專(zhuān)利名稱(chēng)：一種以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的基因定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，即一種以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的基因定量方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種簡(jiǎn)單，專(zhuān)一，靈敏，快速的擴(kuò)增特定DNA的方法，但標(biāo)準(zhǔn)PCR方法的功能局限于定性擴(kuò)增，其原因在于PCR的前階段產(chǎn)物按指數(shù)方式擴(kuò)增，產(chǎn)物增長(zhǎng)呈直線(xiàn)，在此階段目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的累積量還相當(dāng)?shù)?，尚不能用熒光染色劑、如溴乙錠對(duì)電泳后的條帶作準(zhǔn)確的定量測(cè)定。PCR反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行、擴(kuò)增產(chǎn)物總量足夠被測(cè)定時(shí)，反應(yīng)已進(jìn)入平坡期或飽和期，此時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物總量與樣品中的原始模板已不成正比關(guān)系，難以定量。若干年來(lái)已發(fā)展了多種方法來(lái)克服標(biāo)準(zhǔn)PCR不能定量的缺陷。方法之一是應(yīng)用同位素標(biāo)記引物或同位素標(biāo)記脫氧核糖核苷酸底物，由于同位素?fù)饺氲綌U(kuò)增產(chǎn)物使檢測(cè)靈敏度大大提高，從而可以在PCR進(jìn)入平坡前停止反應(yīng)并進(jìn)行測(cè)定。這種方法雖較簡(jiǎn)單，但是放射性同位素的安全性和由此帶來(lái)的一系列操作問(wèn)題使這一方法的應(yīng)用受到極大的限制。方法之二是在引物上標(biāo)記生物素或地高辛。方法之三是PCR之后進(jìn)行核酸雜交，利用標(biāo)記探針的信號(hào)放大作用來(lái)進(jìn)行測(cè)定。從檢測(cè)靈敏度看，后二種方法均可在進(jìn)入平坡前停止PCR反應(yīng)，但這二種方法的后續(xù)檢測(cè)都涉及生物素與親合素的反應(yīng)，抗原與抗體的反應(yīng)和酶促顯色反應(yīng)，程序復(fù)雜、操作麻煩。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有RNA生物技術(shù)存在的缺陷，提供一種較其它各種以PCR為基礎(chǔ)的方法優(yōu)越的基因定量方法。
本發(fā)明以PCR為基礎(chǔ)的基因定量方法，是先作比通常循環(huán)數(shù)少5-10個(gè)的低循環(huán)數(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在進(jìn)入平坡前停止反應(yīng)，不經(jīng)過(guò)任何純化，在加入轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑后立即接續(xù)進(jìn)行RNA合成，最后經(jīng)電泳，染色和條帶掃描定量測(cè)定RNA；本發(fā)明中的PCR的一個(gè)引物長(zhǎng)31-50鹼基，其5’端含T7，T3或SP6DNA依賴(lài)的RNA聚合酶的識(shí)別順序，該識(shí)別順序與模板順序至少有20-30鹼基的互補(bǔ)；本發(fā)明PCR的引物終濃度0.01-1uM，4種脫氧核糖核苷酸的濃度為0.01-0.2mM，Taq DNA聚合酶的用量為每50微升反應(yīng)液0.5-5微升，其下限小于通常被采用的每50微升1個(gè)單位；本發(fā)明PCR和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以在同一反應(yīng)試管中接續(xù)進(jìn)行，PCR反應(yīng)體積小于10微升。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液總體積是PCR反應(yīng)液的1.5倍以上，優(yōu)選2-4倍。
本發(fā)明基因定量方法包括PCR反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)二個(gè)步驟，二個(gè)步驟相互接續(xù)，可以只用一個(gè)試管來(lái)完成，第一步用PCR來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)基因，但PCR循環(huán)數(shù)比通常少5-10個(gè)循環(huán)，雖然此時(shí)反應(yīng)液中擴(kuò)增產(chǎn)物的總量較少，不能直接用通常的核酸染色劑來(lái)定量測(cè)定，但因?yàn)镻CR反應(yīng)仍處在直線(xiàn)階段未進(jìn)入平坡期，所以擴(kuò)增產(chǎn)物總量與樣品中原始模板的數(shù)量成正比例。本發(fā)明的原理在于用轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步按線(xiàn)性增加的方式合成RNA。這一設(shè)想能付之實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)是發(fā)現(xiàn)PCR反應(yīng)液的必要成份脫氧核糖核苷酸，正，反引物和DNA聚合酶等在相當(dāng)寬的濃度范圍內(nèi)對(duì)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)沒(méi)有可測(cè)見(jiàn)的顯著影響。所以，在完成PCR反應(yīng)后可以不經(jīng)過(guò)任何分離步驟而進(jìn)入轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在RNA聚合酶和核糖核苷酸底物過(guò)量，反應(yīng)溫度和時(shí)間固定的條件下，RNA的合成量與轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板數(shù)量，即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量成正比例，所以，最終合成的RNA量反映了樣品中原始模板DNA的數(shù)量。由轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的RNA量可達(dá)到模板數(shù)量的幾百至千倍，從而可以方便地用溴乙錠或其他核酸染色劑定量測(cè)定。
為了使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能作為轉(zhuǎn)錄RNA的模板，必須在PCR的一個(gè)引物的5’接上T7，T3或SP6的DNA依賴(lài)的RNA聚合酶的識(shí)別順序。這一方法已被用于制備反義RNA探針，但涉及克隆，質(zhì)粒線(xiàn)性化或核酸分離步驟。因?yàn)镻CR反應(yīng)液的組成成份不影響轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，如果經(jīng)PCR反應(yīng)產(chǎn)物中不含可能干擾轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的非專(zhuān)一擴(kuò)增產(chǎn)物，就可在PCR完成后直接進(jìn)入轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。本發(fā)明采用含RNA聚合酶識(shí)別順序的引物進(jìn)行PCR，其特征在于不經(jīng)過(guò)任何純化和其他步驟，在添加已預(yù)配好的轉(zhuǎn)錄試劑后就直接開(kāi)始轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。為了消除非專(zhuān)一擴(kuò)增產(chǎn)物，本發(fā)明在引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件等方面具有如下一些特征第一，本發(fā)明的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)應(yīng)用一對(duì)引物，其中一個(gè)引物在5’端含RNA聚合酶識(shí)別順序，引物長(zhǎng)40-50鹼基。該引物的3’端與目標(biāo)基因順序完全匹配，長(zhǎng)度為20-30鹼基。該引物的5’端為RNA聚合酶識(shí)別順序與目標(biāo)基因順序有至少20-30的互補(bǔ)鹼基數(shù)，從面使整個(gè)引物具有高嚴(yán)謹(jǐn)性，高解鏈溫度和高的與模板專(zhuān)一結(jié)合強(qiáng)度。另一引物長(zhǎng)31-40鹼基，其順序與目標(biāo)基因完全匹配，其嚴(yán)謹(jǐn)性，解鏈溫度和與模板專(zhuān)一結(jié)合強(qiáng)度與帶RNA聚合酶識(shí)別順序的引物接近。如此設(shè)計(jì)的引物對(duì)能在68℃以上的溫度下退火，PCR產(chǎn)物不含任何非專(zhuān)一擴(kuò)增產(chǎn)物，避免了對(duì)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的干擾。第二，PCR反應(yīng)液體積可以采用通常的50或100微升，反應(yīng)結(jié)束后取一定體積至另一試管并按1∶1至1∶4的比例加入轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑。為了使PCR和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)能在同一個(gè)試管內(nèi)完成并節(jié)約大量試劑，PCR反應(yīng)液體積可降低為5或10微升，反應(yīng)結(jié)束后加15或10微升轉(zhuǎn)錄試劑，使轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液總體積為通常使用的20微升。第三，PCR反應(yīng)液引物的終濃度范圍為0.01-1uM，4種脫氧核糖核苷酸的濃度范圍為0.01-0.2mM，DNA聚合酶的用量范圍可為每50微升反應(yīng)液0.5-5單位，這三種試劑濃度范圍的下限均比標(biāo)準(zhǔn)PCR的通常范圍低，這是因?yàn)楸景l(fā)明的PCR只需進(jìn)行15-20循環(huán)，引物和脫氧核糖核苷酸的消耗比通常PCR少幾十至幾百倍，無(wú)論試劑的初始濃度是高還是低，其消耗量相對(duì)于起始量都可以忽略不計(jì)。采用較低濃度的試劑既增強(qiáng)了PCR反應(yīng)參數(shù)的嚴(yán)謹(jǐn)性，有利于減少非專(zhuān)一產(chǎn)物，又節(jié)約了試劑，同時(shí)降低了轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中這些試劑的濃度。第四，PCR反應(yīng)與轉(zhuǎn)錄反應(yīng)均需要鎂離子但最適濃度不盡相同。由于鎂離子在反應(yīng)中無(wú)消耗，反應(yīng)前后濃度不變，PCR反應(yīng)液帶入轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的鎂離子量在管與管之間沒(méi)有區(qū)別，不影響整個(gè)測(cè)定的準(zhǔn)確性。為了使PCR反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)均能在各自的最佳鎂離子濃度下工作，可以增大轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體積與PCR反應(yīng)體積之比，或者在配制轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液時(shí)，將PCR反應(yīng)將會(huì)帶入的鎂離子量考慮進(jìn)去。第五，PCR反應(yīng)的最適pH比轉(zhuǎn)錄反應(yīng)高0.5-1個(gè)單位，PCR反應(yīng)液的加入不會(huì)影響測(cè)定的準(zhǔn)確性，但會(huì)使轉(zhuǎn)錄反應(yīng)pH值偏高而影響反應(yīng)速度。為了使轉(zhuǎn)錄反應(yīng)能在最佳pH下工作，可適當(dāng)降低PCR緩沖液的濃度或適當(dāng)提高轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液的濃度來(lái)減少PCR反應(yīng)液對(duì)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)pH的影響，或者增加轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液體積對(duì)PCR反應(yīng)液體積的比值，或者配制轉(zhuǎn)錄緩沖液時(shí)使其pH值比最佳反應(yīng)pH值略低，將預(yù)配的轉(zhuǎn)錄試劑加入到PCR反應(yīng)管后就達(dá)到轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的最佳pH值。
本發(fā)明較現(xiàn)有其它各種以PCR為基礎(chǔ)的基因定量方法簡(jiǎn)單，方便，準(zhǔn)確。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程既不涉及放射性同位素操作，又不必制備探針和進(jìn)行核酸雜交，也毋需抗原抗體作用和酶促顯色反應(yīng)。


圖1為DNA模板的加量與RNA條帶掃描值關(guān)系圖。
圖2為c-DNA加量與RNA條帶掃描值關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明以對(duì)甘油-3-磷酸脫氫酶基因(基因庫(kù)編號(hào)XM_006959)的定量測(cè)定為實(shí)施例，PCR反應(yīng)引物的特性和順序列于表一。
表一 引物特性和順序(表中含底線(xiàn)_的核苷酸為T(mén)7DNA聚合酶識(shí)別順序)

實(shí)施例1，比較兩對(duì)引物在相同條件下的最高允許退火溫度。第一對(duì)引物(A5’和A3’)是用引物設(shè)計(jì)軟件選取的20鹼基左右的具有高嚴(yán)謹(jǐn)性的優(yōu)秀引物。第二對(duì)引物(B5’和B3’)與第一對(duì)同源，其中B3’引物是在A3’引物的5’端加上含20鹼基的T7 RNA聚合酶識(shí)別順序，而B(niǎo)5’引物則是在A5’引物的5’端延伸9個(gè)鹼基，B5’的解鏈溫度(Tm)為86.7℃，比A5’高近17度。PCR反應(yīng)液組成成份的終濃度為緩沖液40mM Tricine-KOH，pH8.7，鎂離子35mM，引物濃度0.5uM，腺嘌呤脫氧核糖核酸dATP，鳥(niǎo)嘌呤脫氧核糖核苷酸dCTP，胞嘧啶脫氧核糖核苷酸dGTP和胸嘧啶脫氧核糖核苷酸dTTP等四種脫氧核糖核苷酸的濃度均為0.2mM，DNA聚合酶每50微升反應(yīng)液2.5U，c-DNA每50微升反應(yīng)液5微升，c-DNA由商品人組織總RNA用反轉(zhuǎn)錄商品試劑盒合成。PCR反應(yīng)首次變性為95℃1分鐘，循環(huán)變性為95℃30秒鐘，延伸為72℃(退火溫度為63.4-72℃時(shí))或74℃(退火溫度為73-74℃時(shí))1分鐘，反應(yīng)30循環(huán)，PCR反應(yīng)液用8％聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴乙錠染色后用商品圖像儀掃描檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果列于表二表二 PCR最高允許退火溫度的比較

結(jié)果表明普通引物長(zhǎng)引物對(duì)A最高能在71℃退火，而同源的含RNA聚合酶識(shí)別順序引物對(duì)B能在73℃以上退火。在如此高溫下退火只形成可作為轉(zhuǎn)錄模板的目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物而無(wú)任何非專(zhuān)一擴(kuò)增產(chǎn)物。
實(shí)施例2，比較兩對(duì)引物在相同條件下的檢測(cè)靈敏度。PCR反應(yīng)液的組成和反應(yīng)條件與實(shí)施例1相同，引物對(duì)A和引物對(duì)B的退火溫度分別為70和72℃，c-DNA按對(duì)半稀釋后加入反應(yīng)液。結(jié)果列于表三表三 PCR反應(yīng)的檢測(cè)靈敏度

結(jié)果表明含有RNA識(shí)別順序的引物與其同源普通引物對(duì)一樣，當(dāng)c-DNA被稀釋250倍后仍有目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物形成。
實(shí)施例3，測(cè)試分析不同濃度的脫氧核糖核苷酸，引物和鎂離子對(duì)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的影響。首先以引物對(duì)B按實(shí)施例1和2所示條件得到PCR產(chǎn)物，用商品PCR純化柱去除殘留的引物、脫氧核糖核苷酸、DNA聚合酶和緩沖劑成分，將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度調(diào)節(jié)至200pg/ul，用作轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的DNA模板。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的組成見(jiàn)表四。
表四 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的組成和配制

在37℃保溫二小時(shí)后用8M尿素5％聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)溴乙錠染色后掃描RNA條帶。結(jié)果表明當(dāng)外源加入的鎂離子濃度為0.5和2mM，4種脫氧核糖核苷酸濃度各為0.1，0.2和0.4mM，正、反引物濃度各為0.1，0.2和0.4uM時(shí)對(duì)RNA合成均沒(méi)有影響。
實(shí)施例4，測(cè)試RNA合成量與DNA模板含量的線(xiàn)性關(guān)系?，F(xiàn)行離體轉(zhuǎn)錄方法制備RNA探針?biāo)玫木€(xiàn)性化質(zhì)粒的模板濃度通常為500-1000ng。而本發(fā)明PCR接續(xù)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)方法的模板量小于1ng。本實(shí)施例所用DNA模板與實(shí)施例3相同，濃度調(diào)節(jié)至100pg/ul，在幾個(gè)測(cè)試管分別加100-400pg的DNA模板。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的組成，反應(yīng)條件和測(cè)定方法與實(shí)施例3相同。RNA條帶掃描強(qiáng)度顯示于圖1。
圖一表明RNA的合成量與加入的DNA模板量呈良好線(xiàn)性關(guān)系，R2＝0.9771。比較RNA條帶與標(biāo)準(zhǔn)RNA的掃描值可測(cè)知RNA合成速度，結(jié)果表明在測(cè)試條件下，每一份DNA模板在2小時(shí)內(nèi)可合成約250拷貝RNA。
實(shí)施例5，說(shuō)明本發(fā)明PCR接續(xù)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)基因定量方法的整個(gè)過(guò)程。先用引物對(duì)B對(duì)含不同量原始模板的樣品進(jìn)行擴(kuò)增。引物濃度為0.1uM，4種核糖核苷酸的濃度均為0.1mM，緩沖液為40mM Tris，pH8.3，鎂離子濃度為1.5mm，Taq DNA聚合酶每50微升反應(yīng)液2U，PCR反應(yīng)體積每管5微升。PCR反應(yīng)條件與實(shí)施例1相同，退火延伸為70℃2分鐘，反應(yīng)20循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后每一管加15微升預(yù)先配制的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，使混合后溶液中的核糖核苷酸濃度、鎂離子濃度，RNA聚合酶濃度，DDT濃度和核酸酶抑制濃度均與表四所示相同。配制轉(zhuǎn)錄反應(yīng)預(yù)混液用的Tris緩沖劑儲(chǔ)液濃度與表四所列相同，但pH為7.3，PCR反應(yīng)液與轉(zhuǎn)錄溶液按比例混合后pH值接近7.5。37℃保溫2小時(shí)后按實(shí)施例3和4的方法測(cè)定。結(jié)果顯示于圖二。結(jié)果表明，當(dāng)c-DNA量為每管1-4微升時(shí)，c-DNA加量與最終得到的RNA條帶掃描值成良好線(xiàn)性關(guān)系，R2＝0.9748。
權(quán)利要求
1.一種以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的基因定量方法，其特征在于先作比通常循環(huán)數(shù)少5-10個(gè)低循環(huán)數(shù)聚合酶鏈反應(yīng)，在進(jìn)入平坡前停止聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在加入轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑后立即接續(xù)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成RNA、進(jìn)行測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因定量方法，其特征在于所說(shuō)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一個(gè)引物長(zhǎng)40-50鹼基，其5’端含T7，T3或SP6 DNA依賴(lài)的RNA聚合酶的識(shí)別順序，該識(shí)別順序與模板順序至少有20-30鹼基互補(bǔ)，引物對(duì)退火溫度大于68℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因定量方法，其特征在于所說(shuō)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物終濃度為0.01-1uM，四種脫氧核糖核苷酸的濃度為0.01-0.2mM，Taq DNA聚合酶的用量小于每50微升1單位。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因定量方法，其特征在于所說(shuō)的PCR反應(yīng)體積小于10微升。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因定量方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液總體積是PCR反應(yīng)液體積的1.5倍以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因定量方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液總體積是PCR反應(yīng)液的2-4倍。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)，即一種以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的基因定量方法。本發(fā)明PCR接續(xù)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)方法分二步進(jìn)行。第一步為先作比通常循環(huán)數(shù)少5－10個(gè)循環(huán)數(shù)的低循環(huán)數(shù)PCR，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物呈直線(xiàn)累積、PCR平坡出現(xiàn)前結(jié)束反應(yīng)。由于在PCR一個(gè)引物的5’端引入了RNA聚合酶識(shí)別順序，PCR目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物可作為離體轉(zhuǎn)錄合成RNA的模板。第二步為在加入轉(zhuǎn)錄試劑后立刻啟動(dòng)RNA合成。在規(guī)定的轉(zhuǎn)錄條件下RNA的合成量與模板數(shù)量即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，因而也反映了測(cè)定樣品中原始模板的數(shù)量，并且，由轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的RNA量可達(dá)模板數(shù)量的幾百至千倍，從而可方便地用溴乙錠或其它核酸染色劑定量測(cè)定。本基因定量方法不用放射性同位素，不涉及抗原抗體作用，也毋須進(jìn)行核酸雜交，方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1515683SQ0310002
公開(kāi)日2004年7月28日 申請(qǐng)日期2003年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月6日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 徐文慧, 孫崇榮 申請(qǐng)人:徐定邦, 徐文慧