉例來說，本發(fā)明中第一方面的慢病毒載體可以用來運(yùn)輸NOI進(jìn)入任意的產(chǎn)前細(xì)胞(prenatal)?！爱a(chǎn)前”是指發(fā)生或者出現(xiàn)在出生之前。在一個(gè)實(shí)施方案中，這個(gè)方法用于胚胎期的細(xì)胞。胚胎包括在出生(或者孵化)前早期發(fā)育階段的動(dòng)物。此處所使用的術(shù)語包括“前胚胎”，也就是卵子受精后、胚胎組織分化前形成的結(jié)構(gòu)，這包括受精卵和原始胚期。“胚胎”也包括胎兒細(xì)胞，也就是位于發(fā)育后期的胚胎細(xì)胞。本發(fā)明也包含基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入到一種圍產(chǎn)期細(xì)胞。“圍產(chǎn)期”指的是產(chǎn)前3個(gè)月產(chǎn)后大約1個(gè)月這一段時(shí)間，同時(shí)也包括新生兒階段?！靶律鷥骸敝傅氖浅錾蟮淖畛鯉字堋?br> 本發(fā)明的一般性載體，舉例來說，本發(fā)明中第一方面的慢病毒載體可用于運(yùn)輸NOI進(jìn)入任意的生殖細(xì)胞，這些生殖細(xì)胞包括原始生殖細(xì)胞或者能引起生殖細(xì)胞系改變的細(xì)胞?！吧臣?xì)胞”是多細(xì)胞生物體的生殖器官中細(xì)胞的總稱，多細(xì)胞生物體可通過減數(shù)分裂產(chǎn)生配子。“配子”指的是單倍體生殖細(xì)胞-卵子和精子。然而，如上所示，本發(fā)明也適用于配子發(fā)育細(xì)胞和諸如卵巢的配子發(fā)生部位的細(xì)胞。
現(xiàn)在通過實(shí)例，結(jié)合哺乳動(dòng)物將討論配子發(fā)生。慢病毒載體可用于運(yùn)輸NOI進(jìn)入到下文所討論結(jié)構(gòu)中的任何細(xì)胞?？深A(yù)見到非哺乳動(dòng)物生物體的相同處理也包括在本發(fā)明之中。簡(jiǎn)而言之，配子發(fā)生是二倍體生殖細(xì)胞形成配子(定義為單倍體，n)的過程。精子發(fā)生是通過減數(shù)分裂(動(dòng)物體內(nèi)，植物體內(nèi)是有絲分裂)在專門的性腺器官中(雄性為受試者)形成精細(xì)胞的過程，分裂后的細(xì)胞經(jīng)過分化成為精細(xì)胞。卵子發(fā)生是通過減數(shù)分裂(動(dòng)物體內(nèi)，植物配偶體內(nèi)是有絲分裂)在專門的卵巢性腺中形成卵子的過程。
在精子發(fā)生過程中，精子由雄性生殖細(xì)胞精原細(xì)胞形成，精原細(xì)胞位于睪丸的生精小管內(nèi)膜。一個(gè)精原細(xì)胞通過有絲分裂形成原始精母細(xì)胞，原始精母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂的初級(jí)分裂形成兩個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞。每個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞經(jīng)過第二次有絲分裂形成兩個(gè)精細(xì)胞，精細(xì)胞成熟成為精子。睪丸由很多的生精小管構(gòu)成，精子發(fā)生在生精小管壁中進(jìn)行。原始生殖細(xì)胞在位于生精小管外部的生殖上皮中生成，當(dāng)細(xì)胞分化產(chǎn)生子細(xì)胞后移行進(jìn)入小管管腔。所有的這些細(xì)胞由鄰近的滋養(yǎng)細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和支持。
在卵子發(fā)生過程中，卵原細(xì)胞分化形成初級(jí)卵母細(xì)胞，然后經(jīng)過第一次減數(shù)分裂形成極體和次級(jí)卵母細(xì)胞。次級(jí)卵母細(xì)胞成熟后，次級(jí)卵母細(xì)胞經(jīng)過第二次減數(shù)分裂形成成熟卵子和二級(jí)極體。卵巢含有許多濾泡，外層的卵泡細(xì)胞圍繞正在發(fā)育的卵細(xì)胞形成濾泡。排卵后卵子移行沿輸卵管進(jìn)入子宮。
可預(yù)見到載體可在一個(gè)位置施用，但是NOI可能在生物體的其它細(xì)胞中表達(dá)或者發(fā)揮作用，也就是說給藥的位點(diǎn)可以不同于靶細(xì)胞。非靈長(zhǎng)類慢病毒載體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞包括上文所列的靶細(xì)胞例子。
更優(yōu)選的是，細(xì)胞處于胚胎期，舉例來說，位于子宮的細(xì)胞，慢病毒載體可通過臍帶、胎盤或者羊水，或者通過腹膜內(nèi)、肝內(nèi)途徑施用。慢病毒載體可借助超聲波導(dǎo)入。
在本領(lǐng)域中人們熟知的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是利用ES細(xì)胞和其它細(xì)胞產(chǎn)生的，舉例來說，以下文獻(xiàn)描述了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法鼠胚胎操作，第二版B.Hogan，R.Beddington，F(xiàn).Costantini和E.Lacy冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社1994年；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)C.Pinkert學(xué)術(shù)出版社1994；基因靶向一種實(shí)用的方法A.L.Joyner.牛津大學(xué)出版社1995；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物科學(xué)的策略G.M.Monastersky和J.M.Robl.ASM出版社1995；和小鼠遺傳學(xué)理論和應(yīng)用Lee M.Silver牛津大學(xué)出版社1995。關(guān)于這個(gè)主題的一本有用的常用參考書是Houdebine轉(zhuǎn)基因動(dòng)物-生產(chǎn)和使用(哈佛，1997)——全面地篇綜述了從魚到小鼠和牛產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所應(yīng)用的技術(shù)。
因此，舉例來說，本發(fā)明準(zhǔn)許利用慢病毒侵染使異種DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的受精卵。在一個(gè)實(shí)施方案中，從捐贈(zèng)母親體內(nèi)收集處于單細(xì)胞期的受精卵，被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到代孕母親體內(nèi)。在單細(xì)胞期發(fā)生整合才產(chǎn)生真正的轉(zhuǎn)基因生物，也就是說，包括生殖細(xì)胞都發(fā)生了轉(zhuǎn)基因。如果在后期發(fā)生整合，則產(chǎn)生嵌合體。在一高度優(yōu)選的方法中，用含目的DNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染發(fā)育的胚胎，被轉(zhuǎn)染的胚胎產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法需要在體外轉(zhuǎn)染胚胎細(xì)胞，然后再植入子宮。本發(fā)明的一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)是NOI能導(dǎo)入子宮(utero)。另一個(gè)方法是用慢病毒感染導(dǎo)入一種核酸進(jìn)入前核階段的卵子用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。然后，被轉(zhuǎn)導(dǎo)的卵子在植入假孕受體的輸卵管之前進(jìn)行培養(yǎng)。
作為一個(gè)明確的實(shí)施例，一個(gè)建立諸如牛的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，包含編碼治療蛋白序列的核酸構(gòu)建體通過本發(fā)明的方法導(dǎo)入到卵母細(xì)胞，卵母細(xì)胞是從新鮮的哺乳動(dòng)物卵巢中分離獲得。卵母細(xì)胞從濾泡吸入，在與解凍的凍存精子受精之前停留在濾泡中，而解凍的精子必須和肝素(heparin)結(jié)合而活化，可通過Percoll剃度分離具有活力的精子部分。
舉例來說，受精的卵母細(xì)胞在15,000g離心8分鐘，觀察生殖核并用于注射，然后用輸卵管組織-條件培養(yǎng)基培養(yǎng)使受精卵進(jìn)入到桑椹胚或胚泡。這種培養(yǎng)基是由輸卵管刮掉的管腔(luminal)組織制備的，在培養(yǎng)受精卵時(shí)需要進(jìn)一步稀釋。在微注射后，受精卵必須在培養(yǎng)基中放置2小時(shí)。
然后，諸如牛待孕受試哺乳動(dòng)物通過施用甾醇使其同時(shí)處于發(fā)情期(Oestrous)。哺乳動(dòng)物在2天內(nèi)進(jìn)入發(fā)情期，而胚胎在受試動(dòng)物動(dòng)情期5～7天后轉(zhuǎn)移。成功的轉(zhuǎn)移可通過Southern雜交對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后代評(píng)估。
作為可替代方案，預(yù)想的構(gòu)建體能導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)，培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞并確保證被轉(zhuǎn)基因變異。變異的細(xì)胞注射到囊胚，囊胚再植入假孕宿主。由此生成的后代是包括ES細(xì)胞和宿主細(xì)胞的嵌合體(chimetic)，而僅包含ES后代的非嵌合體細(xì)胞株可以通過常規(guī)的交叉雜交方法獲得。舉例來說，這種技術(shù)已在WO91/10741中被描述。
包含轉(zhuǎn)基因序列的動(dòng)物可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR或者Southern雜交方法進(jìn)行分析檢測(cè)。如果有必要，生物體可以繁殖而獲得純合體。
本發(fā)明可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物，在上文中已涉及到在基因治療和疾病模型建立方面的應(yīng)用。在具體實(shí)施例中，疾病模型便于進(jìn)行基因功能的實(shí)驗(yàn)研究。通常情況下，表達(dá)新基因或帶有異源啟動(dòng)子基因的轉(zhuǎn)基因生物表現(xiàn)為“功能獲得”突變。基因缺失突變可通過基因打靶獲得，即所謂的“基因敲除”生物。轉(zhuǎn)基因生物體也用于研究基因控制區(qū)域和基因表達(dá)形式。轉(zhuǎn)基因生物也可利用插入突變、基因俘獲(gene traps)和啟動(dòng)子俘獲(promoter traps)等方法鑒定新基因。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在農(nóng)業(yè)中也有應(yīng)用，舉例來說，通過遺傳改造提高牛奶產(chǎn)量、增加體重、增加牛奶營(yíng)養(yǎng)成分，提高疾病免疫能力等。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也用作所謂的“制藥農(nóng)場(chǎng)”(pharmaceutical farming)，即是指轉(zhuǎn)基因家畜用來生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)。
作為一個(gè)實(shí)施例，SMN的調(diào)節(jié)性缺失(純合子缺失導(dǎo)致出生前死亡)可提供一個(gè)用于基因治療研究的脊柱肌肉萎縮模型。一個(gè)CFTR缺陷模型也是一種有用的模型。其它假定的候選基因包括早老因子-1、RARα、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)。
可利用諸如組織分析和微矩陣基因表達(dá)譜(profiling)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因結(jié)果的表型分析。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特征，一個(gè)優(yōu)選的EIAV慢病毒載體用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小雞，在其卵中產(chǎn)生治療或診斷性蛋白。
利用慢病毒載體能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鳥類，經(jīng)多代繁殖的眾多轉(zhuǎn)基因鳥類個(gè)體都能使目的基因正常表達(dá)，利用某些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行觀察沒有發(fā)現(xiàn)外源基因沉默。舉例來說，Mizuarai等(2001)(Biochemical andBiophysics Research Communications 286456-463)觀察到在轉(zhuǎn)基因鵪鶉中，基于MLV載體的LTR不能啟始基因表達(dá)，同時(shí)鳥類自身的勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子能啟始靶基因在G0、G1、G2期表達(dá)。
慢病毒載體編碼治療性蛋白或者診斷性蛋白，舉例來說，含有一種抗體或者一種抗體的片段的慢病毒載體可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小雞。通過工程改造后，抗體可以含有來自多個(gè)種類動(dòng)物的結(jié)構(gòu)域，或者含有結(jié)合不同靶分子的結(jié)構(gòu)域。編碼靶基因的核苷酸序列可改變并增加RNA的穩(wěn)定性或者RNA轉(zhuǎn)錄水平，而不改變目的蛋白的氨基酸序列。
治療/診斷基因可由一個(gè)組成性啟動(dòng)子或者一個(gè)具有組織特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)。舉例來說，靶蛋白的表達(dá)可以限定在生殖結(jié)構(gòu)(包括輸卵管或者生殖道)，通過這種方式，導(dǎo)致在卵中含有表達(dá)的靶蛋白。在蛋清中存在卵清蛋白、溶菌酶、伴清蛋白和卵類粘蛋白等蛋白，編碼這些蛋白的基因的啟動(dòng)子或者啟動(dòng)子的元件可以使用。這些基因的表達(dá)受甾體激素的調(diào)節(jié)，但是有證據(jù)表明其它細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子參與卵清蛋白和伴清蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)節(jié)(Dierich等，EMBOJ，19876(8)2305-12)。已經(jīng)證明卵白蛋白基因啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)上游-3200和-2800bp之間存在組織特異性沉默元件(Muramatsu等Mol CellBiochem 1998 185(1-2)27-32)，而一種沉默元件位于從溶菌酶轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)上游的-2400bp處(Bonifer等J Biol Chem 1997 272(42)26075-8綜述)。然而，Dierich等(1987)在-1348和-1的截短卵白蛋白中獲得了一定程度的細(xì)胞特異性。在原代培養(yǎng)的小雞輸卵管管腺細(xì)胞中對(duì)于從-425延伸到-1的截短卵白蛋白來說，觀察到了某種程度上的類固醇調(diào)節(jié)作用(Dierich等1987)。
編碼治療/診斷性蛋白質(zhì)的慢病毒載體通過注射的方法用來轉(zhuǎn)導(dǎo)新生卵的處于囊胚期胚胎的細(xì)胞。作為替換方案，使用諸如WO90/13626中所述或者類似的已發(fā)表技術(shù)之類的技術(shù)，使用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)較早期胚胎。
簡(jiǎn)而言之，可以通過手工操作的方法或者通過誘導(dǎo)早產(chǎn)的方法來獲得子宮胚胎。胚胎用慢病毒載體轉(zhuǎn)染，然后培養(yǎng)至成熟。這使胚胎細(xì)胞在存在的細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較低的時(shí)候得以轉(zhuǎn)導(dǎo)，增加產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因雞的數(shù)量，其中轉(zhuǎn)基因存在于胚系中并可遺傳。
本發(fā)明還涉及到RNAi的使用以增加來自于轉(zhuǎn)基因鳥類的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。
為了最大限度的增加目的蛋白的表達(dá)，如實(shí)施例8所描述，RNAi可以被用作降低蛋中正常情況下存在的富含蛋白的比例，如卵白蛋白、溶菌酶、伴清蛋白和類卵粘蛋白的比例。下調(diào)這些蛋白的產(chǎn)量可以導(dǎo)致相伴的目的蛋白比例增加，產(chǎn)量提高。
這可以通過表達(dá)siRNAs或者短發(fā)卡前體，靶向所需的EIAV載體mRNA來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。該載體可以包括siRNAs，siRNAs靶向mRNA中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上的一個(gè)或多個(gè)mRNAs。
諸如卵白蛋白的蛋白質(zhì)的有效靶向?qū)е庐a(chǎn)生不具有繁殖能力的卵子。因此可以鑒定轉(zhuǎn)基因公雞，并且將之和具有包含目的轉(zhuǎn)基因的載體的轉(zhuǎn)基因母雞交配，以獲得具有兩種性狀的雌性后代，用作蛋白質(zhì)生產(chǎn)的生物反應(yīng)器。siRNAs的調(diào)節(jié)(如實(shí)施例10中所述)也可以是另外的方式當(dāng)卵子是用作蛋白質(zhì)生產(chǎn)而非繁殖時(shí)，在產(chǎn)卵母雞中誘導(dǎo)基因沉默。這也可以克服整個(gè)生物體中靶基因表達(dá)下調(diào)所致的任何可能有害作用。
現(xiàn)在，參照下面的非限制性實(shí)施例通過舉例的方式來描述本發(fā)明。
實(shí)施例1-圍產(chǎn)期動(dòng)物的EIAV轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的制備如前所述通過瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293T人胚腎細(xì)胞來制備載體(Mitrophanous等1999)。該EIAV載體基因組SMART2Z從一個(gè)內(nèi)部CMV啟動(dòng)子處表達(dá)β-半乳糖苷酶受體。它包含EIAV中心多嘌呤序列(cPPT)(Stetor等1999)和土撥鼠肝炎轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(WPRE)(Donelle等，1998)。
載體的施用通過胎兒血管內(nèi)注射施用載體，具體如下異氟烷麻醉下，在腹部中線切開以暴露懷孕16天的妊娠小鼠的子宮。對(duì)于每個(gè)鼠胎，使用34號(hào)針頭(Hamilton)注射載體進(jìn)入外周卵黃囊血管，載體總體積20μL，2×107T.U.(轉(zhuǎn)導(dǎo)單位)。每個(gè)dam最多注射五個(gè)鼠胎。一層一層縫合封閉打開的腹部，在溫暖的籠子中使小鼠恢復(fù)。
轉(zhuǎn)基因檢測(cè)妊娠18～19天后小鼠出生。異氟烷麻醉后處死各個(gè)發(fā)育階段(3，7，14，28，79天)的小鼠，制作樣本用作組織學(xué)研究。器官置于100％乙醇溶液中2小時(shí)后，用X-gel溶液(1mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷溶解于二甲基亞砜，5mM鐵氰化鉀，5mM亞鐵氰化鉀，2mM氯化鎂)對(duì)載體表達(dá)的β-半乳糖苷酶標(biāo)記基因進(jìn)行染色。染色組織用10％甲醛固定2小時(shí)、石蠟包被、切片、中性紅染色。染色顯示諸如肝臟、肺、心臟、肌肉、腎臟、骨骼肌和腦的一些器官的轉(zhuǎn)導(dǎo)情況。該結(jié)果見圖1到11。
觀察到在研究期間表達(dá)水平不降低，且轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和無性繁殖期間。
除了注射進(jìn)入卵黃囊血管或者臍靜脈，也可以直接注射進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)、CSF其他組織或者羊水。后者對(duì)于肺或者皮膚組織的轉(zhuǎn)導(dǎo)非常適合。
實(shí)施例2血友病本實(shí)施例通過實(shí)施例1中的方法進(jìn)行。血友病是血液疾病，該病中一種重要的凝血因子部分或者完全缺失，是和X關(guān)聯(lián)的隱形疾病。有兩種血友病，最常見的是血友病A，其中凝血因子VIII缺乏。在血友病B中，凝血因子IX缺乏。EIAV用作轉(zhuǎn)導(dǎo)VIII和IX進(jìn)入血友病胎兒的臍靜脈或者肝臟門靜脈。
載體的制備一種載體，例如在我們共同未決的GB0202403.1.1中描述的載體。
具體細(xì)節(jié)pONY 8.4系列載體含有許多修飾，這些修飾使之作為瞬時(shí)或者穩(wěn)定載體系統(tǒng)發(fā)揮作用，這些系統(tǒng)完全獨(dú)立于附屬蛋白，并且對(duì)于滴度沒有有害作用。傳統(tǒng)的慢病毒載體基因組需要生產(chǎn)細(xì)胞(瞬時(shí)或者穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)中存在病毒蛋白rev以獲得足夠的滴度。這包括目前的HIV載體系統(tǒng)和更早期的EIAV載體。
和pONY8.1系列載體基因組相比有三種修飾，它們是a)所有來自于gag、形成包裝信號(hào)一部分的ATG基序都被修飾成為閱讀ATTG。這可以插入一個(gè)受LTR中啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的開放閱讀框架。
b)基因組的長(zhǎng)度，即R區(qū)域間的距離比wt病毒中所觀察到的更近(7.9kb)。
c)3’U3區(qū)域得以修飾含有來自于莫洛尼白血病病毒(MLV)U3區(qū)域的序列，因此在轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)除了內(nèi)部序列盒之外它還能驅(qū)動(dòng)第二個(gè)開放閱讀框，在本實(shí)施例中，我們使用了MLV，但是可以是任何啟動(dòng)子。
修飾LTRs的其他細(xì)節(jié)可以參考我們的WO96/37623和WO98/17816。
圖12是EIAV基因組示意圖?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法使用這些進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，3’LTR將被拷貝到5’LTR。圖13提供了pONy8.1G的全部質(zhì)粒序列。圖14提供了pONY8.4ZCG的全部質(zhì)粒序列。圖15提供了pONY8.4GCZ的全部質(zhì)粒序列。圖16是雜合U3區(qū)域的示意圖。圖17提供了是雜合LTR的序列。
EIAV/MLV雜合LTR的構(gòu)建PCR按照如下所述進(jìn)行產(chǎn)物A＝引物KM001+KM003，pONY8.1Z作為靶分子。
產(chǎn)物B＝引物KM004+KM005，pHIT111作為靶分子。
產(chǎn)物C＝引物KM006+KM002，pONY8.1Z作為靶分子。
PCR產(chǎn)物(A，B和C)通過凝膠純化。使用產(chǎn)物A和B(使用引物KM001和KM005)進(jìn)行PCR反應(yīng)產(chǎn)生產(chǎn)物D。使用產(chǎn)物B和C(使用引物KM004和KM002)進(jìn)行PCR反應(yīng)產(chǎn)生產(chǎn)物E。產(chǎn)物D和E用凝膠純化，并用于PCR反應(yīng)中的靶分子，使用引物KM001和KM002生成產(chǎn)物F。PCR產(chǎn)物F用凝膠分離純化(大約1kb)。然后用Sap I切割并亞克隆進(jìn)入用Sap I切割的pONY8.1Z，形成圖18和19所示的載體pONY8.1Zhyb。這時(shí)EIAV的3’LTR置換成了EIAV/MLV雜合LTR。該EIAV U3幾乎被MLV U3區(qū)域所取代。EIAV的3’LTR的5’U3序列保留，因?yàn)樵撔蛄邪╝tt位點(diǎn)，該位點(diǎn)是整合所必需的序列。
引物序列如下1EIAV/MLV雜交U3KM001CAAAGCATGCCTGCAGGAATTCGKM002GAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGKM003GCCAAACCTACAGGTGGGGTCTTTCATTATAAAACCCCTCATAAAAACCCCACAGKM004CTGTGGGGTTTTTATGAGGGGTTTTATAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCKM005GAAGGGACTCAGACCGCAGAATCTGAGTGCCCCCCGAGTGAGGGGTTGTGGGCTCTKM006AGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTC最終PCR產(chǎn)物序列。
EIAV PPT/U3CAAAGCATGCCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGAATTGGAAGAGCTTTAAATCCTGGCACATCTCATGTATCAATGCCTCAGTATGTTTAGAAAAACAAGGGGGGAACTGTGGGGTTTTTATGAGGGGTTTTATAAMLV U3TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGMLV U3/EIAV R/U5GGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATCCTACAGAGCTCATGCCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTC血友病A一種表達(dá)因子VIII(野生型全長(zhǎng)開放閱讀框(ORF)或者截短形式B結(jié)構(gòu)域缺失的野生ORF或者密碼子優(yōu)化的ORF或者截短形式B結(jié)構(gòu)域缺失的優(yōu)化ORF)的EIAV病毒載體(例如以上所描述的載體)按照實(shí)施例1中的方法施用，施用方法包括靜脈內(nèi)或者肝內(nèi)或者肌肉運(yùn)送。使用諸如CMV的適當(dāng)啟動(dòng)子或者諸如PGK的人啟動(dòng)子/增強(qiáng)子來表達(dá)基因。此外，還可以使用諸如Tet系統(tǒng)的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)表達(dá)。作為替換方案，使用組織特異性啟動(dòng)子/增強(qiáng)子使表達(dá)局限于細(xì)胞型。
血友病B一種表達(dá)因子IX(野生型ORF或者密碼子優(yōu)化的ORF)的EIAV病毒載體(例如上述載體)按照實(shí)施例1中的方法學(xué)施用，施用方法包括靜脈內(nèi)或者肝內(nèi)或者肌肉途徑。使用諸如CMV的適當(dāng)啟動(dòng)子或者諸如PGK的人啟動(dòng)子/增強(qiáng)子來表達(dá)基因。此外，還可以使用諸如Tet系統(tǒng)的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)表達(dá)。作為可替換方案，使用組織特異性啟動(dòng)子/增強(qiáng)子使表達(dá)局限于細(xì)胞型。
實(shí)施例3囊性纖維化本實(shí)施例根據(jù)實(shí)施例1中的方法學(xué)進(jìn)行。囊性纖維化是一種遺傳性隱性疾病，由囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)突變引起。CFTR是一種蛋白質(zhì)，在離子轉(zhuǎn)運(yùn)、粘液流變學(xué)、炎癥、細(xì)菌粘附中具有作用。EIAV經(jīng)由羊水轉(zhuǎn)運(yùn)CFTR從而對(duì)肺臟進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。
一種表達(dá)CFTR(野生型OFF或者一種密碼子優(yōu)化的ORF)的EIAV病毒載體(例如上述所描寫的載體)按照實(shí)施例1中的方法學(xué)施用，施用方法包括胃腸道內(nèi)、肺內(nèi)或者羊膜內(nèi)途徑。一種合適的啟動(dòng)子諸如CMV或者人啟動(dòng)子/增強(qiáng)子諸如PGK用來表達(dá)基因。此外，還可以使用諸如Tet系統(tǒng)的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)表達(dá)。作為可替換方案，使用組織特異性啟動(dòng)子/增強(qiáng)子使表達(dá)局限于細(xì)胞型。
實(shí)施例4肌營(yíng)養(yǎng)不良本實(shí)施例根據(jù)實(shí)施例1中的方法學(xué)進(jìn)行。Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)是一種致命的和X染色體有關(guān)的隱性疾病。DMD是由位于紋肌肉組織的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白水平和/或者活性的遺傳缺陷引起。EIAV用來攜帶最小的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白cDNA(對(duì)應(yīng)于一種輕度的貝克爾氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(BMD)表型)到perinates的臍靜脈和/或者直接進(jìn)入胎兒骨骼肌。
一種表達(dá)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(野生全長(zhǎng)開放閱讀框(ORF)或者截短的的野生ORF或者密碼子優(yōu)化的ORF或者截短的密碼子優(yōu)化的ORF)的EIAV病毒載體(例如上述所描寫的載體)根據(jù)實(shí)施例1中的方法施用，施用方法包括進(jìn)入所有的肌群途徑。一種合適的啟動(dòng)子諸如CMV活或人啟動(dòng)子/增強(qiáng)子諸如PGK用來表達(dá)基因。此外，還可以使用諸如Tet系統(tǒng)的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)表達(dá)。作為可替換方案，使用組織特異性啟動(dòng)子/增強(qiáng)子使表達(dá)局限于細(xì)胞型。
實(shí)施例5核酶本實(shí)施例根據(jù)實(shí)施例1中的方法學(xué)進(jìn)行。利用EIAV運(yùn)輸一個(gè)靶向黑色素生物合成途徑中一個(gè)基因的核酶。這個(gè)方法便于進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定。
實(shí)施例6用于帕金森癥轉(zhuǎn)基因模型的EIAV的使用帕金森癥(PD)是常見的神經(jīng)退變性疾病之一，幾乎2％的65歲以上群體受此疾病侵襲。該病具有包括運(yùn)動(dòng)僵硬、休息性震顫和bradykinesia(運(yùn)動(dòng)起始和運(yùn)動(dòng)遲鈍)的運(yùn)動(dòng)紊亂-帕金森病-綜合癥特征。這是由于黑質(zhì)神經(jīng)元丟失引起，黑質(zhì)神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺。引起PD的病因很大程度上不清楚，盡管極少數(shù)家庭的疾病能遺傳。在帶有常染色體顯性PD的家族中，兩種不同的錯(cuò)義突變定位于α-synuclein(Ploymeropoulos等1997，Kruger等1998)，其編碼一個(gè)小的磷蛋白，被認(rèn)為與突觸囊泡運(yùn)輸有關(guān)。一個(gè)在青春期發(fā)病的常染色體隱性幼年期帕金森癥(AR-JP)病例中，Kitade等(1998)發(fā)現(xiàn)基因與帕金森癥有關(guān)，最近提出E3泛素連接酶能催化α-synuclein的泛素化(Shimura等2001)。因此已經(jīng)推測(cè)α-synuclein降解功能的缺失導(dǎo)致AR-JP和偶爾發(fā)生的PD(Haass和Kahle 2001)。
EIAV載體系統(tǒng)用來運(yùn)輸一個(gè)或多個(gè)下述核酸序列進(jìn)入小鼠spermatogonial干細(xì)胞(Nagano等2001)1.帕金森癥的核酶
2.突變?chǔ)?synuclein等位基因3.酪氨酸羥化酶的核酶(多巴胺合成所需酶)實(shí)施例7血管生成缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)是一種轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，保持氧動(dòng)態(tài)平衡的作用。在含氧量正常的條件下，由von Hippel-Lindau復(fù)合物識(shí)別HIF中羥基化脯氨酸殘基，HIFα亞單位降解被降解。因此，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定狀態(tài)水平很低和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物不能形成。一個(gè)脯氨酰-4-羥化酶家族已被描述(Epstein等2001)，其酶活性受缺氧、鐵離子螯合和二價(jià)鈷離子調(diào)節(jié)，該酶是實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)HIF的氧傳感器的必要條件。在培養(yǎng)的果蠅屬黑素細(xì)胞中，通過RNA干擾抑制脯氨酰-4-羥化酶導(dǎo)致在含氧量正常的條件下缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)增高。(Bruick和McKnight 2001)。
EIAV載體系統(tǒng)用于運(yùn)輸1.脯氨酰-4-羥化酶(或者VHL)的一種核酶。這可以使HIF-1α亞單位組成性上調(diào)、HIF復(fù)合物的活化和HIF靶基因的過度表達(dá)。
2.組成性活化HIF-1(HIF在含氧量正常的條件下上調(diào))或者PHD3(HIF在組織缺氧條件下調(diào))。
對(duì)于小鼠卵母細(xì)胞注射于卵周間隙(Chan等19982001)。
在健康相關(guān)研究中，轉(zhuǎn)基因鼠模型的建立和應(yīng)用已被詳細(xì)描述。計(jì)劃研究能夠發(fā)展更廣泛的人類疾病模型，現(xiàn)有的“基因敲除”方法不能滿足產(chǎn)生人類疾病模型的需要。
優(yōu)于現(xiàn)存技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)包括如下1)與注射DNA的非同源性重組相比，通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)提高轉(zhuǎn)基因效率。原核注射導(dǎo)致大的串連DNA插入，插入的DNA不穩(wěn)定且易于重排和丟失。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)通常導(dǎo)致有限數(shù)量的載體拷貝穩(wěn)定整合，在染色體DNA上以不連續(xù)的轉(zhuǎn)錄盒分布。
2)和當(dāng)前的“基因敲除”相比時(shí)間周期縮短。產(chǎn)生純合基因缺失的小鼠是一個(gè)相對(duì)工作強(qiáng)度大、耗時(shí)的過程，需要嵌合體雜合子交叉繁殖，胚系細(xì)胞已丟失工程化缺失基因。相比之下，受精之前轉(zhuǎn)導(dǎo)卵母細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞將包含部分缺失的基因盒。不需要交叉繁殖，這使得周期更短并且需要的動(dòng)物數(shù)量顯著下降。
3)下調(diào)基因表達(dá)產(chǎn)物的靈活性。如討論所述，該技術(shù)在建立致命靶基因的疾病模型中特別有用。有利于研究在特定的發(fā)育階段或者在特定的組織中基因表達(dá)的消除。
4)HIV載體有許多缺點(diǎn)，這限制它們?cè)谀承┘膊≈械闹委煈?yīng)用。HIV-1具有人類致病源的缺點(diǎn)，攜帶潛在的原癌基因蛋白質(zhì)和序列。在包裝細(xì)胞中形成的載體顆粒表達(dá)HIV gag-pol，HIV載體導(dǎo)入帶來的危險(xiǎn)因素是使這些蛋白質(zhì)進(jìn)入個(gè)體而導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明具體實(shí)施方案中使用的非靈長(zhǎng)類慢病毒載體不會(huì)在個(gè)體內(nèi)引入HIV蛋白質(zhì)。
實(shí)施例8產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鳥類作為生物反應(yīng)器用于合成蛋白一種編碼細(xì)菌β半乳糖苷酶的EIAV載體，10μL的pONY8Z5’cppt，直接到注射新生卵囊胚層期的胚胎下，具體操作技術(shù)可以參見專利號(hào)為US 5258307，或者注射更早期的胚胎，具體操作參見WO90/13626所描述的技術(shù)。一種惰性的染料用于囊胚期注射以確定載體的準(zhǔn)確運(yùn)輸。通過收集在孵育和孵化后的不同發(fā)育階段的胚胎分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。然后，對(duì)胚胎進(jìn)行切片并用β半乳糖苷酶染色以鑒定哪些器官被轉(zhuǎn)導(dǎo)和胚胎性腺的生殖細(xì)胞是否被轉(zhuǎn)導(dǎo)。采集胚胎中諸如血液和CAM的組織樣品，使用定量PCR的方法評(píng)估被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的百分率。一些雄性胚胎成長(zhǎng)到性成熟，精液將被采集。遺傳該轉(zhuǎn)基因到其后代的可能性也通過定量PCR方法進(jìn)行評(píng)估。然后精液被用來使雌鳥受孕，收集胚胎并用定量PCR方法評(píng)估以確定轉(zhuǎn)基因后代的百分率。此外，處于G1群中的該載體上β-半乳糖苷酶表達(dá)水平通過X-Gal染色評(píng)估。
實(shí)施例9用于RNA干擾(RNAi)的載體圖20圖解了適于慢病毒的許多RNAi表達(dá)盒，距離來說，EIAV在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和動(dòng)物中表達(dá)siRNA。在每個(gè)實(shí)施例中，都利用了一個(gè)RNA聚合酶III啟動(dòng)子(U6)。RNA聚合酶III產(chǎn)生許多包括小的5S核糖體RNA和轉(zhuǎn)運(yùn)RNAs在內(nèi)小的、穩(wěn)定RNAs。有效的RNAi由單一U6啟動(dòng)子啟動(dòng)短發(fā)卡表達(dá)介導(dǎo)合成(圖20A)，或者也可通過合并的兩個(gè)U6啟動(dòng)子介導(dǎo)調(diào)節(jié)，其中一種表達(dá)正義鏈區(qū)，另一種表達(dá)該靶序列的同一序列的反向互補(bǔ)序列(圖20B)。圖20C給出了一個(gè)具體實(shí)施方案，兩個(gè)反向的啟動(dòng)子從表達(dá)盒的正鏈和互補(bǔ)鏈用來轉(zhuǎn)錄靶基因的正義和反義序列。
實(shí)施例10用于調(diào)節(jié)短RNAs生成的適應(yīng)體/核酶(適應(yīng)酶)病毒載體諸如慢病毒載體用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因并運(yùn)輸siRNAs，能靶向具有重要或必需功能基因的一個(gè)基因，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在發(fā)育過程中死亡。因此，調(diào)節(jié)siRNAs轉(zhuǎn)錄使基因的沉默作用受到調(diào)節(jié)是值得做的研究。在這個(gè)實(shí)施例中，我們描述了一種適應(yīng)體/核酶雜交體用于調(diào)節(jié)功能性siRNAs的合成。
適應(yīng)體是核苷酸分子，形成一定結(jié)構(gòu)，可結(jié)合許多包括蛋白質(zhì)和藥物分子的配體。通過用一個(gè)適應(yīng)體取代錘頭狀核酶的一個(gè)螺旋能形成催化性RNA，通過在配體存在或者不存在的情況下構(gòu)象被誘導(dǎo)改變并沒、能夠剪切底物(底物可以是其自身)。圖21A圖解了一個(gè)表達(dá)盒的設(shè)計(jì)，該表達(dá)盒可以在本發(fā)明的載體中和本發(fā)明的方法中使用。在這個(gè)實(shí)施例中，適應(yīng)酶短發(fā)卡編碼的siRNA的5’端增加了一個(gè)適應(yīng)酶。這導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本自身剪切可以受調(diào)節(jié)性誘導(dǎo)(或抑制)，發(fā)卡從適應(yīng)酶結(jié)構(gòu)中分離，并激活基因沉默。象圖21B中圖解的一樣，配體的增加或者去除可以觸發(fā)催化活性、剪切轉(zhuǎn)錄本和使短發(fā)卡釋放以誘導(dǎo)靶基因沉默。
實(shí)施例11低氧情況siRNAs誘導(dǎo)的VEGF沉默在這個(gè)實(shí)施例中，我們描述了一種用于調(diào)節(jié)功能性siRNAs生成的適應(yīng)酶的應(yīng)用，其中適應(yīng)酶的特異性蛋白質(zhì)配體是由同一個(gè)載體表達(dá)的。一個(gè)載體根據(jù)圖22的圖解進(jìn)行構(gòu)建，RNA聚合酶III U6 snRNA基因啟動(dòng)子用來啟動(dòng)一個(gè)與適應(yīng)酶相連的作用于VEGF的短發(fā)卡表達(dá)。在缺氧條件下，缺氧反應(yīng)元件(HRE)被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因X，基因X編碼的蛋白質(zhì)X是適應(yīng)體的一個(gè)配體。配體結(jié)合后引發(fā)催化、短發(fā)卡釋放和隨后導(dǎo)致VEGF基因沉默。
因此，VEGF在缺氧條件下被特異性地下調(diào)，這可能有助于治療包括增生性糖尿病視網(wǎng)膜病在內(nèi)的許多疾病。
在另一可替代的實(shí)施方案中，適應(yīng)體的配體可以是VEGF本身。
實(shí)施例12用于轉(zhuǎn)錄siRNA前體的RNA聚合酶II啟動(dòng)子的應(yīng)用在這個(gè)實(shí)施例中，我們描述在RNA聚合酶II啟動(dòng)子控制下siRNA前體的轉(zhuǎn)錄。這可通過對(duì)短發(fā)卡引入旁側(cè)區(qū)獲得(圖23A)，或者通過siRNA序列引入編碼有RNA催化活性的適應(yīng)酶或其作用的靶序列(圖23B)而實(shí)現(xiàn)。旁側(cè)序列的剪切使前體釋放siRNA或者短發(fā)卡。
在圖23A中的表達(dá)盒，短發(fā)卡的表達(dá)是受一種RNA聚合酶II啟動(dòng)子CMV的控制。Tet操縱子下游的兩個(gè)拷貝給出了其它水平的調(diào)節(jié)。在Tet抑制蛋白的存在下轉(zhuǎn)錄被抑制(缺少強(qiáng)力霉素)，Tet抑制蛋白可以獨(dú)立表達(dá)或者由同一個(gè)載體表達(dá)。適應(yīng)酶位于轉(zhuǎn)錄本的旁側(cè)區(qū)，能被活化并剪切設(shè)計(jì)的位點(diǎn)，釋放短發(fā)卡，從而能啟始靶基因的沉默化。在這個(gè)具體實(shí)施方案中，有必要使用適應(yīng)酶而不是核酶，因?yàn)楹笳邔?dǎo)致慢病毒基因組的自身剪切。
在圖23B中的表達(dá)盒，只有反義siRNA的表達(dá)是受適應(yīng)酶的調(diào)節(jié)控制。同樣，適應(yīng)酶位于靶序列旁側(cè)區(qū)，剪切釋放合適的RNA序列，與正義RNA形成二聚體，正義RNA是用U6啟動(dòng)子組成性表達(dá)的。因此，靶基因沉默的開啟或者關(guān)閉依賴于適應(yīng)酶配體的存在與否。
實(shí)施例13用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)節(jié)的含有適應(yīng)酶序列的載體的應(yīng)用適應(yīng)酶可以用于包括基因的任何核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。適應(yīng)酶通過增加/去除合適的配體而被活化(或抑制)，從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本的剪切，適應(yīng)酶可以去除轉(zhuǎn)錄本的部分片段，舉例來說，去除編碼起始甲硫氨酸的密碼子或者一段阻止RNA加帽和/或者轉(zhuǎn)錄本多聚腺苷酸化的UTR區(qū)。這提供了一種關(guān)閉某種基因產(chǎn)物表達(dá)合成的方法，舉例來說，一種諸如因子IX的治療性基因，如果其表達(dá)過高可通過此方法調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)基因的表達(dá)能通過工程設(shè)計(jì)用這種方式進(jìn)行自身調(diào)節(jié)。
圖24A圖解了一個(gè)用于胰島素表達(dá)調(diào)節(jié)的構(gòu)建體。適應(yīng)酶的活性通過葡萄糖的結(jié)合來調(diào)節(jié)，因此，在血糖水平增高時(shí)胰島素才會(huì)高水平表達(dá)。如果血糖降低到能激活適應(yīng)酶活性的正常臨界值以下，胰島素轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄本被破壞。
圖24B圖解了一個(gè)用于因子IX表達(dá)調(diào)節(jié)的構(gòu)建體。在這個(gè)構(gòu)建體中，一種受強(qiáng)力霉素調(diào)節(jié)的適應(yīng)酶在體內(nèi)和體外都可以通過施用強(qiáng)力霉素來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因/短RNAs的表達(dá)。在這個(gè)構(gòu)建體中，Tet操縱子序列插入到啟動(dòng)子的下游。在Tet抑制蛋白(可以由同一個(gè)載體表達(dá))存在下，去除強(qiáng)力霉素轉(zhuǎn)錄受到抑制，因此阻斷重新轉(zhuǎn)錄。由于在沒有強(qiáng)力霉素時(shí)適應(yīng)酶被活化，因此任何現(xiàn)存的轉(zhuǎn)錄本將被剪切和降解。
T-RexTM系統(tǒng)能選擇性地結(jié)合并用這種策略來增加其它的的調(diào)節(jié)水平。
實(shí)施例14用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)節(jié)的含有適應(yīng)酶序列的載體的應(yīng)用—阻止載體基因組RNA自身剪切的方法本發(fā)明的病毒載體應(yīng)該在適應(yīng)酶酶活性最小和載體基因組不被自身剪切破壞的條件下進(jìn)行合成，但是一種優(yōu)選的措施是通過構(gòu)建一個(gè)分裂內(nèi)含子載體而在物理結(jié)構(gòu)上隔開(或者核酶)(Ismail等2000)。這可確保全長(zhǎng)的核酶僅存在于原病毒編碼的轉(zhuǎn)錄本中，而不存在于載體顆粒的RNA基因組中。
圖25A圖解了分裂內(nèi)含子策略，圖28B圖解了本發(fā)明這一方面的合適載體。在剪切供體逆轉(zhuǎn)錄過程中，核酶5’某些序列拷貝到病毒5’LTR，因此僅當(dāng)轉(zhuǎn)錄的前病毒剪切后才形成核酶。應(yīng)用圖25A中的具體實(shí)施例，編碼適應(yīng)酶的序列在病毒產(chǎn)生細(xì)胞包裝的基因組中將被分割，這使得藍(lán)色標(biāo)注區(qū)域(AGAUCAU)將不會(huì)出現(xiàn)在黑色標(biāo)注區(qū)域(GAUGCU)的序列上游。相反，它將與包含一個(gè)剪切供體(劃線的)的其它序列同時(shí)出現(xiàn)在3’LTR中。一旦逆轉(zhuǎn)錄開始，將拷貝到5’LTR。因此它位于剪切受體的上游與適應(yīng)酶的其余序列相鄰。一旦開始轉(zhuǎn)錄，內(nèi)含子序列(GUAAAUAAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG)將被剪接從而形成一個(gè)完全的適應(yīng)酶。因此，適應(yīng)酶僅存在于轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，阻止任何載體基因組的剪切，否則將導(dǎo)致滴度下降。
圖25B圖解了分裂內(nèi)含子載體在本發(fā)明這一方面的應(yīng)用。載體含有一個(gè)EIAV/MLV雜合LTR。在轉(zhuǎn)錄的起始下游和EIAV重復(fù)序列的上游插入了剪切供體，其中包含了適應(yīng)酶的5’部分序列。在逆轉(zhuǎn)錄過程中，修飾的3’LTR拷貝到5’LTR。經(jīng)轉(zhuǎn)錄和剪接后形成功能性適應(yīng)酶。適應(yīng)酶活化剪切轉(zhuǎn)錄本導(dǎo)致自身降解。
另外一個(gè)防止病毒基因組中潛在的活化適應(yīng)酶形成的方法是在啟動(dòng)子的3’末端增加一段序列，該序列能和適應(yīng)酶部分序列堿基互補(bǔ)，從而降低適應(yīng)酶形成正確構(gòu)象的可能性。這在圖26中有描述。如圖所示，U6啟動(dòng)子的3’末端進(jìn)行修飾增加一段序列，該序列和形成發(fā)卡的螺旋I的5’區(qū)域互補(bǔ)，阻止適應(yīng)酶形成催化活性所必需的構(gòu)象。這僅出現(xiàn)于RNA基因組而不會(huì)出現(xiàn)于轉(zhuǎn)錄本，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄的起始將在啟動(dòng)子修飾序列的下游。這不會(huì)影響被轉(zhuǎn)錄的原病毒的三級(jí)結(jié)構(gòu)，因?yàn)閱?dòng)子序列并不存在。
不同的修改和本發(fā)明中所描述的方法和系統(tǒng)的改進(jìn)為本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員所熟知，它們不偏離本發(fā)明的范圍和本質(zhì)。雖然本發(fā)明結(jié)合優(yōu)選的實(shí)施方案加以描述，但必須注意本發(fā)明并不局限于這些具體的實(shí)施方案。事實(shí)上，對(duì)本發(fā)明的已被描述的方法加以修飾，這些方法對(duì)于那些化學(xué)、生物或者其他相關(guān)領(lǐng)域的研究人員是熟知的，本發(fā)明也試圖包括這些方法。以上說明中所有提及的出版物在此并入作為參考。
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權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法，該方法包括將含有目的核苷酸(NOI)的非靈長(zhǎng)類慢病毒表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中NOI編碼且能夠表達(dá)治療性蛋白質(zhì)或適應(yīng)酶，或能夠產(chǎn)生反義寡核苷酸、核酶、siRNA、短發(fā)卡RNA、微RNA或1型內(nèi)含子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中非靈長(zhǎng)類慢病毒表達(dá)載體來源于EIAV、FIV、BIV、CAEV或MVV。
4.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法，該方法包括向細(xì)胞中導(dǎo)入包含NOI或適應(yīng)酶的慢病毒表達(dá)載體，該載體能夠產(chǎn)生反義寡核苷酸、核酶、siRNA、短發(fā)卡RNA、微RNA或1型內(nèi)含子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中慢病毒表達(dá)載體來自于EIAV、FIV、BIV、CAEV、MVV或HIV。
6.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中表達(dá)載體經(jīng)體內(nèi)或離體導(dǎo)入。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中細(xì)胞位于子宮內(nèi)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中細(xì)胞是圍產(chǎn)期細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中細(xì)胞是胚胎細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中細(xì)胞是胎兒細(xì)胞。
11.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞能夠引起胚系改變。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中細(xì)胞是生殖細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中細(xì)胞參與配子形成。
14.根據(jù)權(quán)利要求11至13任何一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞是卵母細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、卵子、卵原細(xì)胞、受精卵、ES細(xì)胞、胚細(xì)胞、精母細(xì)胞、精細(xì)胞、精子或者精原細(xì)胞。
15.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中慢病毒表達(dá)載體經(jīng)由囊胚層、臍帶、胎盤、或羊水、子宮、性腺或通過腹膜內(nèi)、肌肉的、脊柱內(nèi)的、顱骨內(nèi)的、靜脈內(nèi)、呼吸道內(nèi)、胃腸道內(nèi)或肝內(nèi)途徑導(dǎo)入細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中慢病毒表達(dá)載體經(jīng)由囊胚層、臍帶、胎盤或羊水、或通過腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、脊髓內(nèi)、顱內(nèi)、靜脈內(nèi)、呼吸道內(nèi)、胃腸道內(nèi)或肝內(nèi)途徑導(dǎo)入子宮細(xì)胞。
17.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法，該方法包括將含有NOI的慢病毒表達(dá)載體導(dǎo)入非分裂細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中慢病毒表達(dá)載體來自EIAV、FIV、BIV、CAEV、MVV或HIV。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或者18的方法，其中NOI編碼并能夠表達(dá)蛋白質(zhì)或適應(yīng)酶，或者能夠產(chǎn)生反義寡核苷酸、核酶、siRNA、短發(fā)卡RNA、微RNA或者1型內(nèi)含子。
20.根據(jù)權(quán)利要求17至19中任何一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞能夠引起胚系改變。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中細(xì)胞是生殖細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中細(xì)胞參與配子形成。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的，其中細(xì)胞是卵母細(xì)胞。
24.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞來自動(dòng)物或者酵母。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中細(xì)胞來源于非人類生物。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中細(xì)胞是鼠類、人類、豬、牛、猴、綿羊、馬、鳥類、昆蟲或者爬行動(dòng)物或者魚類細(xì)胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中細(xì)胞來源于線蟲或果蠅。
29.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中慢病毒表達(dá)載體是假型病毒。
30.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中慢病毒表達(dá)載體不包含任何功能性附屬基因。
31.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中NOI可操縱性地和組成性、組織特異性或者誘導(dǎo)性啟動(dòng)子相連接。
32.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項(xiàng)方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
33.從根據(jù)權(quán)利要求32產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞產(chǎn)生或獲得、或者通過權(quán)利要求1至31中任何一項(xiàng)所限定的方法產(chǎn)生或獲得的轉(zhuǎn)基因生物。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的轉(zhuǎn)基因生物，其中NOI在輸卵管細(xì)胞、生殖道細(xì)胞、造血細(xì)胞(包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞或者這些細(xì)胞的祖細(xì)胞)、分泌細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、或者神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)元、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎臟、肝臟、心臟或者肺細(xì)胞中表達(dá)。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或者34的轉(zhuǎn)基因生物，其中的生物是鳥類。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的轉(zhuǎn)基因生物，其中的生物是家禽，例如雞、鴨或者鵝
37.來源于權(quán)利要求33至36中任何一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因生物的轉(zhuǎn)基因卵。
38.前面權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因生物或卵，包括編碼且能夠表達(dá)蛋白質(zhì)的至少一種NOI。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的轉(zhuǎn)基因生物或卵，進(jìn)一步包括能夠產(chǎn)生適應(yīng)酶、反義寡核苷酸、核酶、siRNA、短發(fā)卡RNA、微RNA或者1型內(nèi)含子的至少一種NOI。
40.包括第一核苷酸序列的載體，其中所述的第一核苷酸序列包括(a)編碼適應(yīng)酶的第二核苷酸序列；和(b)能夠產(chǎn)生多寡核苷酸的第三核苷酸序列；其中(a)和(b)可操縱性地相連接，其中的適應(yīng)酶能活化，以切割第一核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄本，從而產(chǎn)生多聚核苷酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的載體，其中所述的多聚核苷酸是能調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的RNA分子。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的載體，其中RNA分子選自適應(yīng)酶、siRNA、短發(fā)卡RNA、微RNA、反義RNA和核酶。
43.包含第一核苷酸序列的載體，其中所述的第一核苷酸序列包括(a)編碼適應(yīng)酶的第二核苷酸序列；和(b)包含NOI的第三核苷酸序列；其中(a)和(b)可操縱性地相連接，其中適應(yīng)酶能活化，以切割第一核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄本，從而抑制所述NOI的表達(dá)。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的載體，其中適應(yīng)酶能活化，以在第三核苷酸序列轉(zhuǎn)錄本中某個(gè)位置的切割第一核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄本。
45.根據(jù)權(quán)利要求43或44的載體，其中的NOI編碼治療性蛋白。
46.根據(jù)權(quán)利要求40到45中任何一項(xiàng)的載體，其中適應(yīng)酶被配體活化。
47.根據(jù)權(quán)利要求40到45中任何一項(xiàng)的載體，其中適應(yīng)酶被配體滅活。
48.根據(jù)權(quán)利要求46或47的載體，其中載體包括編碼權(quán)利要求46或47中配體的第四核苷酸序列。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的載體，其中編碼配體的核苷酸序列可操縱性地和啟動(dòng)子相連接。
50.根據(jù)權(quán)利要求46至49中任何一項(xiàng)的載體，其中配體選自多肽和其片段、線性肽、環(huán)肽、其編碼核酸、包括低分子量有機(jī)或者無機(jī)化合物的合成和天然化合物以及抗體。
51.根據(jù)權(quán)利要求46至49中任何一項(xiàng)的載體，其中配體選自FMN、強(qiáng)力霉素和VEGF、四環(huán)素和葡萄糖。
52.根據(jù)權(quán)利要求40至51中任何一項(xiàng)的載體，其中(a)和(b)可操縱性地和啟動(dòng)子相連。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的載體，其中啟動(dòng)子選自RNA聚合酶III啟動(dòng)子和RNA聚合酶II啟動(dòng)子。
54.根據(jù)權(quán)利要求52的載體，其中啟動(dòng)子可操縱性地和至少一個(gè)拷貝的四環(huán)素應(yīng)答元件(TRE)相連接，從而使第一核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄受四環(huán)素調(diào)節(jié)因子、四環(huán)素或及其衍生物的調(diào)節(jié)。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的載體，其中的載體包括編碼四環(huán)素調(diào)節(jié)因子的第五核苷酸序列。
56.根據(jù)權(quán)利要求52到55中任何一項(xiàng)的載體，其中啟動(dòng)子的3’端包括一段能夠和適應(yīng)酶的一部分進(jìn)行堿基配對(duì)的序列，從而形成發(fā)卡，阻止病毒RNA基因組中活性適應(yīng)酶的形成。
57.根據(jù)權(quán)利要求40至56中任何一項(xiàng)的載體，它為病毒載體形式。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的載體，其中載體以分裂內(nèi)含子載體形式存在，從而能夠阻止病毒RNA基因組中活化適應(yīng)酶的形成。
59.根據(jù)權(quán)利要求57或58的載體，其中載體系統(tǒng)來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒載體、皰疹病毒載體、痘病毒載體、細(xì)小病毒載體和桿狀病毒載體。
60.使用權(quán)利要求40至59任何一項(xiàng)中的載體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法。
61.通過產(chǎn)生權(quán)利要求60所限定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞而產(chǎn)生或獲得的轉(zhuǎn)基因生物。
62.使用權(quán)利要求46至59任何一項(xiàng)的載體的權(quán)利要求1至31任何一項(xiàng)的方法。
63.通過權(quán)利要求62的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
64.通過產(chǎn)生權(quán)利要求63的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞而產(chǎn)生或獲得的轉(zhuǎn)基因生物。
65.根據(jù)權(quán)利要求64的轉(zhuǎn)基因生物，其中NOI在輸卵管細(xì)胞、生殖道細(xì)胞、白蛋白、造血細(xì)胞(包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、或者這些細(xì)胞的祖輩細(xì)胞)、分泌細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、或者神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)元、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、腎臟、肝臟、心臟和肺細(xì)胞表達(dá)。
全文摘要
產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法，該方法包括往細(xì)胞中導(dǎo)入含有目的核苷酸序列(NOI)的非靈長(zhǎng)類慢病毒表達(dá)載體。還描述了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法，該方法包括往細(xì)胞中導(dǎo)入含有NOI的慢病毒表達(dá)載體，該NOI能夠產(chǎn)生反義寡核苷酸、核酶、siRNA、短發(fā)卡RNA、微RNA或者1型內(nèi)含子。同樣還描述了含有第一核苷酸序列的一種病毒載體，其中所述的第一核苷酸序列包括(a)含有適應(yīng)酶的第二核苷酸序列；和(b)能夠產(chǎn)生多聚核苷酸的第三核苷酸序列；此處(a)和(b)可操縱性地相連接，其中的適應(yīng)酶活化，切割第一核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄本，從而產(chǎn)生多聚核苷酸。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1620508SQ02828287
公開日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2002年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月21日
發(fā)明者P·拉德克利菲, K·米特羅法諾斯, M·特米斯 申請(qǐng)人:牛津生物醫(yī)學(xué)(英國)有限公司