專利名稱：對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌0105的o－抗原特異的核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鮑氏志賀氏菌11型(Shigella boydii11)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特別是涉及鮑氏志賀氏菌11型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用這些對O-抗原特異的寡核苷酸快速、準(zhǔn)確地檢測人體及環(huán)境中的鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105(Escherichiacoli O105)并鑒定這些致病菌中的O-抗原。
O-抗原是革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖中的O特異性多糖成分，它由許多重復(fù)的寡糖單位組成。O-抗原的合成過程研究得較清楚先由糖基轉(zhuǎn)移酶將核苷二磷酸單糖轉(zhuǎn)移到一個固定在細(xì)胞內(nèi)膜的脂分子上，然后在內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)合成寡糖單位，O-抗原的寡糖單位再通過轉(zhuǎn)運(yùn)酶被轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜外側(cè)，而后通過聚合酶聚合成多糖，再被連接到一個糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。編碼負(fù)責(zé)O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色體上相鄰排列，形成一個基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在志賀氏菌、大腸桿菌和沙門氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之間[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“TheEscherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgeneclusters encoding the same colitose-containing O antigen are highlyconserved”.Journal of Bacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三類基因糖合成路徑基因，糖基轉(zhuǎn)移酶基因，寡糖單位處理基因。其中糖合成路徑基因編碼的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸單糖；糖基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的酶將核苷二磷酸單糖及其它分子轉(zhuǎn)到單糖上從而使單糖聚合成寡糖單位；寡糖單位處理基因包括轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因，它們將寡糖單位轉(zhuǎn)移到細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)，再聚合成多糖。糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因只存在于攜帶這些基因的基因簇里。O-抗原中單糖的不同，單糖間聯(lián)結(jié)鍵的不同和寡糖單位之間聯(lián)結(jié)鍵的不同構(gòu)成了O-抗原的多樣性，而單糖的組成、單糖間的聯(lián)結(jié)鍵及寡糖單位之間的聯(lián)結(jié)鍵是由O-抗原基因簇中的基因控制著，所以O(shè)-抗原基因簇決定了O-抗原的合成，也決定了O-抗原的多樣性。
因?yàn)镺-抗原是極強(qiáng)的抗原，是志賀氏菌重要的致病因素之一，同時它又具有極強(qiáng)的多樣性，這啟示我們能研究一種快速、準(zhǔn)確地檢測志賀氏菌及其O-抗原的特異性好、靈敏度高的方法。以表面多糖為目標(biāo)的血清學(xué)免疫反應(yīng)自上世紀(jì)30年代以來一直被用于對細(xì)菌的分型和鑒定，是鑒定致病菌的唯一的手段。這種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和儲存中也存在一些困難。另一方面此法耗時長、靈敏度低、漏檢率高、準(zhǔn)確性差，所以，現(xiàn)在普遍認(rèn)為這種傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測方法將為現(xiàn)代分子生物學(xué)方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙門氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特異核苷酸序列通過PCR方法鑒定了沙門氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是將相應(yīng)于沙門氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原內(nèi)的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到對不同血清型的沙門氏菌特異的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用針對E.coli O111的O-抗原特異的源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定了一株產(chǎn)毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichiacoli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后來的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定E.coli O111的血清型的方法有假陽性結(jié)果出現(xiàn)。Bastin D.A.and Reeves，P.R.認(rèn)為，這是由于wbdI基因是一個推測的糖合成路徑基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111.Gene 16417-23]，而在其它細(xì)菌的O-抗原的結(jié)構(gòu)中也可能有這個糖，所以糖合成路徑基因?qū)τ贠-抗原并不是高度特異的。
志賀氏菌有46種血清型，大腸桿菌有166種不同的O-抗原，二者親緣關(guān)系非常近，并且有12種O-抗原是大腸桿菌和志賀氏菌共有的，其中鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105就擁有相同的O-抗原[Ewing，W.H.(1986)“Edwardsand Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.ElsevierScience Publishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships between the enteroinvasive Escherichiacoli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and O164 andShigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)681-684]，傳統(tǒng)的血清型方法不能將它們區(qū)分。
本發(fā)明的次一目的是提供了鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列。
本發(fā)明的另一目的是提供了構(gòu)成鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇的基因轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf7 orf8、orf9、orf10基因；糖合成路徑基因，包括rmlB、rmlD、rmlA、rmlC。
本發(fā)明的又一目的是提供了寡核苷酸，它們分別源于鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇中編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因包括orf5、orf7、orf8、orf9、orf10基因；源于編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因、源于編碼聚合酶的基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；它們是上述基因內(nèi)的寡核苷酸，長度在10-20nt；它們對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原是特異的；尤其是表一中列出的寡核苷酸，它們對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原是高度特異的，而且這些寡核苷酸還可重新組合，組合后的寡核苷酸對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原也是高度特異的。
本發(fā)明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列，從而通過這些方法來檢測和鑒定鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原及檢測和鑒定鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105。
本發(fā)明的還一目的是提供了分離鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以獲得其他細(xì)菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以獲得編碼其他多糖抗原的細(xì)菌的基因簇的全序列。
本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的是采用以下技術(shù)方案本發(fā)明對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸，其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長13367個堿基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的堿基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ IDNO1的核苷酸。
前述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸，其是由11個基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
前述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸，其中所述的基因包括轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf7、orf8、orf9、orf10基因；其中所述的orf5基因是SEQID NO1中的4667至5410堿基的核苷酸；wzy基因是SEQ ID NO1中的5432至6460堿基的核苷酸；orf7基因是SEQ ID NO1中的6468至7310堿基的核苷酸；orf8基因是SEQ ID NO1中的7310至8446堿基的核苷酸；orf9基因是SEQ ID NO1中的8443至9327堿基的核苷酸；orf10基因是SEQ ID NO1中的9344至10327堿基的核苷酸；wzx基因是SEQ ID NO1中的10367至11794堿基的核苷酸。
前述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸，其中源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基轉(zhuǎn)移酶基因orf5、orf7、orf8、orf9、orf10基因；或糖合成路徑基因中的寡核苷酸；以及它們的混合或它們的重組。
前述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸，其中源于orf5基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的4882至4900堿基的核苷酸和5283至5300堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5116至5133堿基的核苷酸和5386至5403堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的4681至4697堿基的核苷酸和5373至5390堿基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸對是SEQ IDNO1中的5620至5638堿基的核苷酸和5980至5998堿基的核苷酸；SEQ IDNO1中的5517至5536堿基的核苷酸和6323至6341堿基的核苷酸；SEQ IDNO1中的5439至5457堿基的核苷酸和5831至5847堿基的核苷酸；源于orf7基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的6578至6596堿基的核苷酸和7014至7032堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的6664至6682堿基的核苷酸和6882至6899堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的6717至6735堿基的核苷酸和6977至6995堿基的核苷酸；源于orf8基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的7502至7520堿基的核苷酸和7974至7992堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的8019至8036堿基的核苷酸和8372至8391堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7376至7394堿基的核苷酸和8219至8237堿基的核苷酸；源于orf9基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的8674至8691堿基的核苷酸和9200至9218堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的8814至8832堿基的核苷酸和9139至9157堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的8543至8560堿基的核苷酸和9053至9070堿基的核苷酸；源于orf10基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的9727至9745堿基的核苷酸和10308至10325堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9784至9802堿基的核苷酸和10015至10033堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9430至9457堿基的核苷酸和10220至10239堿基的核苷酸；源于wzx基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的10484至10502堿基的核苷酸和10748至10765堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10599至10617堿基的核苷酸和11509至11527堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10997至11015堿基的核苷酸和11692至11710堿基的核苷酸。
前述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸在檢測表達(dá)O-抗原的細(xì)菌、在診斷中鑒定細(xì)菌的O-抗原和細(xì)菌的其它多糖抗原的應(yīng)用。
前述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，且通過插入表達(dá)可提供表達(dá)鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原，并成為細(xì)菌疫苗。
前述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸的應(yīng)用，其中，其作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測、或者用于制造基因芯片或微陣列，檢測人體和環(huán)境中的細(xì)菌。
前述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其中，包括下述步驟(1)基因組的提取在LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)志賀氏菌，離心收集細(xì)胞，用Tris-HCl(pH8.0)和EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分后加入溶菌酶裂解細(xì)菌，加入蛋白酶K和SDS降解蛋白質(zhì)，再加入RNase去除RNA；然后用等體積酚及等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提去除其中的酶和蛋白，再用等體積的乙醚抽提除去殘余的酚；用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA后用70％乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ulTE中，基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過Long PCR擴(kuò)增鮑氏志賀氏菌11型中的O-抗原基因簇首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動子區(qū)的JumpStart序列設(shè)計上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分；然后94℃變性10秒；60℃退火30秒，68℃延伸15分，這樣進(jìn)行30個循環(huán)；最后，在68℃繼續(xù)延伸7分，得到長度為13367個堿基的PCR產(chǎn)物；合并6管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)件O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫，反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行；選擇合適的反應(yīng)時間使酶切后的DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)，合并4管同樣的反應(yīng)體系，分別用等體積的酚和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等體積的乙醚抽提兩次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中；隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，使DNA的3’端加dA尾，此混合物經(jīng)氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提和乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接24小時，總體積為90ul，其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶，最后用無水乙醇沉淀連接混合物，70％乙醇洗后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物，用Bio-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時間為5.0毫秒-6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落。將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時從每個克隆中提取質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆構(gòu)成了鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在700bp以上的120個克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段單向進(jìn)行測序，使序列達(dá)到80％的覆蓋率，剩余20％的序列再根據(jù)已得到的序列設(shè)計引物，該兩對引物，如下所示5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’及5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’；再從鮑氏志賀氏菌11型的基因組DNA中直接PCR并對PCR產(chǎn)物測序，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。
(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列(見序列列表)。序列的質(zhì)量主要由兩個方面來保證1)對鮑氏志賀氏菌11型的基因組作6個Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫。2)對每個堿基，保證3個以上高質(zhì)量的覆蓋率。在得到鮑氏志賀氏菌11型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術(shù)信息學(xué)中心(TheNational Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到11個開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對，最后得到鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)；(6)特異基因的篩選針對鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf5、orf7、orf8、orf9、orf10基因設(shè)計引物；在每個基因內(nèi)各設(shè)計了三對引物，每對引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，所有引物都在大腸桿菌O105中得到陽性結(jié)果，在其他組中都沒有擴(kuò)增到任何大小正確的帶，即在大多數(shù)組中沒有得到任何PCR產(chǎn)物帶，雖然在少數(shù)組中得到PDR產(chǎn)物帶，但其大小不符合預(yù)期大小，所以wzx、wzy、orf5、orf7、orf8、orf9、orf10基因?qū)︴U氏志賀氏菌11型的O-抗原都是高度特異的。
也就是本發(fā)明的第一個方面，提供了鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全長13367個堿基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的堿基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通過本發(fā)明的方法得到了鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)(在圖一中列出)，它總共由11個基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
本發(fā)明的第二個方面，提供了鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇中的基因，即轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因(wzx基因或與wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或與wzy有相似功能的基因)；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf7、orf8、orf9、orf10基因；細(xì)菌多糖抗原中特殊的糖合成路徑基因，包括rmlB、rmlD、rmlA、rmlC基因，它們在O-抗原基因簇中的起始位置和終止位置及核苷酸序列都列在表4中。本發(fā)明尤其涉及到糖基轉(zhuǎn)移酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因，因?yàn)樘呛铣陕窂交蚣春铣珊塑斩姿釂翁堑幕颥F(xiàn)在被預(yù)示對較多胞外多糖是常見的、共同的，對細(xì)菌的O-抗原并不是很特異的，而本發(fā)明涉及到的糖基轉(zhuǎn)移酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因?qū)︴U氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原是高度特異的。
本發(fā)明的第三個方面，提供了源于鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇中的wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因和糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf7、orf8、orf9、orf10基因的寡核苷酸，它們是這些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，優(yōu)先被用的是列于表一中的寡核苷酸對，在表一中也列出了這些寡核苷酸對在O-抗原基因簇中的位置及以這些寡核苷酸對為引物所做的PCR反應(yīng)的產(chǎn)物的大小，這些PCR反應(yīng)可用表中的退火溫度進(jìn)行。這些引物只在以鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增中得到預(yù)期大小的產(chǎn)物，而在以表二所列的166株大腸桿菌和43株志賀氏菌為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增中都未得到預(yù)期大小的產(chǎn)物。更詳細(xì)地說，以這些寡核苷酸對為引物所做的PCR反應(yīng)在大多數(shù)細(xì)菌中均未得到任何產(chǎn)物，雖然在有些菌中得到了PCR產(chǎn)物帶，但其大小不符合預(yù)期大小，這是由于引物結(jié)合到基因組的別的位置造成，這種問題可通過用基因內(nèi)的其它引物做PCR來避免。所以，可以確定這些引物即表一所列的寡核苷酸對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105及它們的O-抗原是高度特異的。
本發(fā)明的其他方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
如本發(fā)明所用，“寡核苷酸”是指來源于O-抗原基因簇中的編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因和編碼聚合酶的基因內(nèi)的一段核苷酸分子，它們在長度上可改變，一般在10到20個核苷酸范圍內(nèi)改變。更確切的說這些寡核苷酸是源于orf5基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的4667至5410堿基)，wzy基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的5432至6460堿基)，orf7基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的6468至7310堿基)，orf8基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的7310至8446堿基)，orf9基因(核苷酸位置是從SEQ IDNO1的8443至9327堿基)，orf10基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的9344至10327堿基)，wzy基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的10367至11794堿基)。源于以上基因內(nèi)的寡核苷酸對鮑氏志賀氏菌11型(SEQ ID NO1)和大腸桿菌O105都是高度特異的。
此外，有時兩個遺傳相似的編碼不同O-抗原的基因簇通過基因重組或突變產(chǎn)生新的O-抗原，從而產(chǎn)生新的細(xì)菌類型，新的突變株。在這種環(huán)境中，需要篩選出多對寡核苷酸同重組基因雜交以提高檢測的特異性。因此，本發(fā)明提供了一整套多對寡核苷酸的混合物，它們源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因；源于轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因；也源于糖合成路徑基因。這些基因的混合物對一個特殊的細(xì)菌多糖抗原來說是特異的，從而使這套寡核苷酸對這個細(xì)菌的多糖抗原是特異的。更具體地說，這些寡核苷酸的混合物是源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因、wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy或與wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸與源于糖合成路徑基因中的寡核苷酸的組合。
在另一方面，本發(fā)明涉及寡核苷酸的鑒定，它們可以用于檢測表達(dá)O-抗原的細(xì)菌和在診斷中鑒定細(xì)菌的O-抗原。
本發(fā)明涉及到一種檢測食品中的一個或多個細(xì)菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(ii)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個寡核苷酸能與至少一個表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個以上的那樣的基因特異性雜交，這些細(xì)菌是鮑氏志賀氏菌11型或大腸桿菌O105?？捎肞CR方法檢測，更可以將本發(fā)明方法中的核苷酸標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)如southern-blot或熒光檢測，或者通過基因芯片或微陣列檢測樣品中的抗原及細(xì)菌。
本發(fā)明者考慮到以下情況當(dāng)單個的特異的寡核苷酸檢測無效時，寡核苷酸的混合物能與靶區(qū)域特異性雜交以檢測樣品。因此本發(fā)明提供了一套寡核苷酸用于本發(fā)明所述的檢測方法。這里所說的寡核苷酸是指源于編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。這套寡核苷酸對一個特殊的細(xì)菌的O-抗原來說是特異的，這一特殊的細(xì)菌O-抗原是由鮑氏志賀氏菌11型或大腸桿菌O105表達(dá)的。
另一方面，本發(fā)明涉及到一種檢測排泄物中的一個或多個細(xì)菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(ii)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個寡核苷酸能與至少一個表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個以上的那樣的基因特異性雜交。這些細(xì)菌是鮑氏志賀氏菌11型或大腸桿菌O105?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸分子標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)如southern-blot或熒光檢測，或者通過基因芯片或微陣列檢測樣品中的抗原及細(xì)菌。
一般一對寡核苷酸可能與同樣的基因雜交也可與不同的基因雜交，但它們中必須有一個寡核苷酸能特異性雜交到特殊抗原型的特異序列上，另一個寡核苷酸可雜交于非特異性區(qū)域。因此，當(dāng)特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新組合時，至少能選出一對寡核苷酸與多糖抗原基因簇中特異基因混合物雜交，或者選出多對寡核苷酸與特異基因的混合物雜交。甚至即使當(dāng)一個特殊的基因簇中所有基因都獨(dú)一無二時，此方法也能應(yīng)用于識別此基因簇內(nèi)的基因混合物的核苷酸分子。因此本發(fā)明提供了一整套用于檢測本發(fā)明方法的多對寡核苷酸，在這里多對寡核苷酸是源于編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因，這套寡核苷酸對一個特殊的細(xì)菌多糖來說是特異的，這套寡核苷酸可能是糖合成中必須基因的核苷酸。
另一方面，本發(fā)明也涉及到一種檢測源于病人的樣品中的一個或多個細(xì)菌多糖抗原的方法。樣品中的一個或多個細(xì)菌多糖抗原可以使樣品能與以下至少一個基因中的一對寡核苷酸中的一個特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(ii)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個寡核苷酸能與樣品中的至少一個表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個以上的那樣的基因特異性雜交，這些細(xì)菌是鮑氏志賀氏菌11型或大腸桿菌O105?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)，或者通過基因芯片，或者微陣列檢測樣品中的抗原及細(xì)菌。
更詳細(xì)地說，以上描述的方法可以理解為當(dāng)寡核苷酸對被使用時，其中的一個寡核苷酸分子能雜交到一個并不是來源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因、wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因的序列上。此外，當(dāng)兩個寡核苷酸都能雜交上時，它們可能雜交于同一基因也可能雜交到不同基因上。也即，當(dāng)交叉反應(yīng)出現(xiàn)問題時，可選擇寡核苷酸的混合物來檢測混合的基因以提供檢測的特異性。
本發(fā)明者相信本發(fā)明不必限于以上所提的核苷酸序列編碼的特定的O-抗原，而且廣泛應(yīng)用于檢測所有表達(dá)O-抗原和鑒定O-抗原的細(xì)菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如細(xì)菌胞外抗原)合成之間的相似性，發(fā)明者相信本發(fā)明的方法和分子也應(yīng)用于這些其他的多糖抗原。
本發(fā)明首次公開了鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇的全長序列，而且可從這個未被克隆的全長基因簇的序列中產(chǎn)生重組分子，通過插入表達(dá)可產(chǎn)生表達(dá)鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原，并成為有用的疫苗。
其次是感受態(tài)細(xì)胞的制備參照Bio-Rad公司提供的方法制備感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α。取一環(huán)大腸桿菌DH5α單菌落于5ml的LB培養(yǎng)基中，180rpm培養(yǎng)10小時后，取2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到200ml的LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm劇烈振蕩培養(yǎng)到OD600 0.5左右，然后冰浴冷卻20分，于4℃4000rpm離心15分。傾盡上清液，用冷的冰預(yù)冷的去離子滅菌水200ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分。再用冷的冰預(yù)冷的去離子滅菌水100ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分。用冷的冰預(yù)冷的10％的甘油懸浮細(xì)胞，4℃6000rpm離心10分，棄上清液，最后沉淀用1ml冰預(yù)冷的10％的甘油懸浮細(xì)胞，即為感受態(tài)細(xì)胞。將制得的感受態(tài)細(xì)胞分裝為50ul一管，-70℃保存。
最后是電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時間為5.0毫秒-6.0ms毫秒。電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇。然后立即將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃倒置過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落。將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時從每個克隆中提取質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群構(gòu)成鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇文庫。實(shí)施例4對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在700bp以上的120個克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段單向進(jìn)行測序，使序列達(dá)到80％的覆蓋率。剩余20％的序列再根據(jù)已得到的序列設(shè)計引物，再從鮑氏志賀氏菌11型的基因組DNA中直接PCR并對PCR產(chǎn)物測序，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。在鮑氏志賀氏菌11型中我們設(shè)計了兩對引物，如下所示5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’實(shí)施例5核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列(見序列列表)。序列的質(zhì)量主要由兩個方面來保證1)對鮑氏志賀氏菌11型的基因組作6個Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫。2)對每個堿基，保證3個以上高質(zhì)量的覆蓋率。在得到鮑氏志賀氏菌11型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術(shù)信息學(xué)中心(TheNational Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到11個開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對，最后得到鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，如表3所示。
通過檢索和比較，發(fā)現(xiàn)orf1與Shigella boydii和Escherichia coli K12的rmlB基因在297個氨基酸的序列中都有97％的相同性，表明它們之間有高度的同源性。所以可以確定orf1是rmlB基因。orf2與Shigella boydii的rmlD基因在299個氨基酸的序列中有98％的相同性，此外與Escherichiacoli K12的rmlD基因的氨基酸序列也有95％的相同性，表明它們之間有高度的同源性。所以，可以確定orf2是rmlD基因。orf3與Shigella boydii和Escherichia coli K12的rmlA基因在292個氨基酸的序列中有97％的相同性，表明它們之間有高度的同源性。所以，可以確定orf3是rmlA基因。orf4與Shigella boydii和Escherichia coli K12的rmlC基因在179個氨基酸的序列中有86％的相同性，表明它們之間也有高度的同源性。所以，可以確定orf4是rmlC基因。此外，在志賀氏菌和大腸桿菌中，rmlB、rmlD、rmlA、rmlC是專門合成鼠李糖的四個基因，在鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原的結(jié)構(gòu)中也有鼠李糖，十分吻合。Orf6與大腸桿菌的wzy基因在317個氨基酸序列中有25％的相同性，另外通過Eisenberg算法得知orf6有10個潛在的穿膜區(qū)，與其他的O-抗原聚合酶有相似的二級結(jié)構(gòu)，所以確定orf6就是wzy基因，命名為wzy。Orf7與Enterococcus faecalis的glycosyltansferase基因在238個氨基酸中有27％的相同性，是一個糖基轉(zhuǎn)移酶基因，命名為orf7。orf9與shigella flexneri的glycosyltansferase基因在289個氨基酸序列中有48％的相同性，69％的相似性，所以確定orf9是一個糖基轉(zhuǎn)移酶基因，命名為orf9。Orf11與shigella boydii的glycosyltansferase基因在468個氨基酸序列中有57％的相同性，76％的相似性，并且通過Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis of membrane and surfaceprotein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179125-142]發(fā)現(xiàn)orf11有12個潛在的穿膜區(qū)，它與許多wzx蛋白相似，而且在wzx蛋白的氨基端有一個大約50個氨基酸的保守基序，所以可以確定orf11是wzx基因，命名為wzx。根據(jù)鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原結(jié)構(gòu)可知還需要有3個糖基轉(zhuǎn)移酶基因，orf5，orf8，orf10與已知序列無明顯同源性，但具有糖基轉(zhuǎn)移酶的特征，是三個糖基轉(zhuǎn)移酶，命名為orf5，orf8，orf10。實(shí)施例6特異基因的篩選。針對鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf5、orf7、orf8、orf9、orf10基因設(shè)計引物，這些基因在核苷酸序列中的位置見表1。
表1列出了鮑氏志賀氏菌11型的O抗原基因簇中糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因及基因內(nèi)的引物及PCR數(shù)據(jù)。在表中列出了鮑氏志賀氏菌11型的O抗原基因簇的糖基轉(zhuǎn)移酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因及它們的相應(yīng)的功能和大小。在每個基因內(nèi)，我們各設(shè)計了三對引物，每對引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方以確保其特異性。在表中還列出了每個引物在SEQ IDNO1中的位置和大小。以每對引物用表中所列的相應(yīng)的退火溫度以表二中的所有菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，得到了相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大腸桿菌的基因組中且高度保守的一個基因，所以我們根據(jù)mdh基因設(shè)計了引物#101(-TTC ATC CTAAAC TCC TTA TT)和#102(-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG)，然后從166株大腸桿菌中提取基因組，方法如前所述。用這對引物從166株大腸桿菌的基因組中PCR以鑒定大腸桿菌并檢測其基因組的質(zhì)量。
表2是用于篩選特異基因的166株大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源，為了檢測的方便，我們將它們每8-10個菌分為一組，總共27組，它們的來源都列于表中。
在第25組中含有鮑氏志賀氏菌11型的基因組DNA作為陽性對照。以每組菌做模板，用表一中的每對引物按如下條件做PCR在94℃預(yù)變性2分后，94℃變性15秒，退火溫度因引物的不同而不同(參照表一)，退火時間是50秒，72℃延伸2分，這樣進(jìn)行30個循環(huán)。最后在72℃繼續(xù)延伸10分，反應(yīng)體系是25ul。反應(yīng)完畢后，取10ulPCR產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增出的片段。
對于wzx、wzy、orf5、orf7、orf8、orf9、orf10基因，每個基因都有1至3對引物被檢測，每對引物除了在第25組中做PCR后得到了預(yù)期大小的正確的一條帶外，在第18組中也都得到同樣大小的特異性帶。以第18組中的每個菌的基因組DNA做模板PCR后，發(fā)現(xiàn)只在大腸桿菌O105中得到了陽性結(jié)果。更詳細(xì)地說，以上每個基因的每一對引物都在大腸桿菌O105中得到預(yù)期大小的正確的PCR產(chǎn)物帶。據(jù)報道，鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原結(jié)構(gòu)是一樣的，我們的結(jié)果從另一個側(cè)面證實(shí)了這一點(diǎn)。此外，所有的引物在其他組中都沒有擴(kuò)增到任何大小正確的帶，也就是說，在大多數(shù)組中沒有得到任何PCR產(chǎn)物帶，雖然在少數(shù)組中得到PCR產(chǎn)物帶，但其大小不符合預(yù)期大小，所以wzx、wzy、orf5、orf7、orf8、orf9、orf10基因?qū)︴U氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105及其O-抗原都是高度特異的。
最后，通過PCR從鮑氏志賀氏菌11型中篩選到對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原高度特異的基因wzx、wzy和四個糖基轉(zhuǎn)移酶基因。而這些基因內(nèi)的任何一段10-20nt的寡核苷酸對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原是特異的，尤其是上述每個基因中的引物即寡核苷酸對經(jīng)PCR檢測后證實(shí)對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105是高度特異的。所有的這些寡核苷酸都可用于快速準(zhǔn)確地檢測人體和環(huán)境中的鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105，并能鑒定它們的O-抗原。
表3是鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)表，在表中列出了鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，共由11個基因組成，每個基因用方框表示，并在方框內(nèi)寫入基因的名稱，數(shù)字表示的是O-抗原基因簇中的開放閱讀框(orf)的順序。在O-抗原基因簇的兩端是galF基因和gnd基因，這兩個基因不負(fù)責(zé)O-抗原的合成，我們只是用它們的一段序列設(shè)計引物來擴(kuò)增O-抗原基因簇的全長序列。
表4是鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇中的所有開放閱讀框在全序列中的準(zhǔn)確位置，在每個開放閱讀框的起始密碼子和終止密碼子的下面劃線。
序列列表SEQUENCE LISTING<110>南開大學(xué)<120>對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸<130>對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>13367<212>DNA<213>Shigella boydii<400>1ctcctggtaa ctcacgcgtc caagaacgcg gtcgaaaacc acttcgacac ctcttatgaa 60ttagaatctc tccttgaact gcgcgtgaag cgtcaactgc tggccgaagt acagtccatt120tgcccgccgg gcgtgaccat tatgaacgtg cgtcagggcg aacctttagg tttaggccac180tccattttat gtgcacgacc cgccattggt gacaatccat ttgtcgtggt gctgccagac240gttgtgatcg atgacgccag cgccgacccg ctgcgctaca accttgcagc catgattgcg300cgcttcaacg aaacgggccg tagccaggtg ctggcaaaac gtatgccagg tgacctctct360gaatactctg tcatccagac caaagagccg ctggatcgcg aaggcaaagt cagccgcatt420gttgaattta tcgaaaaacc ggatcagccg cagacgctgg actcagacat catggccgta480ggtcgttatg tgctttctgc cgatatttgg ccggaacttg aacgcacgca gccaggggca540tggggacgta ttcagctgac agatgccatc gctgaactgg cgaaaaaaca gtccgttgat600gcaatgctga tgactggtga cagctacgac tgcggtaaaa aaatgggcta tatgcaggcg660tttgtgaagt atggactacg caacctgaaa gaaggggcga agttccgcaa 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*在所有組中得到1條錯誤大小的帶**在所有組中都得到2條錯誤大小的帶表二166株大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源組號 該組中含有的菌株 來源1 野生型大腸桿菌O1，O2，O3，O10，O16，O18，O39 IMVSa2 野生型大腸桿菌O40，O41，O48，O49，O71，O73，O88，O100IMVS3 野生型大腸桿菌O102，O109，O119，O120，O121，O125，O126，O137 IMVS4 野生型大腸桿菌O138，O139，O149，O7，O5，O6，O11，O12 IMVS5 野生型大腸桿菌O13，O14，O15，O17，O19ab，O20，O21，O22 IMVS6 野生型大腸桿菌O23，O24，O25，O26，O27，O28，O29，O30 IMVS7 野生型大腸桿菌O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O42 IMVS8 野生型大腸桿菌O43，O44，O45，O46，O50，O51，O52，O53 IMVS9 野生型大腸桿菌O54，O55，O56，O57，O58，O59，O60，O61 IMVS10野生型大腸桿菌O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70 IMVS11野生型大腸桿菌O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81 IMVS12野生型大腸桿菌O82，O83，O84，O85，O86，O87，O89，O90 IMVS13野生型大腸桿菌O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O101IMVS14野生型大腸桿菌O112，O162，O113，O114，O115，O116，O117，O118 IMVS15野生型大腸桿菌O123，O165，O166，O167，O168，O169，O170，O171 Seeb16野生型大腸桿菌O172，O173，O127，O128，O129，O130，O131，O132， Seec17野生型大腸桿菌O133，O134，O135，O136，O140，O141，O142，O143 IMVS18野生型大腸桿菌O144，O145，O146，O147，O148，O150，O151，O152 IMVS19野生型大腸桿菌O153，0154，O155，O156，O157，O158，O159，O164 IMVS20野生型大腸桿菌O160，O161，O163，O8，O9，O124，O111 IMVS21野生型大腸桿菌O103，O104，O105，O106，O107，O108，O110 IMVS22鮑氏志賀氏菌血清型B4，B5，B6，B8，B9，B11，B12，B14 Seed23鮑氏志賀氏菌血清型B1，B3，B7，B8，B10，B13，B15，B16，B17，B18 Seed24痢疾志賀氏菌血清型D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8 Seed25痢疾志賀氏菌血清D9，D10，D11，D12，D13 Seed26弗氏志賀氏菌F6a，F(xiàn)1a，F(xiàn)1b，F(xiàn)2a，F(xiàn)2b，F(xiàn)3，F(xiàn)4a，F(xiàn)4b，F(xiàn)5(v7)F5(v4) Seed27宋內(nèi)氏志賀氏菌D5，DR Seeda. Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australiab. O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc. 172 and 173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVSd. 中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)研究所表3是鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)表 1kb表4是鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇中的基因的位置表ctcctggtaa ctcacgcgtc caagaacgcg gtcgaaaacc acttcgacac ctcttatgaa 60ttagaatctc tccttgaact gcgcgtgaag cgtcaactgc tggccgaagt acagtccatt120tgcccgccgg gcgtgaccat tatgaacgtg cgtcagggcg aacctttagg tttaggccac180tccattttat gtgcacgacc cgccattggt gacaatccat ttgtcgtggt gctgccagac240gttgtgatcg atgacgccag cgccgacccg ctgcgctaca accttgcagc catgattgcg300cgcttcaacg aaacgggccg tagccaggtg ctggcaaaac gtatgccagg tgacctctct360gaatactctg tcatccagac caaagagccg ctggatcgcg aaggcaaagt cagccgcatt420gttgaattta tcgaaaaacc ggatcagccg cagacgctgg actcagacat catggccgta480ggtcgttatg tgctttctgc cgatatttgg ccggaacttg aacgcacgca gccaggggca540tggggacgta ttcagctgac agatgccatc gctgaactgg cgaaaaaaca gtccgttgat600gcaatgctga tgactggtga cagctacgac tgcggtaaaa aaatgggcta tatgcaggcg660tttgtgaagt atggactacg caacctgaaa gaaggggcga agttccgcaa aggtattgag720aagctgttaa gcgaataatg aaaatctgac cggatgtaac ggttgataag aaaattataa780cggcagtgaa gattcgtggc gaaagtaatt tgttgcgaat tttcctgccg ttgttttata840taaacaatca gaataacaac gagttagcaa taggattttt gtcaaagttt tccaggattt900tccttgtttc cagagcggat tggtaagaca attagcgttt gaatttttcg ggtttagcgc960gagtgggtaa cgctcgtcac atcgtaggca tgcatgcagt gctctggtag ctgtaaagcc 1020aggggcggta gcgtgcatta atacctctat taatcaaact gagagccgct tatttcacag 1080catgctctga agtaatatgg aataaattaa gtgaaaatac ttgttactgg tggcgcagga 1140tttattggtt ctgctgtagt tcgtcacatt ataaataata cgcaggatag tgttgttaat 1200gtcgataaat taacgtacgc cggaaacctg gaatcacttg ctgatgtttc tgattccgaa 1260orf1的起始cgctatgttt ttgaacatgc ggatatttgc gatgcagctg taatggcacg gatttttgct 1320cagcatcagc cggatgcagt gatgcacctg gctgctgaaa gccatgtgga ccgttcaatt 1380acaggtcctg cggcatttat tgaaaccaat attgttggta catatgtcct tttggaagcc 1440gctcgcaatt actggtctgc tcttgatagc gacaagaaaa atagcttccg ttttcatcat 1500atttctactg acgaagtcta tggttatttg cctcatcctg acgaggtgaa taatacagaa 1560gaattaccct tatttactga gacaacagct tacgcgccaa gcagccctta ttccgcatcc 1620aaagcatcca gcgatcattt agtccgcgcg tggaaacgta cctatggttt accgaccatt 1680gtgactaatt gttcgaataa ctacggtcct tatcactttc cggaaaaatt gattccacta 1740gtaattctta atgctctgga aggtaaggca ttacctattt atggcaaagg ggatcaaatt 1800cgcgactggc tgtatgttga agatcatgca cgtgcgttat ataccgtcgt aaccgaaggt 1860aaagcgggtg aaacttataa cattggtgga cacaacgaaa agaaaaacat cgatgtagtg 1920ctcactattt gtgatttgtt ggatgagatt gtaccgaaag agaaatctta ccgcgagcaa 1980attacttatg ttgccgatcg tccgggacac gatcgccgtt atgccattga tgctgagaag 2040attgctcgcg aattgggatg gaaaccacag gaaacgtttg agagcgggat tcggaagaca 2100gtggaatggt acctgtccaa tacaaaatgg gttgataatg tgaaaagtgg tgcctatcaa 2160orf1的中止orf2的起始tcgtggattg aacagaacta tgagggccgc cagtaatgaa tattctcctt ttcggcaaaa 2220cagggcaggt aggttgggaa ctacagcgtg ctctggcacc tttgggtaat ttgattgctc 2280ttgatgttca ctccactgat tattgtggtg attttagtaa tcctgaaggt gtggctgaaa 2340ccgtcaaaaa aattcgccct gatgttattg ttaatgctgc ggctcatacc gcagtagata 2400aggctgagtc agaacccgaa tttgcacaat tactcaatgc gaccagcgtt gaatcaattg 2460caaaagcggc taatgaagtt ggggcctggg taattcatta ctcaactgac tacgtatttc 2520cgggaaccgg tgaaatacca tggctggaga cggatgcaac cgcaccgcta aatgtttacg 2580gtgaaaccaa gttagccgga gaaaaagcgt tacaggaaca ttgcgcgaag catcttattt 2640tccgtaccag ctgggtatac gcaggtaaag gaaataactt cgccaaaacg atgttgcgtc 2700tggcaaaaga gcgtgaagaa ttagcggtta ttaacgatca gtttggtgca ccaacgggtg 2760ctgagctgct ggctgattgt acggcacatg ctattcgtgt tgcactgaaa aaaacagaag 2820tcgcaggctt gtaccatttg gtagctagtg gtaccacaac ctggtacgat tatgctgcgc 2880tggtttttga agaggcgcgc aaagcaggca ttccccttgt actcaacaag ctcaacgcag 2940taccaacaac tgcctatcct acaccagctc gtcgtccaca taactctcgc cttaatacag 3000aaaaatttca gcagaacttt gcgcttgtct tgcctgactg gcaggttggc gtgaaacgaa 3060orf2的中止tgctcaacga attatttacg actacagcaa tttaatagtt tttgcatctt gttcgtgatg 3120orf3的起始gtggagcaag atgaattaaa aggaatgatg aaatgaaaac gcgtaaaggt attattttag 3180cgggtggttc tggtacacgt ctttatcctg tgacgatggc cgtcagtaaa cagctgttac 3240cgatttatga taaaccgatg atctattacc cgctttctac actgatgtta gcgggtattc 3300gcgatattct gattatcagt acgccacagg atactcctcg ttttcaacaa ctgctgggtg 3360acgggagcca gtgggggcta aatcttcagt acaaagtaca accgagtccg gatggtcttg 3420cgcaggcgtt tattatcggt gaagagttta ttggtggtga tgattgtgct ttggttcttg 3480gtgacaatat cttctacggt cacgatctgc cgaagttaat ggacgtagct gttaacaaag 3540aaagtggtgc aacggtattt gcctatcacg ttaatgatcc tgaacgctac ggtgtcgttg 3600agtttgataa aaacggtacg gcgatcagcc tggaagaaaa accgctacaa ccaaaaagta 3660attatgcggt aaccgggctt tatttttatg ataacgacgt tgtcgaaatg gcgaaaaatc 3720ttaagccttc tgcccgcggt gaactggaaa ttaccgatat taaccgtatt tatatggaac 3780aggggcgttt atccgttgcc atgatggggc gtggatatgc atggctggac acgggaacac 3840atcaaagtct tattgaagca agcaacttca ttgcaacaat tgaagaacgt caggggctga 3900aagtatcctg cccggaagaa attgcttacc gtaaaggatt tattgattct gagcaggtga 3960aagtattagc tgaaccgctg aaaaaaaatg cttatggtca gtacctacta aaaatgattg 4020orf3的中止orf4的起始aaggttattaataaaatgaa cgtaattaaa actgaaattc ctgatgtgtt aatttttgag 4080ccgaaagttt ttggtgatga gcgtggtttc tttatggaaa gctttaatca gaaagttttc 4140gaagaggctg taggacgtaa ggttgaattt gttcaggata accattcgaa gtctagtaaa 4200ggtgttttac gcgggctgca ttatcagtta gaaccttatg cgcaagggaa attggtacgt 4260tgcgttgttg gtgaggtttt tgatgtagct gttgatattc gtaaatcgtc gcctaccttt 4320ggtaaatggg ttggggtgaa tttatctgct gagaataagc ggcaattgtg gatacctgaa 4380ggatttgcac atggtttttt ggtgctgagt gaaacggcgg agtttttgta taagacgact 4440aattattatc atcctgaaag tgatagggga attatttggg atgattcctt cattaatatc 4500caatggcctt atgctgagtg cattatttta tctgacaaag ataaacatca gcctagatta 4560orf4的中止tctagataat taatataacc taggtttttt attgttattc atgagctatc tttatgaatg 4620orf5的起始gttgagtttc ccaatttaaa acagattaat ttgtcaaggt caaaatatgt gtaaaattgt 4680ggtgtataca gctattacag ggaattatga taatattaag cccctgtcat acgttaatac 4740caactttgat tatttgtgtt ttacagacta tgaatataca ggtgttattc ctgagccttg 4800gaaacagatt cgaatgccac cagcgaagtg gtgtaataag gacttggcac gatatattaa 4860aatgaatgtg catgagattt tacctaatta tgaagctagt gtttggattg atggaaatat 4920agacattatc aacaatattg agggtttggt ttttgatgcc ttaaaaaaag ggggggcctc 4980atcataccaa cattggggcc gaaataatat taatgaggaa atgattgagt gtgcaaaaat 5040tggatacgat agtattttta ttcttttgaa acaaatgaaa caatatggta atgaaggttt 5100catctcaaac gaactgtatg aaacaaatgt tttgattaga gatcatacta atagcagtat 5160ttctgaattc tctaaaattt ggtgggagca atatatgcag tatggtaaac gagatcaata 5220cgcctttact tatgctgcgt ggaaatctgg actaaatatt cataatttag gacgacatga 5280ccctagattt attaaaaaat atttttcata ttttccacat aaaaatggga aaagcataaa 5340agtatatagg ataaaacaat taattaataa aataaccaat cgtattacgc tcagaattat 5400orf5的中止 orf6的起始taaaatataacagtatgaag gtttatttat aatggtttac ggttttctat ggtgtctatg 5460ttttctatta agtttgttta ataataacag ttattttaaa tattatatta cactatgtat 5520aataatggtt ctttggtttt tggcttcctt taggggggca ggagttgatg gtgattatgc 5580aaattatatt gagtacataa atgatgctca aagtattgga tattcttata gaggtggtta 5640tttttttgat tggatagtta atttttttgt ttatattggc ttgcctgcca catatgtttt 5700tgcagtatat gcacttgcca taccgataaa aataaaatta tttcaaaagt tttcattatt 5760atcttcttct atattactcg gttatgttgg tttttttatt tatctgcatg attttactca 5820aattagagct ggcttagctg ttggtattgc tttttggggg atttattatt acgcatatca 5880gaataaaata aaggcagtaa tactattttt tgcgagttgc tttattcatc catcgctcat 5940atttcttgtg gcctttgtat gctttaataa attcttgtct aataaattat tagtggtcac 6000actgatgata agtattattt tatgtataat aaatgcaaat acatttatag tacagaaaat 6060agttgattta agtggcagtg cagatcttga tttatattat cgcttggcag ttgatggtca 6120gattattaaa acatttggag catttccatt actgaattta tttatatcga tagtatcact 6180gtattatttg aataatatag caagagaaaa tgctttactt tcaatcttta ttaagatgct 6240tttgttttcg caaatttcat ggttcctttt ctctcccata cctgtattag ctgcacgaat 6300aagtcagatt tttttattct caattgtctt tgttttgccg catttatctg taaagctatt 6360taatcagcca ataactatac cagcactata tagctttgtg ggttttttag cctttattat 6420orf6的中止 orf7的起始tatagccgaa ttaatgcatc catatcagtt aggattttgatacataaatgaagataacta 6480tcttggtagt gctttataat aaaaaattta aagaaagccc aacattacag acaatattga 6540gtgaaaaaca taccttgaaa aaaatgaatg ttgaactctg tattcatgac aattcaccca 6600attcgcaatt agatgagtgt tatattagtg agatgaagga atttgtaaaa tgttattata 6660cacacacacc agaaaatatg acattaagag agatatataa taatataatt aataccttaa 6720aatacaatac ttatctttgt ttgatggatg atgatactag tttaccacag tccttcttta 6780atgaggtaat aagtgctatc aataaaaatc cagatattga gttaattgta ccacgagtta 6840tcgttaatga taagctttat agtccacata aaagttattc atttataaat agaccaacat 6900ttagggatat taaaggaata cagaagtcca ggaacatgtc ggctataaat agtgggatgg 6960taatcaaatc aaattttttt aaacgttgtg ggtttaaata tcctgaatat acaagttatt 7020atgggacgga taaggctttt tttgatcatt atctaaaata taatcaagaa tattatgttt 7080tagatattga tataaatcat gatgtaagta accatccaca taataaagat gatgtacgtt 7140attcacagat tatttcatct gtgaatttct tttggatgca acatttaaaa ggaaactatg 7200cgcttaagtt tttatacata atttatatta tattatatcg tatcaaacta tccatactca 7260orf8的起始 orf7的中止ggaaaaattt aatttttatt aaatcaatag tatctctagg taataaataa tgaaaaataa7320tagctataaa gtatttcctt tttattttcc tcaattttat gcaacgaaag aaaatgatat 7380gtggtggggg aaaggtttta ctgattggga actggtaaaa aaagctcaag cagtacatca 7440atctcagtca caacctcgta ttcctctaaa tggctattat gatcagtctg atccagtagt 7500aataaaaaaa caatcaaaat tagcaagtga atatggaata gatggtttta atttctatca 7560ctactggttt gatggtactg tgttgctaga taaacctatg caaaatttat ataatgataa 7620aagtatcgat atagaatatt tctttacatg ggctaatgaa acatggacaa ggcagtgggt 7680tggacgcccg caagatctac taataaagca agaacataaa gtggatataa atatatggaa 7740tgaacactat gaatatttga ggaaattttt tcttgacgat aggtatttaa aaatcaataa 7800ttcacctgtg ctttgcatat atagacctga acttttaaaa tcgttaagag aatgggtggc 7860tttttttaat aataaagcaa agtgtgatgg atttgatggc atacatttga tcgcattacg 7920agcatacagt attgcaaatg cagattctgt ttataaatat tttgataaaa ttgttaactt 7980tcaacctaga tttgcaataa acactcattt aaaaaaatcg agtccactaa agaaattaat 8040tgaaagcact ctaaggattg ctccagagtg gcttcagttg cagcttgtaa gaataataaa 8100aaataagaga gcaacttata atcattataa atatagtgat tatatacaat caatgaaaaa 8160cgacgtaacg gaatataaag gtaagccaat ataccccgtt gtttttcctg actgggataa 8220tgccccaaga tataaagaaa atgcaacttt tttttgtgaa tcttcagcat ttgattttga 8280aaaagcattg aatatcgctt gtgatattac gagaaatcat gatgacaagc tgatatttat 8340taatgcttgg aatgaatggt ctgaaggagc atatttagaa ccagatgaaa tgtacaaata 8400orf9的起始 orf8的中止ttctaattta gaaattatta aaaaagtatt tcaggataag agatgaaacg cattgctatt 8460ttattagcag catataatgg cgctcgatgg ttagaagagc aaattagctc aatcctacaa 8520caaacgaatg ttgaggttac tatatatgtt agtattgatc tgtcaaatga tgaaacttat 8580ttattagttt caaagttggc tttaaaggaa cctaggatca taattcttcc ctatggtgat 8640atatatggag gggctgcaaa gaatttttac cggttaattt gtgaagtcga ctatgaaaat 8700tatgattata tagctttgtc tgatcaggac gacgtatggc gaaaaaacaa actagaacgt 8760gcatgtgagt ttttaaaaaa taacgatttt tattctagta atgtcatcgc attttgggaa 8820aatgggaaac aagcactaat aactaagtca caagataagg ttgcatttga tcattttttt 8880gaatcggcag ggccaggttg tacatttgtt tttaagagag aatatgctct tcaactcaag 8940cgtttcttga tgataaataa acatgccatg gatgtagaac ttcatgactg gttgatttac 9000gcatttgcac gagaaaataa cttaaaatgg catattgatt cgtatccggg aatgtattat 9060cgacaacata aaaataacca agtaggagca aataattcac taaaagcaat tattaaaaga 9120attcgactta taaagtccgg atggtatagg aatgaaataa taaagatatt aaatttattt 9180gaacaaagtg atattccctt tagagataac ctttgtaata aaaattactt tacctcatta 9240tttctcttaa aatatattta tatgataaga cgaaagagaa aagatagagc atttttagtt 9300orf9的中止 orf10的起始ttaatgatta tttttggtct tttttaactt ataggaatat tcaatgaatt ttgtatcgtt 9360agaaaacatg attagcgata ttaggggttt tataccagaa cttgcaattc atgattttga 9420cctcattgtc ggtattccaa gaagtgggat gattccagca tatacaattg gattgtattt 9480aaatattgat gttacagatg tttcttcttt tgtgaaaaat gtaccattgc aaagaggaat 9540ttctagggaa aaaccaacta gccttaagct gcctcaagac gcaaaaaaaa tactattagt 9600ggatgatagt tatacaacag gaaaatcgtt agctaatact ctaggcaaaa ttcctatgga 9660acttaggaat cgcattgtat cttttgcatt gtataccaca gacagagaaa atcataattt 9720agatatgttt atacgggtag taaaataccc acgtgtgttc gaatggaata ttctgaatca 9780taacattatt ggcaatagtt gcttagatat agacggtgtg ttatgtatgg atcctacaga 9840tgatgataat gatgatggac aaaaatatat aactttcctt gaaaatgcga aaccaaaatt 9900tattccaaaa gtgaaaataa agtatcttgt tacaaacagg ttggaaaaat atagaactca 9960taccgagaaa tggttatcta aaaataatgt taaatatgag caattaataa tgttagatct 10020taaaacaaaa gaagaaagaa taagatctgg acttcattcc acacataagg ctaaatttta 10080taaacattct ggttgttcac tttttattga aagtgatgtt aaacaagcat atgaaataat 10140gatgcaaagt ggtttgccgg tatattgtat tgatgacaat acaatgtata aaccaggtat 10200gacaaaatat tttataaagc aacctagcaa tgcattaaaa aaaatcattc tctggttacc 10260aatactaata tataaaaata ttcctaagcc atatcagaaa attattcggc gtttgataaa 10320orf10的中止aaaataaaaa gaaccaagtc atatggcttg gttctttgct gataaattac ctttttttaa 10380tttttgtttg caatgtttta ataagtttcc tgctttctga tatgggcaat agaagcagta 10440aataaatggt tccaccgatt gctgataaaa caaaaagaga tttaatgtca gatgcgaaat 10500gaactctaac atttgatatt aatatgaagc ttatagcagc agatataaat agtggataag 10560tttttttaaa tatgcttaaa atatttgatt ttattgtttt catcgtgaat ataatacatg 10620gaataaaatg tattgcattt gcaatgaaat aatattttgc aagatcaaca attccgcaat 10680ggatgcccac cataaatgat accgcagtta atatagttcc ctggatgcct aaaagaagca 10740aaatacctgt tttcccttga gacatgaaaa tagtgccagt ggtgcttagc accgactgta 10800ttattgcagt gggggcaagc caaactaata tatccgcaga cagaatccat tgttctccaa 10860aaacaacttg aatgaaaagt ttgtttaagc tagtaattac tgtaactaat ggtaaagtaa 10920taaaccaaat aatatagatt gtatttaaat aaatatcatt tatttctttg taattatttt 10980tcttctggct taatatagga tataaagaac gattagcaat aaaagtcaaa gatgagagtg 11040ggaatagcat aatccgataa gctaaattat aagatccaag tatagatgct gacatatact 11100taccgatcag aaaactatca agatttctgg caaaaaaatt aattatatta aaaagagaaa 11160gttgtgaggt aaaacgaaat atttctttta aatgatttat cacatgtcta ggtttgcctt 11220taggtctcca tggggatact atccataaca gtactgcaga gctcaaagaa ttaagcagag 11280attgaaatac cagactatat attccaaagc tattattagc taatataata gctaataaaa 11340gagacaaagc agctgaaaat acttcaattt tagaaataat aaaaaatttc gattctcttt 11400caagcatagc tagatgcaat gatgaagagc cggaaataat aaaactaaaa gatagcaaag 11460gtaaaacaat tagtagttta ggttgattgt acaaatgtga tataaagggg gtaagtgttg 11520taataataat aaataccaaa aagcctaaca aaaaattaag ccaaaaaacg gcacttttag 11580tttcatcttg caattgttct ttttgtataa ttgctgctga ggtccctaaa tctcgaaata 11640aactagcaaa attcattaca acaccagcca ttgccatgat gccgtattca tttggtggta 11700ttattcttgc taaataaaca atgcttatta gctgagttag tattttgaaa acttgtgaaa 11760aagtattcca ttttaaatta ttgaaaatgc tcatgtttta atctcactgt tccgattttt 11820aaattatacc tgaactgtta gaatgctaca atatttttga ttattgatac taatctctat 11880attattgata ccacattggc gattagtttg agtatgttac tacaggcgat ataattttat 11940atctaccttg gcttggcgat ttattatttg ttgttaacag aatacctttg taatttatat 12000taactgtata tatctatttc ttttatcgtt gaatcaaaat ctgacaggag taaacaatgt 12060caaagcaaca gatcggcgtc gtcggcatgg cagtgatggg gcgcaacctt gcgctcaaca 12120tcgaaagccg tggttatacc gtctctattt tcaaccgttc ccgtgaaaag acggaagaag 12180
tgattgccga aaatccaggc aagaaactgg ttccttacta tacggtgaaa gagtttgttg 12240aatctctgga aacgcctcgt cgcatcctgt tagtggtgaa agcaggtgca ggcacggatg 12300ctgctattga ttccctcaaa ccatatctcg ataaaggcga catcatcatt gatggtggta 12360acaccttctt ccaggacacc attcgtcgta atcgtgagct ttctgcagaa ggctttaact 12420tcattggtac cggtgtttcc ggcggtgaag aaggtgcgct gaaaggtcct tccattatgc 12480ctggtgggca gaaagaagcc tatgaactgg ttgcaccgat cctgaccaaa atcgccgcag 12540tggctgaaga cggtgagcca tgcgttacct atattggtgc cgatggtgca ggtcattatg 12600tgaagatggt tcacaacggt attgaatacg gtgatatgca actgattgcc gaagcctatt 12660ctctgctaaa aggtggcctg aaccttacca acgaagaact ggcacagacc tttaccgagt 12720ggaataacgg tgaactgagc agctacctga tcgacatcac caaagacatc ttcactaaaa 12780aagatgaaga cggtaactac ttggttgatg tgattctgga tgaagcggct aacaaaggta 12840ccggtaaatg gaccagccag agtgcgctgg atctcggcga accgctgtcg ctgattaccg 12900agtctgtgtt tgcacgttat atctcgtctc tgaaagatca gcgtgttgcc gcgtctaaag 12960ttctctctgg tccgcaagcg cagccagcag gcgataaagc tgagtttatc gagaaagttc 13020gccgtgcgct gtatctgggc aaaatcgttt cttacgctca gggcttctct cagctgcgtg 13080ctgcgtctga agagtacaac tgggatctga actacggtga aatcgcgaag attatccgtg 13140ctggctgcat catccgtgcg cagttcctgc agaaaatcac cgatgcttat gccgaaaatc 13200cgcagatcgc taacctgctg ctggctcctt acttcaagca aattgccgat gactaccagc 13260aggcgctgcg cgatgtcgtc gcttatgcag tacagaacgg tatcccggtt ccgaccttcg 13320ccgctgcggt tgcctattac gatagctacc gtgccgctgt tctgcct13367以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長13367個堿基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的堿基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照權(quán)利要求1所述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其是由11個基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
3.按照權(quán)利要求2所述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述的基因包括轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf7、orf8、orf9、orf10基因；其中所述的orf5基因是SEQ ID NO1中的4667至5410堿基的核苷酸；wzy基因是SEQ ID NO1中的5432至6460堿基的核苷酸；orf7基因是SEQ IDNO1中的6468至7310堿基的核苷酸；orf8基因是SEQ ID NO1中的7310至8446堿基的核苷酸；orf9基因是SEQ ID NO1中的8443至9327堿基的核苷酸；orf10基因是SEQ ID NO1中的9344至10327堿基的核苷酸；wzx基因是SEQ ID NO1中的10367至11794堿基的核苷酸。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基轉(zhuǎn)移酶基因orf5、orf7、orf8、orf9、orf10基因；或糖合成路徑基因中的寡核苷酸；以及它們的混合或它們的重組。
5.按照權(quán)利要求4所述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述的源于orf5基因的寡核苷酸對是SEQID NO1中的4882至4900堿基的核苷酸和5283至5300堿基的核苷酸；SEQ IDNO1中的5116至5133堿基的核苷酸和5386至5403堿基的核苷酸；SEQ IDNO1中的4681至4697堿基的核苷酸和5373至5390堿基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的5620至5638堿基的核苷酸和5980至5998堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5517至5536堿基的核苷酸和6323至6341堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5439至5457堿基的核苷酸和5831至5847堿基的核苷酸；源于orf7基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的6578至6596堿基的核苷酸和7014至7032堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的6664至6682堿基的核苷酸和6882至6899堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的6717至6735堿基的核苷酸和6977至6995堿基的核苷酸；源于orf8基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的7502至7520堿基的核苷酸和7974至7992堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的8019至8036堿基的核苷酸和8372至8391堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7376至7394堿基的核苷酸和8219至8237堿基的核苷酸；源于orf9基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的8674至8691堿基的核苷酸和9200至9218堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的8814至8832堿基的核苷酸和9139至9157堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的8543至8560堿基的核苷酸和9053至9070堿基的核苷酸；源于orf10基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的9727至9745堿基的核苷酸和10308至10325堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9784至9802堿基的核苷酸和10015至10033堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9430至9457堿基的核苷酸和10220至10239堿基的核苷酸；源于wzx基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的10484至10502堿基的核苷酸和10748至10765堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10599至10617堿基的核苷酸和11509至11527堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10997至11015堿基的核苷酸和11692至11710堿基的核苷酸。
6.權(quán)利要求1所述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸在檢測表達(dá)O-抗原的細(xì)菌、在診斷中鑒定細(xì)菌的O-抗原和細(xì)菌的其它多糖抗原的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，而且通過插入表達(dá)可提供表達(dá)鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原，并成為細(xì)菌疫苗。
8.按照權(quán)利要求1所述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸的應(yīng)用，其特征在于，其作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測、或者用于制造基因芯片或微陣列，檢測人體和環(huán)境中的細(xì)菌。
9.一種如權(quán)利要求1所述的對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌O105的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)志賀氏菌，離心收集細(xì)胞，用Tris-HCl(pH8.0)和EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分后加入溶菌酶裂解細(xì)菌，加入蛋白酶K和SDS降解蛋白質(zhì)，再加入RNase去除RNA；然后用等體積酚及等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提去除其中的酶和蛋白，再用等體積的乙醚抽提除去殘余的酚；用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA后用70％乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ulTE中，基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過Long PCR擴(kuò)增鮑氏志賀氏菌11型中的O-抗原基因簇首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動子區(qū)的JumpStart序列設(shè)計上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分；然后94℃變性10秒；60℃退火30秒，68℃延伸15分，這樣進(jìn)行30個循環(huán)；最后，在68℃繼續(xù)延伸7分，得到長度為13367個堿基的PCR產(chǎn)物；合并6管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)件O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫，反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行；選擇合適的反應(yīng)時間使酶切后的DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)，合并4管同樣的反應(yīng)體系，分別用等體積的酚和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等體積的乙醚抽提兩次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中；隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，使DNA的3’端加dA尾，此混合物經(jīng)氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提和乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接24小時，總體積為90ul，其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶，最后用無水乙醇沉淀連接混合物，70％乙醇洗后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物，用Bio-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時間為5.0毫秒-6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落。將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時從每個克隆中提取質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆構(gòu)成了鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在700bp以上的120個克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段單向進(jìn)行測序，使序列達(dá)到80％的覆蓋率，剩余20％的序列再根據(jù)已得到的序列設(shè)計引物，該兩對引物，如下所示5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’及5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’，再從鮑氏志賀氏菌11型的基因組DNA中直接PCR并對PCR產(chǎn)物測序，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列(見序列列表)。序列的質(zhì)量主要由兩個方面來保證1)對鮑氏志賀氏菌11型的基因組作6個Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫。2)對每個堿基，保證3個以上高質(zhì)量的覆蓋率。在得到鮑氏志賀氏菌11型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術(shù)信息學(xué)中心(TheNational Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到11個開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對，最后得到鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)；(6)特異基因的篩選針對鮑氏志賀氏菌11型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf5、orf7、orf8、orf9、orf10基因設(shè)計引物；在每個基因內(nèi)各設(shè)計了三對引物，每對引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，所有引物都在大腸桿菌O105中得到陽性結(jié)果，在其他組中都沒有擴(kuò)增到任何大小正確的帶，即在大多數(shù)組中沒有得到任何PCR產(chǎn)物帶，雖然在少數(shù)組中得到PCR產(chǎn)物帶，但其大小不符合預(yù)期大小，所以wzx、wzy、orf5、orf7、orf8、orf9、orf10基因?qū)︴U氏志賀氏菌11型的O-抗原都是高度特異的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌0105的O－抗原特異的核苷酸，它是鮑氏志賀氏菌11型(Shigella boydii 11)中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列。還包括O－抗原基因簇的結(jié)構(gòu)以及源于鮑氏志賀氏菌11型的O－抗原基因簇中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因(包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy相似功能的基因)的寡核苷酸，并且包括獲得細(xì)菌O－抗原基因簇的方法。本發(fā)明通過PCR證實(shí)它們對鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌0105的O－抗原都有高度的特異性。本發(fā)明還公開了用本發(fā)明的寡核苷酸檢測和鑒定人體及環(huán)境中的鮑氏志賀氏菌11型和大腸桿菌0105的方法。
文檔編號C12N15/31GK1429831SQ0310053
公開日2003年7月16日 申請日期2003年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月20日
發(fā)明者王磊, 陶江, 馮露 申請人:南開大學(xué)