專利名稱：用于動(dòng)物飼料的耐熱植酸酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地說涉及制備和使用耐熱植酸酶的方法。
背景技術(shù)：
植酸酶(肌醇-六磷酸磷酸水解酶(myo-inositol hexakisphosphatephosphohydrolase)EC3.1.3.8)是將植酸鹽(phytate)(肌醇六磷酸鹽)水解為肌醇和無機(jī)磷酸鹽的酶。已知該酶是有價(jià)值的食品添加劑。在21世紀(jì)來臨之際，植酸酶作為動(dòng)物飼料添加劑的年銷售額估計(jì)為1億美元，且仍在增長。
家禽和豬飼料目前主要以谷類、豆類和油料種子產(chǎn)品為基礎(chǔ)。大約有三分之二的磷(P)以植酸鹽，即植酸的鹽(肌醇六磷酸鹽，InsP6)形式存在于這些飼料中(Jongbloed et al.，1993)。在植物體內(nèi)，肌醇六磷酸鹽中的磷在混合形式的肌醇六磷酸鈣-鎂-鉀鹽中以螯合物形式存在，其溶解性非常低(Pallauf and Rimbach，1997)。這種形式的磷對于單胃動(dòng)物如人類、豬和家禽來說很難消化/利用。
對于肌醇六磷酸復(fù)合物中結(jié)合的肌醇六磷酸磷和礦物質(zhì)以及微量元素的利用來說，需要植酸酶來水解植酸中以酯型結(jié)合的磷酸基團(tuán)(Rimbach et al.，1994)。植酸酶是一類特殊的磷酸酶，它能夠?qū)⒅菜崴獬梢幌盗屑〈嫉牡图壛姿狨ズ土姿猁}。已知存在有兩種類型的植酸酶3-植酸酶和6-植酸酶，提示了易受攻擊的磷酸鹽酯鍵。雖然單胃動(dòng)物缺少足夠的植酸酶來有效地利用植酸形式的磷酸，許多真菌、細(xì)菌和酵母生成可用于添加到動(dòng)物食物的植酸酶。
有足夠的資料說明了補(bǔ)充植酸酶對磷可消化性和動(dòng)物表現(xiàn)的益處(Mroz et al，1994；Kornegay et al.，1996；Rao et al.，1999；Ravindramet al.，1999)。但是，經(jīng)常僅利用以生產(chǎn)商的銷售策略形式提供的和酶相關(guān)的膚淺信息，在特定的(ad hoc)基礎(chǔ)上進(jìn)行了大多數(shù)研究。酶制劑的效率不但取決于類型、包涵率(inclusion rate)和所具有的活性水平，還取決于酶在通過胃腸道時(shí)所經(jīng)受的不同條件下，以及在用于預(yù)處理食物和飼料制劑的條件下保持活性的能力。
雖然多種植酸酶可以用作補(bǔ)充劑，許多酶都具有一定的缺點(diǎn)。例如，目前使用的許多植酸酶都在飼料成丸過程中由于熱處理而喪失活性。另外，在補(bǔ)充有低水平磷酸鈣的飲食中，目前使用的許多植酸酶都是不夠的。并且，許多情況下，微生物表達(dá)酶的生產(chǎn)成本高。
因此，需要特性得到改善的植酸酶來用于動(dòng)物飼料和食品加工，以及生產(chǎn)該植酸酶的經(jīng)濟(jì)方法。生產(chǎn)更經(jīng)濟(jì)的植酸酶的一個(gè)方法是通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生能夠表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物或植物器官，并將植酸酶添加到動(dòng)物飼料或人飲食中，直接使用?？商鎿Q的方案是，提取植酸酶，如果需要的話，根據(jù)所需用途加以純化。
發(fā)明概述相應(yīng)地，本發(fā)明提供了制備和使用編碼耐熱植酸酶的核酸分子(多聚核苷酸)的方法，所述耐熱植酸酶在約60℃30分鐘后仍保留至少40％活性、且具有高度的比活(specific activity)，即37℃、酸性pH如pH4.5條件下至少約200U/mg的耐熱植酸酶。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備耐熱植酸酶的方法。該方法包括在植物宿主細(xì)胞中表達(dá)表達(dá)盒(expression cassette)的方法，該表達(dá)盒包含和編碼耐熱植酸酶的核酸分子可操縱性相連接的啟動(dòng)子，其中耐熱植酸酶約60℃下30分鐘后仍保留至少40％活性、且pH4.5、37℃條件下比活超過200U/mg。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括分離耐熱植酸酶。植物宿主細(xì)胞可以是單子葉植物細(xì)胞，如玉米或小麥細(xì)胞，或者雙子葉植物細(xì)胞，如大豆細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用來制備重組耐熱植酸酶的植物細(xì)胞產(chǎn)生糖基化形式的重組耐熱植酸酶。
本發(fā)明還提供了編碼耐熱植酸酶的多聚核苷酸序列，其中多聚核苷酸序列優(yōu)化在植物細(xì)胞也就是玉米細(xì)胞中表達(dá)。
優(yōu)選的是，編碼耐熱植酸酶的多聚核苷酸(第一個(gè)多聚核苷酸)可操縱性地和至少一個(gè)調(diào)控序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、終止序列或其任意組合相連接，或可選擇性地和編碼信號序列的第二個(gè)多聚核苷酸相連接，其中信號序列將第一個(gè)多聚核苷酸編碼的酶導(dǎo)向特定的細(xì)胞部位，如細(xì)胞外部位位置。啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子，如泛素啟動(dòng)子，或者誘導(dǎo)性(條件)啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是組織特異性的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是胚乳特異性啟動(dòng)子，如玉米γ-玉米醇溶蛋白(zein)谷蛋白-2啟動(dòng)子，優(yōu)選玉米27-KD的γ-玉米醇溶蛋白谷蛋白-2啟動(dòng)子，或玉米ADP-葡萄糖焦磷酸酶啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是胚芽(embryo)特異性的啟動(dòng)子，如玉米球蛋白1或玉米油質(zhì)蛋白18KD啟動(dòng)子。示例性的啟動(dòng)子包括但不限于SEQ ID NO8和SEQ ID NO9。
優(yōu)選的是本發(fā)明的耐熱植酸酶約60℃下30分鐘仍保留至少40％活性，較優(yōu)選的是約65℃下30分鐘仍保留至少40％活性，更優(yōu)選的是約70℃下30分鐘仍保留至少35％活性；37℃、酸性pH如小于pH5.0，較優(yōu)選小于pH4.0且大于pH1.5條件下，比活至少約400U/mg，較優(yōu)選約600U/mg，更優(yōu)選約800U/mg。SEQ ID NO1中提供了本發(fā)明的示例性耐熱植酸酶。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明表達(dá)盒或多聚核苷酸的載體，以及包含本發(fā)明多聚核苷酸、表達(dá)盒或載體的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。本發(fā)明的載體還編碼多個(gè)多肽，包括多個(gè)耐熱植酸酶；還編碼包含本發(fā)明耐熱植酸酶的融合多肽，植物細(xì)胞可以包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的載體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞可用于制備本發(fā)明的重組耐熱植酸酶。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了從本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞分離的耐熱植酸酶，以及合成制備的酶。
通過本發(fā)明方法制備的融合多肽優(yōu)選包含信號序列。該信號序列，可操縱性地和植酸酶基因相連接，將植酸酶靶向到細(xì)胞的造粉體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)外體或淀粉顆粒。示例性的信號序列包括但不局限于蠟質(zhì)基因的N末端序列、γ-玉米醇溶蛋白的N末端序列，淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如蠟質(zhì)基因淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中制備和采用的融合多肽包含SEKDEL信號序列，該信號序列和耐熱植酸酶的C末端可操縱性地相連接。
本發(fā)明提供的耐熱植酸酶在pH大于2.0、小于4.0的條件下半衰期超過25分鐘。
本發(fā)明進(jìn)一步提供的是耐熱植酸酶、植酸酶制劑或酶混合制劑的配制方法。重組耐熱植酸酶或其制劑以補(bǔ)充劑的形式添加到食物或動(dòng)物飼料中，或在食物或動(dòng)物飼料加工過程之前、加工過程中或加工之后加到食物及飼料的組分中。優(yōu)選的是，本發(fā)明的重組耐熱植酸酶在制粒機(jī)中的熱(如蒸汽)條件之前和/或過程中添加到飼料組分的混合物中。因此，本發(fā)明包括制備和使用耐熱植酸酶的方法。
另外，由于本發(fā)明的植酸酶能夠耐受飼料配制過程中商用制粒機(jī)中的熱條件，本發(fā)明提供了制備動(dòng)物飼料，如包含耐熱植酸酶的硬顆粒飼料顆粒的方法。為了制備飼料，可以將配制好的植酸酶和飼料組分相混合，在制粒機(jī)中形成混合物蒸汽條件，使其保留至少50％熱處理前的酶活性，然后飼料壓榨通過顆粒著色(pellet dye)。除了和維生素、礦物質(zhì)、其他飼料酶、農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品(如麥麩或玉米麩片)或其組合一起使用之外，植酸酶自身也可以用作動(dòng)物飼料補(bǔ)充劑。該酶還可以添加到糊狀食物中，如沒有?；氖澄?。
由于目前能夠購買到的植酸酶不是耐熱的，它們經(jīng)常在?；髴?yīng)用，通常通過將酶溶液噴灑到?；娘暳仙稀Ｅc噴灑方法相關(guān)的一些問題是只有一小部分顆粒和酶相接觸，酶只存在于已包被顆粒的表面，飼料廠需要引進(jìn)并操縱復(fù)合噴灑機(jī)器。相比之下，本發(fā)明的耐熱植酸酶，比活比其他商業(yè)來源的植酸酶高出約8倍，可以在?；凹尤?，從而生產(chǎn)出酶分布得到改善的飼料。而且，和噴灑植酸酶的飼料相比，包含本發(fā)明中耐熱植酸酶的飼料具有更長的半衰期，這是因?yàn)閲姙⒎椒ㄒ肓速A存過程中支持真菌和細(xì)菌生長的濕度。另外，本發(fā)明中耐熱植酸酶的比活更高，使得飼料生產(chǎn)商能夠在飼料中使用水平顯著降低的磷酸鹽。例如，目前建議補(bǔ)充有能夠購買到的植酸酶的食物推薦使用基礎(chǔ)水平為0.45％的無機(jī)磷酸鹽。本發(fā)明的耐熱植酸酶可以補(bǔ)充較低水平的磷酸鹽，如家禽食物中約0.225％。
本發(fā)明因此提供了制備動(dòng)物飼料的方法，該方法包括提供包含一個(gè)或多個(gè)飼料組分和包含本發(fā)明中耐熱植酸酶的制備物的混合物，在適當(dāng)?shù)臏囟群蜐穸葪l件下對混合物進(jìn)行處理，使混合物中存在的植酸水解。還提供了通過這種方法制備的動(dòng)物飼料。
進(jìn)一步提供了制備作飼料制劑組合物的耐熱植酸酶的方法，該方法包括將包含本發(fā)明中耐熱植酸酶的液體溶液和粗粉，如大豆粗粉相合并，產(chǎn)生混合物；將混合物凍干，產(chǎn)生凍干組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將凍干組合物和其他飼料組分相合并，產(chǎn)生進(jìn)一步的組合物。本發(fā)明還提供了根據(jù)這些方法制備的凍干組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種方法，其中對包含動(dòng)物飼料組分和含有本發(fā)明中耐熱植酸酶的制劑的混合物進(jìn)行熱處理，優(yōu)選在超過50℃的溫度下進(jìn)行熱處理，產(chǎn)生熱處理的動(dòng)物飼料混合物。也提供了通過該方法制備的熱處理動(dòng)物飼料。植酸酶制劑可以是液體制劑或固體制劑，優(yōu)選包含少于約1％的無機(jī)磷酸鹽。優(yōu)選的植酸酶制劑是轉(zhuǎn)基因植物材料。轉(zhuǎn)基因植物材料優(yōu)選玉米粒、碾碎的玉米粒、玉米粉或從玉米中制備的酶提取物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，包含本發(fā)明中耐熱植酸酶的液體溶液和大豆粗粉相合并，產(chǎn)生混合物，然后將混合物凍干。優(yōu)選包含少于0.45％無機(jī)磷酸鹽的混合物可以包含至少一種維生素、礦物質(zhì)、耐熱植酸酶之外的酶、有機(jī)酸、原生物(probiotic)產(chǎn)物、必需的油(essential oil)或谷物(grain)加工輔產(chǎn)品(co-product)。可以對熱處理的飼料進(jìn)行進(jìn)一步加工，如通過制粒機(jī)壓榨熱處理的飼料，產(chǎn)生?；膭?dòng)物飼料，也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
還提供了包含按照本發(fā)明方法制備的耐熱植酸酶的動(dòng)物飼料組合物。尤其是，本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明方法制備的耐熱植酸酶的動(dòng)物飼料組合物，pH4.5、37℃條件下植酸酶的比活超過400U/mg，優(yōu)選pH4.5、37℃條件下超過600U/mg，更優(yōu)選pH4.5、37℃條件下超過800U/mg。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，動(dòng)物飼料組合物包含耐熱植酸酶，在pH大于2.0、小于4.0條件下該植酸酶半衰期超過25分鐘。
還提供了包含按照本發(fā)明方法制備的耐熱植酸酶的酶飼料添加劑或食物添加劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，飼料和食物添加劑包含耐熱植酸酶，pH4.5、37℃條件下該酶的比活超過400U/mg，優(yōu)選pH4.5、37℃條件下超過600U/mg，更優(yōu)選pH4.5、37℃條件下超過800U/mg。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，動(dòng)物飼料和食物添加劑組合物包含耐熱植酸酶，在pH大于2.0、小于4.0條件下該植酸酶半衰期超過25分鐘。
還提供了減小/降低飼料轉(zhuǎn)化率、改善動(dòng)物體重增加的方法，該方法包括用包含耐熱植酸酶的飼料飼養(yǎng)動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括用包含低于0.45％的無機(jī)磷酸鹽和能夠增加飼料轉(zhuǎn)化率或改善動(dòng)物體重增加的有效量熱穩(wěn)定性植酸酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的是熱穩(wěn)定性植酸酶在動(dòng)物消化道中具有約30分鐘的半衰期。
進(jìn)一步提供了將動(dòng)物對磷，如無機(jī)磷的飲食需求降至最低的方法。該方法包括用有效量的、包含本發(fā)明耐熱植酸酶的飼料飼養(yǎng)動(dòng)物，以增加對動(dòng)物飼料中磷的生物利用度，優(yōu)選對動(dòng)物飼料中無機(jī)磷的生物利用度。還提供了增加對動(dòng)物飼料中磷的利用的方法，該方法包括用有效量的、包含本發(fā)明耐熱植酸酶的飼料飼養(yǎng)動(dòng)物，以增加對動(dòng)物飼料中磷的生物利用度。在這些方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，植酸酶在動(dòng)物消化道中具有約30分鐘的半衰期。
另外，本發(fā)明提供了降低動(dòng)物排泄物中磷酸鹽水平的方法，該方法包括用有效量的、包含本發(fā)明耐熱植酸酶的飼料飼養(yǎng)動(dòng)物，以降低動(dòng)物排泄物中的磷酸水平。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了降低動(dòng)物排泄物中磷酸水平的方法，該方法包括用包含少于0.45％的無機(jī)磷和有效量本發(fā)明耐熱植酸酶的飼料飼養(yǎng)動(dòng)物，以降低動(dòng)物排泄物中的磷酸水平。在這些方法的實(shí)施方案中，植酸酶在動(dòng)物消化道中具有約30分鐘的半衰期。
本發(fā)明還提供了提高動(dòng)物飼料或人類食品營養(yǎng)價(jià)值的方法。該方法包括在制備動(dòng)物飼料或人類食品的過程中加入本發(fā)明的耐熱植酸酶。還提供了制備人類食品的方法，該方法包括提供食品組分和包含本發(fā)明耐熱植酸酶的制劑所形成的混合物；在適當(dāng)?shù)臏囟群蜐穸葪l件下處理混合物，促進(jìn)混合物中植酸的水解。根據(jù)該方法制備的處理人類食品也屬于本發(fā)明的范圍。和相應(yīng)的未處理人類食品中的植酸含量相比，處理人類食品的植酸含量較低。
本發(fā)明還提供了改善谷物加工的方法，該方法包括在谷物加工過程中加入本發(fā)明的耐熱植酸酶。該方法可用于改善所有谷物的加工，優(yōu)選用于改善玉米、小麥、大豆、卡諾拉(canola)或甘蔗。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了提高加工的谷物產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值的方法或加工谷物的方法，包括在谷物加工過程中往谷物產(chǎn)品中加入有效量的本發(fā)明耐熱植酸酶，以提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，谷物是玉米，谷物加工方法是濕碾法，加工產(chǎn)品是玉米麩質(zhì)(gluten)飼料、玉米麩質(zhì)和玉米淀粉。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，谷物是玉米、小麥、大豆、卡諾拉或甘蔗。在其他的優(yōu)選方案中，谷物是油料種子，如大豆或油菜籽，加工的谷物產(chǎn)品是油料種子粗粉。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備包含耐熱植酸酶的食物配方組合物的方法，該方法包括將包含本發(fā)明耐熱植酸酶的液體溶液和粗粉相合并，產(chǎn)生混合物；將混合物凍干，產(chǎn)生凍干組合物。本發(fā)明還提供了通過這種方法制備的凍干組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了將凍干組合物和其他食物組分相合并，產(chǎn)生進(jìn)一步的混合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含耐熱植酸酶的組合物包含pH4.5、37℃條件下比活超過800U/mg的耐熱植酸酶。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在pH大于2.0、小于4.0條件下耐熱植酸酶半衰期超過25分鐘。
另一方面，本發(fā)明提供了制備表達(dá)本發(fā)明耐熱植酸酶的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、植物部位或植物的方法。該方法還包括通過這些方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物部位或植物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括將表達(dá)盒導(dǎo)入植物細(xì)胞中，從而獲得從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物，其中的表達(dá)盒包含和編碼耐熱植酸酶的核酸分子可操縱性相連接的啟動(dòng)子。其中耐熱植酸酶優(yōu)選約60℃下30分鐘后保留至少40％活性、且pH4.5、37℃條件下比活超過200U/mg。較優(yōu)選的是，pH4.5、37℃條件下耐熱植酸酶的比活超過400U/mg。更為優(yōu)選的是，pH4.5、37℃條件下耐熱植酸酶的比活超過600U/mg。更進(jìn)一步優(yōu)選的是，pH4.5、37℃條件下耐熱植酸酶的比活超過800U/mg。
轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物部位或植物可以是雙子葉植物細(xì)胞或單子葉植物細(xì)胞，優(yōu)選谷物細(xì)胞，更優(yōu)選玉米或小麥細(xì)胞，或大豆細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用此方法制備包括SEQ ID NO1中耐熱植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物部位或植物。其中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物部位或植物也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，耐熱植酸酶在植物種子中表達(dá)。這種植物的種子也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
包含本發(fā)明表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、植物部位和植物也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。如前所述，表達(dá)盒包含和編碼耐熱植酸酶的核酸分子可操縱性相連接的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是胚芽特異性啟動(dòng)子，如玉米球蛋白-1啟動(dòng)子或玉米油質(zhì)蛋白18KD啟動(dòng)子，優(yōu)選胚乳特異性啟動(dòng)子，如玉米ADP-葡萄糖磷酸酶啟動(dòng)子或玉米γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子。
本發(fā)明還包括包含編碼具有本發(fā)明耐熱植酸酶之融合多肽的核酸分子的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、植物部位或植物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物包含具有和耐熱植酸梅可操縱性相連接的γ-玉米醇溶蛋白N末端信號序列的融合多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物包含具有和耐熱植酸酶的C末端可操縱性相連接的SEKDEL的融合多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物包含具有和耐熱植酸酶可操縱性相連接的N末端蠟質(zhì)基因造粉體靶向肽的融合多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物包含具有和耐熱植酸酶可操縱性相連接的蠟質(zhì)基因淀粉包被結(jié)構(gòu)域的融合多肽。
本發(fā)明還包括本發(fā)明植物的產(chǎn)品，該產(chǎn)品包含耐熱植酸酶。產(chǎn)品優(yōu)選為種子、谷?；蚬麑?shí)。產(chǎn)品可以是一個(gè)植物，尤其是雜交植物和近交植物。產(chǎn)品還可以是包含本發(fā)明耐熱植酸酶的谷粒加工產(chǎn)品，如前文所述的玉米谷粒加工產(chǎn)品和油料種子谷粒加工產(chǎn)品，或者油料種子加工產(chǎn)品。
屬于本發(fā)明范圍的動(dòng)物包括多胃動(dòng)物，如牛，以及單胃動(dòng)物，如豬、家禽(如雞、火雞、鵝、鴨、野雞、松雞、鵪鶉和鴕鳥)、馬、綿羊、山羊、犬和貓，以及魚和甲殼類動(dòng)物。本發(fā)明中制備和/或采用的優(yōu)選飼料或動(dòng)物飼料包括家禽飼料和豬飼料。
飼料或食物中植酸酶的水平優(yōu)選約50U/kg至5000U/kg，更優(yōu)選為100U/kg至1200U/kg，或300U/kg至1200U/kg。
本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物。優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)化植物是玉米、小麥或大豆植物。
附圖簡述

圖1所示為在玉米種子中蓄積的、編碼功能性植酸酶的密碼子優(yōu)化的玉米植酸酶基因(Nov9X)的表達(dá)。上圖各柱表示從Nov9X轉(zhuǎn)基因隔離(segregating)植物的6個(gè)谷粒中提取的總磷酸鹽。下圖總植酸酶活性(在計(jì)算活性之前減去磷酸鹽背景)。1單位＝6個(gè)谷粒的總提取物釋放的μmol磷酸鹽/min。264A8C#14為陰性對照(缺少Nov9X轉(zhuǎn)基因)；305A13包含質(zhì)粒pNOV4057；305B11包含質(zhì)粒pNOV4061。
圖2表明玉米中產(chǎn)生的重組Nov9X植酸酶活性是熱穩(wěn)定的。單位的定義如圖1所述。A.提取的總植酸酶活性。B.考馬斯亮藍(lán)染色的、提取物的SDS-PAGE凝膠。
圖3比較了從干燥的谷粒獲得的面粉提取物中的植酸酶水平。所有的植物都含有pNOV4057或pNOV4061。上圖反應(yīng)物中的磷酸鹽濃度。下圖植酸酶單位表示為釋放的μmol磷酸鹽/mg蛋白質(zhì)/min。Nov9X拷貝#top4305A24A，2個(gè)拷貝；305B11A、20A、27A都＞3個(gè)拷貝。
圖4所示為玉米中產(chǎn)生的植酸酶(Nov9X)的蓄積。該圖比較了玉米面粉懸液和粉提取物中的植酸酶活性。266B-2E是陰性對照。上圖中示出了所有樣品中的磷酸鹽濃度。糾正了陰性對照266-2E中存在的內(nèi)源性磷酸鹽后計(jì)算植酸酶單位。示出了各對照和處理的兩個(gè)重復(fù)。從處理組的磷酸鹽濃度中減去陰性對照的磷酸鹽濃度，確定由于植酸酶的活性所釋放的磷酸鹽(下圖)。
圖5所示為Nov9X的胚乳特異性表達(dá)。該圖所示為T2胚乳和胚提取物中的植酸酶(Nov9X)活性。提取兩個(gè)重復(fù)樣品(定為1和2)。
圖6顯示玉米表達(dá)的Nov9X植酸酶在加熱胚乳提取物的過程中是穩(wěn)定的，高度富集在加熱上清液的可溶性級分中。A.未加熱和加熱樣品的植酸酶活性。B.未加熱和加熱樣品的植酸酶比活。
圖7所示為包含2個(gè)事件的幾個(gè)株系中的植酸酶活性(FTU/g)。各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示將10個(gè)谷粒磨碎所獲得的1g面粉中提取的植酸酶活性。對于每個(gè)株系來說，重復(fù)磨碎10個(gè)谷粒樣品(樣品1和2)。近交ID取代了之前版本中使用的傳粉者、維持者和不育者。
圖8A、8B和8C所示為從三個(gè)21天雞飼養(yǎng)試驗(yàn)中獲得的飼料轉(zhuǎn)化率(FCRs)，說明了補(bǔ)充玉米植酸酶的益處。FCRs表示為LS均值。可利用磷陽性對照，0.400％；陰性對照，0.225％。往低磷飲食(0.225％可利用磷＝陰性對照)的樣品中加入磨碎的轉(zhuǎn)基因玉米，制備補(bǔ)充植酸酶的飲食。陰性對照飲食和補(bǔ)充酶的飲食之間的區(qū)別是加入了包含Nov9X植酸酶的、磨碎的轉(zhuǎn)基因玉米。
圖8A將完整的轉(zhuǎn)基因玉米粒磨成面粉，配制植酸酶。然后將面粉直接加到飲食漿(低磷)中，充分混勻。用飲食漿飼養(yǎng)動(dòng)物，測定第21天的增重量。三角形從包含載體pNOV4057的玉米種子獲得的面粉。菱形從包含載體pNOV4061的玉米種子獲得的面粉。
圖8B在蒸汽處理和制粒之前將磨碎的玉米加入到低磷雞飼料中。方形從包含pNOV4061的玉米種子獲得的玉米面粉。菱形從包含pNOV4057的玉米種子獲得的玉米面粉。
圖8C在蒸汽處理和制粒之前將磨碎的玉米加入到低磷雞飼料中。將包含植酸酶(質(zhì)粒pNOV4057編碼)的玉米種子磨成不同平均顆粒大小，從細(xì)的面粉至粗的磨碎谷粒。菱形精細(xì)研磨物(粉末)；方形中等程度研磨物，三角形粗糙研磨物。粗糙研磨物主要由＞2000微米的顆粒組成。中等程度研磨物大小主要在500～2000微米之間。精細(xì)研磨物＜500微米。
發(fā)明詳述I.定義“水平改變”指轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞或生物中的表達(dá)水平和正?；蛭崔D(zhuǎn)化細(xì)胞或生物的表達(dá)水平不同。
術(shù)語“植物特征改變”指和野生型、未轉(zhuǎn)化或未轉(zhuǎn)染植物宿主相對的轉(zhuǎn)基因植物中的任意表型或基因型發(fā)生改變。
“反義抑制”指反義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生能夠抑制蛋白質(zhì)從內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
“嵌合的”用來指DNA序列，如載體或基因由多個(gè)不同來源的DNA序列組成，這些DNA序列通過重組DNA技術(shù)融合在一起形成一個(gè)非天然存在的DNA序列。術(shù)語“嵌合基因”指包含1)DNA序列，包括自然界中并不在一起的調(diào)控序列和編碼序列，或2)編碼非天然連接的部分蛋白質(zhì)或3)非天然連接的部分啟動(dòng)子的任意基因。相應(yīng)地，嵌合基因可以包含具有不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或包含具有相同來源的調(diào)控序列和編碼序列，但是其排列方式和自然界中的不同。
“整合入染色體”指外源基因或DNA構(gòu)建體通過共價(jià)鍵向宿主DNA的整合。在基因不是“整合入染色體”的情況下，可以“瞬時(shí)表達(dá)”?；虻乃矔r(shí)表達(dá)指未整合到宿主染色體中、而作為自主復(fù)制質(zhì)?；虮磉_(dá)盒，例如，或作為另一個(gè)生物系統(tǒng)如病毒的一部分獨(dú)立行使功能的基因的表達(dá)。
“克隆載體”典型地包含一個(gè)或一些限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)以及適于用作鑒定和選擇轉(zhuǎn)化有克隆載體的細(xì)胞的標(biāo)記基因，外源DNA序列能夠以可確定的方式插入這些限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)中，而不喪失載體的必需生物功能。標(biāo)記基因典型地包括賦予抗生素抗性，如四環(huán)素、潮霉素或氨芐霉素抗性的基因或選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的其他手段。
“編碼序列”指編碼特定氨基酸序列、而不包括非編碼序列的DNA或RNA序列。它可以組成“未打斷的編碼序列”，即cDNA中不含內(nèi)含子，或包括邊界上有適當(dāng)剪接位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子?！皟?nèi)含子”是原始轉(zhuǎn)錄物中包含的RNA序列，通過對細(xì)胞中的RNA進(jìn)行切割和重新連接將之去除，產(chǎn)生能夠翻譯成蛋白質(zhì)的成熟mRNA。
“組成性表達(dá)”指使用組成性或調(diào)控性啟動(dòng)子的表達(dá)?！皸l件”和“調(diào)控表達(dá)”指受調(diào)控性啟動(dòng)子控制的表達(dá)。
“組成性啟動(dòng)子”指能夠在植物的整個(gè)或幾乎整個(gè)發(fā)育階段中在全部或幾乎全部植物組織中控制基因表達(dá)的啟動(dòng)子。每個(gè)轉(zhuǎn)錄激活元件都不表現(xiàn)出絕對的組織特異性，而是可以介導(dǎo)多數(shù)植物部分的轉(zhuǎn)錄激活，其水平不低于轉(zhuǎn)錄最為活躍的植物部分所達(dá)到水平的1％。
術(shù)語“接觸”指將核酸片段導(dǎo)入細(xì)胞的任意已知或所述方法。
“表達(dá)”指植物中內(nèi)源性基因或轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，在使用反義構(gòu)建體的情況下，表達(dá)僅指反義DNA的轉(zhuǎn)錄。表達(dá)還指反義(mRNA)或功能性RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定蓄積。
這里所用的“表達(dá)盒”指能夠指導(dǎo)特定核苷酸序列在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)的DNA序列，包含目的核苷酸序列可操縱性相連接的啟動(dòng)子，其中目的核苷酸序列可操縱性地和終止信號相連接。它還典型地包含核苷酸序列正確翻譯所需的序列。包含目的核苷酸序列的表達(dá)盒可以是嵌合的，意思是其組分中至少一個(gè)組分和其他組分的至少一個(gè)是異源的。表達(dá)盒還可以是天然存在的，但是以能夠異源表達(dá)的重組形式獲得。表達(dá)盒中核苷酸序列的表達(dá)可以在組成性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的控制之下，誘導(dǎo)性啟動(dòng)子僅在宿主細(xì)胞和某些特定的外來刺激劑相接觸的時(shí)候起始轉(zhuǎn)錄。在多細(xì)胞生物的情況下，啟動(dòng)子還可以對特定組織或發(fā)育階段具有特異性。
啟動(dòng)子(帶有或不帶有增強(qiáng)子)的“表達(dá)模式”是表明啟動(dòng)子在植物的哪個(gè)部位和哪個(gè)發(fā)育階段起始轉(zhuǎn)錄的表達(dá)水平模式。當(dāng)一個(gè)啟動(dòng)子的表達(dá)模式和另一個(gè)啟動(dòng)子的表達(dá)模式幾乎沒有重疊的情況下，則說這些啟動(dòng)子的表達(dá)模式是互補(bǔ)的?？梢酝ㄟ^測定標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄報(bào)道m(xù)RNA的“穩(wěn)態(tài)”濃度來確定啟動(dòng)子的表達(dá)水平。這種測定方法是間接的，這是因?yàn)閳?bào)道m(xù)RNA的濃度不僅依賴于其合成速度，還依賴于mRNA的降解速度。因此穩(wěn)態(tài)水平是合成速度和降解速度的總體表現(xiàn)。
在轉(zhuǎn)錄的序列相同的情況下，可以認(rèn)為降解速度是固定的，因此該值可以作為合成速度的指標(biāo)。當(dāng)通過這種方式比較啟動(dòng)子時(shí)，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員便于使用的技術(shù)是雜交S1-RNAse分析、Northern印跡分析和競爭RT-PCR。這些技術(shù)并不代表所有可以使用的技術(shù)，但是描述了分析轉(zhuǎn)錄活性和mRNA表達(dá)水平的常用方法。
實(shí)際上所有啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)分析表明轉(zhuǎn)錄通常并非從單個(gè)堿基起始，而是從或多或少成簇的起始位點(diǎn)開始，每個(gè)起始位點(diǎn)簇負(fù)責(zé)mRNA的一些起始點(diǎn)。由于這種分布依據(jù)啟動(dòng)子的不同而不同，各個(gè)群體中報(bào)道m(xù)RNA的序列各自不同。既然各個(gè)mRNA物種或多或少易于降解，對于不同的報(bào)道m(xù)RNA來說沒有單一的降解速度而言。研究表明對于不同的真核啟動(dòng)子序列而言，起始位點(diǎn)(“起始子(initiator)”)周圍的序列在決定特異啟動(dòng)子指導(dǎo)的RNA表達(dá)水平方面起重要作用。起始位點(diǎn)還包括部分轉(zhuǎn)錄的序列。啟動(dòng)子和報(bào)道序列的直接融合會(huì)導(dǎo)致亞最佳水平的轉(zhuǎn)錄。
“5’非編碼區(qū)“指位于編碼區(qū)5’端(上游)的核苷酸序列。它存在于起始密碼子上游的完全加工mRNA中，會(huì)影響原始轉(zhuǎn)錄物向mRNA的加工、mRNA的穩(wěn)定性或翻譯效率(Turner et al.，1995)。
術(shù)語“基因”廣義上指和生物功能相關(guān)的任意核酸片段。因此，基因包括編碼序列和/或其表達(dá)所需的調(diào)控序列。例如，基因指表達(dá)mRNA、特定蛋白質(zhì)的核酸片段，包括調(diào)控序列?；蜻€包括不表達(dá)的DNA片段，例如形成其他蛋白質(zhì)的識(shí)別序列?；虻墨@得有多種來源，包括從目的材料克隆，或從已知或預(yù)測的序列信息合成，它包括具有所需參數(shù)的序列。
“遺傳穩(wěn)定”和“可遺傳的”指整合入染色體的遺傳元件，它們穩(wěn)定存在于植物中，連續(xù)數(shù)代通過子代進(jìn)行穩(wěn)定的遺傳。
“基因組”指生物的全部遺傳物質(zhì)。
“胚系細(xì)胞”指能夠形成配子、其遺傳物質(zhì)能夠遺傳的細(xì)胞。
這里所用的術(shù)語“異源DNA序列”、“外源DNA片段”或“異源多聚核酸”各自指來源和特定宿主細(xì)胞不同的序列，或者如果來源相同，對其原始形式進(jìn)行了修飾。因此，宿主細(xì)胞中的異源基因包括對于特定宿主細(xì)胞來說是內(nèi)源的，但是通過使用DNA改組加以修飾的基因。該術(shù)語還包括非天然存在的、多拷貝的天然存在的DNA序列。因此，該術(shù)語指對于細(xì)胞來說為外源或異源的DNA片段，或?qū)τ诩?xì)胞來說是同源的，但是在宿主細(xì)胞核酸的一個(gè)位點(diǎn)上元件通常不存在DNA片段。外源DNA片段表達(dá)產(chǎn)生外源多肽。
“誘導(dǎo)性啟動(dòng)子”指能夠在一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞類型中被一個(gè)外來刺激劑，如化學(xué)物質(zhì)、光、激素、應(yīng)激或病原體所啟動(dòng)的調(diào)控性啟動(dòng)子。
“起始位點(diǎn)”是轉(zhuǎn)錄序列部分的第一個(gè)核苷酸的位置，即+1位置?；虻钠渌行蛄屑捌淇刂茀^(qū)都相對于該位點(diǎn)加以編號。下游序列(即3’方向上的進(jìn)一步蛋白質(zhì)編碼序列)定為正的，而上游序列(5’方向上的多數(shù)控制區(qū))定為負(fù)的。
術(shù)語“細(xì)胞內(nèi)定位序列”指編碼細(xì)胞內(nèi)靶向信號的核苷酸序列?！凹?xì)胞內(nèi)靶向信號”是與蛋白質(zhì)一起接翻譯、并指導(dǎo)蛋白質(zhì)向特定的亞細(xì)胞區(qū)室定位的氨基酸序列?！皟?nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)停運(yùn)信號”指多肽的一段羧基末端延伸序列，翻譯后和多肽相連接，使蛋白質(zhì)進(jìn)入分泌途徑，停留在ER中。“ER停運(yùn)序列”指編碼ER靶向信號的核苷酸序列。其他的細(xì)胞內(nèi)靶向序列編碼在種子和/或葉子中活躍的靶向信號和液泡靶向信號。
本發(fā)明包括分離的或基本純化的核酸或蛋白質(zhì)組合物。在本發(fā)明的上下文中，“分離的”或“純化的”核苷酸是通過人為處理脫離其天然環(huán)境的多聚核酸片段或多肽，因此不是天然產(chǎn)物。分離的多聚核酸片段或多肽可以是純化形式的，也可以存在于非天然環(huán)境中，例如轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。舉例來說，“分離的”或“純化的”多聚核酸片段或蛋白質(zhì)或其生物活性部分當(dāng)通過重組技術(shù)生產(chǎn)時(shí)，基本上游離于其他的細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者，當(dāng)通過化學(xué)合成時(shí)，基本上游離于化合物前體或其他化合物。優(yōu)選的是，“分離的”多聚核酸(優(yōu)選蛋白質(zhì)編碼序列)游離于獲得核酸的生物基因組中天然狀態(tài)下位于核酸旁側(cè)的序列(即位于核酸5’和3’末端的序列)。舉例來說，在各個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸分子包含小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的、獲得核酸的生物基因組中天然狀態(tài)下位于核酸旁側(cè)的核苷酸序列?；旧嫌坞x于細(xì)胞物質(zhì)的蛋白質(zhì)包括具有約30％、20％、10％、5％(干重)雜質(zhì)蛋白的蛋白質(zhì)或多肽制劑。但重組產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其生物活性片段(如催化活性)時(shí)，優(yōu)選的培養(yǎng)基包含少于30％、20％、10％、5％(干重)的化學(xué)前體或非目的蛋白化合物。公開的核苷酸序列的片段和變體及其編碼的蛋白質(zhì)或部分長度的蛋白質(zhì)也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?！捌巍敝傅氖遣糠趾塑账嵝蛄谢虿糠职被嵝蛄?，及其編碼的部分多肽或蛋白質(zhì)。
“標(biāo)記基因”編碼可選擇或可篩選特征。
術(shù)語“成熟”蛋白指翻譯后加工后不具有其信號肽的蛋白質(zhì)?！扒绑w”蛋白指mRNA翻譯的初始產(chǎn)物?！靶盘栯摹敝付嚯牡陌被搜由煨蛄校g后和多肽相連接，形成前體肽，是多肽進(jìn)入分泌途徑所必需的。術(shù)語“信號序列”指編碼信號肽的核苷酸序列。
術(shù)語“天然基因”指存在于未轉(zhuǎn)化細(xì)胞基因組中的基因。
“天然存在”用來描述能夠在自然界中發(fā)現(xiàn)、和人為加工的物體不同的物體。例如，存在于生物(包括病毒)中、能夠從天然材料中分離的蛋白質(zhì)或核苷酸序列，這些序列未經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室中的人為修飾，是天然存在的。
Nov9X和Nov9x互換使用。
術(shù)語“多聚核苷酸”、“核酸”、“多聚核酸”或“多聚核酸片段”指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸及其共聚物，由包含糖、磷酸和堿基的單體(核苷酸)組成，堿基可以是嘌呤或嘧啶。如非特意限制，該術(shù)語包括包含天然核苷酸已知類似物的核酸，這些天然核酸類似物具有和參照核酸類似的結(jié)合特征，和天然存在的核苷酸代謝方式類似。如非另外指明，特定的核酸序列無疑還包括其保守修飾的變體(如簡并密碼子替換)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。具體地說，一個(gè)或多個(gè)選定的(或所有)密碼子的第三個(gè)位置上的堿基替換為混合堿基和/或脫氧肌苷殘基而產(chǎn)生的序列(Batzer et al.，1991；Ohtsuka et al.，1985；Rossolini et al.，1994)。
“核酸片段”是給定核酸分子的一部分。在高等植物中，脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳物質(zhì)，而核糖核酸(RNA)參與將DNA中包含的信息轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)。“基因組”是生物的每個(gè)細(xì)胞中所包含的遺傳物質(zhì)的總體。術(shù)語“核苷酸序列”指單鏈或雙鏈的DNA或RNA多聚物，可選擇性地包含能夠摻入到DNA或RNA多聚物中的合成的、非天然的或改變了的核苷酸堿基。術(shù)語“核酸”或“核酸序列”還可以和基因、cDNA、DNA和基因所編碼的RNA互換使用(Batzeret al.，1991；Ohtsuka et al.，1985；Rossolini et al.，1994)。
將本發(fā)明編碼植酸酶的開放閱讀框?qū)胨拗骷?xì)胞所采用的表達(dá)盒優(yōu)選包含和開放閱讀框可操縱性相連接的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。這種表達(dá)盒可以具有多個(gè)限制性位點(diǎn)，以便插入開放閱讀框和或其他DNA，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和/或選擇標(biāo)記基因。
轉(zhuǎn)錄序列盒包括5’-3’方向的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)、目的DNA序列以及在植物中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。終止區(qū)可以是轉(zhuǎn)錄起始區(qū)天然具有的，可以是目的DNA序列天然具有的，或來自其他來源。對于植物細(xì)胞來說，便于使用的終止區(qū)可以從根瘤土壤桿菌的Ti質(zhì)粒獲得，如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。還參見Guerineau etal.，1991；Proudfoot，1991；Sanfacon et al.，1991；Mogen et al.，1990；Munroe et al.，1990；Ballas et al.，1989；Joshi et al.，1987.
術(shù)語“開放閱讀框”和“ORF”指編碼序列的翻譯起始密碼子和終止密碼子之間的序列所編碼的氨基酸序列。術(shù)語“起始密碼子”和“終止密碼子”指編碼序列中三個(gè)相鄰核苷酸單位(“密碼子”)，分別指定蛋白質(zhì)合成(mRNA翻譯)的起始和鏈終止。
“可操縱性連接”用于核酸時(shí)，指作為同一核酸分子的一部分相連接，使位置和取向適于從啟動(dòng)子處起始轉(zhuǎn)錄?？刹倏v性和啟動(dòng)子相連接的DNA位于啟動(dòng)子“轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控之下”。編碼序列以正義或反義取向可操縱性地和調(diào)控序列相連接。當(dāng)用于多聚核苷酸時(shí)，“可操縱性連接”指作為同一多聚核苷酸的一部分相連接，即通過肽鍵相連接。
“超表達(dá)”指轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或生物中的表達(dá)水平超過正?；蛭崔D(zhuǎn)化細(xì)胞或生物中的表達(dá)水平。
已知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)“PCR”方法包括但不局限于使用成對引物、巢式引物、單特異引物、簡并引物、基因特異引物、載體特異引物、部分錯(cuò)配引物等。還參見Innis et al.，1995；Gelfand，1995和Innisand Gelfand，1999。
“植物組織”包括分化的和未分化的植物組織，包括但不局限于根、莖、芽、葉、花粉、種子、瘤組織和各種形式的細(xì)胞和培養(yǎng)物，如單個(gè)細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚和愈傷組織。植物組織可以是存在于植物或器官中，組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中。
“原代轉(zhuǎn)化體”和“T0代”指和最初轉(zhuǎn)化的組織屬于同一遺傳代的轉(zhuǎn)基因植物(即轉(zhuǎn)化后還沒有經(jīng)過減數(shù)分裂和受精)。
“產(chǎn)品組織”指有不分裂、末端分化的細(xì)胞組成的成熟且可收獲的組織。它不包括由胚系、有絲分裂的、未完全分化的細(xì)胞組成的幼小且正在生長的組織。
“啟動(dòng)子”指通常位于編碼序列上游(5’)的核苷酸序列，它通過提供RNA聚合酶和正確轉(zhuǎn)錄所需的其他因子的識(shí)別位點(diǎn)，控制編碼序列的表達(dá)?！皢?dòng)子”包括基本啟動(dòng)子，它由TATA盒和其他指明轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的序列組成，調(diào)控元件加到基本啟動(dòng)子上控制表達(dá)。“啟動(dòng)子”還指包括基本啟動(dòng)子和調(diào)控元件的核苷酸序列，它能夠控制編碼序列或功能性RNA的表達(dá)。這種類型的啟動(dòng)子序列由臨近的和更遠(yuǎn)的上游元件組成，更遠(yuǎn)的上游元件通常稱為增強(qiáng)子。相應(yīng)地，“增強(qiáng)子”是能夠刺激啟動(dòng)子活性的DNA序列，可以是啟動(dòng)子的固有元件，也可以是插入的、用來增強(qiáng)啟動(dòng)子水平或組織特異性的異源元件。它能夠在兩個(gè)方向(正?；蚍D(zhuǎn)(flipped))上起作用，即使往啟動(dòng)子的上游或下游移動(dòng)后也能夠起作用。增強(qiáng)子和其他上游啟動(dòng)子元件和介導(dǎo)其效應(yīng)的序列特異性DNA結(jié)合蛋白相結(jié)合。啟動(dòng)子可以整體來源于天然基因，或者由來源于自然界中存在的不同啟動(dòng)子的不同元件組成，甚至由合成的DNA片段組成。啟動(dòng)子還可以包含參與結(jié)合蛋白質(zhì)因子的DNA序列，這些蛋白質(zhì)因子對生理或發(fā)育條件產(chǎn)生應(yīng)答，控制轉(zhuǎn)錄起始效率。
上游不活化的條件下無活性或啟動(dòng)子活性大大降低的啟動(dòng)子元件，尤其是TATA元件稱為“基本或核心啟動(dòng)子”。在不存在適當(dāng)?shù)囊粋€(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的條件下，基本啟動(dòng)子發(fā)揮作用，允許轉(zhuǎn)錄。因此“基本或核心啟動(dòng)子”僅包括轉(zhuǎn)錄起始所需的所有基本元件，如TATA盒和/或起始子。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”和“多肽”在這里可以互換使用。
“調(diào)控性啟動(dòng)子”指非組成性、而以時(shí)間和/或空間上調(diào)控的方式指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動(dòng)子，包括組織特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。它包括天然和合成的序列，以及合成和天然序列的組合。不同的啟動(dòng)子可以指導(dǎo)不同組織或細(xì)胞類型、發(fā)育的不同階段或不同環(huán)境條件刺激下的基因表達(dá)。在植物細(xì)胞中有用的各種類型的新啟動(dòng)子不斷地得以發(fā)現(xiàn)，許多例子都可以在Okamuro等(1989)的匯編資料中找到。用于植物中的典型調(diào)控性啟動(dòng)子包括但不局限于safener誘導(dǎo)性啟動(dòng)子、來源于四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)的啟動(dòng)子、來源于水楊酸誘導(dǎo)系統(tǒng)的啟動(dòng)子、來源于乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)系統(tǒng)的啟動(dòng)子、來源于糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)系統(tǒng)的啟動(dòng)子、來源于病原體誘導(dǎo)系統(tǒng)的啟動(dòng)子和來源于蛻皮素誘導(dǎo)系統(tǒng)的啟動(dòng)子。
“調(diào)控序列”和“適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列”各自指位于編碼序列上游(5’非編碼序列)、內(nèi)部或下游(3’非編碼序列)的核苷酸序列，它們影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯。調(diào)控序列包括增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多聚腺苷酸化信號序列。它們包括天然的和合成的序列，以及合成和天然序列的組合序列。正如前面所指出的，術(shù)語“適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列”不局限于啟動(dòng)子。本發(fā)明中用在植物中的一些適當(dāng)調(diào)控序列包括但不局限于組成性植物啟動(dòng)子、植物組織特異性啟動(dòng)子、植物發(fā)育特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)性植物啟動(dòng)子和病毒啟動(dòng)子。
術(shù)語“RNA轉(zhuǎn)錄物”指RNA聚合酶催化DNA序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是DNA序列的完全互補(bǔ)的拷貝時(shí)，稱作原始轉(zhuǎn)錄物；RNA轉(zhuǎn)錄物還可以是來源于原始轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄后加工的RNA序列，稱作成熟RNA?！靶攀筊NA”(mRNA)指不帶有內(nèi)含子、能夠被細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA?！癱DNA”指與mRNA互補(bǔ)且來源于mRNA的單鏈或雙鏈DNA。
“二代轉(zhuǎn)化體”和“T1、T2、T3等代”指原代轉(zhuǎn)化體通過一個(gè)或多個(gè)減數(shù)分裂或受精周期所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。它們可以通過原代轉(zhuǎn)化體或二代轉(zhuǎn)化體自體受精來產(chǎn)生，或者通過將原代轉(zhuǎn)化體或二代轉(zhuǎn)化體和其他轉(zhuǎn)化或未轉(zhuǎn)化的植物相雜交來產(chǎn)生。
“特異性表達(dá)”是局限于一種或幾種植物組織(空間限制)和/或一個(gè)或幾個(gè)植物發(fā)育階段(時(shí)間限制)的基因產(chǎn)物的表達(dá)。得到承認(rèn)的是幾乎沒有絕對的特異性存在啟動(dòng)子似乎優(yōu)選在某些組織中啟動(dòng)，而在其他組織中可以沒有或僅有一點(diǎn)活性。這種現(xiàn)象稱作泄漏表達(dá)。但是，本發(fā)明中的特異性表達(dá)指的是優(yōu)選在一種或幾種植物組織中表達(dá)。
“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”指轉(zhuǎn)化后在選擇培養(yǎng)基上選擇并再生的細(xì)胞。
“3’非編碼序列”指位于編碼序列3’端(下游)的核苷酸序列，包括多聚腺苷酸化信號和編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)控信號的其他序列。多聚腺苷酸化信號的特征通常是影響多聚腺苷酸向mRNA前體的3’末端的加入。Ingelbrecht等(1989)例舉了不同3’非編碼序列的使用。
“組織特異性啟動(dòng)子”指并非在所有的生物細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控性啟動(dòng)子，如不在所有植物細(xì)胞中表達(dá)，而僅在特定器官(如葉和種子)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞類型、特定組織(如胚或子葉)或特定細(xì)胞類型(如葉薄壁組織或種子儲(chǔ)藏細(xì)胞)中表達(dá)的調(diào)控性啟動(dòng)子。這些還包括時(shí)間上受調(diào)控的啟動(dòng)子，如在早期或晚期胚形成中、果實(shí)成熟形成種子或果實(shí)的過程中、完全分化的葉中或開始衰老的時(shí)候。
“轉(zhuǎn)錄停止片段”指包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)控信號如多聚腺苷酸化信號序列、能夠終止轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。例子包括編碼胭脂堿合酶的基因3’非調(diào)控區(qū)和核酮糖二磷酸羧化酶。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指核酸片段向宿主細(xì)胞基因組中轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生遺傳穩(wěn)定的遺傳性。包含轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主細(xì)胞稱為“轉(zhuǎn)基因”細(xì)胞，包含轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的生物稱為“轉(zhuǎn)基因生物”。舉例來說，轉(zhuǎn)化植物和植物細(xì)胞的方法包括土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(De Blaere et al.，1987)和基因槍技術(shù)(Klein et al.，1987；美國專利No.4,945,050)。但是，許多其他的細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法也是本領(lǐng)域已知的?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員所熟知的方法從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生完整的植物(例如參見Frommet al.，1990)。
“轉(zhuǎn)化的”、“轉(zhuǎn)基因的”和“重組體”指已經(jīng)導(dǎo)入異源核酸分子的宿主生物，如植物?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中普遍已知的、Sambrook等，1989中公開的方法將核酸分子穩(wěn)定地整合到基因組中。例如，“轉(zhuǎn)化的”“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)基因的”植物或愈合組織已經(jīng)經(jīng)受轉(zhuǎn)化過程，包含整合到其染色體中的外源基因。術(shù)語“未轉(zhuǎn)化的”指沒有經(jīng)受轉(zhuǎn)化過程的正常植物。
“轉(zhuǎn)基因”指已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入基因組并穩(wěn)定維持的基因。舉例來說，轉(zhuǎn)基因包括對于待轉(zhuǎn)化的特定植物基因來說為異源的或同源的基因。另外，轉(zhuǎn)基因還包括插入到非天然生物中的天然基因或嵌合基因。術(shù)語“內(nèi)源性基因”指存在于生物基因組的天然位置上的天然基因?！巴庠础被蛑刚Ｇ闆r下在宿主生物中不存在，通過基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入的基因。
“轉(zhuǎn)基因植物”是具有包含異源DNA序列的一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞的植物。
“瞬時(shí)表達(dá)“指通過病毒感染或通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔或基因槍轟擊之類的方法導(dǎo)入了的轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中的表達(dá)，但是不選擇其穩(wěn)定的維持狀態(tài)。
術(shù)語“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化”指導(dǎo)入(例如通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或基因槍轟擊之類的方法)的表達(dá)盒、多聚核苷酸或轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中的表達(dá)，但是不選擇其穩(wěn)定的維持狀態(tài)。
術(shù)語“翻譯前導(dǎo)序列”指基因中位于啟動(dòng)子和編碼序列之間、能夠轉(zhuǎn)錄成RNA并存在于完全加工的mRNA翻譯起始密碼子上游(5’)的部分DNA序列。翻譯前導(dǎo)序列影響原始轉(zhuǎn)錄物向mRNA的加工、mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。
“翻譯停止片段”指包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)控信號、能夠終止翻譯的核苷酸序列，如所有三個(gè)框架上的一個(gè)或多個(gè)終止密碼子。將翻譯停止片段插入到編碼序列5’端起始密碼子的附近或臨近部位將停止翻譯或?qū)е洛e(cuò)誤的翻譯。通過位點(diǎn)特異性重組切除翻譯停止片段，會(huì)在編碼序列中留下不干擾使用起始密碼子進(jìn)行正確翻譯的位點(diǎn)特異序列序列。
表現(xiàn)出“植酸酶”活性的多肽或酶，或“植酸酶”涵蓋了能夠影響無機(jī)磷酸鹽或磷從各種肌醇磷酸鹽中釋放的任意酶。這種肌醇磷酸鹽(植酸酶底物)的例子包括植酸及其鹽，如植酸鈉鹽或植酸鉀鹽或混合的鹽。肌醇的單磷酸鹽、二磷酸鹽、三磷酸鹽、四磷酸鹽或五磷酸鹽也可以用作植酸酶的底物。根據(jù)上述定義，使用任意分析方法來測定植酸酶活性，這些分析中使用上述的一種底物。
本發(fā)明的耐熱植酸酶包括來源于特定耐熱植酸酶的突變多肽，這些突變多肽可以通過在天然蛋白質(zhì)的N末端和/或C末端刪除(稱作截短)或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；在天然蛋白質(zhì)的一個(gè)位點(diǎn)上刪除或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；在耐熱植酸酶的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸而獲得。舉例來說，這種變體可以通過人為操作產(chǎn)生。這種操作方法通常是本領(lǐng)域已知的。例如，可以通過DNA中的突變來植被多肽的氨基酸序列變體。誘變和核苷酸序列改變的方法是本領(lǐng)域所熟知的。例如參見Kunkel，1985；Kunkel et al.，1987；美國專利No.4,873,192；Walker和Gaastra，1983和其中所引用的參考文獻(xiàn)。Dayhoff等，1978的模型中對不影響目的蛋白質(zhì)生物活性的適當(dāng)氨基酸替換作了指導(dǎo)，在此引入作為參考。優(yōu)選保守替換，如將一個(gè)氨基酸替換為另一個(gè)具有相似特征的氨基酸。
因此，本發(fā)明的耐熱植酸酶基因和核苷酸序列包括天然存在的序列，以及突變的序列。類似的，本發(fā)明的耐熱植酸酶多肽包括天然存在的蛋白質(zhì)及其突變和修飾形式。這種變體仍具有所需的活性。這里多肽序列的缺失、插入和替換并不希望發(fā)生多肽特征中的基本改變。但是，當(dāng)難以提前預(yù)測替換、缺失或插入的確切效應(yīng)時(shí)，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員明白可以通過常規(guī)的篩選分析來評價(jià)這種效應(yīng)。
本發(fā)明的核酸分子已經(jīng)過優(yōu)化，以增強(qiáng)在目的生物中的表達(dá)。對于植物來說，例如參見EPA035472；WO 91/16432；Perlak et al.，1991和Murray et al.，1989。通過這種方式，可以使用植物的優(yōu)先密碼子來合成基因或基因片段。例如參見Campbell和Gowri，1990對宿主優(yōu)先密碼子慣用性的討論。人們認(rèn)識(shí)到可以優(yōu)化或合成全部或部分基因序列。也就是說，還可以使用合成的或部分優(yōu)化的序列。突變核苷酸序列和蛋白質(zhì)還包括來源于諸如DNA改組之類誘變或重組生成方法的序列和蛋白質(zhì)。使用這種方法，可以對一個(gè)或多個(gè)不同的編碼序列進(jìn)行操作，產(chǎn)生具有所需特征的新的多肽。通過這種方式，從相關(guān)序列多聚核苷酸的群體產(chǎn)生重組多聚核苷酸文庫，其中相關(guān)序列多聚核苷酸內(nèi)群體包括具有基本序列相同性的序列區(qū)域，可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行同源重組。這種DNA改組的方法是本領(lǐng)域所已知的。例如參見Stemmer，1994；Stemmer，1994；Crameri et al.，1997；Moore et al.，1997；Zhang et al.，1997；Crameri et al.，1998，以及美國專利Nos.5,605,793和5,837,458。
“變體”指基本上相似的序列。對于核苷酸序列來說，變體包括由于遺傳密碼子的簡并性而編碼和參照蛋白質(zhì)的氨基酸序列相同的核苷酸序列。這些天然存在的等位變體可以使用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定，例如使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)進(jìn)行鑒定。變體核苷酸序列也包括合成的核苷酸序列，諸如通過對編碼參照蛋白質(zhì)的序列以及編碼具有氨基酸替換的多肽的序列進(jìn)行定點(diǎn)誘變所產(chǎn)生的核苷酸序列。通常，本發(fā)明的核苷酸序列變體將具有和天然核苷酸序列相比至少40％、50％、60％，優(yōu)選70％，較優(yōu)選80％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選99％，以及在這些分級的基礎(chǔ)上增加一個(gè)百分單位的相同性。例如，71％、72％、73％等，直至至少90％級別。變體還可以包括和鑒定到的基因片段相對應(yīng)的全長基因。
“載體”包括雙鏈或單鏈、線形或環(huán)形、能夠或不能夠自我轉(zhuǎn)移或移動(dòng)、能夠通過整合到細(xì)胞基因組上或存在于染色體外(帶有復(fù)制起點(diǎn)的自主復(fù)制質(zhì)粒)的方式轉(zhuǎn)化原核或真核宿主的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或土壤桿菌雙元載體。
本發(fā)明的優(yōu)選構(gòu)建體和宿主細(xì)胞本發(fā)明優(yōu)選提供表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括能夠指導(dǎo)編碼耐熱植酸酶的多聚核苷酸在體外或體內(nèi)表達(dá)的核酸序列(啟動(dòng)子)。如這里下文所述，本發(fā)明優(yōu)選的多聚核苷酸作了優(yōu)化，能夠在特定的生物，如植物中表達(dá)。制備和/或鑒定耐熱植酸酶的方法包括誘變，如遞歸(recursive)誘變和/或選擇或篩選在高于60℃的溫度下具有活性的植酸酶。誘變和核苷酸序列突變的方法是本領(lǐng)域所熟知的。例如參見Kunkel，1985；Kunkel et al.，1987；美國專利No.4,873,192；Walker andGaastra，1983和其中所引用的參考文獻(xiàn)以及Arnold et al.，1996。一旦鑒定到了編碼耐熱植酸酶的多聚核苷酸，就將多聚核苷酸的序列加以優(yōu)化。優(yōu)化核酸片段在特定生物中表達(dá)的方法是本領(lǐng)域中所熟知的。簡要地說，獲得靶生物使用最佳密碼子的密碼子慣用性表，選擇最佳密碼子置換靶多聚核苷酸中的密碼子，然后化學(xué)合成優(yōu)化的序列。美國專利No.5,625,136中介紹了玉米的優(yōu)先密碼子。
用于轉(zhuǎn)化的DNA和宿主細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的載體、質(zhì)粒、粘粒、YAC(酵母人造染色體)、BAC(細(xì)菌人造染色體)和DNA片段通常包含人們需要導(dǎo)入細(xì)胞的、編碼植酸酶的DNA以及cDNA、基因或多個(gè)基因之類的其他DNA。這些DNA構(gòu)建體可以進(jìn)一步包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多接頭之類的結(jié)構(gòu)，必要時(shí)甚至包括調(diào)控基因。選擇導(dǎo)入細(xì)胞的其中一個(gè)DNA片段或基因經(jīng)常編碼在產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化(重組)細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)，產(chǎn)生一個(gè)可篩選的或可選擇的特征，和/或改善轉(zhuǎn)化細(xì)胞和/或從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生的植物的一個(gè)表型。但是，情況并非總是如此，本發(fā)明還包括含有非表達(dá)性轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和植物。
用來導(dǎo)入細(xì)胞的DNA包括來源于或自任意材料分離的DNA，隨后分析其結(jié)構(gòu)、大小和/或功能，化學(xué)改變，之后導(dǎo)入植物中。舉例來說，“來源于”一種材料的DNA是鑒定為能夠用在給定生物中的DNA序列，該序列能夠以基本純化的形式化學(xué)合成。舉例來說，“分離自”一種材料的DNA是通過化學(xué)手段從所述材料切除或去除的有用DNA序列。這些化學(xué)手段可以是使用限制性內(nèi)切酶，以便對其進(jìn)行進(jìn)一步操作；也可以通過基因工程方法進(jìn)行擴(kuò)增，用于本發(fā)明。這種DNA通常稱為“重組DNA”。
因此有用的DNA包括全合成的DNA、半合成的DNA、分離自生物材料的DNA和來源于導(dǎo)入之RNA的DNA。通常，導(dǎo)入的DNA最初不存在于作為DNA接受者的基因型中，但是從給定基因型分離基因、隨后將多拷貝的基因?qū)胪换蚪M來增強(qiáng)給定基因產(chǎn)物的生成屬于本發(fā)明的范圍。
導(dǎo)入的DNA包括但不局限于來源于植物基因的DNA和來源于非植物基因的DNA，如來源于細(xì)菌、酵母、真菌、動(dòng)物或病毒。導(dǎo)入的DNA可以包括修飾的或合成的基因，部分基因或嵌合基因，包括來自相同或不同基因型的基因。術(shù)語“嵌合基因”或“嵌合DNA”指由至少兩個(gè)DNA序列或片段組成的基因或DNA序列或片段，提供DNA序列或片段在天然條件下并不合并DNA，或者DNA序列或片段的定位或連接方式在未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的天然基因組中是非正常發(fā)生的。
這里用作轉(zhuǎn)化的導(dǎo)入DNA可以是環(huán)形或線形、雙鏈或單鏈的。通常，DNA以嵌合DNA，如還包括編碼區(qū)的質(zhì)粒DNA，其中編碼區(qū)旁側(cè)具有啟動(dòng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中重組DNA表達(dá)的調(diào)控序列。例如，DNA可以自身包含或包括在細(xì)胞中活化的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子來源于該細(xì)胞之外的其他材料，還可以使用轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞中已經(jīng)存在的啟動(dòng)子。
通常，導(dǎo)入的DNA相當(dāng)小，小于30kb，使其對物理、化學(xué)或酶降解的敏感性降至最低，這是因?yàn)檫@種敏感性隨著DNA大小的增加而增加。導(dǎo)入細(xì)胞的蛋白質(zhì)、RNA轉(zhuǎn)錄物或其混合物的數(shù)目優(yōu)選提前選擇，限定形成1至約5～10個(gè)導(dǎo)入DNA的這種產(chǎn)物。
適當(dāng)表達(dá)載體的選擇將依賴于宿主細(xì)胞。典型地，一個(gè)表達(dá)載體包含(1)編碼細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的原核DNA元件，和用于在細(xì)菌宿主中擴(kuò)增和選擇表達(dá)載體的抗生素抗性基因；(2)控制轉(zhuǎn)錄起始的DNA元件，如啟動(dòng)子；(3)控制轉(zhuǎn)錄物加工的DNA元件，如內(nèi)含子、轉(zhuǎn)錄終止/多聚腺苷酸化序列；和(4)可操縱性與控制轉(zhuǎn)錄起始的DNA元件相連接的目的基因。使用的表達(dá)載體可以是能夠在上述宿主中自主復(fù)制的表達(dá)載體，也可以是能夠整合到染色體中的表達(dá)載體，其起初在促使相連植酸酶基因轉(zhuǎn)錄的位置上包含一個(gè)啟動(dòng)子。
如果細(xì)菌之類的原核生物用做宿主，植酸酶的表達(dá)載體優(yōu)選能夠在微生物中自主復(fù)制的表達(dá)載體，包含啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、新的植酸酶基因和轉(zhuǎn)錄終止序列。載體還可以包含調(diào)控該啟動(dòng)子的基因。
Gruber等(1993)對植物表達(dá)載體和報(bào)道基因作了一般介紹。
哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可以包含復(fù)制起點(diǎn)、適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和增強(qiáng)子和必要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’旁側(cè)非轉(zhuǎn)錄序列。
舉例來說，適當(dāng)?shù)妮d體包括細(xì)菌載體pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBluescript II(Statagene)、pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真核細(xì)胞載體pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。舉例來說，商品化的載體包括例如pKK223-3(Pharmacia精細(xì)化學(xué)試劑，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，Wis.，USA)。但是，也可以是其他的質(zhì)粒或載體，只要這些質(zhì)?；蜉d體能夠在宿主中復(fù)制和存活。
在某些實(shí)施方案中，在單子葉植物轉(zhuǎn)化中可以考慮采用有復(fù)制能力的病毒載體。舉例來說，這些載體包括小麥矮小病毒(WDV)“穿梭”載體，如pW1-11和pW1-GUS(Ugaki et al.，1991)。這些載體能夠在玉米細(xì)胞以及大腸桿菌中自主復(fù)制，這樣將增加檢測轉(zhuǎn)運(yùn)至轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中DNA的靈敏性。復(fù)制載體還可用來運(yùn)送旁側(cè)帶有來自于Ac、Ds或Mu之類轉(zhuǎn)座元件的DNA序列的基因。還可考慮使用轉(zhuǎn)座元件來導(dǎo)入DNA片段，該DNA片段缺少選擇和維持細(xì)菌中質(zhì)粒載體所必需的元件，如抗生素抗性基因和DNA復(fù)制起點(diǎn)。還建議使用Ac、Ds或Mu之類的轉(zhuǎn)座元件，這些元件能夠活躍地驅(qū)動(dòng)DNA的整合，從而增加穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞出現(xiàn)的頻率。
適當(dāng)宿主的代表性例子如下細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌、枯草桿菌；和埃希桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷菌屬、鏈霉菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、芽孢桿菌屬、微桿菌屬和葡萄球菌屬中的各個(gè)物種，但也可以選用其他屬的物種；屬于曲霉屬、根霉菌屬、木霉屬、鏈孢霉屬、毛霉菌屬、青霉屬等的真菌細(xì)胞；屬于克魯維酵母菌屬、酵母屬、裂殖酵母屬、毛孢子菌屬、許旺酵母菌屬的酵母；諸如果蠅S2和夜蛾Sf9之類的昆蟲細(xì)胞；諸如CHO、COS或黑色素瘤、C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細(xì)胞系之類的動(dòng)物細(xì)胞；植物細(xì)胞，等等。可以使用任意宿主，只要它能夠表達(dá)目的基因。
從本發(fā)明可以看出，本發(fā)明中采用的載體構(gòu)建方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的(參見Sambrook et al.，1989；Gelvin et al.，1990)。
本發(fā)明的表達(dá)盒可以包含一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)，使得編碼耐熱植酸酶的多聚核苷酸位于調(diào)控序列的調(diào)控之下。該表達(dá)盒還可以包含和多聚核苷酸可操縱性相連接的終止信號，以及多聚核苷酸正確翻譯所必需的調(diào)控序列。包含本發(fā)明多聚核苷酸的表達(dá)盒可以是嵌合的，意思是其至少一個(gè)組分和其他組分中的至少一個(gè)是異源的。表達(dá)盒中多聚核苷酸的表達(dá)可以位于組成性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)性啟動(dòng)子、調(diào)控性啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、病毒啟動(dòng)子或合成啟動(dòng)子的調(diào)控之下。
表達(dá)盒可以包括5’-3’方向的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)、本發(fā)明的多聚核苷酸和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)，它們在體內(nèi)或體外具有功能。終止區(qū)可以是轉(zhuǎn)錄起始區(qū)天然配套的，或者來源于其他的材料。
調(diào)控序列可以位于編碼序列的上游(5’非編碼序列)、內(nèi)部(內(nèi)含子)或下游(3’非編碼序列)，影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工和穩(wěn)定性和/或翻譯。調(diào)控序列可以包括但不局限于增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多聚腺苷酸化信號序列。它們可以包括天然序列和合成序列，以及合成序列和天然序列的組合序列。
用在本發(fā)明中的載體還包括用于擴(kuò)增表達(dá)的適當(dāng)序列。
調(diào)控序列啟動(dòng)子是一種核苷酸序列，它通過提供正確轉(zhuǎn)錄所需的RNA聚合酶和其他因子的識(shí)別位點(diǎn)來控制編碼序列表達(dá)。啟動(dòng)子包括基本啟動(dòng)子，它僅由轉(zhuǎn)錄起始所需的所有基本元件組成，如TATA盒和/或起始子，由TATA盒和其他指明轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的序列組成，調(diào)控元件加到基本啟動(dòng)子上控制表達(dá)。啟動(dòng)子可以全部來自于天然基因，或者由來自自然界中不同啟動(dòng)子的不同元件組成，甚至由合成的DNA片段組成。啟動(dòng)子可以包含參與結(jié)合蛋白質(zhì)因子的DNA序列，這些序列對生理或發(fā)育條件作出應(yīng)答，控制轉(zhuǎn)錄起始效率。啟動(dòng)子還包括基本啟動(dòng)子和一個(gè)或多個(gè)調(diào)控元件，該調(diào)控元件能夠控制編碼序列或功能性RNA的表達(dá)。這種類型的啟動(dòng)子序列由臨近的和更遠(yuǎn)的上游元件組成，后者通常稱為增強(qiáng)子。
代表性的啟動(dòng)子包括但不局限于能夠在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中控制基因表達(dá)的啟動(dòng)子。具體的細(xì)菌啟動(dòng)子包括大腸桿菌的lac或trp，λ噬菌體PL啟動(dòng)子、lacI、lacZ、T3、T7、gpt和λPR。真核啟動(dòng)子包括CMV即早啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR和小鼠金屬硫蛋白-I啟動(dòng)子。另外，還可以將人CMV中IE基因的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子一起使用。
可以將能夠在酵母宿主中表達(dá)的任意啟動(dòng)子用作啟動(dòng)子。其例子包括己糖激酶基因的啟動(dòng)子和糖酵解途徑中的類似啟動(dòng)子，gal 1啟動(dòng)子、gal 10啟動(dòng)子、熱休克蛋白啟動(dòng)子、MFα-1啟動(dòng)子和CUP 1啟動(dòng)子。
可以使用能夠在發(fā)酵真菌中表達(dá)的啟動(dòng)子。例子是淀粉或纖維素強(qiáng)誘導(dǎo)性的啟動(dòng)子、如曲霉屬葡糖淀粉酶或α-淀粉酶或者木霉屬纖維素酶(纖維二糖水化酶(cellobiohydrase))的啟動(dòng)子，糖酵解途徑中酶的啟動(dòng)子，如磷酸甘油酸激酶(pgk)和甘油醛-3磷酸脫氫酶(gpd)等的啟動(dòng)子。
植物啟動(dòng)子區(qū)有幾個(gè)結(jié)構(gòu)域是啟動(dòng)子完全發(fā)揮功能所必需的。其中的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域緊鄰著結(jié)構(gòu)基因的上游，形成包含共有序列的“核心啟動(dòng)子區(qū)”，正常情況下是基因即上游的70個(gè)堿基對。核心啟動(dòng)子區(qū)包含特征性CAAT和TATA盒及其周圍序列，代表限定結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄起始序列。
核心啟動(dòng)子區(qū)的存在是將一個(gè)序列定義為啟動(dòng)子的標(biāo)記如果該區(qū)域缺失，則啟動(dòng)子不具有功能。另外，核心啟動(dòng)子不足以提供完全的啟動(dòng)子活性。核心上游的一系列調(diào)控序列組成啟動(dòng)子的其余部分。調(diào)控序列決定表達(dá)水平，表達(dá)的空間效應(yīng)和時(shí)間模式，對于重要的啟動(dòng)子亞組來說，還決定誘導(dǎo)條件下的表達(dá)(諸如光、溫度、化合物、激素之類外界因子的調(diào)控)。
已知一系列天然存在的啟動(dòng)子能夠在植物中起作用，已經(jīng)用于驅(qū)動(dòng)植物中異源(外源和內(nèi)源)基因的表達(dá)例如，組成性35S花椰菜花葉病毒(CaMV)啟動(dòng)子、成熟增強(qiáng)的番茄多聚半乳糖醛酸酶啟動(dòng)子(Bird et al.，1988)、E8啟動(dòng)子(Diekman & Fischer，1988)和果實(shí)特異性2A1啟動(dòng)子(Pear et al.，1989)和其他許多啟動(dòng)子。
調(diào)控表達(dá)的兩個(gè)主要方法是已知的，即超表達(dá)和表達(dá)不足。通過插入一個(gè)或多個(gè)額外拷貝的選定基因可以實(shí)現(xiàn)超表達(dá)。但是，尚不清楚最初轉(zhuǎn)化有一個(gè)或多個(gè)額外拷貝核苷酸序列的植物或其子代是表現(xiàn)為表達(dá)不足的效應(yīng)還是超表達(dá)效應(yīng)。對于表達(dá)不足來說存在有兩個(gè)主要方法，本領(lǐng)域中通常稱為“反義下調(diào)”和“正義下調(diào)”(正義下調(diào)也稱“共阻遏”)。一般來說，這些方法稱為“基因沉默”。這兩種方法都對靶基因的表達(dá)具有抑制作用。
在適當(dāng)植物組織中實(shí)現(xiàn)足夠水平轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是產(chǎn)生遺傳改造作物的一個(gè)重要方面。異源DNA序列在植物宿主中的表達(dá)依賴于操縱性相連接的、在植物宿主中具有功能的啟動(dòng)子的存在。啟動(dòng)子序列的選擇將決定異源DNA序列在生物中表達(dá)的時(shí)間和部位。
因此，用于指導(dǎo)給定轉(zhuǎn)基因表達(dá)的啟動(dòng)子的選擇是關(guān)鍵性的。用于植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)的啟動(dòng)子包括誘導(dǎo)性的、病毒的、合成的、組成性的(Odell et al.，1985)、時(shí)間上受調(diào)控的、空間上受調(diào)控的、組織特異性的以及時(shí)間-空間上受調(diào)控的啟動(dòng)子。
當(dāng)需要在特定組織和器官中表達(dá)時(shí)，可以使用組織特異性啟動(dòng)子。相比之下，當(dāng)需要在刺激物的刺激下進(jìn)行基因表達(dá)時(shí)，誘導(dǎo)性啟動(dòng)子是首選的調(diào)控元件。當(dāng)需要在植物的所有細(xì)胞中進(jìn)行持續(xù)表達(dá)時(shí)，則使用組成性啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)化載體的表達(dá)構(gòu)建體中還何以包括核心啟動(dòng)子序列上游和/或下游的其他調(diào)控序列，使異源核苷酸序列在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平不同。
已經(jīng)介紹了具有不同表達(dá)特征的許多植物啟動(dòng)子。已經(jīng)介紹的一些組成性啟動(dòng)子包括水稻肌動(dòng)蛋白1(Wang et al.，1992；美國專利No.5,641,876)、CaMV 35S(Odell et al.，1985)、CaMV 19S(Lawton etal.，1987)、蔗糖合酶和泛素啟動(dòng)子。
已經(jīng)介紹的組織特異性啟動(dòng)子包括植物凝集素(Vodkin，1983；Lindstrom et al.，1990)、玉米醇脫氫酶1(Vogel et al.，1989；Dennis etal.，1984)、玉米集光復(fù)合體(Simpson，1986；Bansal et al.，1992)、玉米熱休克蛋白(Odell et al.，1985)、豌豆RuBP羧化酶小亞基(Poulsenet al.，1986；Cashmore et al.，1983)、Ti質(zhì)粒甘露糖醇合酶(Langridgeet al.，1989)、Ti質(zhì)粒胭脂堿合酶(Langridge et al.，1989)、矮牽牛屬植物查爾酮異構(gòu)酶(vanTunen et al.，1988)、蠶豆甘氨酸富含蛋白1(Keller et al.，1989)、截短的CaMV 35s(Odell et al.，1985)、土豆塊莖蛋白patatin(Wenzler et al.，1989)、根細(xì)胞(Yamamoto et al.，1990)、玉米醇溶蛋白(Reina et al.，1990；Kriz et al.，1987；Wandeltet al.，1989；Langridge et al.，1983；Reina et al.，1990)、球蛋白-1(Belanger et al.，1991)、α-微管蛋白、cab(Sullivan et al.，1989)、REPCase(Hudspeth & Grula，1989)、R基因復(fù)合物相關(guān)啟動(dòng)子(Chandler et al.，1989)和查爾酮合酶啟動(dòng)子(Franken et al.，1991)。
已經(jīng)介紹的誘導(dǎo)性啟動(dòng)子包括ABA誘導(dǎo)性和膨脹誘導(dǎo)性啟動(dòng)子、生長素結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子(Schwob et al.，1993)、UDP葡萄糖黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子(Ralston et al.，1988)、MPI蛋白質(zhì)抑制因子啟動(dòng)子(Cordero et al.，1994)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子(Kohler et al.，1995；Quigley et al.，1989；Martinez et al.，1989)。
已經(jīng)報(bào)道了植物中的幾個(gè)組織特異性受調(diào)控的基因和/或啟動(dòng)子。它們包括編碼種子貯存蛋白(如napin、cruciferin、β-conglycinin、菜豆球蛋白)、醇溶蛋白或油體蛋白(如油質(zhì)蛋白)的基因，或參與脂肪酸生物合成(包括?；d體蛋白、硬脂酰-ACP脫氫酶及脂肪酸脫氫酶(fad2-1))的基因以及其它在胚發(fā)育期間表達(dá)的基因(如Bce4，可可參見EP255378和Kridl等，1991)。對幼苗特異性表達(dá)非常有用的是豌豆球蛋白啟動(dòng)子(Czako等，1992)。(也參見美國專利NO.5,625,136，其內(nèi)容在此引入作為參考)。其他對于成熟葉中表達(dá)的有用啟動(dòng)子為衰老發(fā)生時(shí)啟動(dòng)的啟動(dòng)子，如來自于擬南芥的SAG啟動(dòng)子(Gan等，1995)。
美國專利NO.4,943,674討論了果實(shí)發(fā)育過程中，至少到果實(shí)開始成熟前表達(dá)的一類果實(shí)特異性啟動(dòng)子，其公開的內(nèi)容在此引入作為參考。優(yōu)先表達(dá)于棉纖維的cDNA克隆也已分離出來(John等，1992)。來自于番茄并在果實(shí)發(fā)育期間表達(dá)有差異的cDNA克隆也分離出來并得以鑒定(Mansson等，1985，Slater等，1985)。果實(shí)成熟過程中多聚半乳糖醛酸酶基因的啟動(dòng)子處于活化狀態(tài)。多聚半乳糖醛酸酶基因在美國專利NO.4,535,060、4,769,061、4,801,590及5,107,065均作了描述，其內(nèi)容在此引入作為參考。
組織特異性啟動(dòng)子的其他實(shí)例包括葉子創(chuàng)傷(如咀嚼昆蟲造成的創(chuàng)傷)后指導(dǎo)葉細(xì)胞中基因表達(dá)的啟動(dòng)子及指導(dǎo)結(jié)節(jié)(如patatin基因啟動(dòng)子)和纖維細(xì)胞中(E6是發(fā)育調(diào)控的纖維蛋白的實(shí)例之一(John等，1992))基因表達(dá)的啟動(dòng)子。雖然在葉、胚珠及花發(fā)現(xiàn)有低水平的E6轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，此基因在纖維中最為活躍。
一些“組織特異性”啟動(dòng)子的組織特異性可能并不是絕對的，本領(lǐng)域內(nèi)的熟練技術(shù)人員可以用白喉毒素序列加以檢驗(yàn)。也可將不同的組織特異性啟動(dòng)子聯(lián)用獲得帶有“泄漏”表達(dá)的組織特異性表達(dá)(Beals等，1997)。本領(lǐng)域內(nèi)的熟練技術(shù)人員可分離出其他組織特異性啟動(dòng)子(參見美國專利NO.5,589,379)。
最終，對于導(dǎo)入到單子葉基因組來說，最理想的DNA片段可能是編碼所需性狀(如蛋白、脂類或淀粉的水解)并引入至處于全新啟動(dòng)子或增強(qiáng)子控制之下的同源基因或基因家族，甚或是同源或組織特異性(如根、軸環(huán)/鞘、輪生體、莖、earshank、核心或葉特異性)的啟動(dòng)子或調(diào)控元件。實(shí)際上，可以想象得出本發(fā)明的具體用途之一將是以組成型或誘導(dǎo)型方式對一基因進(jìn)行打靶。
對于轉(zhuǎn)基因植物中組織特異性基因打靶來說，可用的載體典型地包括組織特異性啟動(dòng)子，還可能包括諸如增強(qiáng)子序列等其他組織特異性的調(diào)控元件。根據(jù)本發(fā)明所公布的內(nèi)容，指導(dǎo)基因在某些組織中特異或增強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子對于本領(lǐng)域內(nèi)的熟練技術(shù)人員來說將變得眾所周知。例如，這些啟動(dòng)子包括綠色組織特異性的rbcS啟動(dòng)子，在根部或受傷葉組織中具有更高活性的ocs、nos及mas啟動(dòng)子，指導(dǎo)基因在根部增強(qiáng)表達(dá)的截短(-90～+8)35S啟動(dòng)子，指導(dǎo)基因在根部表達(dá)的α-微管蛋白基因，以及來自于玉米儲(chǔ)存蛋白基因、指導(dǎo)基因在胚乳中表達(dá)的啟動(dòng)子。
將組成性表達(dá)的基因(所有組織中均表達(dá))與一反義基因共同引入可以實(shí)現(xiàn)功能性的組織特異性表達(dá)，其中該反義基因僅在所述基因不需要表達(dá)的組織中表達(dá)。例如，可將編碼脂肪酶的基因加以引入以便它可利用來自于菜花樣花葉病毒的35S啟動(dòng)子在所有組織中表達(dá)。例如利用玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子使脂肪酶基因的反義轉(zhuǎn)錄物在玉米核中表達(dá)，將阻止脂肪酶蛋白在種子中蓄積。因此，所導(dǎo)入基因編碼的蛋白將在除了核之外的所有組織中存在。
轉(zhuǎn)基因植物中某一基因的表達(dá)可能僅在該植物發(fā)育的一定時(shí)期內(nèi)是需要的。發(fā)育同步常與組織特異基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)。例如，玉米儲(chǔ)存蛋白約在授粉15天后開始在胚乳中表達(dá)。
有數(shù)種誘導(dǎo)性啟動(dòng)子在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。Gatz(1996)對其中的許多均作了回顧(也參見Gatz，1997)。這些實(shí)例包括四環(huán)素阻遏子系統(tǒng)、Lac阻遏子系統(tǒng)、銅誘導(dǎo)系統(tǒng)、水楊酸鹽誘導(dǎo)系統(tǒng)(如PPR1a系統(tǒng))、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)系統(tǒng)(Aoyama T等，1997)和蛻皮激素誘導(dǎo)系統(tǒng)。苯硫胺誘導(dǎo)系統(tǒng)(NO.5364,780號美國專利)、醇誘導(dǎo)系統(tǒng)(WO 97/06269及WO 97/06268)及谷光甘肽S轉(zhuǎn)化酶啟動(dòng)子也包含在內(nèi)。在多細(xì)胞生物的情況一，啟動(dòng)子也可對特定組織、器官或發(fā)育階段來說是特異的。此類啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于玉米ADP-gpp和玉米γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子。
其他研究集中于對諸如鹽度升高、干旱、病原體及創(chuàng)傷(Graham等，1985，Graham等，1985，Smith等，1986)之類環(huán)境應(yīng)激或刺激產(chǎn)生應(yīng)答發(fā)生誘導(dǎo)性調(diào)控的基因。據(jù)報(bào)道受傷土豆植物葉中有金屬羧肽酶抑制蛋白蓄積(Graham等，1981)。也有報(bào)道甲基茉莉酮酸酯、激發(fā)子(elicitor)、熱休克、厭氧性應(yīng)激或除草劑安全劑等均可誘導(dǎo)其他基因表達(dá)。
嵌合反式作用病毒復(fù)制蛋白的調(diào)控表達(dá)可為其他基因策略進(jìn)一步調(diào)控。例如，Odell等1990所述Cre介導(dǎo)的基因活化。因而，Cre-介導(dǎo)的激動(dòng)可去除包含在啟動(dòng)子和復(fù)制蛋白編碼區(qū)間以lox位點(diǎn)連接的3’調(diào)控序列、阻止嵌合復(fù)制基因表達(dá)的DNA片段，使所述反式作用復(fù)制基因得以表達(dá)。在此情況下，嵌合Cre基因、嵌合反式作用復(fù)制基因或二者均可處于組織特異性或發(fā)育特異性或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的調(diào)控之下。另一種基因策略是使用tRNA抑制子基因。例如，如Ulmasov等，1997所述，tRNA抑制子基因的調(diào)控性表達(dá)可在一定條件下調(diào)控反式作用復(fù)制蛋白的表達(dá)，其中該復(fù)制蛋白基因編碼含有合適終止子的序列。同樣，嵌合tRNA抑制子基因、嵌合反式作用復(fù)制基因或二者均可處于組織特異性或發(fā)育特異性或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的調(diào)控之下。
除了使用特別的啟動(dòng)子之外，其他類型的元件也可影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。特別是內(nèi)含子已證明具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的潛能。例如，Callis等(1987)報(bào)道，來自于玉米乙醇脫氫酶基因的內(nèi)含子，可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。類似的，Vasil等(1989)報(bào)道來自于玉米蔗糖合酶基因的內(nèi)含子具有類似的增強(qiáng)表達(dá)活性。大米肌動(dòng)蛋白第一內(nèi)含子已廣泛用于在大量不同的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)(McElroy等，1991)。
其他元件包括可被內(nèi)源性物質(zhì)或外源性物質(zhì)如鋅指蛋白等調(diào)控的元件，鋅指蛋白包括天然存在的鋅指蛋白或嵌合鋅指蛋白。參見NO.5,789,538號美國專利、WO 99/48909、WO 99/45132、WO 98/53060、WO 98/53057、WO 98/53058、WO 00/23464、WO 95/19431和WO98/54311等專利。
增強(qiáng)子是可刺激啟動(dòng)子活性的DNA序列，可以是該啟動(dòng)子所固有的元件，也可以是為增強(qiáng)特定啟動(dòng)子的表達(dá)水平或組織特異性而插入的異源元件。增強(qiáng)子可以在兩個(gè)方向上操縱(相對于基因目的編碼序列的5’到3’及3’到5’)，甚至移到啟動(dòng)子的上游或下游時(shí)仍可起作用。所有增強(qiáng)子及其他上游啟動(dòng)子元件與介導(dǎo)其效應(yīng)的序列特異性DNA結(jié)合蛋白發(fā)生結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明，所用載體可構(gòu)建成包含ocs增強(qiáng)子元件。此元件起初鑒定為一種來自于土壤桿菌章魚堿合酶(ocs)基因的16bp回文增強(qiáng)子(Ellis等，1987)，至少在其他10種啟動(dòng)子中均存在該增強(qiáng)子(Bouchez等，1989)。當(dāng)在單子葉轉(zhuǎn)化等情況下應(yīng)用時(shí)，使用諸如ocs元件之類的增強(qiáng)子元件尤其是該元件的多拷貝，可以提高起自鄰近啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平。
本發(fā)明的構(gòu)建體也包括帶3’端DNA序列的目的基因，該3’端DNA序列提供轉(zhuǎn)錄終止的信號并使得產(chǎn)生的mRNA可以聚腺苷酸化。用于植物的優(yōu)選3’元件包括來自于根瘤土壤桿菌胭脂堿合酶基因(Bevan等，1983)、來自于瘤土壤桿菌章魚堿合酶基因T7轉(zhuǎn)錄物終止子以及來自于土豆或番茄蛋白酶抑制劑I或II基因3’末端的3′元件。必要時(shí)，還可進(jìn)一步包括諸如Adh內(nèi)含子1(Callis等，1987)、蔗糖合酶內(nèi)含子(Vasil等，1989)或TMV Ω元件(Gallie等，1989)的調(diào)控性元件。植物終止區(qū)域可方便地使用來自于根瘤土壤桿菌Ti質(zhì)粒的終止區(qū)，如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)域。也可參見Guerineau等(1991)、Proudfoot等(1991)、Sanfacon等(1991)、Mogen等(1990)、Munroe等(1990)、Ballas等(1989)、Joshi等(1987)。
此外，在轉(zhuǎn)基植物細(xì)胞中進(jìn)行特定基因產(chǎn)物的細(xì)胞內(nèi)打靶或指導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境時(shí)可以構(gòu)建及采用載體。通常通過將編碼某一輸送或信號肽序列的DNA序列與特定基因的編碼序列連接起來構(gòu)建這樣的載體。所得輸送肽或信號肽將分別把該蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到一特定的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外目的地，然后本身發(fā)生翻譯后切除。輸送肽或信號肽通過促進(jìn)蛋白穿過諸如液泡、囊泡、質(zhì)體、線粒體膜等細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)，或指導(dǎo)蛋白穿過細(xì)胞外膜來起作用。在植物中，信號序列可將聚核苷酸編碼的多肽導(dǎo)向植物內(nèi)特定的腔室。這樣的目的地實(shí)例包括但不限于液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體或淀粉顆粒。將蛋白導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并分泌入質(zhì)外體的玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信號序列是一個(gè)此類信號肽實(shí)例(Torrent等，1997)。另一信號肽為將多肽固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的SEKDEL氨基酸序列(Munro和Pelham，1987)。通過與蠟質(zhì)基因造粉體靶向肽融合(Klosgen等，1986)，也可將多肽導(dǎo)向到造粉體或淀粉顆粒。
例如，將引入的DNA導(dǎo)向到核可能是有用的，因?yàn)檫@樣可以提高轉(zhuǎn)化的效率。為了實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合，在核本身內(nèi)部對基因進(jìn)行導(dǎo)向很有用。例如，將基因取代細(xì)胞中已存在基因?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)化而使基因得以引入將是有用的。
既然轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和編碼序列的起始位點(diǎn)之間的DNA序列，即未翻譯的前導(dǎo)序列，可以影響基因表達(dá)，可考慮采用特別的前導(dǎo)序列。優(yōu)選前導(dǎo)序列應(yīng)該包括含預(yù)計(jì)可指導(dǎo)所連接基因最優(yōu)表達(dá)之序列的序列，即包括可提高或維持mRNA穩(wěn)定性并阻止不合時(shí)宜之翻譯啟動(dòng)的一致前導(dǎo)序列。根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，選擇這樣的序列對于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說是熟知的。最優(yōu)選那些源自于植物中高表達(dá)基因的序列。
標(biāo)記基因?yàn)榱颂岣哞b別轉(zhuǎn)化體的能力，可能需要采用選擇或篩選標(biāo)記基因作為目的可表達(dá)基因或其附加基因?！皹?biāo)記基因”是將截然不同的表型傳給表達(dá)該標(biāo)記基因的細(xì)胞，并可使轉(zhuǎn)化細(xì)胞與不含該標(biāo)記基因的細(xì)胞區(qū)別開來的基因。根據(jù)該標(biāo)記是否賦有某一可通過化學(xué)方法選擇即使用選擇試劑(如除草劑、抗生素等等)的性狀，或其是否為可通過觀察或檢驗(yàn)即“篩選”(如R-基因座性狀)得到鑒別的簡單性狀，這些基因可編碼選擇標(biāo)記或篩選標(biāo)記。當(dāng)然，許多合適的標(biāo)記基因?qū)嵗诒绢I(lǐng)域是大家熟知的，并可用于本發(fā)明的實(shí)踐。
術(shù)語選擇或篩選標(biāo)記基因也包括編碼“分泌標(biāo)記物”的基因，其分泌物可作為鑒別或選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的工具加以檢測。實(shí)例包括編碼可被杭體相互作用識(shí)別之分泌抗原或可通過其催化活性加以檢測的分泌性酶的標(biāo)記基因?？煞置诘鞍追殖蓴?shù)類，包括可用ELISA檢測的擴(kuò)散性小蛋白、可在細(xì)胞外溶液檢測的活化酶(如α-淀粉酶、β-內(nèi)酰胺酶、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)以及插入細(xì)胞壁或或被其捕獲的蛋白(如延展蛋白或煙草PR-S表達(dá)單元中發(fā)現(xiàn)、包含一段前導(dǎo)序列的蛋白)。
就分泌性選擇標(biāo)記來說，使用編碼最后隱蔽于細(xì)胞壁的蛋白并且該蛋白包括一個(gè)獨(dú)特抗原表位的基因尤其具有優(yōu)勢。此類抗原標(biāo)記最好采用一段在植物中具有低背景的抗原表位，一段啟動(dòng)子前導(dǎo)序列，該序列提供高效表達(dá)并導(dǎo)向穿過胞漿膜并產(chǎn)生細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)、抗體可以接觸到的蛋白。將正常分泌的細(xì)胞壁蛋白改良成包含一個(gè)獨(dú)特表西半球也可滿足這樣的要求。
適于這種改良的一個(gè)蛋白實(shí)例是延展蛋白或富羥脯氨酸糖蛋白(HPRG)。例如，玉米HPRG分子(Steifel等，1990)在分子生物學(xué)、表達(dá)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面已得到很好的分析。但是，延展蛋白及/或富甘氨酸細(xì)胞壁蛋白的任一變體(Keller等，1989)均可添加抗原位點(diǎn)加以改良生，產(chǎn)生篩選標(biāo)記。
選擇標(biāo)記可能與本發(fā)明相聯(lián)用的選擇標(biāo)記包括但不限于，編碼卡那霉素抗性并可用卡那霉素、G418等進(jìn)行選擇的neo基因(Potrykus等，1985)、編碼雙丙胺膦抗性的bar基因、編碼改變EPSP合酶蛋白(Hinchee等，1988)從而具有草甘膦抗性的基因、諸如來自于臭鼻克雷伯氏桿菌、具有溴草腈抗性的bxn等腈水解酶基因(Stalker等，1988)、具有咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS抑制化合物抗性的突變乙酰乳酸合酶基因(ALS)(154,204號歐洲專利申請，1988)、具氨甲蝶呤抗性的DHFR基因(Thillet等，1988)，具有除草劑茅草枯抗性的茅草枯脫鹵化酶基因、具有5-甲基色氨酸抗性的突變鄰氨基苯甲酸酯合酶基因。當(dāng)使用突變EPSP合酶基因時(shí)，可引入合適的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽CTP而得到額外的益處(0,218,571號歐洲專利申請，1987)可用于選擇轉(zhuǎn)化體系統(tǒng)的選擇標(biāo)記基因的演示實(shí)施方案是編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因，如來自于吸水鏈霉菌的bar基因或來自于綠色產(chǎn)色鏈霉菌的pat基因。膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶滅活除草劑雙丙胺膦中的活性成分膦絲菌素(PPT)。PPT抑制谷氨酰胺合酶(Murakami等，1986，Twell等，1989)，導(dǎo)致氨迅速蓄積使細(xì)胞死亡。成功在單子葉植物中成功使用此選擇系統(tǒng)是非常令人驚奇的，因?yàn)橛袌?bào)道在谷類實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化是非常困難(Potrykus，19889)。
當(dāng)在本發(fā)明的實(shí)踐中需要采用雙丙胺膦抗性基因時(shí)，用于此目的的一個(gè)特別有用的基因是可從鏈霉素(如ATCC NO.21,705)獲得的bar或pat基因。有報(bào)道(Murakami等，1986；Thompson等，1987)，bar基因的克隆應(yīng)用于除了單子葉植物這外的植物環(huán)境中(De Block等，1987；De Block等，1989)。
用于原核的選擇標(biāo)記包括四環(huán)素抗性或ampillicin抗性基因。
篩選標(biāo)記可采用的篩選標(biāo)記包括但不限于，編碼各種發(fā)色底物為已知的酶的β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)、編碼產(chǎn)物調(diào)控植物組織中花青素色素(紅色)生成的R-基因座基因(Dellaporta等，1988)、編碼各種發(fā)色底物為已知(如PADAC，一種發(fā)色頭孢菌素)的酶的β-內(nèi)酰胺酶基因(Sutcliffe，1978)、編碼可轉(zhuǎn)化發(fā)色兒茶酚的兒茶酚二氧合酶的xylE基因(Zukowsky等，1983)、α-淀粉酶基因(Ikuta等，1990)、編碼酪氨酸酶的基因(Katz等，1983)，其中酪氨酸酶可將酷氨酸氧化成DOPA和多巴醌，后者反過來聚積形成易于檢測的化合物黑色素；以及含發(fā)色底物的半乳糖苷酶基因、可用生物發(fā)光法檢測的螢光素酶基因(Ow等，1986)，甚至是可用鈣敏感生物發(fā)光法檢測的水母發(fā)光蛋白或綠色熒光蛋白基因(Niedz等，1995)。
來自于玉米R(shí)基因復(fù)合物的基因作為篩選標(biāo)記應(yīng)該特別有用。玉米中的R基因復(fù)合物編碼一種調(diào)控大部分種子及植物組織中花色素甙色素生成的蛋白。來自于玉米R(shí)基因復(fù)合物的基因可用于玉米的轉(zhuǎn)化，因?yàn)樵摶蛟谵D(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)不會(huì)傷害細(xì)胞。因此，R基因引入這些細(xì)胞將會(huì)導(dǎo)到紅色色素的表達(dá)，并且如果引入穩(wěn)定的話可對紅色區(qū)域進(jìn)行視覺評分。如果一株玉米系攜帶了花色素甙生物合成途徑(C2、A1、A2、Bz1和Bz2)中編碼酶中間體的基因的顯性等位基因，但攜帶了R基因座的隱性等位基因，用R轉(zhuǎn)化來自于該系的任何細(xì)胞將導(dǎo)致紅色色素的形成。實(shí)例性的細(xì)胞系包括含rg-Stadler等位基因和TR112的Wisconsin 22，為r-g、b、P1的K55衍生物。如果C1和R等位基因同時(shí)引入，則可利用玉米的其他任意基因型。本發(fā)明中打算使用的另一篩選標(biāo)記是由lux基因編碼的螢火蟲熒光素酶。例如，可用X-射線膠片、閃爍計(jì)數(shù)熒光分光度法、低亮度攝相機(jī)、光子計(jì)數(shù)相機(jī)或多孔發(fā)光計(jì)等檢測轉(zhuǎn)化細(xì)胞中l(wèi)ux基因的存在。可以預(yù)見的是本系統(tǒng)可用于研發(fā)群體的生物發(fā)光篩選，如在組織培養(yǎng)板上甚或是整株植物的篩選。
轉(zhuǎn)化表達(dá)盒或含表達(dá)盒的載體構(gòu)建體，可以插入細(xì)胞中。表達(dá)盒或載體構(gòu)建體可以附加體的形式攜帶或整合入細(xì)胞的基因組中，如SV40衍生物、細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質(zhì)粒，來源于質(zhì)體及噬菌體DNA組合的載體，牛痘、腺病毒、雞痘及偽狂犬病的病毒DNA。但是，只要是可復(fù)制并能在宿主中存活，任何載體均可使用。如果表達(dá)盒引入植物細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可能長成轉(zhuǎn)基因植物。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)品。這樣的產(chǎn)品包括但不限于種子、果實(shí)、子代及該轉(zhuǎn)基因植物子代的產(chǎn)品。
就構(gòu)建體引入細(xì)胞宿主來說，有各種各樣的方法可以使用，而且對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說都是已知的。可用聚乙二醇、氯化鈣、病毒感染、DEAE右旋糖酐、噬菌體感染、電穿孔及其他本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法轉(zhuǎn)化細(xì)菌及許多真核細(xì)胞。真菌的轉(zhuǎn)化可依據(jù)Gonni等(1987)所述來完成。可利用包括電穿孔、使用原生質(zhì)球、醋酸鋰等等在內(nèi)的方法完成重組載體對酵母的轉(zhuǎn)化。任何可使DNA引入動(dòng)物細(xì)胞的方法均可使用例如，電穿孔、磷酸鈣、脂質(zhì)體感染，等等。
可利用桿狀病毒將表達(dá)盒插入昆蟲細(xì)胞(實(shí)例參見桿狀病毒表達(dá)載體—實(shí)驗(yàn)手冊，1992)。例如，將要進(jìn)入重組基因的載體可與桿狀病毒一起引入以便在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)上清中獲得重組病毒。然后用重組病毒感染昆蟲病毒，使該蛋白得以表達(dá)。此方法中所用的基因?qū)胼d體可包括pLV1392、pLV1393及pBluBacIII(均為Invitrogen的產(chǎn)品)。桿狀病毒可以是蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒，該病毒感染某些娥類昆蟲。昆蟲細(xì)胞可以是來自于草地夜蛾的Sf9和Sf21卵細(xì)胞及High5細(xì)胞(Invitrogen)，High5細(xì)胞是來自于大豆擬尺蛾(Trichoplusia ni)的卵細(xì)胞。為了進(jìn)行含重組基因和含桿狀病毒的共同轉(zhuǎn)入，可使用磷酸鈣或脂質(zhì)體感染的方法。
將表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織的方法包括直接感染，以及根瘤土壤桿菌與植物細(xì)胞共培養(yǎng)(Horsch等，1985)。Gruber等(1997)對土壤桿菌載體系統(tǒng)及土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移作了描述。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的技術(shù)包括以根瘤土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌為轉(zhuǎn)化試劑用DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞、電穿孔、DNA注射、微粒轟擊、粒子加速，等等(例如可見EP 295959和EP 138341)。
特別優(yōu)先使用土壤桿菌(Agrobacterium spp.)的Ti及Ri質(zhì)粒的雙元載體。Ti來源的載體可轉(zhuǎn)化大范圍、包括單子葉植物和雙子葉植物在內(nèi)的高等植物，如大豆、棉、油菜、煙草及水稻等(Pacciotti等，1985；Byrne等，1987；Sukhapinda等，1987；Lorz等，1985；Potrykus等，1985；Byrne等，1987；Park等，1985；以及Hiei等，1994)。使用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞已有廣泛的研究和詳細(xì)的描述(例如參見EP 120516；Hoekema，1985；Krauf等，1983及An.等，1985)。本領(lǐng)域內(nèi)的熟練技術(shù)人員也可使用其他轉(zhuǎn)化方法，如外源DNA構(gòu)建體的直接攝取(見EP 295959)、電穿孔技術(shù)(Fromm等，1986)或用核酸構(gòu)建體包被的金屬顆粒高速彈道彈丸(Kline等，1987，及NO.4,945,050號美國專利)。細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，本領(lǐng)域內(nèi)的熟練技術(shù)人員可使之再生。最近說明的方法與將外源基因轉(zhuǎn)化入商業(yè)上重要的農(nóng)作物之間有著特別的關(guān)聯(lián)，如油菜籽(DeBlock等，1989)、向日葵(Everett等，1987)、大豆(McCabe等，1988；Hinchee等，1988；Chee等，1989；Christou等，1989；及EP 301749)、水稻(Hiei等，1994)和玉米(Gordon Kamm等，1990；及Fromm等，1990)。
含基因組或合成片段的表達(dá)載體可導(dǎo)入原生質(zhì)體或完整組織或分離的細(xì)胞中。優(yōu)選將表達(dá)載體導(dǎo)入完整組織中。Maki等(1993)及Phillips等(1988)提供了培養(yǎng)植物組織的通用方法。
優(yōu)選利用諸如微顆粒介導(dǎo)的輸送、DNA注射、電穿孔等等的直接基因轉(zhuǎn)移方法將表達(dá)載體導(dǎo)入玉米或其他植物組織中。更優(yōu)選使用帶生物彈射裝置的微顆粒介導(dǎo)輸送方法將表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織。例如，可見Tomes等(1995)。
本領(lǐng)域內(nèi)的熟練技術(shù)人員將會(huì)理解方法的選擇可能取決于將要轉(zhuǎn)化的植物類型即單子葉植物或雙子葉植物。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的適當(dāng)方法包括但不限于微注射(Crossway等，1986)、電穿孔(Riggs等，1986)、土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(De Blaere等，1987及Hinchee等，1988)、直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等，1984，引用我們的專利)及利用來自于Agracetus，Inc.，Madison，Wis.和BioRad，Herules，Calif.的設(shè)備的彈道顆粒激發(fā)(例如，可參見Sanford等，NO.4,945,050號美國專利及McCabe等，1988)。也可參見，Weissinger等，1988；Sanford等，1987(洋蔥)；Christou等，1988(大豆)；McCabe等，1988(大豆)；Datta等，1990(水稻)；Klein等，1988(玉米)；；Klein等，1988(玉米)；；Klein等，1988(玉米)；Fromm等，1990(玉米)；Gordon-Kamm等，1990(玉米)；Svab等，1990(煙草葉綠體)；koziel等，1993(玉米)；Shimamoto等，1989(水稻)；Christou等，1991(水稻)；EP 0 332 581號歐洲專利申請(鴨茅(orchardgrass)及其他早熟禾亞科植物(pooideae))；Vasil等，1993(小麥)；Weeks等，1993(小麥)以及分子生物學(xué)中的方法(1998)。
植物的轉(zhuǎn)化可用單個(gè)的DNA分子或多個(gè)DNA分子(即共轉(zhuǎn)化)一起進(jìn)行，這些技術(shù)均適用于與表達(dá)盒和本發(fā)明的構(gòu)建體一起使用。有大量的轉(zhuǎn)化載體可用于植物的轉(zhuǎn)化，并且本發(fā)明的表達(dá)盒可用于與這些載體任意聯(lián)用。載體的選擇取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)及轉(zhuǎn)化的靶種屬。
許多載體可在用根瘤土壤桿菌的轉(zhuǎn)化中使用。這些載體典型地至少攜帶了一段T-DNA邊界序列及諸如pBIN19.Bevan(1984)的誘導(dǎo)載體。在土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中另一有用的載體是雙元載體pCIB10，它含有編碼在植物中進(jìn)行選擇的卡那霉素抗性基因、T-DNA的左側(cè)及右側(cè)邊界序列，可引入具有廣泛宿主范圍的質(zhì)粒pRK252中的序列，使之可在大腸桿菌及土壤桿菌中均可復(fù)制。Rothstein等(1987)對其構(gòu)建作了描述。Gritz等(1983)描述了v如何構(gòu)建各種導(dǎo)入潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的pCIP10衍生物。這些衍生物可使轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞僅對潮霉素(pCIB743)或?qū)Τ泵顾睾涂敲顾?pCIB715，pCIB717)進(jìn)行選擇。
使用直接基因轉(zhuǎn)移形式或土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的形式的方法通常但不是必須與選擇標(biāo)記一起進(jìn)行，該標(biāo)記可提供對抗生素(如卡那霉素、潮霉素或氨甲蝶呤)或除草劑(如膦絲菌素)的抗性。但是，植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記的選擇對于本發(fā)明并不是關(guān)鍵的。
對于某些植物組織來說，可偏向于不同的抗生素或除草劑選擇標(biāo)記。在轉(zhuǎn)化中使用的常規(guī)選擇標(biāo)記包括對卡那霉素及相關(guān)抗生素具有抗性的nptII基因(Messing & Vierra，1982；Bevan等，1983)，對除草劑膦絲菌素具有抗性的bar基因(White等，1990；Spencer等，1990)，對抗生素潮霉素具有抗性的hph基因(blochinger & Diggelmann)，以及對氨甲蝶呤具有抗性的dhfr基因(Bourouis等，1983)。
pCIB3064就是這樣一個(gè)將直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)與除草劑Basta(或膦絲菌素)聯(lián)合起來的有用載體。該載體基于pCIB246質(zhì)粒，pCIB246包含與大腸桿菌GUS基因操縱性融合的CaMV 35S啟動(dòng)子和CaMV35S轉(zhuǎn)錄終止子，并在WO 93/07278中作了描述，其內(nèi)容在此引入作為參考。來自于綠色產(chǎn)色鏈霉菌的bar基因(Thompson等，1987)是對膦絲菌素產(chǎn)生抗性的一個(gè)有用基因。此載體適合于克隆含其自有調(diào)控信號的植物表達(dá)盒。另一轉(zhuǎn)化載體是pSOG35，它利用大腸桿菌二氫葉酸還原酶(DHFR)作為對氨甲蝶呤產(chǎn)生抗性的選擇標(biāo)記。
任何可以亞克隆繁殖的植物組織，不管其由器官發(fā)生還是胚發(fā)生，均可用本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。術(shù)語器官發(fā)生指芽和根相繼從分生中心發(fā)育而來的過程，而胚生成則指芽和根以一樣的方式同時(shí)(不是先后)從體細(xì)胞或配子發(fā)育的過程。特定組織的選擇很大程度上取決于可用的克隆繁殖系統(tǒng)、最適用的組織和要轉(zhuǎn)化特定種屬。靶組織的示例包括葉圓盤(leaf disk)、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子體、愈合組織、已存在的分生組織(如頂端分生組織、腋芽、根分生組織)及誘導(dǎo)的分生組織(如子葉分生組織和下胚軸分生組織)。
本發(fā)明的植物可以采用各種各樣的形式。植物可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；可以是克隆的轉(zhuǎn)化體(如所有細(xì)胞轉(zhuǎn)化成含有表達(dá)盒的細(xì)胞)；可以包含轉(zhuǎn)化組織及未轉(zhuǎn)化組織的嫁接物(如轉(zhuǎn)化的根原種嫁接到柑桔種中未轉(zhuǎn)化的幼芽上)。轉(zhuǎn)化植物可用諸如克隆繁殖或傳統(tǒng)培育技術(shù)的各種方法進(jìn)行繁殖。例如，第一代轉(zhuǎn)化植物(或T1)可自身產(chǎn)生純合的第二代轉(zhuǎn)化植物(或T2)，T2植物可進(jìn)一步用傳統(tǒng)的培育技術(shù)進(jìn)行繁殖?？蓪⒁粋€(gè)顯性選擇標(biāo)記(如npt II)與表達(dá)盒相關(guān)聯(lián)，以輔助培育。
本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)化任何品種的植物，包括但不限于谷類(玉米)、蕓苔屬(如B.napus，B.rapa，B.juncea)尤其是像蕓苔這樣可用作種子油的品種、苜蓿(紫花苜蓿)、水稻(Oryza sativa)、黑麥(Secalecereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、黍(如pear millet(珍珠粟))、黃米(糯性黍米)、小米(Setaria italica)、龍爪粟(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、番紅花(Carthamustinctorius)、小麥(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、煙草(Nicotiana tabacum)、土豆(Solanum tuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉(海島棉(Gossypium barbadense)、陸地棉(Gossypiumhirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠蘿(Ananas comosus)、柑桔樹(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鱷梨(Persea americana)、無花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄欖(Oleaeuropaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳大利亞堅(jiān)果(Macadamia integrifolia)、杏仁(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物及松類。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、萵苣(如Lactucasativa)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、扁白豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)及諸如黃瓜(C.sativus)、哈蜜瓜(C.cantalupensis)、香瓜(C.melo)的香瓜屬(Cucumis)成員。觀賞植物包括村鵑花(Rhododendron spp.)、八仙花屬(Macrophylla hydrangea)、芙蓉屬(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipaspp.)、水仙花(石蒜科)、牽?；?矮牽牛屬)、康乃馨(香石竹)、一品紅(猩猩木)和菊花。可能在本發(fā)明中應(yīng)用的針葉樹類包括諸如火炬松(火炬松)、愛氏松(濕地松)、美國黃松(美國黃松)、海灘松(小干松)、蒙特例松(輻射松)以及道格拉斯杉(黃杉)之類的松樹；西部鐵杉(加拿大鐵杉)、水杉(白云杉)、美國杉樹(北美紅杉)；諸如銀冷杉(太平洋銀冷衫)、香脂冷杉(膠冷杉)之類的冷杉；以及諸如西部紅杉(北美喬柏)、阿拉斯加黃柏(阿拉斯加黃扁柏)之類的香柏。豆類植物包括菜豆(beans)和豌豆(peas)。豆包括關(guān)華豆、刺槐豆、胡蘆巴、綠豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、扁豆、鷹嘴豆等。莢果包括但不限于諸如花生的花生屬，諸如小寇花、毛葉苕子的蠶豆屬，小豆，綠豆和鷹嘴豆，羽扇豆屬如白羽扇豆，車軸草屬，菜豆屬如普通的豆角和利馬豆，碗豆屬如蠶豆，草木犀屬如紅花草，苜蓿屬如紫花苜蓿，蓮花如三葉草，扁豆屬如扁豆和假木蘭。本發(fā)明方法中使用的優(yōu)選糧草和草地草包括紫花苜蓿、果園草、高牛毛草、黑麥草、蔓延彎曲的草及小糠草。
本發(fā)明植物優(yōu)選為農(nóng)作物，如玉米、苜蓿、向日葵、蕓苔、大豆、棉、番紅花、花生、高粱、小麥、燕麥、黑麥、黍、煙草、大麥、水稻、番茄、土豆、南瓜、甜瓜、莢果類作物如豌豆、菜豆及大豆，等等。
重組酶制備重組植酸酶時(shí)，適當(dāng)?shù)乃拗鞯靡赞D(zhuǎn)化和生長后，用合適的方法(如溫度變換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇啟動(dòng)子，細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間以收獲重組酶。細(xì)胞一般用離心來收集，用物理或化學(xué)的方法加以裂解，保留所得粗提取物以進(jìn)一步純化。
蛋白表達(dá)中采用的細(xì)胞可用任意常規(guī)方法裂解，包括反復(fù)凍融、超聲、機(jī)械裂解，或使用細(xì)胞裂解劑，這些方法都是本領(lǐng)域內(nèi)熟練技術(shù)人員所熟知的。
從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)原和純化酶可以使用包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、親和層析、磷酸纖維素層析、疏水交換層析、親和層析、羥磷灰石層析和植物凝集素層析在內(nèi)的方法。必要時(shí)，在完成成熟蛋白構(gòu)型時(shí)使用蛋白重新折疊步驟。最后，可用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行最后的純化。
本發(fā)明的酶可以是化學(xué)合成方法的產(chǎn)品，或用重組技術(shù)從真核宿主如高等植物生成。
根據(jù)重組生產(chǎn)方法中所采用的宿主細(xì)胞不同，本發(fā)明的酶可進(jìn)行糖基化加以共價(jià)修飾，也可不修飾。真核細(xì)胞中分泌蛋白的糖基化起調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊、構(gòu)象、熱穩(wěn)定性和抗蛋白水解的作用。就特定的植酸酶應(yīng)用來說，該酶的糖基化形式要優(yōu)于非糖基化形式。例如，在動(dòng)物飲料中使用糖基化植酸酶可以幫助保護(hù)該酶在形成小球時(shí)不會(huì)發(fā)生熱變性，當(dāng)穿過動(dòng)物的胃時(shí)不會(huì)水解失活，幫助將活化的酶輸送到小腸及作用部位。就食物加工應(yīng)用來說，僅在食物加工過程中需要酶活性而最終產(chǎn)品是不需要的，優(yōu)選非糖基化、不耐熱、對蛋白水解敏感的植酸酶。
本發(fā)明的酶也可包括或不包括初始的甲硫氨酸殘基。
可在需要或想要此酶的活性時(shí)，使用本發(fā)明的酶。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，使用該酶催化植酸酶在動(dòng)物飲料中的水解。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，使用該酶催化植酸酶在食物中的水解。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物的生成和鑒定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞置于合適的選擇性培養(yǎng)基中來選擇轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，然后讓其長成愈合組織。從愈合組織長芽，然后芽在長根培養(yǎng)基生成苗。正常情況下，各種構(gòu)建體與一種標(biāo)記相連以便在植物細(xì)胞中進(jìn)行選擇。傳統(tǒng)的標(biāo)記可對殺菌劑(尤其是抗生素，如卡那霉素、G418、博菜霉素、潮霉素、氯霉素、除草劑，等等)產(chǎn)生抗性。相對缺乏所導(dǎo)入DNA的細(xì)胞來說，所用的特別標(biāo)記使得轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以進(jìn)行選擇。包括本發(fā)明轉(zhuǎn)錄/表達(dá)盒在內(nèi)的DNA構(gòu)建體其組分可從對宿主細(xì)胞來說為天然(內(nèi)源)或外來(異源)的序列制備。從“外來”序列制備指該序列在構(gòu)建體導(dǎo)入的野生型宿主中未發(fā)現(xiàn)。異源構(gòu)建體將至少包含一個(gè)對來源于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的基因來說是非天然的的區(qū)域。
為了確認(rèn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和植物中轉(zhuǎn)基因的存在，可采用各種分析方法。這些分析方法包括對本領(lǐng)域內(nèi)熟練技術(shù)人員來說熟知的“分子生物學(xué)”測定法，如Southern和Northern印跡、原位雜交及諸如PCR或RT-PCR的基于核酸的擴(kuò)增方法、諸如通過免疫學(xué)方法(ELISA及Western印跡)或酶學(xué)功能方法等檢測蛋白質(zhì)產(chǎn)物存在的“生化”測定方法、諸如葉或根部分析的植物分部分析法，也包括分析整個(gè)再生表型的方法。
可使用本領(lǐng)域內(nèi)熟練技術(shù)人員所熟知的技術(shù)將DNA從細(xì)胞或其中包括任意植物部分的器官或組織中分離出來以測定特定核酸片段的存在。應(yīng)注意通常不存在完整的序列，大概為細(xì)胞中序列發(fā)生重排或缺失所致。
通過本發(fā)明的方法所導(dǎo)入的核酸元件可用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)確定其存在與否。利用此技術(shù)擴(kuò)增不連續(xù)核酸片段并用凝膠電滬進(jìn)行檢測。這種分析可以測定預(yù)選擇的核酸片段是否在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體中存在，但不能證明所導(dǎo)入宿主基因組中的預(yù)選擇核酸是完整的。另外，利用PCR技術(shù)也不可能測定轉(zhuǎn)化體是否含有導(dǎo)入基因組中不同位點(diǎn)的外源基因，即不能確定轉(zhuǎn)化體是否為獨(dú)立的起源。預(yù)期的是利用PCR技術(shù)可能可以克隆與所導(dǎo)入特定DNA片段相連的宿主基因組DNA片段。
可用Southern雜交技術(shù)測定轉(zhuǎn)化體中DNA整合入宿主基因組的陽性證據(jù)及獨(dú)立身份。利用此技術(shù)可以鑒定導(dǎo)入宿主基因組的DNA序列及旁側(cè)的宿主DNA序列。因此，指定轉(zhuǎn)化體的Southern雜交模式作為該轉(zhuǎn)化體的鑒別特征之一。另外還可能通過Southern雜交來證明高分子量DNA中所導(dǎo)入特定DNA片段的存在，即確認(rèn)所導(dǎo)入的特定DNA片段已整合入宿主細(xì)胞基因組中。Southern雜交技術(shù)提供了用PCR獲得的信息，如某一特定DNA片段的存在與否，但也可證明DNA片段整合入基因組中并鑒定每一單獨(dú)的轉(zhuǎn)化體。
可以預(yù)期的是利用Southern雜交作了修改的點(diǎn)印跡或槽印跡雜交技術(shù)，可以獲得來源PCR的相同信息，如某一特定DNA片段的存在與否。
PCR和Southern雜交技術(shù)均可用于證明特定DNA片段傳遞到了子代。在大部分情況下，指定轉(zhuǎn)化體的特征性Southern雜交模式在子代中分隔成一個(gè)或多個(gè)孟德爾基因(Spencer等，1992；Laursen等，1994)，表明基因得以穩(wěn)定地遺傳。胚系傳遞和相同Southern印跡雜交模式及在愈合組織、R0植物及為轉(zhuǎn)化基因而分離出來的R1子代中轉(zhuǎn)化DNA的強(qiáng)度，可以提示父系轉(zhuǎn)化體(R0)和愈合組織的非嵌合性質(zhì)。
相對于DNA分析技術(shù)可利用從植物任一部分離出來的DNA來實(shí)施，RNA可能僅在特定細(xì)胞或組織中表達(dá)，因而需從這些組織中制備用于分析的RNA。PCR技術(shù)也可用于對所導(dǎo)入特定DNA片段產(chǎn)生的RNA進(jìn)行檢測和定量。在PCR的這一應(yīng)用中，首先要用諸如逆轉(zhuǎn)錄酶之類的酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，然后用傳統(tǒng)的PCR技術(shù)擴(kuò)增此DNA。大部分情況下，PCR技術(shù)雖然有用，但不能證明RNA產(chǎn)物的完整性。有關(guān)該RNA產(chǎn)物進(jìn)一步的信息可從Northern印跡來獲得。此技術(shù)可證明RNA種屬的存在，并給出該RNA有關(guān)完整性的信息。某一RNA種屬的存在與否也可用點(diǎn)或槽Northern雜交來測定。這些技術(shù)是對Northern印跡的修飾，僅可證明某一RNA種屬的存在與否。
因此，盡管Southern印跡和PCR可用于檢測所述的特定DNA片段，它們不能提供關(guān)于該特定DNA片段是否在表達(dá)的信息。可通過特異性的鑒別所導(dǎo)入特定DNA片段的蛋白產(chǎn)物或評價(jià)其表達(dá)所產(chǎn)生的表型改變來評估表達(dá)情況。
特定蛋白生成和鑒定的分析可利用該蛋白的物理-化學(xué)、結(jié)構(gòu)、功能或其他性質(zhì)。獨(dú)特的物理-化學(xué)性質(zhì)或結(jié)構(gòu)性質(zhì)可使蛋白利用諸如自然或變性凝膠電泳或等電聚焦電泳的電泳方法、諸如離子交換或凝膠排拆層析的層析技術(shù)加以分離。各個(gè)蛋白的獨(dú)特結(jié)構(gòu)為利用特異性抗體以ELISA檢測方法等方式檢測其存在提供了機(jī)會(huì)。可采取途徑聯(lián)用以更特具特異性，如聯(lián)用抗體用于定位已用電泳技術(shù)分離的個(gè)體基因產(chǎn)物的Western印跡?？捎脛e的技術(shù)以絕對確認(rèn)目的產(chǎn)物的鑒別，如純化后進(jìn)行氨基酸測序來評價(jià)。盡管這些是最常用的，其他方法也可使用。
通過其功能性尤其是催化涉及特異底物及產(chǎn)物的特異性化學(xué)反應(yīng)的酶活性，測定方法也可用于鑒別蛋白的表達(dá)。這些反應(yīng)可以是利用物理或化學(xué)的方法提供和定量反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的生成。實(shí)施例隨所分析的酶不同而不一樣。
通過評價(jià)基因表達(dá)的表型結(jié)果來測定該基因產(chǎn)物的頻繁表達(dá)。這些測定方法采取多種形式，包括但不限于分析該植物的化學(xué)組成、形態(tài)學(xué)或生理性質(zhì)改變。
植酸酶組合物一般地，植酸酶為液體或干物。
液體組合物除了植酸酶外不一定包含其他物質(zhì)，在高純度時(shí)尤其如此。然而可以添加諸如甘油、山梨醇、單丙二醇的穩(wěn)定劑。液體也可包括其他添加劑，如鹽、糖、防腐劑、pH調(diào)節(jié)劑、蛋白質(zhì)及肌醇六磷酸鹽(一種植酸酶的底物)。典型的液體組合物為水性或油性混懸液。液體組合物可以在可選的小丸形成成之前或之后加到食物或飼料中。
當(dāng)組合物采取干體形式、除了酶之外不需要包含其他物質(zhì)時(shí)，可以是凍干或噴霧干燥的組合物。干組合物可以是呈粒狀，易于與食物或飼料組分等混合形成預(yù)混合組分。酶顆粒的顆粒大小優(yōu)選混合物其他組分的大小相兼容。這樣就提供了一種安全、方便地將酶導(dǎo)入已加工食物或動(dòng)物飼料等的方法。
例如，可將液體酶溶液與疏松劑如地面大豆粗粉共同冷凍，然后將混合物凍干，從而制備穩(wěn)定的植酸酶制劑。水分減少以及植酸酶與疏松劑結(jié)合的相互作用可保護(hù)酶免受諸如溫度超過復(fù)合飼料制備過程中所經(jīng)歷的溫度等外界環(huán)境因素的影響。還可將用于目標(biāo)酶的液體發(fā)酵混合物中可能以副產(chǎn)品存在的潛在蛋白水解酶的活性降到最低，以此進(jìn)一步增強(qiáng)干制劑的穩(wěn)定性。所得干燥酶-大豆粉混合物可耐受極高的溫度。例如，在96℃加熱120分鐘后，干酶制劑可保留其原始酶活性的97.8％。按配方制成的酶混合物可用作家禽及豬生產(chǎn)的食物補(bǔ)充劑。例如，在1Kg標(biāo)準(zhǔn)玉米-大豆粉食物中加入500酶單位的本發(fā)明耐熱植酸酶，可降低當(dāng)前動(dòng)物營養(yǎng)品的無機(jī)磷酸鹽補(bǔ)充劑用量，即從0.45％降到0.225％。以含0.225％磷酸鹽及補(bǔ)充有按配方制成的植酸酶的食物來喂養(yǎng)雞，與用含0.45％磷酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)食物具有相當(dāng)?shù)墓πА６伊姿猁}補(bǔ)充劑的減少可降低磷酸鹽污染的程度，從而顯著減少動(dòng)物集約商業(yè)生產(chǎn)對環(huán)境的影響。
使用小顆粒干制劑的潛在不利之處在于其形成粉塵的趨勢及顆粒表面目標(biāo)酶局部濃度偏高。酶蛋白飽和的粉塵顆粒可帶來免疫學(xué)的顧慮，而酶主要定位于小顆粒的表面可能影響穩(wěn)定性，尤其是在飼料的加工過程中和儲(chǔ)存期延長時(shí)。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了制劑的非加工方法，該方法包括在諸如玉米、小麥或大豆等糧食中生成和輸送本發(fā)明的酶。完整糧食保護(hù)目標(biāo)酶免受外界環(huán)境因素影響并使粉塵的產(chǎn)生減至最少。這種酶輸送的方法可使配制成本顯著減少，尤其是與目前商用低粉塵顆粒制劑的成本比較時(shí)。此外，可從種子制備蛋白提取物，提取物可進(jìn)一步加工成穩(wěn)定的液體或利用凍干或噴霧干燥制成干品。例如，具有酶學(xué)活性的植酸酶在玉米中產(chǎn)生的量可達(dá)每公斤種子1,000,000單位的水平，而且具活性的酶可用水提物從種子復(fù)原。
在填充物質(zhì)和酶一起凝聚、形成顆粒的過程中，利用凝聚技術(shù)在高度修剪的混合物中制備結(jié)塊顆粒。用具有吸附酶或?yàn)槊杆坏妮d體物質(zhì)核心來制備吸附顆粒。
典型的填充物質(zhì)為諸如硫酸鈉的鹽。其他填充劑包括高嶺土、滑石、硅酸鎂鋁和纖維素纖維(cellulose fibre)。凝聚顆粒中也可選擇性地包括諸如糊精之類的粘合劑。
典型的載體物質(zhì)包括木薯、玉米、土豆、水稻、小麥等形式的淀粉。鹽也可用作載體物質(zhì)。
可選的是，用包衣混合物包被顆粒。此類混合物包含包被試劑，優(yōu)選疏水包被試劑，如氫化的棕櫚油和牛油，如果必要的活，可包含諸如碳酸鈣或高嶺土等其他添加劑。
另外，植酸酶組合物可包含其他取代物，如著色劑、芳香化合物、穩(wěn)定劑、維生素、礦物質(zhì)、其他飼料或食物增強(qiáng)酶，等等。這些尤其在所謂的預(yù)混合物中使用。
“食物或飼料添加劑”是打算或適合加到食物或飲飼料中的必要純化合物或多組分組合物。特別地，它是一種欲成為食物或飼料產(chǎn)品的組分之一或影響食物或飼料產(chǎn)品任意特性的特質(zhì)。因此，植酸酶添加劑理解為在主要食物或飼料物質(zhì)中并不是天然成分或其濃度不以天然濃度存在的植酸酶，例如可單獨(dú)或與其他飼料添加劑從飼料物質(zhì)分別加到飼料中，或植酸酶是一種飼料物質(zhì)的一個(gè)完整部分但已用重組DNA技術(shù)在其中產(chǎn)生。典型的添加劑通常包含諸如維生素、礦物質(zhì)或飼料增強(qiáng)酶及適當(dāng)載體和/或賦形劑之類的一種或多種化合物。
即用型植酸酶添加劑在這里指不在動(dòng)物飼料內(nèi)部或已加工食物中生成的添加劑。即用型植酸酶添加劑可用于直接或優(yōu)選與其他飼料或食物成分混合后直接喂養(yǎng)人類或動(dòng)物。例如，依據(jù)本發(fā)明此方面的飼料添加劑與其他飼料組分一起生成飼料。此類其他飼料組分包括一種或多種其他(優(yōu)選耐熱的)酶補(bǔ)充劑，維生素飼料添加劑、礦物質(zhì)飼料添加劑和氨基酸飼料添加劑。然后將適量可能包括數(shù)種組分的所得(組合)飼料添加劑與其他飼料組分如谷類及蛋白補(bǔ)充劑混合，形成動(dòng)物飼料?？捎矛F(xiàn)有的加工器械如雙制粒機(jī)、蒸氣制粒機(jī)、膨脹機(jī)或擠壓機(jī)，將這些組分加工成動(dòng)物飼料。
類似的，依據(jù)本發(fā)明此方面的飼料添加劑與其他食物組分以產(chǎn)生加工的食物產(chǎn)品。此類其他食物組分包括一種或多種其他(優(yōu)選耐熱的)酶補(bǔ)充劑，維生素食物添加劑和礦物質(zhì)食物添加劑。然后將適量可能包括數(shù)種組分的所得(組合)食物添加劑與其他食物組分如谷類及植物蛋白混合，形成加工食物成品?？捎萌我猬F(xiàn)有加工器械將這些組分加工成加工食物成品。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的植酸酶組合物包含一種或多種有效量的飼料或食物增強(qiáng)酶，尤其是該飼料或食物增強(qiáng)酶選自α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶尤其是乳糖酶、其他植酸酶、β-葡聚糖酶尤其是內(nèi)切(endo)-β-1，4-葡聚糖酶和內(nèi)切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、纖維素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶尤其是阿拉伯半乳聚糖內(nèi)切-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖內(nèi)切-1，3-β-半乳糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶尤其是內(nèi)切-1，2-β-葡聚糖酶、內(nèi)切-1，3-α-葡聚糖酶和內(nèi)切-1，3-β-葡聚糖酶，果膠降解酶尤其是果膠酶、果膠酯酶、果膠裂解酶，多聚半乳糖醛酸酶、arabinanase、rhamnogalacturonase、rhamnogalacturonan乙酰酯酶、rhamnogalacturonan-α-鼠李糖苷酶、果膠酸裂解酶和α-galacturonisidase，甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶，甘露聚糖乙酰酯酶，木聚糖乙酰酯酶，蛋白水解酶，木聚糖酶，arabinoxylanase，以及諸如脂肪酶、磷脂酶和角質(zhì)素分解酶等脂肪分解酶。
本發(fā)明動(dòng)物飼料添加劑在飲食之前或與飲食同時(shí)補(bǔ)充給動(dòng)物。優(yōu)選的是本發(fā)明飼料添加劑與飲食同時(shí)補(bǔ)充給動(dòng)物。
食物或飼料中的植酸酶有效量約為10到20,000FTU/kg，優(yōu)選約10到15,000FTU/kg，更優(yōu)選約10到10,000FTU/kg，尤其優(yōu)選約100到5,000FTU/kg，特別是約100到2,000FTU/kg飼料或食物。
利用植酸酶加工和生產(chǎn)人類食物和動(dòng)物飼料也屬于本發(fā)明的范圍。用于人類食物的谷物和面粉可用植酸酶進(jìn)行酶學(xué)處理以減少材料中的植酸鈣鎂含量。植酸鈣鎂的含量降低可增加基本物質(zhì)如鐵、鈣和鋅的營養(yǎng)利用度從而增強(qiáng)食物的質(zhì)量。除了增加食物的營養(yǎng)質(zhì)量，在食物加工過程中使用植酸酶可以提高食物生產(chǎn)方法的總體效能。例如，大豆蛋白分離生產(chǎn)時(shí)在白色大豆薄片加添加植酸酶，可顯著提高可提取蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量。食物生產(chǎn)時(shí)植酸酶僅在生產(chǎn)和加工程中具有活性，在最終的食物產(chǎn)品中無活性。例如，此方面與生面團(tuán)的制備和烘焙相關(guān)。類似的，動(dòng)物飼料谷物如吐司大豆粉或蕓苔粉，在制造復(fù)合飼料之前可用植酸酶預(yù)處理。在復(fù)合飼料制備前除去動(dòng)物飼料組分中的抗?fàn)I養(yǎng)因素可以生成營養(yǎng)質(zhì)量更好和更有價(jià)值的動(dòng)物飼料成分。在此加工方法中，飼料制備時(shí)植酸酶具有活性，攝入處理過的食物后在動(dòng)物的消化道中可能具有活性也可有沒有活性。
除了用植酸酶作食物加工輔助外，本發(fā)明的范圍包括將植酸酶用作人用補(bǔ)充消化輔助劑?？稍谶M(jìn)食前攝取片劑形式的植酸酶，以將活化的酶輸送到受者的胃腸道。消費(fèi)者將在體內(nèi)經(jīng)受營養(yǎng)的獲取，并可從食物加工時(shí)不能用植酸酶處理的食物獲得。
在食物或飼料制品或添加劑的制備時(shí)使用植酸酶，即植酸酶僅在制造時(shí)具有活性而在最終的食物或飼料產(chǎn)品中沒有活性，也屬于本發(fā)明的范圍。例如，本發(fā)明此方面與生面團(tuán)的制備和烘焙、及其他基于谷類的即食型產(chǎn)品的生產(chǎn)相關(guān)。
將植酸酶作為動(dòng)物動(dòng)物飼料及加工食品的外源添加劑的另一種可能是，將含有植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物材料添加到飼料中，優(yōu)選添加到加工轉(zhuǎn)基因種子中，在種子中植酸酶已通過異源基因表達(dá)合成了。動(dòng)物飼料中可包括表達(dá)異源植酸酶的植物部分如轉(zhuǎn)基因的種子或其他植物材料如根、莖、葉、木材、花、樹皮及/或果實(shí)，可以原始狀態(tài)或進(jìn)一步加工后加入。在以谷類為基礎(chǔ)的飼料或食物中，谷類優(yōu)選小麥、大麥、玉米、高梁、黑麥、燕麥、黑小麥或水稻。植酸酶也可方便地在單胃及多胃動(dòng)物尤其是小牛中使用。魚和甲殼動(dòng)物的食物也可補(bǔ)充植酸酶以便在集約生產(chǎn)系統(tǒng)中進(jìn)一步提高食物轉(zhuǎn)化率、減少排泄磷的含量。本發(fā)明的飼料可供動(dòng)物使用，如家禽，例如火雞、鵝、鴨，以及豬、馬、牛、綿羊、山羊、犬、貓，以及魚和甲殼動(dòng)物。優(yōu)選將飼料應(yīng)用于豬或家禽，包括但不限于烤雞、母雞尤其是正下蛋白的母雞、火雞和鴨。
飼料組合物及使用方法本發(fā)明的植酸酶(如上所述配制)可與其他成分組合形成具有特定優(yōu)勢的全新飼料組合物。
例如，集約動(dòng)物生產(chǎn)操作限制所產(chǎn)生動(dòng)物糞便的磷酸鹽污染是合宜的。飲食中存在的磷酸鹽含量及飲食中的磷酸鹽利用率是影響動(dòng)物糞便中磷酸鹽排泄量的主要因素。目前，植物的利用率或是大豆粉、玉米粒(及其他飼料)中存在的谷物來源磷酸鹽的利用率與主要以肌醇六磷酸形式存在的磷酸鹽一樣低。為了使動(dòng)物的生長效率最大化，在飼料中加入無機(jī)磷酸鹽，使飼料組合物含有充足含量的可利用磷酸鹽。然而，這些飼料制劑包含太多的總磷酸鹽，從而產(chǎn)生磷酸鹽污染。
盡管目前商用的植酸酶使磷酸酶利用度更高，仍被推薦與加入高含量的無機(jī)磷酸鹽一起使用。本發(fā)明的植酸酶活性很高，以致可用于產(chǎn)生全新飼料制劑，具有下列性質(zhì)a)無機(jī)鹽磷酸鹽的含量顯著降低，b)實(shí)現(xiàn)飼料的上好轉(zhuǎn)化率，提高相對正常飲食所增加的體重。目前，商用植酸酶不能使以不含添加無機(jī)磷酸鹽的飼料所喂養(yǎng)的動(dòng)物有效生產(chǎn)。
具體的，本發(fā)明的動(dòng)物飼料包含本發(fā)明植酸酶與動(dòng)物飼料成分組合而成的組合物，并形成基本上只含低水平無機(jī)磷酸鹽的飼料。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的飼料組合物包含典型的飼料成分、微量營養(yǎng)元素、維生素等及有效量的耐熱植酸酶和無機(jī)磷酸鹽，其中植酸酶及磷的含量約為每公斤飼料含50-20,000單位植酸酶及少于0.45％的無機(jī)磷，優(yōu)選每公斤飼料含100-10,000單位植酸酶及少于0.225％的無機(jī)磷尤其是每公斤飼料含150-10,000單位植酸酶及少于0.15％的無機(jī)磷，或每公斤飼料含250-20,000單位植酸酶同時(shí)不含添加的外源無機(jī)磷。
與農(nóng)場動(dòng)物生產(chǎn)相關(guān)的改善增加體重及食物轉(zhuǎn)化率(FCR)也屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的植酸酶可以體重增加及FCR得到改善，尤其是當(dāng)與低無機(jī)磷酸鹽飲食聯(lián)用時(shí)。具體的，本發(fā)明的方法通過將含有本發(fā)明植酸酶及無機(jī)磷酸鹽不高于0.45％的飲食喂養(yǎng)動(dòng)物，來改善FCR或低無機(jī)磷酸鹽飲食的體重增加該方法。優(yōu)選包含用含植酸酶及少于0.225％無機(jī)磷酸鹽的飲食喂養(yǎng)，或最優(yōu)選用含植酸酶及不添加無機(jī)磷的飲食喂養(yǎng)。
本發(fā)明的動(dòng)物飼料可在單胃或多胃動(dòng)物中使用。本發(fā)明的動(dòng)物飼料可用于飼養(yǎng)家禽或豬或小?；虬閭H動(dòng)物如狗或貓或馬。實(shí)施例3中提供了這些飼料的實(shí)例及其用途。
本發(fā)明也提供了一種動(dòng)物飼養(yǎng)方法，使環(huán)境磷酸鹽的負(fù)荷顯著降低。該方法包含用含本發(fā)明植酸酶及減量無機(jī)磷(少于0.45％)的組合物喂養(yǎng)大量或成群的農(nóng)場動(dòng)物。更優(yōu)選該方法包含用含本發(fā)明植酸酶及減量無機(jī)磷(少于0.225％)的組合物喂養(yǎng)大量或成群的農(nóng)場動(dòng)物，或最優(yōu)選用含本發(fā)明植酸酶及不含無機(jī)磷的組合物喂養(yǎng)大量或成群的農(nóng)場動(dòng)物。此方法可以實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的高密度管理，而使農(nóng)場作業(yè)釋放入環(huán)境的磷酸鹽減至最少。
對本發(fā)明有用的方法I.對本發(fā)明有用的表達(dá)盒先在表達(dá)盒中將欲在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的編碼序列裝配，并連接到可在植物中表達(dá)的合適啟動(dòng)子的3’端。表達(dá)盒也可進(jìn)步包含該轉(zhuǎn)基因進(jìn)行選擇所需要的其他任何序列。此類序列包括但不限于轉(zhuǎn)錄終止子，增強(qiáng)表達(dá)的外來序列如內(nèi)含子、關(guān)鍵序列(vital sequence)，及將基因產(chǎn)物靶向到特定細(xì)胞器和腔室的序列。然后這些表達(dá)盒可轉(zhuǎn)到本文所述的植物轉(zhuǎn)化載體中。
A.啟動(dòng)子選擇表達(dá)盒中使用的的啟動(dòng)子將決定轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因植物中的空間和時(shí)間表達(dá)模式。所選擇的啟動(dòng)子將使轉(zhuǎn)基因在特定細(xì)胞(如葉上皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、根皮質(zhì)細(xì)胞)或特定組織或器官(如根、葉或花)中表達(dá)，所進(jìn)行的選擇應(yīng)反映轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的蓄積部位。啟動(dòng)子的強(qiáng)度即促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的能力各不相同。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，均可采用在量的合適啟動(dòng)子，包括該基因的天然啟動(dòng)子。下面是可在本發(fā)明表達(dá)盒中采用的的啟動(dòng)子非限制性實(shí)例。
組成型啟動(dòng)子a.泛素啟動(dòng)子已知泛素是在多種細(xì)胞中蓄積的基因產(chǎn)物，其啟動(dòng)子已從數(shù)種物種中克隆出來在轉(zhuǎn)基因植物中使用(如向日葵-Binet等，Plant Science7987-94(1991)；玉米-Christensen等，Plant Molec.Biol.12619-632(1989)；以及arabidopsis-Norris等，Plant Mol.Biol.21895-906(1993))。已在轉(zhuǎn)基因單子葉系統(tǒng)中研究成了玉米泛素啟動(dòng)子，專利公布EP 0 342 926(Lubrizol公司)公開了其序列和為單子葉植物轉(zhuǎn)化所構(gòu)建的載體，其內(nèi)容在此引入作為參考。Taylor等人(Plant CellRep.12491-495(1993))描繪了一種載體(pAHC25)，它包含玉米泛素啟動(dòng)子和第一個(gè)內(nèi)含子，通過微粒轟擊導(dǎo)入之后在大量的單子葉植物的細(xì)胞懸液中具有很高的活性。Arabidopsis泛素啟動(dòng)子在與本發(fā)明的核苷酸序列一起使用是理想的。泛素啟動(dòng)子同時(shí)適宜于單子葉和雙子葉轉(zhuǎn)基因植物中的基因表達(dá)。合適的載體包括pAHC25的衍生物或本申請中所述的任意轉(zhuǎn)化載體。可將合適的泛素啟動(dòng)子及/或內(nèi)含子序列導(dǎo)入載體，對其進(jìn)行修飾。
b.CaMV 35S啟動(dòng)子已公開的專利申請EP 0 392 225(于1991年9月25日公開；CibaGeigy公司；實(shí)施例23)描述了質(zhì)粒pCGN1761的構(gòu)建，其內(nèi)容在此引入入作為參考。該質(zhì)粒含雙CaMV 35S啟動(dòng)子和tml轉(zhuǎn)錄終止子，在啟動(dòng)子和終止子間存在一個(gè)唯一的EcoRI位點(diǎn)，并具有pUC型的主鏈。構(gòu)建了含修飾多接頭的pCGN1761的衍生物，該接頭除了已有的EcoRI位點(diǎn)外還包括NotI和XhoI位點(diǎn)。該衍生的特指pCGN1761ENX對于克隆其多接頭內(nèi)轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的表達(dá)受35S啟動(dòng)子調(diào)控的cDNA序列或編碼序列(包括微生物ORF序列)時(shí)非常有用。構(gòu)建體的這樣一個(gè)完整35S啟動(dòng)子-編碼序列-tml終止子表達(dá)盒，可在啟動(dòng)子5’的HindIII、SphI、SalI和XbaI位點(diǎn)及終止子3’端的XBaI、BamHI和BglI位點(diǎn)進(jìn)行切除，用于轉(zhuǎn)移到諸如下述轉(zhuǎn)化載體。而且，雙35S啟動(dòng)子片段可用HindIII、SphI、SalI、XbaI或Pstl進(jìn)行5’端切除，及在任意多接頭位點(diǎn)(EcoRI、NotI或XhoI)進(jìn)行3’端切除，以用其他啟動(dòng)子取而代之。如果必要的話，可導(dǎo)入能增強(qiáng)翻譯的序列對克隆位點(diǎn)的周圍進(jìn)行修飾。這一點(diǎn)在需要過表達(dá)時(shí)尤其有用。例如，可如美國NO.5,639,949號專利(1997年6月17日頒給CibaGeigy公司)所述對pCGN1761ENX作出修飾，優(yōu)化翻譯起始位點(diǎn)，其他內(nèi)容在此引入作為參考。
c.肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子
已知大部分類型的細(xì)胞中均有數(shù)種同功型的肌動(dòng)蛋白表達(dá)，因而肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子的一個(gè)好選擇。特別是來自于水稻ActI基因的啟動(dòng)子已克隆出來并得到鑒定(McElroy等，Plant Cell 2163-171(1990))。發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子的一個(gè)1.3kb片段含在水稻原生質(zhì)體中表達(dá)所需的所有調(diào)控序列。而且，已構(gòu)建了特別在單子葉植物中使用、基于ActI啟動(dòng)子的大量表達(dá)載體(McElroy等，Mol.Gen.Genet.231150-160(1991))。它們導(dǎo)入了ActI內(nèi)含子1、AdhI 5’旁側(cè)序列和AdhI內(nèi)含子1(來自于玉米乙醇脫氫酶基因)，及來自于CaMV35S啟動(dòng)子的序列。表現(xiàn)出高表達(dá)水平的載體是35S與ActI內(nèi)含子或ActI 5’旁側(cè)序列和ActI內(nèi)含子的融合體。對(GUS報(bào)告基因的)起始ATG附近的序列進(jìn)行優(yōu)化也可增強(qiáng)表達(dá)。McElroy等所述(Mol.Gen.Genet.231150-160(1991))的啟動(dòng)子表達(dá)盒易于修飾用于基因表達(dá)，尤其適宜于在單子葉植物宿主中使用。例如可從McElroy構(gòu)建體中移除含啟動(dòng)子的片段，并用它取代pCGN1761ENX中的雙35S啟動(dòng)子，pCGN1761ENX就可以插入特定的基因序列了。然后將這樣構(gòu)建的融合基因轉(zhuǎn)到合適的轉(zhuǎn)化載體中。在一單獨(dú)的報(bào)道中，也發(fā)現(xiàn)水稻ActI啟動(dòng)子及其第一個(gè)內(nèi)啟子也可在培養(yǎng)的大麥細(xì)胞中指導(dǎo)高水平表達(dá)(Chibbar等，Plant Cell Rep.12506-509(1993))。
誘導(dǎo)型表達(dá)a.PR-1啟動(dòng)子pCGN1761ENX中的雙35S啟動(dòng)子可選擇適合于高水平表達(dá)的其他任意啟動(dòng)子取代。例如，美國專利NO.5,614,395(1997年3月25日頒給Ciba Geigy)中所述的化學(xué)物質(zhì)調(diào)控啟動(dòng)子如煙草PR-1a啟動(dòng)子，可取代該雙35S啟動(dòng)子。此外，也可使用Lebel等在Plant J.16223-233(1998)中所述的arabidopsis PR-1啟動(dòng)子。啟動(dòng)子優(yōu)先選擇用限制性內(nèi)切酶從其來源切下來的啟動(dòng)子，但也可替代性地選擇用攜帶合適末端限制性酶切位點(diǎn)的引物通過PCR擴(kuò)增出來的的啟動(dòng)子。應(yīng)該先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后在靶載體中克隆擴(kuò)增的啟動(dòng)子后對對其重新測序，檢查是否有擴(kuò)增錯(cuò)誤發(fā)生。將化學(xué)物質(zhì)/病原體可調(diào)控的煙草PR-1a啟動(dòng)子從pCIB1004質(zhì)粒(其構(gòu)建參見EP 0 332 104(1991年3月20日公開，Ciba Geigy)的實(shí)施例21，其內(nèi)容在此引入作為參考)中切下來，并轉(zhuǎn)到pCGN1761ENX質(zhì)粒(Uknes等，Plant Cell 4645-656(1992))中。用NcoI切割pCIB1004質(zhì)粒，所得線性片段的3’突出端用T4 DNA聚合酶處理使之變成平端。然后將該片段用HindIII切割，所得含PR-1a啟動(dòng)子片段用凝膠純化，將克隆入雙35S啟動(dòng)子已除去的pCGN1761ENX中。這一步這樣操作用XhoI切割、T4 DNA聚合酶平端化，然后用HindIII切割，將pCIB1004啟動(dòng)子片段所克隆入的、含大一些載體終止子的片段分離出來。這一步產(chǎn)生的一種含PR-1a啟動(dòng)子、tml終止子及具有唯一EcoRI和NotI位點(diǎn)的插入多接頭的pCGN1761ENX衍生物。所選的編碼序列可插入此載體中，隨后可將融合產(chǎn)物(即啟動(dòng)子-基因-終止子)轉(zhuǎn)到包括下文所述轉(zhuǎn)化載體在類的選定轉(zhuǎn)化載體中。
可使用各種化學(xué)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)選定編碼序列在根據(jù)本發(fā)明所轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)，這些調(diào)節(jié)劑包括美國專利NOs.5,523,311和5,614,395公開的苯并噻二唑、異煙酸、水楊酸類化合物。
b.乙醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可被某些醇或酮如乙醇誘導(dǎo)的的啟動(dòng)子，也可用于本發(fā)明編碼序列的誘導(dǎo)性表達(dá)。例如，來自于構(gòu)巢曲霉alcA基因的啟動(dòng)子就是這樣一種啟動(dòng)子(Caddick等，1998，Nat.Biothechnol，16177-180)。在構(gòu)巢曲霉中，alcA基因編碼乙醇脫氫酶I，其表達(dá)由化學(xué)誘導(dǎo)劑存在時(shí)的AlcR轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。就本發(fā)明的目的來說，含與基本35S啟動(dòng)子融合的alcA基因啟動(dòng)子序列的placA:CAT質(zhì)粒(Caddick等，1998，Nat.Biothechnol，16177-180)中編碼CAT的序列用本發(fā)明的編碼序列取代，以形成具用受alcA基因啟動(dòng)子調(diào)控的編碼序列的表達(dá)盒。這一步用本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的方法完成。
c.糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子本發(fā)明核酸序列的誘導(dǎo)表達(dá)也計(jì)劃使用基于甾體激素的系統(tǒng)。例如，使用了了一種糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的誘導(dǎo)系統(tǒng)(Aoyama和Chua，1997，The Plant Journal，11)，基因的表達(dá)用糖皮質(zhì)激素如合成的糖皮質(zhì)激素，優(yōu)選地塞米松來誘導(dǎo)，濃度優(yōu)選0.1mM至1mM，更優(yōu)選10mM到100mM。出于本發(fā)明目的考慮，用本發(fā)明的核酸序列取代了螢光素酶基因序列以形成含有本發(fā)明核酸序列的表達(dá)盒，其中本發(fā)明的核酸序列受六拷貝與35S基本啟動(dòng)子融合的GAL4上游激活序列調(diào)控。這一步用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法完成。該反式作用因子包含與皰疹病毒蛋白VP16反式激活域(Picard等，1988，GenesDevel.，2718-729)融合的GAL4 DNA-結(jié)合域(Keegan等，1986，Science，231699-704)，其中VP16與大鼠糖皮質(zhì)激素受體的激素結(jié)合域融合(Picard等，1988，Cell，541073-1080)。本領(lǐng)域所知或此處所述的任意適于植物中表達(dá)的載體均可調(diào)控該融合蛋白的表達(dá)。該表達(dá)盒也可包含于含有與6xGAL4/基本啟動(dòng)子融合的本發(fā)明核酸序列的植物中。這樣就可實(shí)現(xiàn)融合蛋白的組織或器官特異性，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明表達(dá)盒的組織或器官特異性。
d.創(chuàng)傷誘導(dǎo)的啟動(dòng)子創(chuàng)傷誘導(dǎo)的啟動(dòng)子也適宜于基因表達(dá)。已有大量這樣的啟動(dòng)子報(bào)道(例如，Xu等，Plant Molec.Biol.22573-588(1993)；Logemann等，Plant Cell 1151-158(1989)；Rohrmeier & Lehle，Plant Molec.Bil.22783-792(1993)；Firek等，Plant Molec.Bil.22129-142(1993)；Warner等，Plant J.3191-201(1993))，并且均適宜于在本發(fā)明中使用。Logemann等描述了雙子葉植物土豆wunI基因的5’上游序列。Xu等表明來自于雙子葉植物土豆(pin2)的創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子在單子葉植物水稻中具有活性。Rohrmeier & Lehle進(jìn)一步描述了玉米WipI cDNA的克隆，它由創(chuàng)傷誘導(dǎo)并可用于利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離同源啟動(dòng)子。類似的，F(xiàn)irek等和Warner等描述了一個(gè)來自于蘆筍的創(chuàng)傷誘導(dǎo)基因，其在創(chuàng)傷和病原體入侵部位局部表達(dá)。利用本領(lǐng)域眾所周知的克隆技術(shù)，可將這些啟動(dòng)子轉(zhuǎn)到合適的載體中，與屬于本發(fā)明的基因融合，并可用于在植物受傷部位表達(dá)這些基因。
3.組織特異性表達(dá)a.根特異性表達(dá)
基因表達(dá)的另一模式是根部表達(dá)。本發(fā)明構(gòu)建體和方法的合適根啟動(dòng)子之一是Framond(FEBS 290103-106(1991))及美國專利NO.5,466,785(1995年11月14日頒給Ciba Geigy)所述的玉米金屬硫蛋白樣(MTL)基因啟動(dòng)子，在此將其內(nèi)容引入作為參考。該“MTL”啟動(dòng)子轉(zhuǎn)到諸如pCGN1761ENX的合合適載體中以插入選定的基因，隨后將不整個(gè)啟動(dòng)子-基因-終止子表達(dá)盒轉(zhuǎn)到目標(biāo)轉(zhuǎn)化體載體中。
b.髓(pith)傾向性表達(dá)專利申請WO 93/07278(1993年4月15日公布，Ciba Geigy)描述了如何分離玉米trpA基因，該基因傾向于在髓細(xì)胞中表達(dá)，在此將其引入作為參考。其基因序列和啟動(dòng)子從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)延伸到-1726bp。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，可將此啟動(dòng)子或其部分轉(zhuǎn)到諸如pCGN1761的載體中，取代35S啟動(dòng)子，并用于驅(qū)動(dòng)外源基因以髓傾向表達(dá)的方式表達(dá)。實(shí)際上，含髓傾向性啟動(dòng)子或其部分的片段可轉(zhuǎn)到任意載體中并加以修飾，在轉(zhuǎn)基因植物中利用。
c.葉特異性表達(dá)Hudspeth和Grula(Plant Molec Biol 12579-589(1989))描述了一個(gè)編碼磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的基因。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，該基因的啟動(dòng)子可用于驅(qū)動(dòng)任意基因以葉特異性的方式在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。
d.花粉特異性表達(dá)WO 93/07278(1993年4月15日公布，Ciba Geigy)描述了玉米鈣鈣依賴性蛋白激酶(CDPK)基因的分離方法，該基因在花粉細(xì)胞中表達(dá)。該基因和啟動(dòng)子從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)延伸到1400bp。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，該啟動(dòng)子或其部分可轉(zhuǎn)到諸如pCGN1761的載體中，取代35S啟動(dòng)子，并驅(qū)動(dòng)本發(fā)明的核酸序列以花粉特異性的方式表達(dá)。
B.轉(zhuǎn)錄終止子本發(fā)明的表達(dá)盒中可使用各種各樣的轉(zhuǎn)錄終止子。這些終止子負(fù)責(zé)終止超越轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄并校正mRNA聚腺苷酸化。合適的終止子是已知在植物中起作用的終止了，包括但不限于CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂堿合酶終止子和碗豆rbcS E9終止子。這些在單子葉植物和雙子葉植物中均可使用。另外，基因的天然轉(zhuǎn)錄終止子也可使用。
C.增強(qiáng)或調(diào)控表達(dá)的序列已發(fā)現(xiàn)大量序列可在轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)增強(qiáng)基因的表達(dá)，這些序列可與本發(fā)明基因連接起來以增強(qiáng)其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。
已發(fā)現(xiàn)各種內(nèi)含子序列可增強(qiáng)基因表達(dá)，尤其是在單子葉植物中。例如，已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)導(dǎo)入到玉米細(xì)胞時(shí)，玉米AdhI基因的內(nèi)含子顯著地增強(qiáng)野生型基因在其同源啟動(dòng)子之下的表達(dá)。已發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1效率特別高，并增強(qiáng)與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因融合的融合構(gòu)建體的表達(dá)(Callis等，Genes Develop.11183-1200(1987))。在相同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，來自于玉米bronzel基因的內(nèi)含子在增強(qiáng)表達(dá)方面具有類似的作用。內(nèi)含子序列已按常規(guī)導(dǎo)入到植物轉(zhuǎn)化載體中，通常在非翻譯前導(dǎo)序列內(nèi)。
大量來源于病毒的非翻譯前導(dǎo)序列也公認(rèn)能增強(qiáng)表達(dá)，并且在雙子葉植物中特定有效。具體地說，來自煙草花葉病毒(TMV，“W序列”)、玉米褪綠斑點(diǎn)病毒(maize chlorotic mottle virus，MCMV)、紫花苜?；ㄈ~病毒(AMV)的前導(dǎo)序列可有效增強(qiáng)表達(dá)(例如，Gallie等，Nucl.Acids Res.158693-8711(1987)，Skuzeski等，Plant Molec.Biol.1565-79(1990))。其他在本領(lǐng)域內(nèi)已知的前導(dǎo)序列包括但不限于細(xì)小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5′非編碼區(qū))(Elroy-Stein，O.，F(xiàn)uerst，T.R.，和Moss，B.，PNASUSA 866126-6130(1989))；馬鈴薯病毒前導(dǎo)序列，如TEV前導(dǎo)序列(煙草腐蝕病毒)(Allison等，1986)；MDMV前導(dǎo)序列(玉米矮花葉病毒)，Virology(1549-20)；人類免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)前導(dǎo)序列，(Macejak，D.G.，和Sarnow，P.，Nature 35390-94(1991))；來自于紫花苜?；ㄈ~病毒包衣蛋白mRNA(AMV RNA4)的未翻譯序列，(Jobling，S.A.，和Gehrke，L，Nature 325622-625(1987))；煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(TMV)，(Gallie，D.R.等，MolecularBiology of RNA，237-256頁(1989))；以及玉米褪綠斑點(diǎn)病毒(MCMV)前導(dǎo)序列(Lommel，S.A.等，Virology 81382-385(1991))。也可參見Della-Cioppa等，Plant physiology 84965-968(1987)。
D.GC/AT含量在本領(lǐng)域內(nèi)，已知可對基因的編碼區(qū)進(jìn)行優(yōu)化成首選宿主密碼子，從而使蛋白在植物中的表達(dá)最優(yōu)化。相應(yīng)地，植物中的優(yōu)先密碼子選擇與某些微生物的優(yōu)先密碼子選擇是不同的。將所克隆微生物ORF內(nèi)的密碼子選擇與植物基因(尤其是來自于目標(biāo)植物的基因)中的密碼子選擇比較，將可以鑒別ORF內(nèi)優(yōu)先改變的密碼子。典型的植物進(jìn)化已導(dǎo)致在單子葉植物中強(qiáng)列傾向第三個(gè)堿基位置選擇C和G，而在雙子葉植物中此位置則傾向于選擇A和T。將基因進(jìn)行改造，導(dǎo)入特定目標(biāo)轉(zhuǎn)基因物種的優(yōu)先密碼子選擇，下面所述許多關(guān)于GC/AT含量和不合理剪接的問題將得到解決。
典型的植物基因GC含量超過35％。植物中富含AT核苷酸的ORF序列會(huì)帶來數(shù)個(gè)問題。首先，ATTTA基序被認(rèn)為可導(dǎo)致信息的不穩(wěn)定，并在許多短生命期mRNA的3’端發(fā)現(xiàn)。其次，大家認(rèn)為在信息中不恰當(dāng)?shù)奈恢贸霈F(xiàn)聚腺苷酸化的信號如AATAAA可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄不成熟截短。另外，單子葉可能將富含AT的序列視為內(nèi)含子并識(shí)別旁側(cè)的剪接位點(diǎn)(見下文)。
E.靠近起始甲硫氨酸的序列植物與微生物的不同之處在于其信息不含固定的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。相反，大家認(rèn)為核糖體粘附到信息的5’末端并掃描第一個(gè)可用的ATG，并在此位點(diǎn)開始翻譯。然而，大家認(rèn)為在該ATG旁邊傾向于出現(xiàn)某些核苷酸，在ATG處包含真核細(xì)胞的共有翻譯起始子可以實(shí)現(xiàn)微生物基因的表達(dá)。Clontech(1993/1994目錄，210頁，在此引入作為參考)提出將一段序列作為在植物中表達(dá)E.coli uidA基因的共有翻譯起始子。還有，Joshi(NAR 156643-6653(1987)，在此引入作為參考)比較了許多植物ATG旁邊的序列，并提出了另一共有序列。當(dāng)在植物中表達(dá)微生物ORF遇到困難時(shí)，在起始ATG處包含這些序列中的一段可能可以促進(jìn)翻譯。在這樣的情況下，共有序列的最后三個(gè)核苷酸可能因?yàn)槠涞诙€(gè)AA殘基發(fā)生改變而不宜于包括進(jìn)去。GenBank數(shù)據(jù)庫中14個(gè)玉米基因的檢查得到下列結(jié)果14個(gè)玉米基因中起始ATG前的位置-10-9-8-7-6-5-4-3-2-1C 38 4 6 2 5 6 0 10 7T 30 3 4 3 2 1 1 10A 23 1 4 3 2 3 7 23G 63 6 0 6 5 4 6 15可在核苷酸序列將要導(dǎo)入以及ATG旁邊序列進(jìn)行改以導(dǎo)入優(yōu)選核苷酸的目標(biāo)植物種屬中進(jìn)行此分析。
從非植物來源克隆并非植物中表達(dá)優(yōu)化的基因也可含有在植物中識(shí)別為5’或3’剪接位點(diǎn)的基序并被切去，從而產(chǎn)生截短的或缺失的信息?？衫帽绢I(lǐng)域內(nèi)熟知的技術(shù)將這些位點(diǎn)去除。
用于修改編碼序列和鄰近序列的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。當(dāng)微生物ORF的起始表達(dá)水平低時(shí)，需要如上所述對該序列作出改變，然后按照本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法完成合成基因的構(gòu)建。例如，已公布的公開專利EP 0 385 962(1990年9月5日公布，Monsanto)、EP0359 472(1995年12月27日頒給Lubrizol)、WO 93/07278(1993年4月15日公布，Ciba-Geigy)均作了描述，其內(nèi)容在此引入作為參考。大部分情況下，優(yōu)選在轉(zhuǎn)到轉(zhuǎn)基因植物之前用瞬時(shí)檢測系統(tǒng)(本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知)分析基因構(gòu)建體的表達(dá)。
II.植物轉(zhuǎn)化載體及選擇標(biāo)記大量可用于植物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化載體在植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域內(nèi)是常規(guī)的技術(shù)，本發(fā)明的相關(guān)基因可與這些載體的任任何一個(gè)聯(lián)接使用。載體的選擇取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和要轉(zhuǎn)化的目標(biāo)種屬。就某些特定的目標(biāo)種屬來說，可傾向于使用不同的抗生素或除草劑選擇標(biāo)記。在轉(zhuǎn)化中常規(guī)使用的選擇標(biāo)記包括對卡那霉素及相關(guān)抗生素具有抗性的nptII基因(Messing & Vierra，1982，Gene 19259-268；Bevan等，1983，Nature，304184-187)，對除草劑膦絲菌素具有抗性的bar基因(White等，1990，Nucl.Acids Res 181062；Spencer等，1990，Thor.Appl.Genet 79625-631)，對抗生素潮霉素具有抗性的hph基因(Blochinger &Diggelmann，Mol Cell Biol 42929-2931)，和對氨甲蝶呤具有抗性的dhfr基因(Bourouis等，1983，EMBO J.2(7)1099-1104)，以及對草甘膦具有抗性的EPSPS基因(美國專利No 4,940,835和5,188,642，分別于1990年7月10日和1993年2月23日頒給Monsanto)和提供代謝甘露糖能力(美國專利No 5,767,378和5,994,629，分別于1998年6月16日和1999年11月30日頒給Novartis)的甘露糖-6磷酸異構(gòu)酶基因(此處也稱為磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因)。
適宜于土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體有許多載體可供用根瘤土壤桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)使用。它們通常攜帶至少一段T-DNA邊界序列，包括諸如pBIN19(Bevan，Nucl.Acids Res.1984)的誘導(dǎo)載體。下面描述了如何構(gòu)建兩種適宜于土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體。
pCIB200和pCIB2001雙元載體pCIB200和pCIB2001用于構(gòu)建與土壤桿菌一起使用的重組載體，按下述方式構(gòu)建。用NarI消化四環(huán)素抗性基因可切除的pTJS75(Schmidhauser & Helinski，1985，J.Bacteriol.164446-455)產(chǎn)生pTJS75kan，然后插入來自于pUC4K、攜帶有NPTII(Messing &Vierra，1982，Gene 19259-268；Bevan等，1983，Nature，304184-187；McBride等，1990，Plant Molecular Biology 14266-276)的AccI片段。XhoI連接子與含T-DNA左、右邊界、植物選擇性nos/nptII嵌合基因及pUC多接頭(Rothstein等，1987，Gene 53153-161)的PCIB7的EcoRV片段連接，將Xhol消化的片段克隆到SalI消化的pTJS75kan中以產(chǎn)生pCIB200(也可見EP 0 332 104，實(shí)施例19；1991年3月20日公布，Ciba Geigy)。pCIB200含有下列唯一額外限制限酶切西位點(diǎn)EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI和SalI。pCIB2001是將含另外限制性酶切位點(diǎn)的多接頭插入pCIB200所得的衍生物。pCIB2001中多接頭中的唯一限制性酶切位點(diǎn)是EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MluI、BclI、AvrII、ApaI、HpaI和StuI。除了具有這此唯一的限制性酶切位點(diǎn)外，pCIB2001也有植物和細(xì)菌卡那霉素選擇性、土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的T-DNA左右邊界、在大腸桿菌和其他宿主間遷移的RK2衍生trfA功能，以及同樣來源于RK2的OriT及OriV功能。pCIB2001多接頭適合用于克隆含其自有調(diào)控信號的植物表達(dá)盒。
pCIB10及其潮霉素選擇衍生物pCIB10雙元載體含有一個(gè)編碼在植物中進(jìn)行選擇的卡那霉素抗性基因和T-DNA的左、右邊界序列，并導(dǎo)入來自于具有廣泛宿主范圍的pRK252質(zhì)粒的序列，使得它可同時(shí)在大腸桿菌和土壤桿菌中復(fù)制。它的構(gòu)建如Rothstein等所述(1987，Gene 53153-161)。Gritz等(1983，Gene 25179-188)描述了v如何構(gòu)建各種導(dǎo)入潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的pCIP10衍生物。這些衍生物可使轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞僅對潮霉素(pCIB743)或?qū)Τ泵顾睾涂敲顾?pCIB715，pCIB717)進(jìn)行選擇。
適宜于非土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體不用根瘤土壤桿菌的轉(zhuǎn)化需繞過所選轉(zhuǎn)化載體中T-DNA序列的要求，因此除了上述含有T-DNA序列的載體外，可利用不含這些序列的載體。不依賴于土壤桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過微粒轟擊、原生質(zhì)體攝取(如PEG和電穿孔)及微注射進(jìn)行轉(zhuǎn)化。載體的選擇很大程度上取決于所轉(zhuǎn)化種屬的優(yōu)先選擇性。下面描述了如何構(gòu)建適宜于非土壤桿菌轉(zhuǎn)化的典型載體。
pCIB3064pCIB3064是適宜于直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、與除草劑basta(或膦絲菌素)選擇聯(lián)用的pUC衍生載體。pCIB246質(zhì)粒包含與大腸村菌GUS基因操縱性融合的CaMV 35S啟動(dòng)子及CaMV 35S轉(zhuǎn)錄終止子，PCT已公布的WO 93/07278專利申請(1993年4月15日公布，Ciba Geigy)對此作了描述。該載體的35S啟動(dòng)子包含兩段5’端起始位點(diǎn)的ATG序列。這些位點(diǎn)用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)進(jìn)行突變以消除ATG并產(chǎn)生SspI和PvuII限制性酶切位點(diǎn)。新的酶切位點(diǎn)距離SalI位點(diǎn)96和37bp，距真正的起始位點(diǎn)101和42bp。所得的pCIB246衍生物指定為pCIB3025。用SalI和SacI消化pCIB3025，從中切除GUS基因，末端鈍化并重新連接從而生成pCIB3060質(zhì)粒。從John Innes Centre，Norwich獲取pJIT82質(zhì)粒，并將含來源于綠色產(chǎn)色鏈霉菌bar基因的一段400bp SmaI片段切下來，插入pCIB3060的HpaI位點(diǎn)(Thompson等，1987，EBO J 62519-2523)。所產(chǎn)生的pCIB3064，包含處于CaMV35S啟動(dòng)子和終止子調(diào)控之下、進(jìn)行除草劑選擇的bar基因，具氨芐青霉素抗性的基因(進(jìn)行大腸桿菌選擇)及含有唯一SphI、PstI、HindIII和BamHI的多接頭。該載體適宜于含自身調(diào)控信號的植物表達(dá)盒的克隆。
pSOG19和pSOG35pSOG35質(zhì)粒是利用對氨甲蝶呤具有抗性的大腸桿菌二氫葉酸還原酶(DFR)基因作為選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)化載體。用PCR擴(kuò)增35S啟動(dòng)子(-800bp)、來自于玉米Adh1基因的內(nèi)含子6(-550bp)和18bp來自于pSOG10的GUS未翻譯前導(dǎo)序列。也用PCR擴(kuò)增編碼大腸桿菌II型二氫葉酸還原酶基因的一段250bp片段，并將這兩個(gè)片段用來自于pB1221(Clontech)的SacI-PstI片段裝配，其中pB1221包含pUC19載體主鏈和胭脂堿合酶終止子。將這些片段裝配起來后生成pSOG19，包含與內(nèi)含子6序列融合的35S啟動(dòng)子、GUS前導(dǎo)序列、DHFR基因及胭脂堿合酶終止子。用來自于玉米褪綠斑點(diǎn)病毒(MCMV)的前導(dǎo)序列取代pSOG19中的GUS前導(dǎo)序列生成pSOG35。pSOG19和pSOG35攜帶有氨芐青霉素抗性的pUC基因，并具有可用于外源物質(zhì)克隆的HindIII、SphI、PstI和EcoRI位點(diǎn)。
適宜于葉綠體轉(zhuǎn)化的的載體使用質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPH143(WO 97/32011，實(shí)施例36，1997年9月4日公布，Novartis)在植物質(zhì)體中表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列。將核苷酸序列插入pPH143以取代編碼PROTOX的序列。然后將該載體用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化并進(jìn)行壯觀霉素抗性選擇。此外，將核苷酸序列插入pPH143以取代aadH基因。此時(shí)，轉(zhuǎn)化體可由PROTOX抑制劑抗性進(jìn)行選擇。
III.轉(zhuǎn)化方法按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物可以單子葉或雙子葉植物，包括但不限于玉米、小麥、大麥、黑麥、甘薯、菜豆、碗豆、菊苣、萵苣、卷心菜、花椰菜、椰菜、蕪箐、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、胡椒、芹菜、葫蘆瓜、南瓜、大麻、西葫蘆、蘋果、梨、溫柏、甜瓜、卡諾拉、李、櫻桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠蘿、鱷梨、木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高梁、甘蔗、甜菜、向日葵、苜蓿、煙草、胡蘿卜、棉、紫花苜蓿、水稻、土豆、茄子、黃瓜、擬南芥及諸如松類和落葉植物的木質(zhì)植物，尤其是玉米、小麥或甜菜。
一旦需要的DNA序列轉(zhuǎn)化入特定的植物物種中，它可在該物種中繁殖或利用傳統(tǒng)的培育技術(shù)進(jìn)入相同種屬的其他變體，尤其包括商用變體。
下面說明了轉(zhuǎn)化雙子葉植物或單子葉植物的代表性技術(shù)以及代表性的質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)。
雙子葉植物的轉(zhuǎn)化雙了葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知，包括基于土壤桿菌的技術(shù)和不需要土壤桿菌的技術(shù)。非土壤桿菌的技術(shù)涉及原生質(zhì)體或細(xì)胞對外源基因物質(zhì)的直接攝取。這一點(diǎn)可通過PEG或電穿孔介導(dǎo)的攝取、微粒轟擊介導(dǎo)的輸送或微注射完成。Paxzkowski等，1984，EMBO J 32717-2722；Potrykus等，1985，Mol.Gen.Genet.199169-177；Reich等，1986，Biotechnology 41001-1004；以及Klein等，1987，Nature 32770-73等描述了這些技術(shù)的實(shí)例。在各種情況下轉(zhuǎn)化的細(xì)胞用本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)再生成完整的植物。
因?yàn)槠滢D(zhuǎn)化效率高和可廣泛為許多不同的物種所利用，土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是用于雙子葉的優(yōu)選技術(shù)。土壤桿菌轉(zhuǎn)化通常涉及將攜帶目標(biāo)外源DNA的雙元載體(如pCIB200或pCIB2001)轉(zhuǎn)到適當(dāng)?shù)耐寥罈U菌菌株，該菌株需要宿主土壤桿菌菌株中共存Ti質(zhì)?；蛉旧w(例如，pCIB200和pCIB2001的CIB542菌株(Uknes等，1993，Plant Cell 5159-169))上所攜帶vir基因的互補(bǔ)。重組載體向土壤桿菌的轉(zhuǎn)移用攜帶該重組雙元載體的大腸桿菌通過三親體配對方法完成，其中攜帶重組雙元載體的大腸桿菌為攜帶諸如pRK2013的質(zhì)粒并能把重組載體移到目標(biāo)土壤桿菌的輔助大腸桿菌。此外，該重組雙元載體可通過DNA轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)到土壤桿菌(Hfgen & Willmitzer，1988，Nucl.Acids Res.169877)。
用重組土壤桿菌對目標(biāo)植物種屬的轉(zhuǎn)化通常涉及土壤桿菌與來自于該植物的外植體共培養(yǎng)，以及遵循本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方案。在選擇性培養(yǎng)基上使轉(zhuǎn)化的組織再生，其中該選擇性培養(yǎng)基攜帶有位于雙鏈質(zhì)粒T-DNA邊界間的抗生素或除草劑抗性標(biāo)記。
用基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的另一途徑涉及在植物組織或細(xì)胞推進(jìn)無活性或具有生物活性的顆粒。美國專利NO.4,945,050、5,036,006及5,100,792公開了此技術(shù)，均頒給Sanford等(分別于1990年7月31日、1991年7月30日和1992年3月31日頒發(fā))。一般地，該方法涉及在有效穿透細(xì)胞外表面及其提供摻入內(nèi)部的條件下推進(jìn)無活性或具生物活性的顆粒。當(dāng)使用無活性顆粒時(shí)，可用含目的基因的載體包被顆粒，從而將載體導(dǎo)入細(xì)胞。此外，目標(biāo)細(xì)胞可用載體包圍以便該載體可通過顆粒的激發(fā)而進(jìn)入細(xì)胞。生物活性的顆粒(如干酵母細(xì)胞、干細(xì)菌或細(xì)菌噬菌體，均含有需要引入的DNA)也可推進(jìn)植物細(xì)胞組織中。
單子葉植物的轉(zhuǎn)化大部分單子葉植物種屬的轉(zhuǎn)化現(xiàn)在也成為常規(guī)了。優(yōu)選的技術(shù)包括用PEG(聚乙二醇)或電穿孔技術(shù)及顆粒轟擊將基因直接轉(zhuǎn)入愈合組織中。轉(zhuǎn)化可用單個(gè)DNA種屬或多DNA種屬(即共轉(zhuǎn)化)實(shí)施，這些均適用于本發(fā)明。共轉(zhuǎn)化具有避免完全載體構(gòu)建，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物該目標(biāo)基因與選擇標(biāo)記的非鏈接基因座、選擇標(biāo)記可在后來的子代中去除的優(yōu)勢，這樣是非常理想的。然而，使用共轉(zhuǎn)化的一個(gè)劣勢是分離的DNA種屬整合入基因組的頻率少于100％(Schocher等，1986，Biotechnology 41093-1096)。
專利申請EP 0 292 435(1995年7月26日頒給Ciba Geigy)、EP0 392 225(1991年9月25日公布，Ciba Geigy)和WO 93/07278(1993年4月15日公布，Ciba Geigy)描述了從玉米原種近交系制備愈合組織和原生質(zhì)體的技術(shù)、用PEG或電穿孔技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的技術(shù)和從轉(zhuǎn)化的原生體再生玉米植物的技術(shù)。Gordon-Kamm等(1990，Plant Cell2603-618)及Fromm等(1990，Biotechnology 8833-839)公開了用顆粒轟擊轉(zhuǎn)化A188衍生的玉米系的技術(shù)。而且，WO 93/07278(1993年4月15日公布，Ciba Geigy)和Koziel等(1993，BioTechnology 11194-200)描述了用顆粒轟擊轉(zhuǎn)化玉米原種近交系的技術(shù)。此技術(shù)利用從授粉14-15天后的玉米穗切下來長1.5-2.5mm的未成熟玉米胚，pDS-1000He生物彈射裝置用于轟擊。
水稻的轉(zhuǎn)化也可利用原生質(zhì)體或顆粒轟擊的直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)完成。已描述了原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化用于japonica-type及Indica-type(Zhang等，1988，Plant Cell Rep 7379-384；Shimamoto等，1989，Nature 338274-277；Datta等，1990，Biotechnology 8736-740)。兩種類型均可用顆粒轟擊進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)化(Christou等，1991，Biotechnology 9957-962)。而且，WO 93/21335(1993年11月28日公開，Plant Genetic Systems)描述了通過電穿孔轉(zhuǎn)化水稻的技術(shù)。專利申請0 332 581(1996年12月11日頒給Ciba Geigy)描述了產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化及再生Pooideae原生質(zhì)體的技術(shù)。這些技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)Dactylis及小麥的轉(zhuǎn)化。此外，Vasil等(1992，Biotechnology 10667-674)描述了利用顆粒轟擊入C型長期可再生愈合組織細(xì)胞的小麥轉(zhuǎn)化，Vasil等(1993，Biotechnology 111553-1558)和Weeks等(1993，Plant Physiol.1021077-1084)也描述了用未成熟胚及未成熟胚衍生的愈合組織的小麥轉(zhuǎn)化。然而小麥轉(zhuǎn)化的優(yōu)選技術(shù)涉及通過未成熟胚的顆粒轟擊的小麥轉(zhuǎn)化，包括在基因輸送前的高蔗糖或高麥芽糖的步驟。在轟擊前，將任意數(shù)量的胚(長0.75-1mm)種植到含3％蔗糖和3mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基上(Murashiga & Skoog，1962，PhysiologiaPlantarum 15473-497)以誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，此步可以在黑暗中進(jìn)行。在選擇轟擊當(dāng)天，將胚從誘導(dǎo)培養(yǎng)基取下來置于滲壓劑上(即含加入所需濃度蔗糖或麥芽糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，濃度典型為15％)。可使胚的胞質(zhì)皺縮2-3小時(shí)，然后轟擊。盡管不是關(guān)鍵的，通常是每目標(biāo)板24個(gè)胚。利用標(biāo)準(zhǔn)方法將攜帶基因的合適質(zhì)粒(如pCIB3064或pSG35)沉淀到微米大小的金顆粒上。用DuPont BioListics氦裝置以約1000psi的脈壓使用標(biāo)準(zhǔn)80目屏幕對每一板胚射擊。轟擊之后，胚放回到黑暗中恢復(fù)約24小時(shí)(仍在滲壓劑上)。24小時(shí)后，將胚從滲壓劑上移下來并放回誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在再生前放置約一個(gè)月。約一個(gè)月后胚外植體與正在發(fā)育的胚愈合組織轉(zhuǎn)到含合適選擇試劑(pCIB3064時(shí)是10mg/L basta，pSOG35時(shí)是2mg/L氨甲蝶呤)的再生培養(yǎng)基上(MS+1mg/L NAA，5mg/L GA)。經(jīng)過約一個(gè)月后，發(fā)育的芽轉(zhuǎn)至更大的諸如“GA7s”的無菌容器中，其含有一半濃度的MS、2％蔗糖、及同樣濃度的選擇試劑。
利用土壤桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物已有描述。參見WO 94/00977(1994年1月20日公布，日本煙草公司)及美國專利NO.5,591,616(1997年1月7日頒給日本煙草公司)，其內(nèi)容在此引入作為參考。
質(zhì)體的轉(zhuǎn)化基本按方法所述(Svab，Z.和Maliga，P.，1993，PNAS 90，913-917)，Nicotiana tabacum c.v.‘Xanthi nc’的種子在T瓊脂培養(yǎng)基上以每板七個(gè)呈1”環(huán)形排列發(fā)芽，播種12-14天后用來源于pPH143及pPH145質(zhì)粒的DNA包被的1μm鎢顆粒(M10，Biorad，Hercules，CA)轟擊。轟擊后的幼苗在T培養(yǎng)基上孵育2天，然后將葉切下來置于明光(350-500umol光子/m2/s)上遠(yuǎn)軸一側(cè)含500μg/ml二鹽酸壯觀霉素(Sigma，St.Louis，MO)的RMOP培養(yǎng)基(Svab，Z.，Hajdukiewica，p.和Maliga，p.，1990，PNAS 87，8526-8530)板上。轟擊3到8周后仍底層葉仍是原色的穩(wěn)定芽亞克隆到相同的選擇培養(yǎng)基，使其形成愈合組織，分離次級芽并進(jìn)行亞克隆。用標(biāo)準(zhǔn)Souther印跡技術(shù)(Sambrook等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港)分析獨(dú)立亞克隆中完全分離的已轉(zhuǎn)化質(zhì)體基因組拷貝(同質(zhì)體)。BamHI/EcoRI消化的總細(xì)胞DNA(Mettler，I.J.，1987，Plant MolBiol reporter 5，346-349)在1％Tris硼酸鹽(TBE)瓊脂糖凝膠上分離，轉(zhuǎn)到尼龍膜(Amersham)上，并根據(jù)來自于含rps7/12質(zhì)體目標(biāo)序列一部分的PC8的0.7kb BamHI/HindIII DNA片段，用32P-標(biāo)記的隨機(jī)引物DNA序列探測。同質(zhì)的芽以無菌方式種到含鏈霉素的MS/IBA培養(yǎng)基中(McBride，K.E.等，1994，PNAS 91，7301-7305)并轉(zhuǎn)移到溫室里。
本發(fā)明將進(jìn)一步描述下列實(shí)施例，這些實(shí)施例不以任何方式對本實(shí)施例1推斷的Nov9x氨基酸序列(SEQ ID NO1)用GCG分析程序Backtranslate和高表達(dá)玉米基因密碼子表(參見美國專利NO.5,625,136)轉(zhuǎn)化成玉米優(yōu)化的核酸序列。由Integrated DNA technologies，Inc.公司(Coralville，IA)制備合成的基因。
Nov9x植酸酶氨基酸序列(8個(gè)突變以粗體和下劃線標(biāo)明)(SEQID NO1)MAQSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWPTWPVKLGELTPRGGELIAYLGHYWRQRLVADGLLPKCGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILERAGGSIADFTGHYQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESCSLTQALPSELKVSADCVSLTGAVSLASMLTEIFLLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFDLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSLNov9x植酸酶經(jīng)玉米優(yōu)化的核酸序列(SEQ ID NO2)5’和3’末端分別包括BamHI和SacI克隆位點(diǎn)(下劃線標(biāo)明)。起始密碼和終止密碼以粗體顯示。
GGATCCACCATGGCGCAGTCCGAGCCGGAGCTGAAGCTGGAGTCCGTGGTGATCGTGTCCCGCCACGGCGTGCGCGCCCCGACCAAGGCCACCCAGCTCATGCAGGACGTGACCCCGGACGCCTGGCCGACCTGGCCGGTGAAGCTCGGCGAGCTGACCCCGCGCGGCGGCGAGCTGATCGCCTACCTCGGCCACTACTGGCGCCAGCGCCTCGTGGCCGACGGCCTCCTCCCGAAGTGCGGCTGCCCGCAGTCCGGCCAGGTGGCCATCATCGCCGACGTGGACGAGCGCACCCGCAAGACCGGCGAGGCCTTCGCCGCCGGCCTCGCCCCGGACTGCGCCATCACCGTGCACACCCAGGCCGACACCTCCTCCCCGGACCCGCTCTTCAACCCGCTCAAGACCGGCGTGTGCCAGCTCGACAACGCCAACGTGACCGACGCCATCCTGGAGCGCGCCGGCGGCTCCATCGCCGACTTCACCGGCCACTACCAGACCGCCTTCCGCGAGCTGGAGCGCGTGCTCAACTTCCCGCAGTCCAACCTCTGCCTCAAGCGCGAGAAGCAGGACGAGTCCTGCTCCCTCACCCAGGCCCTCCCGTCCGAGCTGAAGGTGTCCGCCGACTGCGTGTCCCTCACCGGCGCCGTGTCCCTCGCCTCCATGCTCACCGAAATCTTCCTCCTCCAGCAGGCCCAGGGCATGCCGGAGCCGGGCTGGGGCCGCATCACCGACTCCCACCAGTGGAACACCCTCCTCTCCCTCCACAACGCCCAGTTCGACCTCCTCCAGCGCACCCCGGAGGTGGCCCGCTCCCGCGCCACCCCGCTCCTCGACCTCATCAAGACCGCCCTCACCCCGCACCCGCCGCAGAAGCAGGCCTACGGCGTGACCCTCCCGACCTCCGTGCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACCTCGCCAACCTCGGCGGCGCCCTGGAGCTGAACTGGACCCTCCCGGGCCAGCCGGACAACACCCCGCCGGGCGGCGAGCTGGTGTTCGAGCGCTGGCGCCGCCTCTCCGACAACTCCCAGTGGATTCAGGTGTCCCTCGTGTTCCAGACCCTCCAGCAGATGCGCGACAAGACCCCGCTCTCCCTCAACACCCCGCCGGGCGAGGTGAAGCTCACCCTCGCCGGCTGCGAGGAGCGCAACGCCCAGGGCATGTGCTCCCTCGCCGGCTTCACCCAGATCGTGAACGAGGCCCGCATCCCGGCCTGCTCCCTCTAATAGAGCTCA.制備具玉米優(yōu)化植酸酶基因的表達(dá)盒構(gòu)建下列表達(dá)盒以在帶各種靶信號的玉米種子中表達(dá)Nov9X植酸酶。Nov9X編碼序列的5’末端有BamHI克隆位點(diǎn)，3’末端有SacI克隆位點(diǎn)。
pNOV4054包含與合成Nov9X植酸酶融合的γ-玉米醇溶蛋白N-末端信號序列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO3)，它將植酸酶靶向到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并分泌到質(zhì)外體中(Torrent等，1997)。緊接信號序列的第一個(gè)殘基是Ala，它取代了Nov9x的Met1。
pNOV4054植酸酶融合氨基酸序列(SEQ ID NO4)(γ-玉米醇溶蛋白以粗體顯示)
MRVLLVALALLALAASATSAAQSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWPTWPVKLGELTPRGGELIAYLGHYWRQRLVADGLLPKCGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILERAGGSIADFTGHYQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESCSLTQALPSELKVSADCVSLTGAVSLASMLTEIFLLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFDLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSLpNOV4054植酸酶融合核苷酸序列(SEQ ID NO5)顯示了旁側(cè)的5’BamHI和3’SacI克隆位點(diǎn)(下劃線標(biāo)明)。起始密碼和終止密碼以粗體顯示。
GGATCCACCATGAGGGTGTTGCTCGTTGCCCTCGCTCTCCTGGCTCTCGCTGCGAGCGCCACCAGCGCTGCGCAGTCCGAGCCGGAGCTGAAGCTGGAGTCCGTGGTGATCGTGTCCCGCCACGGCGTGCGCGCCCCGACCAAGGCCACCCAGCTCATGCAGGACGTGACCCCGGACGCCTGGCCGACCTGGCCGGTGAAGCTCGGCGAGCTGACCCCGCGCGGCGGCGAGCTGATCGCCTACCTCGGCCACTACTGGCGCCAGCGCCTCGTGGCCGACGGCCTCCTCCCGAAGTGCGGCTGCCCGCAGTCCGGCCAGGTGGCCATCATCGCCGACGTGGACGAGCGCACCCGCAAGACCGGCGAGGCCTTCGCCGCCGGCCTCGCCCCGGACTGCGCCATCACCGTGCACACCCAGGCCGACACCTCCTCCCCGGACCCGCTCTTCAACCCGCTCAAGACCGGCGTGTGCCAGCTCGACAACGCCAACGTGACCGACGCCATCCTGGAGCGCGCCGGCGGCTCCATCGCCGACTTCACCGGCCACTACCAGACCGCCTTCCGCGAGCTGGAGCGCGTGCTCAACTTCCCGCAGTCCAACCTCTGCCTCAAGCGCGAGAAGCAGGACGAGTCCTGCTCCCTCACCCAGGCCCTCCCGTCCGAGCTGAAGGTGTCCGCCGACTGCGTGTCCCTCACCGGCGCCGTGTCCCTCGCCTCCATGCTCACCGAAATCTTCCTCCTCCAGCAGGCCCAGGGCATGCCGGAGCCGGGCTGGGGCCGCATCACCGACTCCCACCAGTGGAACACCCTCCTCTCCCTCCACAACGCCCAGTTCGACCTCCTCCAGCGCACCCCGGAGGTGGCCCGCTCCCGCGCCACCCCGCTCCTCGACCTCATCAAGACCGCCCTCACCCCGCACCCGCCGCAGAAGCAGGCCTACGGCGTGACCCTCCCGACCTCCGTGCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACCTCGCCAACCTCGGCGGCGCCCTGGAGCTGAACTGGACCCTCCCGGGCCAGCCGGACAACACCCCGCCGGGCGGCGAGCTGGTGTTCGAGCGCTGGCGCCGCCTCTCCGACAACTCCCAGTGGATTCAGGTGTCCCTCGTGTTCCAGACCCTCCAGCAGATGCGCGACAAGACCCCGCTCTCCCTCAACACCCCGCCGGGCGAGGTGAAGCTCACCCTCGCCGGCTGCGAGGAGCGCAACGCCCAGGGCATGTGCTCCCTCGCCGGCTTCACCCAGATCGTGAACGAGGCCCGCATCCCGGCCTGCTCCCTCTAATAGAGCTC
pNOV4058包含與合成Nov9X植酸酶融合的γ-玉米醇溶蛋白N-末端信號序列，其中Nov9X植酸酶C末端帶有附加的一段SEKDEL序列以便將其靶向并固定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)(Munro和Pelham，1987)。緊接信號序列的第一個(gè)殘基是Ala，它取代了Nov9x的Met1。
pNOV4058植酸酶融合氨基酸序列(SEQ ID NO6)(N-末端的γ-玉米醇溶蛋白和C-末端的SEKDEL序列以粗體顯示)MRVLLVALALLALAASATSAAQSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWPTWPVKLGELTPRGGELIAYLGHYWRQRLVADGLLPKCGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILERAGGSLADFTGHYQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESCSLTQALPSELKVSADCVSLTGAVSLASMLTEIFLLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFDLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFLAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSLSEKDELpNOV4058植酸酶融合核苷酸序列(SEQ ID NO7)顯示了旁側(cè)的5’BamHI和3’SacI克隆位點(diǎn)(下劃線標(biāo)明)。編碼γ-玉米醇溶蛋白信號序列和SEKDEL信號序列的序列以粗體顯示。
GGATCCACCATGAGGGTGTTGCTCGTTGCCCTCGCTCTCCTGGCTCTCGCTGCGAGCGCCACCAGCGCTGCGCAGTCCGAGCCGGAGCTGAAGCTGGAGTCCGTGGTGATCGTGTCCCGCCACGGCGTGCGCGCCCCGACCAAGGCCACCCAGCTCATGCAGGACGTGACCCCGGACGCCTGGCCGACCTGGCCGGTGAAGCTCGGCGAGCTGACCCCGCGCGGCGGCGAGCTGATCGCCTACCTCGGCCACTACTGGCGCCAGCGCCTCGTGGCCGACGGCCTCCTCCCGAAGTGCGGCTGCCCGCAGTCCGGCCAGGTGGCCATCATCGCCGACGTG
GACGAGCGCACCCGCAAGACCGGCGAGGCCTTCGCCGCCGGCCTCGCCCCGGACTGCGCCATCACCGTGCACACCCAGGCCGACACCTCCTCCCCGGACCCGCTCTTCAACCCGCTCAAGACCGGCGTGTGCCAGCTCGACAACGCCAACGTGACCGACGCCATCCTGGAGCGCGCCGGCGGCTCCATCGCCGACTTCACCGGCCACTACCAGACCGCCTTCCGCGAGCTGGAGCGCGTGCTCAACTTCCCGCAGTCCAACCTCTGCCTCAAGCGCGAGAAGCAGGACGAGTCCTGCTCCCTCACCCAGGCCCTCCCGTCCGAGCTGAAGGTGTCCGCCGACTGCGTGTCCCTCACCGGCGCCGTGTCCCTCGCCTCCATGCTCACCGAAATCTTCCTCCTCCAGCAGGCCCAGGGCATGCCGGAGCCGGGCTGGGGCCGCATCACCGACTCCCACCAGTGGAACACCCTCCTCTCCCTCCACAACGCCCAGTTCGACCTCCTCCAGCGCACCCCGGAGGTGGCCCGCTCCCGCGCCACCCCGCTCCTCGACCTCATCAAGACCGCCCTCACCCCGCACCCGCCGCAGAAGCAGGCCTACGGCGTGACCCTCCCGACCTCCGTGCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACCTCGCCAACCTCGGCGGCGCCCTGGAGCTGAACTGGACCCTCCCGGGCCAGCCGGACAACACCCCGCCGGGCGGCGAGCTGGTGTTCGAGCGCTGGCGCCGCCTCTCCGACAACTCCCAGTGGATTCAGGTGTCCCTCGTGTTCCAGACCCTCCAGCAGATGCGCGACAAGACCCCGCTCTCCCTCAACACCCCGCCGGGCGAGGTGAAGCTCACCCTCGCCGGCTGCGAGGAGCGCAACGCCCAGGGCATGTGCTCCCTCGCCGGCTTCACCCAGATCGTGAACGAGGCCCGCATCCCGGCCTGCTCCCTCTCCGAGAAGGACGAGCTGTAATAGAGCTCB.分離用于玉米中胚乳特異表達(dá)的啟動(dòng)子從pGZ27.3質(zhì)粒將來自于玉米γ-玉米醇溶蛋白基因的啟動(dòng)子擴(kuò)增673bp的片段。γ-玉米醇溶蛋白具有胚乳特異性(Torrent等，1997)。將HindIII和BamHI克隆位點(diǎn)分別導(dǎo)入5’和3’末端。這些位點(diǎn)以下劃線標(biāo)明。
玉米γ-玉米醇溶蛋白基因啟動(dòng)子核酸序列(SEQ ID NO8)AAGCTTCGATCATCCAGGTGCAACCGTATAAGTCCTAAAGTGGTGAGGAACACGAAACAACCATGCATTGGCATGTAAAGCTCCAAGAATTTGTTGTATCCTTAACAACTCACAGAACATCAACCAAAATTGCACGTCAAGGGTATTGGGTAAGAAACAATCAAACAAATCCTCTCTGTGTGCAAAGAAACACGGTGAGTCATGCCGAGATCATACTCATCTGATATACATGCTTACAGCTCACAAGACATTACAAACAACTCATATTGCATTACAAAGATCGTTTCATGAAAAATAAAATAGGCCGGACAGGACAAAAATCCTTGACGTGTAAAGTAAATTTACAACAAAAAAAAAGCCATATGTCAAGCTAAATCTAATTCGTTTTACGTAGATCAACAACCTGTAGAAGGCAACAAAACTGAGCCACGCAGAAGTACAGAATGATTCCAGATGAACCATCGACGTGCTACGTAAAGAGAGTGACGA
GTCATATACATTTGGCAAGAAACCATGAAGCTGCCTACAGCCGTCTCGGTGGCATAAGAACACAAGAAATTGTGTTAATTAATCAAAGCTATAAATAACGCTCGCATGCCTGTGCACTTCTCCATCACCACCACTGGGTCTTCAGACCATTAGCTTTATCTACTCCAGAGCGCAGAAGAACCCGATCGACAGGATCCC.分離用于玉米中胚芽特異表達(dá)的啟動(dòng)子用從GenBank登記號L22344設(shè)計(jì)的引物，將來自于玉米基因組DNA中主要玉米胚芽球蛋白glob1的啟動(dòng)子和5’非編碼區(qū)擴(kuò)增成1427個(gè)堿基對的片段。該球蛋白啟動(dòng)子主要是胚芽特異性(Belanger和Kriz，1989)。將HindIII和BamHI克隆位點(diǎn)分別導(dǎo)入5’和3’末端。這些位點(diǎn)以下劃線標(biāo)明。
玉米球蛋白1啟動(dòng)子核酸序列(SEQ ID NO9)AAGCTTAGTGCCATCCTTGGACACTCGATAAAGTATATTTTATTTTTTTTATTTTGCCAACCAAACTTTTTGTGGTATGTTCCTACACTATGTAGATCTACATGTACCATTTTGGCACAATTACATATTTACAAAAATGTTTTCTATAAATATTAGATTTAGTTCGTTTATTTGAATTTCTTCGGAAAATTCACATTTAAACTGCAAGTCACTCGAAACATGGAAAACCGTGCATGCAAAATAAATGATATGCATGTTATCTAGCACAAGTTACGACCGATTTCAGAAGCAGACCAGAATCTTCAAGCACCATGCTCACTAAACATGACCGTGAACTTGTTATCTAGTTGTTTAAAAATTGTATAAAACACAAATAAAGTCAGAAATTAATGAAACTTGTCCACATGTCATGATATCATATATAGAGGTTGTGATAAAAATTTGATAATGTTTCGGTAAAGTTGTGACGTACTATGTGTAGAAACCTAAGTGACCTACACATAAAATCATAGAGTTTCAATGTAGTTCACTCGACAAAGACTTTGTCAAGTGTCCGATAAAAAGTACTCGACAAAGAAGCCGTTGTCGATGTACTGTTCGTCGAGATCTCTTTGTCGAGTGTCACACTAGGCAAAGTCTTTACGGAGTGTTTTTCAGGCTTTGACACTCGGCAAAGCGCTCGATTCCAGTAGTGACAGTAATTTGCATCAAAAATAGCTGAGAGATTTAGGCCCCGTTTCAATCTCACGGGATAAAGTTTAGCTTCCTGCTAAACTTTAGCTATATGAATTGAAGTGCTAAAGTTTAGTTTCAATTACCACCATTAGCTCTCCTGTTTAGATTACAAATGGCTAAAAGTAGCTAAAAAATAGCTGCTAAAGTTTATCTCGCGAGATTGAAACAGGGCCTTAAAATGAGTCAACTAATAGACCAACTAATTATTAGCTATTAGTCGTTAGCTTCTTTAATCTAAGCTAAAACCAACTAATAGCTTATTTGTTGAATTACAATTAGCTCAACGGAATTCTCTGTTTTTTCTATAAAAAAAGGGAAACTGCCCCTCATTTACAGCAAATTGTCCGCTGCCTGTCGTCCAGATACAATGAACGTACCTAGTAGGAACTCTTTTACACGCTCGGTCGCTCGCCGCGGATCGGAGTCCCAGGAACACGACACCACTGTGTAACACGACAAAGTCTGCTCAGAGGCGGCCACACCCTGGCGTGCACCGAGCCGGAGCCCGGATAAGCACGGTAAGGAGAGTACGGCGGGACGTGGCGACCCGT
GTGTCTGCTGCCACGCAGCCTTCCTCCACGTAGCCGCGCGGCCGCGCCACGTACCAGGGCCCGGCGCTGGTATAAATGCGCGCTACCTCCGCTTTAGTTCTGCATACAGTCAACCTAACACACCCGAGCATATCACAGTGGGATCCD.構(gòu)建玉米優(yōu)化植酸酶基因的植物轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建玉米轉(zhuǎn)化的雙元載體通過兩個(gè)步驟完成。在第一步中，將三個(gè)片段融合以產(chǎn)生表達(dá)盒。該表達(dá)盒由以融合方式連接的HindIII-BamHI啟動(dòng)子盒(上述B和C部分)、BamHI-SacI Nov9x盒(上述A部分)和SacI-KpnI終止子盒組成。終止子盒包括一個(gè)反向的PEPC內(nèi)含子。將表達(dá)盒以HindIII-BamHI片段轉(zhuǎn)到pNOV2117雙元載體中，pNOV2117含磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)基因，可用甘露糖對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行選擇。
制備的植物轉(zhuǎn)化雙元載體概況如表1。將此6個(gè)載體導(dǎo)入玉米內(nèi)。
表1所列的Nov9X雙元載體均含相同的帶PEPC內(nèi)含子的終止子盒。pNOV4051、4055、4059載體含球蛋白啟動(dòng)子盒，pNOV4053、4057、4059載體含γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子盒。pNOV4051和4053載體含有如SEQ ID NO2所示序列、具有胞漿靶向性的Nov9X。pNOV4055和4057載體含有來自于pNOV4054、具有質(zhì)外體靶向性的Nov9X。pNOV4059和4061載體含有來自于pNOV4058、具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)停留性的Nov9X。
表1
載體pNOV4057和pNOV4059已于2001年12月28日保藏于位于大學(xué)街1815N，Peoria，Illinois 61604，USA的美國農(nóng)業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心(NRRL)，保藏號分別為NRRL B-30537和NRRL B-30538。該中心是根據(jù)布達(dá)佩斯條約有關(guān)國際承認(rèn)的、用于專利方法的微生物保藏目的建立的國際保藏機(jī)構(gòu)。
實(shí)施例2玉米和小麥的基因修飾如上所述將插入適當(dāng)載體中的合成Nov9X基因用土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化導(dǎo)入玉米，用生物彈射轉(zhuǎn)化導(dǎo)入小麥。根據(jù)美國專利NO.5,767,378和5,994,629，使用Positech系統(tǒng)使穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體在選擇性培養(yǎng)基人從組織再生。
土壤桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化基本上按照Negrotto等，2000，Plant Cell Reports 19798-803所述實(shí)施未成熟玉米胚芽的轉(zhuǎn)化。其中所述的各種培養(yǎng)基成分可以加以替換。
轉(zhuǎn)化質(zhì)粒和選擇標(biāo)記用于轉(zhuǎn)化的基因克隆入上述適宜于玉米轉(zhuǎn)化的載體中。所用載體含作為選擇標(biāo)記的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)基因(Negrotto等，2000，Plant Cell Reports 19798-803)。
根瘤土壤桿菌的制備含植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的土壤桿菌株LBA4404(pSB1)置YEP固體培養(yǎng)基(酵母提取物(5g/L)，蛋白胨(10g/L)，NaCl(5g/L)，15g/L瓊脂，pH6.8)上于28℃生長2到4天。將約0.8×109重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化土壤桿菌懸浮于含100μM乙酰丁香酮(As)的LS-inf培養(yǎng)基(LSAs培養(yǎng)基)中(Negrotto等，2000，Plant Cell Reports 19798-803)細(xì)菌在此培養(yǎng)基中預(yù)誘導(dǎo)30-60分鐘。
接種將來自于A188或其他合適玉米基因型的未成熟胚芽從8～12天齡的穗切下來，置于液態(tài)LS-inf+100μM As(LSAs)。胚芽渦旋5秒，用新鮮感染培養(yǎng)基漂洗一遍。棄去感染培養(yǎng)基，加入土壤桿菌溶液，胚芽渦旋30秒，讓其與穩(wěn)定于細(xì)菌上5分鐘。然后將胚芽轉(zhuǎn)到盾片覆蓋的LSAs培養(yǎng)基，于黑暗中培養(yǎng)2～3天。隨后，以每petri皿20～25個(gè)胚芽將其轉(zhuǎn)到補(bǔ)充有頭孢噻肟(250mg/L)和硝酸銀(1.6mg/L)的LSDc培養(yǎng)基中(Negrotto等，2000)，在黑暗中于28℃培養(yǎng)約10天。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化植物的再生將生成胚芽性愈合組織的未成熟胚芽轉(zhuǎn)到LSD1M0.5S培養(yǎng)基(含取代二氯甲氧苯酸0.5mg/L 2，4-D、10g/L甘露糖、5g/L蔗糖、不含硝酸鹽的LSDc)。培養(yǎng)物在此培養(yǎng)基上選擇6周，在3周時(shí)進(jìn)行亞培養(yǎng)步驟。幸存的愈合組織轉(zhuǎn)移到LSD1M0.5S培養(yǎng)基使其發(fā)脹，或轉(zhuǎn)移到Reg1培養(yǎng)基(如Negrotto等，2000所述)。在明光(方案為16小時(shí)光/8小時(shí)暗)下培養(yǎng)后，將綠色組織轉(zhuǎn)到不含生長調(diào)控劑(如Negrotto等，2000所述)的Reg2培養(yǎng)基，孵育1～2周。將幼苗轉(zhuǎn)到含Reg3培養(yǎng)基的Magenta GA-7盒子中(Magenta公司，Chicago III.)，在光線下生長。Nov9X表達(dá)盒PCR陽性的植物轉(zhuǎn)到土壤中，于溫室內(nèi)生長。
DNA分析用+/-PCR測試或Taqman拷貝數(shù)測試來測定Nov9X基因的存在。用Taqman拷貝數(shù)測試測定PMI選擇標(biāo)記的存在。用+/-PCR測試測定鏈霉素抗性選擇性標(biāo)記。
實(shí)施例3玉米種子的蛋白提取物在授粉24～40天后或約30天時(shí)(DAP)收割第一代和第二代轉(zhuǎn)基因玉米植物的穗。新鮮的谷粒和分離的胚乳于室溫在水中粉碎。用研缽和杵在水中提取蛋白。
此外，將谷粒置穗軸上于105°F干燥5天。用Kleco組織粉碎機(jī)于室溫將干谷粒粉碎約20～30秒，得到粉末。100mg粉末加1ml緩沖液，于室溫孵育20分鐘，將蛋白提取出來。
4℃離心10分鐘，除去不溶物質(zhì)。提取物置冰上。用ADV01蛋白檢測試劑(Cytoskeleton，Denver，CO)以BSA為標(biāo)準(zhǔn)測定蛋白濃度。蛋白測定在96孔板中以310μl反應(yīng)體系進(jìn)行。用SpectraMaxPlus讀板儀(Molecular Devices)測量595nm的吸光度。典型地，10μl 10倍稀釋提取物進(jìn)一步用300μl ADV01試劑稀釋。
酶測定植酸酶活性的評估植酸酶活性的測定可按照Englelen等(2001)所述方法在37℃進(jìn)行，其活性基于評估肌醇六磷酸水解釋放的無機(jī)磷酸鹽含量。一個(gè)酶活性單位定義為在測定條件下每分鐘釋放1μmol無機(jī)磷酸鹽所需的酶用量。例如，植酸酶活性可以這樣測量將2.0ml酶制品與4.0ml的9.1mM肌醇六磷酸混合于37℃孵育60分鐘，其中肌醇六磷酸溶于pH5.5、補(bǔ)充有1mM CaCl2的250mM醋酸鈉緩沖液；孵育后，加入4.0ml顯色終止試劑終止反應(yīng)，終止試劑由等量的的10％(w/v)鉬酸銨和0.235％(w/v)釩酸銨儲(chǔ)備液組成；對比磷酸鹽在415nm處的一系列分光光度標(biāo)準(zhǔn)測量所釋放的磷酸鹽含量。用生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線將含植酸酶樣品所測得的A415nm吸收值進(jìn)行插值計(jì)算植酸酶活性。此外，用植酸酶標(biāo)準(zhǔn)品生成的植酸酶活性曲線可以代替磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定酶活性，植酸酶標(biāo)準(zhǔn)品的活性由廠商擔(dān)保。比活可以每mg蛋白的酶活性單位表示。
此外，也可按Wyss等，1999的方法稍作修改測量植酸酶活性。測定在1.5ml試管和96孔微量反應(yīng)板中進(jìn)行。試管測定時(shí)，將5μl的1M醋酸鈉(pH4.5)、10μl的10mM肌醇六磷酸(Sigma目錄號P8810)、5μl的1M蒸餾水與5μl稀釋提取物混合一起，開始測定。反應(yīng)液于37℃孵育10分鐘，將試管置于冰上，立即加入25μl 15％三氯醋酸(TCA)結(jié)束反應(yīng)。終止反應(yīng)液用450μl蒸餾水稀釋。
加入500μl比色試劑(0.6M硫酸、2％抗壞血酸和0.5％鉬酸銨)開始磷酸鹽濃度的比色測定，于50℃孵育15分鐘。測定800nm處的吸收值并與磷酸鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，以此測定磷酸鹽的濃度。
在微量反應(yīng)板(平底，孔容量為300μl)中測定時(shí)，將20μl的1M醋酸鈉、40μl的10mM肌醇六磷酸和40μl稀釋提取物混合，開始測定。混合時(shí)反應(yīng)板置于冰上。反應(yīng)板用箔密封，置反應(yīng)板加熱儀(Boekel-Grant PH-100)于37℃放置10分鐘。然后將反應(yīng)板轉(zhuǎn)到冰上，加入100μl的15％TCA結(jié)束反應(yīng)。取15μl終止反應(yīng)液用135μl蒸餾水在第二塊反應(yīng)板上稀釋，加入150μl比色劑開始比色反應(yīng)。第二志反應(yīng)板包括了磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品。反應(yīng)板用箔密封，置反應(yīng)板加熱儀(Boekel-Grant PH-100)于50℃放置15分鐘。對標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在820nm處的吸收值進(jìn)行重復(fù)讀數(shù)。
SDS-PAGE及Western印跡分析電泳樣品緩沖液及流動(dòng)緩沖液如Laemmli，1970。樣品煮沸2分鐘，然后用預(yù)凝的NOVEX Tris-進(jìn)行甘氨酸凝膠(Invitrogen)電泳。電泳轉(zhuǎn)移用NOVEX Mini-Cell系統(tǒng)(Invitrogen)按其操作方案和緩沖液配方進(jìn)行。轉(zhuǎn)移緩沖液含12mM Tris、96mM甘氨酸和20％甲醇。于25V和室溫下將多肽向硝化纖維素(NOVEX LC2000)轉(zhuǎn)移1～2小時(shí)。在30mM Tris-鹽酸(pH10.2)、150mM NaCl和補(bǔ)充有3％BSA的0.05％吐溫-20(TBST)中孵育，于室溫封閉15分鐘。
山羊初級免疫血清從Duncroft，Inc.公司(Lovettsville，VA)獲得。將山羊與從大腸桿菌(從Diversa獲得)提取的重組Nov9X植酸酶一起孵育。印跡與第一抗體(TBST以1∶2000稀釋)一起于室溫孵育1小時(shí)，然后用TBST洗滌35分鐘。用TBST以1∶50,000稀釋的第二抗體(小鼠抗-山羊IgG)重復(fù)此步驟。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光使印跡顯現(xiàn)出來。
實(shí)施例3用載體pNOV4057和pNOV4061轉(zhuǎn)化的第一代轉(zhuǎn)基因植物的玉米種子內(nèi)Nov9X植酸酶的蓄積玉米種子所產(chǎn)生植酸酶的示范性制劑之一是液體提取物的形式。這里描述了去胚、水提取、加熱和離心對Nov9X植酸酶的富集。
用來自兩棵第一代轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生成熟穗的新鮮谷粒分析植酸酶活性。這些植物源自已用質(zhì)粒pNOV4057(305A13事件)和pNOV4061(305B11事件)轉(zhuǎn)化的胚芽。從不含Nov9X植酸酶基因的第三方穗獲得相同年齡的新鮮谷粒。此對照植物(264A8C#14事件)包含pNOV4314載體，其編碼一種異源酶。各從三支穗取6粒谷粒和胚乳，用研缽和杵碾碎。在谷粒中加入ddH2O，到10ml。用混懸液的可溶性級分進(jìn)行總蛋白和植酸酶活性的分析。
谷粒及胚乳提取物的植酸酶測定結(jié)果如圖1所示。該測定測量了37℃孵育10分鐘后反應(yīng)液中的磷酸鹽濃度。陰性對照組織的提取物也包括在內(nèi)，以測定內(nèi)源性磷本鹽的水平(圖1，上圖)此北景磷酸鹽水平可在數(shù)種基于對照樣品粉末提取物的分析中重現(xiàn)(數(shù)據(jù)未列出)。進(jìn)行背景磷酸鹽校正后，計(jì)算兩種含Nov9X植酸酶基因的植物中的植酸酶活性。植酸酶活性以從6粒谷類所提取的總單位表示，如圖1的下圖所示。來自于相同穗的谷粒和胚乳來說，其總植酸酶活性差異由于轉(zhuǎn)基因分離所致。
圖1中分析的各胚乳提取物均取一部分于60℃加熱30分鐘。如圖2所示，這些提取物中的植酸酶活性不受加熱影響。用SDS-PAGE對未加熱和加熱過的胚乳提取物樣品進(jìn)行分析(圖2B)。Nov9X基因產(chǎn)物計(jì)算出來的大小為43kDa。提取物中存在大量大小為40-50kD的蛋白。在加熱過程中，此蛋白保持可溶，是加熱后胚乳提取物可溶性組分中含量最多的組分。將來自于山羊的抗血清與大腸桿菌產(chǎn)生的的Nov9X一起孵育，進(jìn)行Western印跡分析，鑒別到了凝膠中此區(qū)域內(nèi)的條帶。此條帶是重組植酸酶的良好侯選者。
液體制劑的另一酶來源是用干燥種子或從干燥種子獲得的粉末?？蓪ΨN子碾磨以生成粉末。從數(shù)種植物于30DAP(授粉后天數(shù))收獲的種子于105°F干燥5天。干燥的種子如前所述粉碎、用緩沖液提取蛋白。22棵植物谷類提取物的植酸酶活性比較如圖3所示。此分析包括了24棵植物初篩時(shí)具有最高植酸酶活性的4棵植物。
玉米種子產(chǎn)生的另一示范性植酸酶制劑是破碎或碾碎的谷?；蚍勰?。含植酸酶的粉末可作為補(bǔ)充劑直接加到動(dòng)物飼料中，或可進(jìn)一步加工，如加工成小丸的形式。下面的試驗(yàn)比較了液體提取物與粉末的植酸酶活性。取20毫克(mg)粉末200μl緩沖液于室溫孵育20分鐘。將一列試管置冰上冷卻，同時(shí)將第二列試管中的不溶物質(zhì)于4℃離心將其除去。第一列試管的總懸液及第一列試管的總懸液用提取緩沖液稀釋，使終體積為5ml。加入肌醇六磷酸(10ml，0.1M)和醋酸鈉(10ml，0.5M，pH5)，將試管于37℃孵育10分鐘。終濃度為40mM肌醇六磷酸代表了上述所用標(biāo)準(zhǔn)方法的10倍提高。將反應(yīng)液置冰上冷卻，立即加入等體積(25μl)的15％TCA。離心(15分鐘，4℃，3,700rpm)除去不溶的物質(zhì)，取部分上清如上所述測量磷酸鹽濃度。
將粉末提取物的植酸酶活性與粉本懸液的植酸酶活性進(jìn)行比較，以測定緩沖液提取方法的效率。將全部谷粒粉末(20mg)與200μ提取緩沖液一起孵育，測定上清組分和粉末懸液的總植酸酶活性。結(jié)果如圖4所示。上圖顯示了等量反應(yīng)液中的總磷酸鹽濃度。事件266B-2E是不含重組植酸酶的陰性對照。分析這些樣品測內(nèi)源磷酸鹽的水平。事件305B-20A和305A-24A是分別用pNOV4061和pNOV4057載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植酸酶事件。黃色柱為含可溶提取物反應(yīng)液中的磷酸鹽濃度，藍(lán)色柱為含粉末懸液的反應(yīng)液中的磷酸鹽濃度。對于兩個(gè)轉(zhuǎn)基因事件，均在轉(zhuǎn)基因粉末存在的條件下釋放出額外的磷酸鹽。
圖4的下圖比較了兩事件的可溶性提取物(黃色)和粉末懸液(藍(lán)色)植酸酶活性。對于事件305B-20A(pNOV4061)和305A-24A(pNOV4057)，分別額外獲得了50％和80％的活性，仍與粉末相關(guān)。
實(shí)施例4
Nov9x植酸酶在T2種子中的胚乳特異性表達(dá)授粉后于24天和26天收割含pNOV4057構(gòu)建體的T2植物穗。每一植物取10粒谷粒分解成胚芽、胚乳和外殼。將10顆胚乳和10顆胚芽組合，加8ml蒸餾水用研缽和杵在室溫將其碾碎。離心，將不溶物質(zhì)除去。測定胚乳及胚芽樣品上清組分中的比活。如圖5所示，轉(zhuǎn)基因胚乳提取物中的特異性植酸酶活性超過300。相反，轉(zhuǎn)基因胚芽提取物的比活少于10。該內(nèi)乎檢測不到的活性可能是小片胚乳污染胚芽所致。
加熱新鮮T2胚乳提取物可極大地促進(jìn)Nov9X植酸酶富集如前面所公開的那樣，玉米種子所產(chǎn)生植酸酶的示范性制劑之一是液體提取物的形式。這里描述了去胚、水提取、加熱和離心對Nov9X植酸酶的富集。
如上所述，將谷粒人工去胚，將胚乳在水中用研缽和杵碾碎。新鮮胚乳的水提物于60℃加熱30分鐘，離心除去不溶物質(zhì)。用SDS-PAGE(膠未列出)分析未加熱和加熱過的樣品。在加熱過的樣品中發(fā)現(xiàn)了富集的約45kD的蛋白(箭頭所指)，是Nov9X植酸酶的預(yù)期大小。該蛋白在對照提取物中未發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因提取物中是含量最多的蛋白。我們推斷該蛋白就是Nov9X植酸酶。未加熱和加熱過的樣品其總植酸酶活性相同(圖6A)，說明玉米產(chǎn)生的植酸酶是耐熱的。加熱后樣品的比活上升達(dá)2倍之多(圖6B)。這些結(jié)果說明了一種從玉米種子制備Nov9X植酸酶液體制劑的可能策略。使用干燥胚乳或全顆粒，同樣的方法應(yīng)該也可產(chǎn)生重組酶高度富集的提取物。
用于家禽飼養(yǎng)試驗(yàn)的T2溫室種子的生產(chǎn)和加工如前面所公開的那樣，示范性植酸酶制劑之一是破碎或碾碎的谷粒或粉末。含植酸酶的粉末可作為補(bǔ)充劑直接加到動(dòng)物飼料中，或可進(jìn)一步加工，如加工成小丸的形式。
從七個(gè)不同T0轉(zhuǎn)基因事件而來的T1種子在溫室中長成玉米植物。所有植物均包含一個(gè)或多外拷貝由Taqman分析測定的Nov9X基因。這些T1植物或自花受精，或用來自于近交或JHAF031的花粉受精。授粉后約30天收割穗并于105干燥5天。就這6個(gè)轉(zhuǎn)基因事件來說，對每一穗均收集不同穗的T2種子。將種子于室溫在通風(fēng)櫥中用設(shè)成最細(xì)研磨的Kitchen Mill(K-TEC)碾碎。各批種子重約66g到398g．立即將粉末從研磨室轉(zhuǎn)到通風(fēng)櫥中的密封塑料袋中。轉(zhuǎn)到密封塑料袋后立即測量粉末的溫度，溫度不超過41℃。粉末于4℃儲(chǔ)存。
如上所述，收集來源于6個(gè)不同T0轉(zhuǎn)基因事件的T2玉米種子并碾碎。來自玉米近交A188的樣品也進(jìn)行加工，作為陰性對照。用上述測定干燥種子蛋白提取物的方法測定玉米粉末的植酸酶活性，植酸酶測定用微量反應(yīng)板方式。蛋白提取物約100mg的粉末樣品測量兩次。
所選用于種子增加的六個(gè)轉(zhuǎn)基因事件表2所示。它們來源于pNOV4057和pNOV4061質(zhì)粒，分別編碼質(zhì)外體靶向和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)停留形式的Nov9X植酸酶。自我受精和雜交植物的種子組分在事件池間變化很大。幾乎所有的T1植物都不是Nov9X同源的。這些因素導(dǎo)致不可能用最終T2種子中基因拷貝數(shù)校正酶產(chǎn)率。每公斤粉末以單位測量的可提取植酸酶活性含量為325,000～1,300,000(表2)。
表2表明，碾碎T2溫室種子粉末可提取植酸酶活性的產(chǎn)率。A188為非轉(zhuǎn)基因近交。
表2
在室溫碾碎玉米不會(huì)降低植酸酶活性。所收集305A-24A事件的種子在碾碎前分成兩半。一批在室溫碾碎。轉(zhuǎn)移后這批碾出來的粉末其溫度是38℃。另一批與粉末在4℃的涼室保持45分鐘。然后在涼室中碾碎。密封好的粉末移到環(huán)境溫度的通風(fēng)櫥中，將粉末轉(zhuǎn)到塑料袋中。這批冷碾碎的粉末轉(zhuǎn)移后立即測量的溫度是24℃。如表2最下面2行所示，在低溫碾碎種子不能改善可提取植酸酶活性的產(chǎn)率。于室溫(RT)碾碎的事件305A-24A來源種子植酸酶產(chǎn)率是1,283,910單位/kg，相同池內(nèi)在低溫下碾碎的種子是1,306,934單位/kg。
表3顯示了分離事件按載體收集時(shí)的總粉末和植酸酶產(chǎn)率。這些數(shù)據(jù)是表2事件特異性數(shù)據(jù)的總和。少于1kg粉末的質(zhì)外體靶向和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)停留形式的酶其可提取植酸酶活性均超過800,000總單位。這里所述粉末是用作飼料添加劑的Nov9X植酸酶可能制劑實(shí)例之一。表3提供了質(zhì)外體靶向和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)停留形式的碾碎T2溫室種子植酸酶產(chǎn)率。
表3
實(shí)施例5玉米近交種子的植酸酶活性從含前導(dǎo)事件的數(shù)株制備粉末樣品(1克)，用50mM Tris-鹽酸(pH8.0)、100mM NaCl、2mM于室溫?cái)嚢杼崛?小時(shí)。提取液體積是100ml。離心使提取物澄清，用醋酸鈉緩沖液(pH5.5)稀釋。用Engelen等(2001)的方法，稍作修改，于pH5.5和37℃測量植酸酶活性。測定以1ml終反應(yīng)體積在微量反應(yīng)板上進(jìn)行。結(jié)果如圖7所示。
實(shí)施例6飼養(yǎng)試驗(yàn)來自于玉米種子的植酸酶制劑是玉米粉末或磨碎中間體。圖8A、圖8B、圖8C總結(jié)了三項(xiàng)飼養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果，其中小雞飼料補(bǔ)充了玉米粉末配制的Nov9X植酸。含可提取植酸酶活性的轉(zhuǎn)基因玉米種子樣品用錘式或圓盤式粉碎機(jī)碾碎，然后直接加到飼料樣品中，徹底混合。處理后的食物可直接以混合飼料使用(試驗(yàn)I)，或用蒸氣處理制成小丸(試驗(yàn)II和III)。在所有情況下植酸酶玉米粉末均加到含有減量磷酸鹽(陰性對照)的飼料配方。這可以實(shí)現(xiàn)比較低磷酸鹽飲食(陰性對照)、高磷酸鹽飲食(陽性對照)和補(bǔ)充了以碾碎玉米制劑形式的低磷酸鹽飲食。
圖8(A、B和C)中的結(jié)果飼料轉(zhuǎn)化率(FCRs)繪制。FCR指消耗的飼料量除以小雞純體重增加值。比值越低說明小雞每消耗單位飼料所獲得的體重增加越多。比值越低表明小雞更能利用所消耗的飼料。使用標(biāo)準(zhǔn)家禽飲食，并在飲食中加入兩種含量的無機(jī)磷酸鹽0.450％(陽性對照)和0.225(陰性對照和補(bǔ)充有酶的飲食)。0.45％是商用家禽飲食的常用水平。每圍欄8只小雞，每次飲食平行，一直長到21天齡，減去一天齡時(shí)的體重測得最終體重。記錄每欄小雞消耗的飼料量，測定平均飼料消耗量。
圖8A顯示了以混合飲食喂養(yǎng)小雞的試驗(yàn)結(jié)果。在此試驗(yàn)中，將整個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米粒碾碎成粉末，以此配制Nov9X植酸酶。從含pNOV4057(外質(zhì)體靶向植酸酶)或pNOV4061(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)停留植酸酶)載體的植物中收割轉(zhuǎn)基因谷粒。以玉米粉末形式將Nov9X植酸酶補(bǔ)充到低磷酸鹽飲食，可以改善FCR并使性能恢復(fù)到與陽性對照相等或更好的水平。這些結(jié)果說明，玉米粉末形式的Nov9X植酸酶制劑改善了低磷酸鹽飲食所喂養(yǎng)小雞的FCR。
圖8B顯示了以小丸飼料喂養(yǎng)小雞的試驗(yàn)結(jié)果。在此試驗(yàn)中，玉米粉末形式的Nov9X植酸酶制劑在蒸氣處理和成丸前加到低磷磷酸鹽小雞飼料中。與圖8A一樣，檢測了質(zhì)外體靶向和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)停留形式的Nov9X植酸酶。補(bǔ)充植酸酶可以使性能恢復(fù)到與陽性對照所觀察到的結(jié)果相等或更好的水平。這些結(jié)果說明，在玉米種子直接合成、玉米粉末形式的Nov9X植酸酶制劑改善了低磷酸鹽飲食所喂養(yǎng)小雞的FCR。
圖8B顯示了一項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，其中外質(zhì)體形式的Nov9x植酸酶(由pNOV4057載體編碼)制劑呈精細(xì)研磨物、中等研磨物或粗磨玉物末形式。粗磨材料由不小于2000微米的顆粒組成，中等研磨材料的大小主要是500～2000微米，而精細(xì)研磨粉末小于500微米。與圖8B一樣，在蒸氣處理成丸前將三種制劑加到低磷酸食物中。這三種制劑的所有測試劑量均可改善飼料轉(zhuǎn)化率。并且這三種制劑所有試驗(yàn)劑量均勝過陽性對照。這些結(jié)果證明了碎裂玉米種子的Nov9X植酸酶優(yōu)選制劑對小雞的效果。
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所有出版物、專利及專利申請均在此引入作為參考。盡管在前面所述的說明書中已描述了與本發(fā)明相關(guān)的某些優(yōu)選實(shí)施方案并且為演示的目的而闡明了許多細(xì)節(jié)，但是本發(fā)明容許其他實(shí)施方案及此處所述的某些細(xì)節(jié)可以變化很大而不脫離本發(fā)明的基本原則，這些對于本領(lǐng)域內(nèi)熟練技術(shù)人員來說是顯而易見的。
序列表<110>Lanahan，MikeBetts，Scott<120>用于動(dòng)物飼料的耐熱植酸酶<130>70099<150>60/344,476<151>2001-12-28<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>412<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Nov9X植酸酶<400>1Met Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val1 5 10 15Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln20 25 30Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu35 40 45Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp50 55 60Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro65 70 75 80
Gln Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg85 90 95Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile100 105 110Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn115 120 125Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp130 135 140Ala Ile Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His145 150 155 160Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln165 170 175Ser Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu180 185 190Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Cys Val Ser195 200 205Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu210 215 220Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr225 230 235 240Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe245 250 255
Asp Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro260 265 270Leu Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys275 280 285Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly290 295 300His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp305 310 315 320Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val325 330 335Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val340 345 350Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu355 360 365Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys370 375 380Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln385 390 395 400Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu405 410<210>2<211>1256
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>玉米優(yōu)化的Nov9X植酸酶<400>2ggatccacca tggcgcagtc cgagccggag ctgaagctgg agtccgtggt gatcgtgtcc 60cgccacggcg tgcgcgcccc gaccaaggcc acccagctca tgcaggacgt gaccccggac120gcctggccga cctggccggt gaagctcggc gagctgaccc cgcgcggcgg cgagctgatc180gcctacctcg gccactactg gcgccagcgc ctcgtggccg acggcctcct cccgaagtgc240ggctgcccgc agtccggcca ggtggccatc atcgccgacg tggacgagcg cacccgcaag300accggcgagg ccttcgccgc cggcctcgcc ccggactgcg ccatcaccgt gcacacccag360gccgacacct cctccccgga cccgctcttc aacccgctca agaccggcgt gtgccagctc420gacaacgcca acgtgaccga cgccatcctg gagcgcgccg gcggctccat cgccgacttc480accggccact accagaccgc cttccgcgag ctggagcgcg tgctcaactt cccgcagtcc540aacctctgcc tcaagcgcga gaagcaggac gagtcctgct ccctcaccca ggccctcccg600tccgagctga aggtgtccgc cgactgcgtg tccctcaccg gcgccgtgtc cctcgcctcc660atgctcaccg aaatcttcct cctccagcag gcccagggca tgccggagcc gggctggggc720cgcatcaccg actcccacca gtggaacacc ctcctctccc tccacaacgc ccagttcgac780ctcctccagc gcaccccgga ggtggcccgc tcccgcgcca ccccgctcct cgacctcatc840aagaccgccc tcaccccgca cccgccgcag aagcaggcct acggcgtgac cctcccgacc900tccgtgctct tcatcgccgg ccacgacacc aacctcgcca acctcggcgg cgccctggag960ctgaactgga ccctcccggg ccagccggac aacaccccgc cgggcggcga gctggtgttc 1020gagcgctggc gccgcctctc cgacaactcc cagtggattc aggtgtccct cgtgttccag 1080accctccagc agatgcgcga caagaccccg ctctccctca acaccccgcc gggcgaggtg 1140
aagctcaccc tcgccggctg cgaggagcgc aacgcccagg gcatgtgctc cctcgccggc 1200ttcacccaga tcgtgaacga ggcccgcatc ccggcctgct ccctctaata gagctc 1256<210>3<211>19<212>PRT<213>玉米<400>3Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15Ala Thr Ser<210>4<211>431<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>pNOV4054植酸酶融合體<400>4Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15Ala Thr Ser Ala Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val20 25 30Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln35 40 45Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys
50 55 60Leu Gly Glu Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly65 70 75 80His Tyr Trp Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Cys85 90 95Gly Cys Pro Gln Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu100 105 110Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp115 120 125Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro130 135 140Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn145 150 155 160Val Thr Asp Ala Ile Leu Glu Arg Ala Gly Gly SerIle Ala Asp Phe165 170175Thr Gly His Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn180 185 190Phe Pro Gln Ser Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser195 200 205Cys Ser Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp210 215 220Cys Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu
225 230 235 240Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly245 250 255Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn260 265 270Ala Gln Phe Asp Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg275 280 285Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro290 295 300Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe305 310 315 320Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu325 330 335Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly340 345 350Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp355 360 365Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys370 375 380Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu385 390 395 400Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly
405 410 415Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu420 425 430<210>5<211>1313<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pNOV4054植酸酶融合體<400>5ggatccacca tgagggtgtt gctcgttgcc ctcgctctcc tggctctcgc tgcgagcgcc 60accagcgctg cgcagtccga gccggagctg aagctggagt ccgtggtgat cgtgtcccgc 120cacggcgtgc gcgccccgac caaggccacc cagctcatgc aggacgtgac cccggacgcc 180tggccgacct ggccggtgaa gctcggcgag ctgaccccgc gcggcggcga gctgatcgcc 240tacctcggcc actactggcg ccagcgcctc gtggccgacg gcctcctccc gaagtgcggc 300tgcccgcagt ccggccaggt ggccatcatc gccgacgtgg acgagcgcac ccgcaagacc 360ggcgaggcct tcgccgccgg cctcgccccg gactgcgcca tcaccgtgca cacccaggcc 420gacacctcct ccccggaccc gctcttcaac ccgctcaaga ccggcgtgtg ccagctcgac 480aacgccaacg tgaccgacgc catcctggag cgcgccggcg gctccatcgc cgacttcacc 540ggccactacc agaccgcctt ccgcgagctg gagcgcgtgc tcaacttccc gcagtccaac 600ctctgcctca agcgcgagaa gcaggacgag tcctgctccc tcacccaggc cctcccgtcc 660gagctgaagg tgtccgccga ctgcgtgtcc ctcaccggcg ccgtgtccct cgcctccatg 720ctcaccgaaa tcttcctcct ccagcaggcc cagggcatgc cggagccggg ctggggccgc 780atcaccgact cccaccagtg gaacaccctc ctctccctcc acaacgccca gttcgacctc840
ctccagcgca ccccggaggt ggcccgctcc cgcgccaccc cgctcctcga cctcatcaag 900accgccctca ccccgcaccc gccgcagaag caggcctacg gcgtgaccct cccgacctcc 960gtgctcttca tcgccggcca cgacaccaac ctcgccaacc tcggcggcgc cctggagctg1020aactggaccc tcccgggcca gccggacaac accccgccgg gcggcgagct ggtgttcgag1080cgctggcgcc gcctctccga caactcccag tggattcagg tgtccctcgt gttccagacc1140ctccagcaga tgcgcgacaa gaccccgctc tccctcaaca ccccgccggg cgaggtgaag1200ctcaccctcg ccggctgcga ggagcgcaac gcccagggca tgtgctccct cgccggcttc1260acccagatcg tgaacgaggc ccgcatcccg gcctgctccc tctaatagag ctc 1313<210>6<211>437<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>pNOV4058植酸酶融合體<400>6Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15Ala Thr Ser Ala Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val20 25 30Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln35 40 45Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys50 55 60Leu Gly Glu Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly
65 70 75 80His Tyr Trp Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Cys85 90 95Gly Cys Pro Gln Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu100 105 110Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp115 120 125Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro130 135 140Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn145 150 155 160Val Thr Asp Ala Ile Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe165 170 175Thr Gly His Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn180 185 190Phe Pro Gln Ser Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser195 200 205Cys Ser Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp210 215 220Cys Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu225 230 235 240Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly
245 250 255Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn260 265 270Ala Gln Phe Asp Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg275 280 285Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro290 295 300Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe305 310 315 320Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu325 330 335Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly340 345 350Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp355 360 365Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys370 375 380Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu385 390 395 400Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly405 410 415Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu Ser
420 425 430Glu Lys Asp Glu Leu435<210>7<211>1331<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pNOV4058植酸酶融合體<400>7ggatccacca tgagggtgtt gctcgttgcc ctcgctctcc tggctctcgc tgcgagcgcc 60accagcgctg cgcagtccga gccggagctg aagctggagt ccgtggtgat cgtgtcccgc 120cacggcgtgc gcgccccgac caaggccacc cagctcatgc aggacgtgac cccggacgcc 180tggccgacct ggccggtgaa gctcggcgag ctgaccccgc gcggcggcga gctgatcgcc 240tacctcggcc actactggcg ccagcgcctc gtggccgacg gcctcctccc gaagtgcggc 300tgcccgcagt ccggccaggt ggccatcatc gccgacgtgg acgagcgcac ccgcaagacc 360ggcgaggcct tcgccgccgg cctcgccccg gactgcgcca tcaccgtgca cacccaggcc 420gacacctcct ccccggaccc gctcttcaac ccgctcaaga ccggcgtgtg ccagctcgac 480aacgccaacg tgaccgacgc catcctggag cgcgccggcg gctccatcgc cgacttcacc 540ggccactacc agaccgcctt ccgcgagctg gagcgcgtgc tcaacttccc gcagtccaac 600ctctgcctca agcgcgagaa gcaggacgag tcctgctccc tcacccaggc cctcccgtcc 660gagctgaagg tgtccgccga ctgcgtgtcc ctcaccggcg ccgtgtccct cgcctccatg 720ctcaccgaaa tcttcctcct ccagcaggcc cagggcatgc cggagccggg ctggggccgc 780atcaccgact cccaccagtg gaacaccctc ctctccctcc acaacgccca gttcgacctc 840
ctccagcgca ccccggaggt ggcccgctcc cgcgccaccc cgctcctcga cctcatcaag 900accgccctca ccccgcaccc gccgcagaag caggcctacg gcgtgaccct cccgacctcc 960gtgctcttca tcgccggcca cgacaccaac ctcgccaacc tcggcggcgc cctggagctg1020aactggaccc tcccgggcca gccggacaac accccgccgg gcggcgagct ggtgttcgag1080cgctggcgcc gcctctccga caactcccag tggattcagg tgtccctcgt gttccagacc1140ctccagcaga tgcgcgacaa gaccccgctc tccctcaaca ccccgccggg cgaggtgaag1200ctcaccctcg ccggctgcga ggagcgcaac gcccagggca tgtgctccct cgccggcttc1260acccagatcg tgaacgaggc ccgcatcccg gcctgctccc tctccgagaa ggacgagctg1320taatagagct c 1331<210>8<211>686<212>DNA<213>玉米<400>8aagcttcgat catccaggtg caaccgtata agtcctaaag tggtgaggaa cacgaaacaa 60ccatgcattg gcatgtaaag ctccaagaat ttgttgtatc cttaacaact cacagaacat 120caaccaaaat tgcacgtcaa gggtattggg taagaaacaa tcaaacaaat cctctctgtg 180tgcaaagaaa cacggtgagt catgccgaga tcatactcat ctgatataca tgcttacagc 240tcacaagaca ttacaaacaa ctcatattgc attacaaaga tcgtttcatg aaaaataaaa 300taggccggac aggacaaaaa tccttgacgt gtaaagtaaa tttacaacaa aaaaaaagcc 360atatgtcaag ctaaatctaa ttcgttttac gtagatcaac aacctgtaga aggcaacaaa 420actgagccac gcagaagtac agaatgattc cagatgaacc atcgacgtgc tacgtaaaga 480gagtgacgag tcatatacat ttggcaagaa accatgaagc tgcctacagc cgtctcggtg 540gcataagaac acaagaaatt gtgttaatta atcaaagcta taaataacgc tcgcatgcct 600
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1.制備耐熱植酸酶的方法，包括在植物細(xì)胞中表達(dá)一種表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含和編碼耐熱植酸酶的核酸分子可操縱性相連接的啟動(dòng)子，其中耐熱植酸酶于60℃下30分鐘后仍保留至少40％活性，在pH 4.5、37℃條件下比活超過200U/mg。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括分離所述耐熱植酸酶。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述耐熱植酸酶包括SEQ ID NO1序列。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述耐熱植酸酶在pH 4.5和37℃條件下的比活超過400U/mg。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述耐熱植酸酶在pH 4.5和37℃條件下的比活超過600U/mg。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述耐熱植酸酶在pH 4.5和37℃條件下的比活超過800U/mg。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述啟動(dòng)子是泛素啟動(dòng)子。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述啟動(dòng)子是植物組織特異性啟動(dòng)子。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述啟動(dòng)子是胚乳特異性啟動(dòng)子。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述胚乳特異性啟動(dòng)子是玉米γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子或玉米ADP-葡萄糖焦磷酸化酶啟動(dòng)子。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述啟動(dòng)子包括SEQ ID NO8或SEQ ID NO9序列。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述啟動(dòng)子是植物胚芽特異性啟動(dòng)子。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述啟動(dòng)子包括玉米球蛋白1啟動(dòng)子。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述啟動(dòng)子包括玉米油質(zhì)蛋白KD18啟動(dòng)子。
15.權(quán)利要求4的方法，其中所述植物細(xì)胞為玉米、小麥或大豆細(xì)胞。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸分子編碼包括耐熱植酸酶的融合多肽。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述融合多肽包括可操縱性與植酸酶連接的信號序列。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述信號序列將植酸酶靶向植物細(xì)胞中的造粉體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)外體或淀粉顆粒。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述信號序列是來自于蠟質(zhì)基因的N末端信號序列或來自γ-玉米醇溶蛋白的N末端信號序列。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述信號序列是淀粉結(jié)合域。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述淀粉結(jié)合域是與耐熱植酸酶C末端可操縱性連接的蠟質(zhì)淀粉封裝域。
22.權(quán)利要求17的方法，其中所述融合多肽包含與耐熱植酸酶C末端可操縱性連接的SEKDEL。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述耐熱植酸酶的半衰期在pH大于2、小于4時(shí)超過25分鐘。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述耐熱植酸酶是糖基化的。
25.制備動(dòng)物飼料的方法，包括a)提供飼料組分和含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶的植酸酶制品的混合物；b)在使混合物中肌醇六磷酸水解的溫度和濕度條件下處理混合物以得到動(dòng)物飼料。
26.權(quán)利要求25中的方法制備的動(dòng)物飼料，其中所述動(dòng)物飼料的肌醇六磷酸含量比用未處理組分所制成飼料中的肌醇六磷酸含量低。
27.制備動(dòng)物飼料的方法，包括a)提供動(dòng)物飼料組分和含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶的植酸酶制品的混合物；b)在超過50℃的溫度下加熱混合物以得到熱處理的動(dòng)物飼料混合物。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述植酸酶制品是液體混合物。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述植酸酶制品是固體混合物。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述制品是轉(zhuǎn)基因植物物質(zhì)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因物質(zhì)為轉(zhuǎn)基因玉米顆粒、碾碎的玉米、玉米粉末或從玉米制備的酶提取物。
32.權(quán)利要求27的方法，其中所述植酸酶制品還包括至少一種維生素、礦物質(zhì)、耐熱植酸酶之外的一種酶、有機(jī)酸、原生物(細(xì)菌)或必需的油或輔產(chǎn)品。
33.權(quán)利要求27的方法，其中所述植酸酶制品的無機(jī)磷酸鹽少于約1％。
34.權(quán)利要求27的方法，其中a)所述混合物的無機(jī)磷酸鹽少于約0.45％。
35.權(quán)利要求27的方法所生成的熱處理動(dòng)物飼料混合物。
36.權(quán)利要求27的方法，還包括用成丸壓榨機(jī)擠出熱處理過的混合物以得到丸狀動(dòng)物飼料。
37.權(quán)利要求36的方法所生成的丸狀動(dòng)物飼料。
38.包含權(quán)利要求1或2中植酸酶的動(dòng)物飼料組合物。
39.權(quán)利要求38的動(dòng)物飼料組合物，其中所述植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于400U/mg。
40.權(quán)利要求38的動(dòng)物飼料組合物，其中所述植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于600U/mg。
41.權(quán)利要求38的動(dòng)物飼料組合物，其中所述植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于800U/mg。
42.權(quán)利要求38的動(dòng)物飼料組合物，其中所述耐熱植酸酶的半衰期在pH大于2、小于4時(shí)超過25分鐘。
43.包含權(quán)利要求1或2中耐熱植酸酶的酶飼料添加劑。
44.權(quán)利要求43的酶飼料添加劑，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于400U/mg。
45.權(quán)利要求43的酶飼料添加劑，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于600U/mg。
46.權(quán)利要求43的酶飼料添加劑，其中所述植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于800U/mg。
47.權(quán)利要求43的酶飼料添加劑，其中所述耐熱植酸酶的半衰期在pH大于2.0、小于4.0時(shí)超過25分鐘。
48.一種制備用于飼料制劑、含耐熱植酸酶的組合物的方法，該方法包括a)將含有權(quán)利要求1或2的耐熱植酸酶的液體溶液與大豆粉末合在一起，得到混合物；和b)將混合物凍干，得到凍干組合物。
49.權(quán)利要求48的方法，還包括將凍干組合物與其他飼料組分合在一起，以得到進(jìn)一步的混合物。
50.權(quán)利要求48的方法，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于200U/mg。
51.權(quán)利要求48的方法，其中所述耐熱植酸酶的半衰期在pH大于2.0、小于4.0時(shí)超過25分鐘。
52.權(quán)利要求48所述方法制備的凍干組合物。
53.一種降低飼料轉(zhuǎn)化率和增加體重的方法，該方法包括用一定量含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶的飼料飼養(yǎng)動(dòng)物以降低動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率。
54.一種改善飼料轉(zhuǎn)化率降低或提高用無機(jī)磷酸鹽含量低于0.45％的飼料所飼養(yǎng)動(dòng)物的體重增加的方法，包括用無機(jī)磷酸鹽含量低于0.45％、含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶的飼料以有效改善飼料轉(zhuǎn)化率或體重增加的用量飼養(yǎng)動(dòng)物。
55.一種使動(dòng)物對飲食性磷需求最低化的方法，該方法包括用含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶的飼料以可提高飼料中磷在動(dòng)物中生物利用度的用量飼養(yǎng)動(dòng)物。
56.一種使動(dòng)物對飲食性磷需求最低化的方法，該方法包括用含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶的飼料飼養(yǎng)動(dòng)物。
57.一種增強(qiáng)動(dòng)物對飼料中所存在磷的利用的方法，該方法包括用含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶的飼料以可提高飼料中磷在動(dòng)物中生物利用度的用量飼養(yǎng)動(dòng)物。
58.一種增強(qiáng)動(dòng)物對飼料中有機(jī)磷來源的有機(jī)磷酸鹽利用的方法，該方法包括用含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶的飼料以可提高飼料中無機(jī)磷在動(dòng)物中生物利用度的用量飼養(yǎng)動(dòng)物。
59.一種降低動(dòng)物排泄物中磷酸鹽水平的方法，該方法包括用含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶的飼料以可降低動(dòng)物中排泄物中磷酸鹽水平的用量飼養(yǎng)動(dòng)物。
60.一種降低動(dòng)物排泄物中磷酸鹽水平的方法，該方法包括用無機(jī)磷含量低于0.45％、含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶的飼料以可降低動(dòng)物中排泄物中磷酸鹽水平的用量飼養(yǎng)動(dòng)物。
61.權(quán)利要求53至60任一項(xiàng)所述方法，其中飼料是家禽飼料。
62.權(quán)利要求53至60任一項(xiàng)所述方法，其中飼料是豬飼料。
63.權(quán)利要求53至60任一項(xiàng)所述方法，其中所述耐熱植酸酶包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5序列。
64.權(quán)利要求53至60任一項(xiàng)所述方法，其中所述耐熱植酸酶在動(dòng)物消化道中的半衰期中約30分鐘。
65.一種改善谷物加工的方法，包括在加工該谷物時(shí)加入權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述谷物為玉米、小麥、大豆、卡諾拉或甘蔗。
67.一種改善加工谷物產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值的方法或谷物加工方法，該方法包括加工過程中，以可有效提高飼料營養(yǎng)價(jià)值的用量在谷物產(chǎn)品中加入權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶。
68.權(quán)利要求67所述方法，其中谷物為玉米，谷物加工方法為濕碾法，加工后的產(chǎn)品為玉米麩質(zhì)飼料、玉米麩質(zhì)及玉米淀粉。
69.權(quán)利要求67所述方法，其中所述谷物為玉米、小麥、大豆、卡諾拉或甘蔗。
70.權(quán)利要求67所述方法，其中所述谷物為諸如大豆、卡諾拉或油菜的含油種子，加工的谷物產(chǎn)品是含油種子的粉。
71.一種改善動(dòng)物飼料營養(yǎng)價(jià)值的方法，該方法包括在制備所述動(dòng)物飼料的過程中，以可有效提高飼料營養(yǎng)價(jià)值的用量加入權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶。
72.一種改善人類食物營養(yǎng)價(jià)值的方法，該方法包括在制備所述人類食物的過程中，以可有效提高食物營養(yǎng)價(jià)值的用量加入權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶。
73.包含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶的食物組合物。
74.一種制備人類食物的方法，該方法包括a)提供食物組分和權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶的混合物；和b)在使混合物中植酸水解的溫度和濕度條件下處理混合物，以得到人類食物。
75.權(quán)利要求74所述方法制備的處理后人類食物，其中所述人類食物的植酸含量比相應(yīng)未處理的人類食物中的含量要低。
76.包含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶的食物添加劑。
77.權(quán)利要求76所述食物添加劑，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于400U/mg。
78.權(quán)利要求76所述食物添加劑，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于600U/mg。
79.權(quán)利要求76所述食物添加劑，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于800U/mg。
80.權(quán)利要求76所述食物添加劑，其中所述耐熱植酸酶的半衰期在pH大于2.0、小于4.0時(shí)超過25分鐘。
81.一種制備用于食物配制、含耐熱植酸酶的組合物的方法，該方法包括a)將含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶的液體溶液與粗粉合在一起，得到混合物；和b)將混合物凍干，得到凍干組合物。
82.權(quán)利要求81的方法，還包括將凍干組合物與其他食物組分合在一起，以得到進(jìn)一步的混合物。
83.權(quán)利要求81的方法，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于800U/mg。
84.權(quán)利要求81的方法，其中所述耐熱植酸酶的半衰期在pH大于2.0、小于4.0時(shí)超過25分鐘。
85.用權(quán)利要求81所述方法制備的凍干組合物。
86.含權(quán)利要求1所述耐熱植酸酶的飼料丸。
87.含權(quán)利要求2所述耐熱植酸酶的飼料丸。
88.一種制備表達(dá)耐熱植酸酶的轉(zhuǎn)化植物的方法，該方法包括a)將包含啟動(dòng)子的表達(dá)盒導(dǎo)入植物細(xì)胞以得到轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中啟動(dòng)子與編碼耐熱植酸酶的核酸分子可操縱性連接，該酶在60℃時(shí)過30分鐘后仍保留至少40％活性，并且在pH4.5及37℃時(shí)比活大于200U/mg；b)從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因植物，該植物在其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)耐熱植酸酶。
89.權(quán)利要求88的方法，其中所述植物細(xì)胞是雙子葉植物細(xì)胞。
90.權(quán)利要求88的方法，其中所述植物細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞。
91.權(quán)利要求88的方法，其中所述植物細(xì)胞是谷類細(xì)胞。
92.權(quán)利要求88的方法，其中所述植物細(xì)胞是玉米細(xì)胞。
93.權(quán)利要求88的方法，其中所述植物細(xì)胞是大豆細(xì)胞。
94.權(quán)利要求88的方法，其中耐熱植酸酶包括SEQ ID NO1序列。
95.權(quán)利要求88至94中任一項(xiàng)的方法，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于400U/mg。
96.權(quán)利要求88至94中任一項(xiàng)的方法，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于60U/mg。
97.權(quán)利要求88至94中任一項(xiàng)的方法，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于800U/mg。
98.包含表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化植物，其中該表達(dá)盒包含與編碼耐熱植酸酶的核酸分子可操縱性連接的啟動(dòng)子，該酶在60℃時(shí)過30分鐘后仍保留至少40％活性，并且在pH4.5及37℃時(shí)比活大于200U/mg。
99.權(quán)利要求98的植物，其中耐熱植酸酶包括SEQ ID NO1序列。
100.權(quán)利要求98的植物，其是雙子葉植物。
101.權(quán)利要求100的植物，其是大豆植物。
102.權(quán)利要求98的植物，其是單子葉植物。
103.權(quán)利要求102的植物，其是玉米或小麥植物。
104權(quán)利要求98的植物，其中所述植物的種子中表達(dá)有耐熱植酸酶。
105.權(quán)利要求98的植物，其中所述啟動(dòng)子為胚芽特異性啟動(dòng)子。
106.權(quán)利要求105的植物，其中所述胚芽特異性啟動(dòng)子為玉米球蛋白1啟動(dòng)子或玉米油質(zhì)蛋白KD18啟動(dòng)子。
107.權(quán)利要求98的植物，其中所述啟動(dòng)子為胚乳特異性啟動(dòng)子。
108.權(quán)利要求107的植物，其中所述胚乳特異性啟動(dòng)子為玉米ADP-葡萄糖磷酸酶啟動(dòng)子或玉米γ-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子。
109.權(quán)利要求98的植物，其中所述核酸分子編碼包含所述耐熱植酸酶的融合多肽。
110.權(quán)利要求109的植物，其中所述融合多肽包含與所述耐熱植酸酶可操縱性連接的γ-玉米醇溶蛋白N末端信號序列。
111.權(quán)利要求109的植物，其中所述融合多肽包含與耐熱植酸酶C末端可操縱性連接的SEKDEL。
112.權(quán)利要求109的植物，其中所述融合多肽包含與耐熱植酸酶可操縱性連接的N末端蠟質(zhì)質(zhì)外體靶向肽。
113.權(quán)利要求109的植物，其中所述融合多肽包含與耐熱植酸酶C末端可操縱性連接的蠟質(zhì)淀粉封裝域。
114.權(quán)利要求98的植物，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于400U/mg。
115.權(quán)利要求98的植物，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于600U/mg。
116.權(quán)利要求98的植物，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于800U/mg。
117.權(quán)利要求98所述植物的產(chǎn)物，其包括耐熱植酸酶。
118.權(quán)利要求117所述的產(chǎn)物，其為種子、谷?；蚬麑?shí)。
119.權(quán)利要求117所述的產(chǎn)物，其為植物。
120.權(quán)利要求119所述的產(chǎn)物，其中所述植物為雜交植物。
121.權(quán)利要求120所述的產(chǎn)物，其中所述植物為近交植物。
122.權(quán)利要求65的谷物加工產(chǎn)物，其包含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶。
123.權(quán)利要求67的玉米粒加工產(chǎn)物，其包含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶。
124.權(quán)利要求68的含油種子加工產(chǎn)物，其包含權(quán)利要求1或2所述耐熱植酸酶。
125.權(quán)利要求1或2生成的轉(zhuǎn)化植物。
126.權(quán)利要求125所述方法，其中轉(zhuǎn)化植物為玉米、小麥或大豆。
127.權(quán)利要求48所述方法，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于400U/mg。
128.權(quán)利要求48所述方法，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于600U/mg。
129.權(quán)利要求48所述方法，其中所述耐熱植酸酶在pH4.5及37℃時(shí)比活大于800U/mg。
全文摘要
本發(fā)明提供了被優(yōu)化在植物中表達(dá)、編碼耐熱植酸酶的合成植酸酶多聚核苷酸，及分離的耐熱植酸酶。還提供了包括植酸酶的飼料或食品，以及表達(dá)耐熱植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物。進(jìn)一步提供了制備和使用耐熱植酸酶的方法，如在飼料和食品加工過程中使用耐熱植酸酶的方法。
文檔編號A23L1/211GK1622825SQ02828409
公開日2005年6月1日 申請日期2002年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月28日
發(fā)明者M·B·拉納漢, S·貝茨 申請人:先正達(dá)公司