專(zhuān)利名稱：一種篩選抗癡呆藥物的果蠅疾病模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選藥物的模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，特別涉及一種篩選抗癡呆藥物的果蠅疾病模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)退行性腦疾病是以腦中樞系統(tǒng)發(fā)生退化性改變?yōu)榛A(chǔ)的重大腦疾病，已成為影響人類(lèi)健康的重要疾病之一。老年癡呆癥(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經(jīng)元退化的疾病。這種神經(jīng)性功能失調(diào)可以是先天遺傳的，也可以是后天誘發(fā)的。目前還沒(méi)有任何理想的有效藥物問(wèn)世。由于發(fā)病率高，用于照顧老年癡呆病患者的醫(yī)療費(fèi)用在美國(guó)及其它發(fā)達(dá)國(guó)家是最大的一筆醫(yī)藥保健開(kāi)銷(xiāo)。同樣，對(duì)已進(jìn)入或即將進(jìn)入老年社會(huì)的國(guó)家將是一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。
到目前為止，諸如AD等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的確切分子機(jī)制仍然不清楚，相應(yīng)的診斷和防治都比較困難。原因之一是人類(lèi)神經(jīng)退行性疾病的病因十分復(fù)雜；原因之二是因?yàn)閷?duì)疾病患者和脊椎動(dòng)物模型如鼠模型的遺傳分析較為困難。目前，對(duì)AD的研究和藥物研發(fā)策略分別在生化模型、細(xì)胞模型和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型上進(jìn)行。轉(zhuǎn)基因鼠模型雖然在進(jìn)化地位上與人的親緣關(guān)系較近，但卻存在生命周期長(zhǎng)、成本代價(jià)昂貴等不足，最致命的缺陷是與年齡相關(guān)的神經(jīng)元退化現(xiàn)象不明顯，在進(jìn)行人腦疾病研究和藥物篩選方面具有一定的缺陷。
果蠅具有遺傳學(xué)和發(fā)育學(xué)的巨大優(yōu)勢(shì)，基因背景清晰，生命周期短，每代只需10天左右，因此藥物篩選工作相對(duì)其它動(dòng)物模型而言具有快捷、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、顯著縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間的優(yōu)越性。大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從果蠅，小鼠到人，在進(jìn)化上具有嚴(yán)格的保守性。加之果蠅基因組計(jì)劃的完成也進(jìn)一步推動(dòng)了果蠅疾病模型的研究進(jìn)展。通過(guò)在果蠅基因組中進(jìn)行人類(lèi)疾病基因的同源檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)287個(gè)人類(lèi)疾病基因中大約178個(gè)基因在果蠅中是保守的，約占62％。進(jìn)一步的歸類(lèi)工作發(fā)現(xiàn)保守基因較多的基因種類(lèi)為癌基因(65個(gè)基因中占47個(gè)，約為72％)和神經(jīng)性疾病基因(59個(gè)基因占38個(gè)，約為64％)。由于與人類(lèi)疾病發(fā)生有關(guān)的疾病基因，尤其是癌基因和神經(jīng)性疾病基因在果蠅基因組中普遍存在保守基因，使我們利用果蠅模型不但可以分析人疾病基因的功能、疾病發(fā)生的細(xì)胞分子機(jī)制，同時(shí)利用果蠅生物學(xué)上的優(yōu)勢(shì)有利于我們探討人類(lèi)單基因異常表達(dá)(如超表達(dá))和單基因突變所導(dǎo)致的組織學(xué)病變的細(xì)胞分子機(jī)制。此外，果蠅遺傳操作(如突變或轉(zhuǎn)基因)和轉(zhuǎn)基因表達(dá)(如熱休克或UAS-Gal4系統(tǒng))也相對(duì)較為方便。通過(guò)將果蠅體內(nèi)的同源基因進(jìn)行突變，或者將人的疾病基因轉(zhuǎn)入到果蠅體內(nèi)，并使其表達(dá)，就可以在果蠅模型上塑造諸如老年癡呆病等神經(jīng)退行性疾病，再現(xiàn)人腦疾病關(guān)鍵的病理特征。
果蠅rutabaga基因編碼產(chǎn)生鈣/鈣調(diào)素調(diào)控的腺苷酸環(huán)化酶(AC)，參與組成cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。而這條通路與果蠅的學(xué)習(xí)記憶功能有關(guān)。rutabaga的突變(rut1)能能夠?qū)е庐a(chǎn)生活性降低腺苷酸環(huán)化酶，從而損害果蠅的學(xué)習(xí)記憶功能。
人tau基因編碼產(chǎn)生一種微管結(jié)合蛋白(tau)，它能促成微管蛋白聚集形成微管并起穩(wěn)定作用。人tau突變體蛋白(R406W tau)所編碼產(chǎn)生的tau蛋白，在其406位上R(精氨酸)被W(色氨酸)所取代，這種突變蛋白部分降低了與微管的結(jié)合能力，進(jìn)而可能會(huì)造成對(duì)神經(jīng)元自身主要功能的物理障礙或是對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的直接毒性作用。人tau基因的突變能夠引發(fā)常染色體顯性遺傳的諸如老年性癡呆病等常見(jiàn)類(lèi)型的神經(jīng)退行性疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于針對(duì)老年性癡呆疾病藥物篩選的轉(zhuǎn)基因果蠅模型。
一種篩選抗癡呆藥物的果蠅疾病模型，它具有rutabaga位點(diǎn)的突變(rut1)，同時(shí)也表達(dá)人tau突變蛋白(R406W tau)。
該模型一方面具有rutabaga的突變(rut1)，影響到該基因編碼鈣/鈣調(diào)素調(diào)控的腺甘酸環(huán)化酶的活性，改變了腦區(qū)神經(jīng)元cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中cAMP的調(diào)控，影響到果蠅的學(xué)習(xí)記憶功能。另一方面還可在果蠅腦區(qū)特異性表達(dá)人R406W突變tau蛋白。在rut1和突變tau蛋白介導(dǎo)的神經(jīng)毒性同時(shí)存在的情況下出現(xiàn)果蠅蛹階段的致死性，導(dǎo)致不能發(fā)育出成蠅。該模型為在rut1存在的條件下，由tau蛋白介導(dǎo)神經(jīng)毒性的轉(zhuǎn)基因果蠅疾病模型。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種構(gòu)建篩選抗癡呆藥物的果蠅疾病模型的方法。
本發(fā)明所提供的構(gòu)建篩選抗癡呆藥物的果蠅疾病模型的方法，是由雌性rut1；Scabrous-Gal4的處女蠅與雄性UAS-tau R406W果蠅進(jìn)行雜交，得到具有rutabaga位點(diǎn)的突變(rut1)，同時(shí)也表達(dá)人tau突變蛋白的子I代果蠅。
Scabrous-Gal4果蠅是將rutabaga等位基因rut1和Gal4啟動(dòng)子Scabrous-Gal4分別整合在果蠅一號(hào)染色體上和二號(hào)染色體上，該果蠅的基因型為rut；Scab-Gal4/rut；Scab-Gal4。
以只在二號(hào)染色體上整合有Gal4啟動(dòng)子Scabrous-Gal4的Gal4果蠅作為親本蠅對(duì)照，該果蠅的基因型為Scabrous-Gal4/Scabrous-Gal4)。
所述果蠅疾病模型的對(duì)照果蠅為scabrous-Gal4的處女蠅或雄蠅分別與UAS-tauWT果蠅的雄蠅或處女蠅雜交后的子I代蠅，其基因型為scabrous-Gal4/+；UAS-tauWT/+。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種快捷篩選抗癡呆藥物的方法。
一種篩選抗癡呆藥物的方法，是由雌性rut1；Scabrous-Gal4的處女蠅與雄性UAS-tauR406W果蠅進(jìn)行雜交，得到具有rutabaga位點(diǎn)的突變(rut1)，同時(shí)也表達(dá)人tau突變蛋白的子I代果蠅；在該子I代果蠅發(fā)育期的不同階段，飼喂待篩選藥物，篩選出修復(fù)神經(jīng)元凋亡的藥物及其有效濃度。
篩選中藥物的飼喂方式是將待篩選的藥物參雜在果蠅培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基可分為藥種類(lèi)系列和同種藥的濃度系列本發(fā)明果蠅模型的突出特點(diǎn)是出現(xiàn)蛹階段致死性，故可在發(fā)育期的不同階段，通過(guò)飼喂不同藥物及藥物的不同濃度篩選出修復(fù)神經(jīng)元凋亡的藥物。通過(guò)藥物篩選實(shí)驗(yàn)找到有效藥物，抑制腦區(qū)神經(jīng)元的毒性，使子I代果蠅能出成蠅。由此就可以依據(jù)凋亡神經(jīng)元的修復(fù)程度作為有效藥物篩選的指標(biāo)。通過(guò)藥物篩選尋找克服果蠅蛹階段的致死性，達(dá)到改善和修復(fù)腦區(qū)神經(jīng)元的活性作為藥物篩選的有效標(biāo)準(zhǔn)。
用轉(zhuǎn)基因果蠅模型來(lái)研究人腦疾病和開(kāi)發(fā)有效藥物有其它系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)勢(shì)。利用本發(fā)明的模型及方法，使快捷地對(duì)大量化合物和中草藥進(jìn)行篩選得以實(shí)現(xiàn)，可以據(jù)此開(kāi)發(fā)出治療老年性癡呆疾病的高效藥物。


圖1為果蠅疾病模型用于藥物篩選時(shí)各種處理的外部形態(tài)。
圖2為用果蠅疾病模型快捷篩選抗癡呆藥物的技術(shù)流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、篩選修復(fù)神經(jīng)元藥物的果蠅疾病模型的建立將rutabaga等位基因rut1和Gal4啟動(dòng)子Scabrous-Gal4分別整合在果蠅一號(hào)染色體上和二號(hào)染色體上，得到Gal4果蠅(基因型為rut；Scab-Gal4/Scab-Gal4)。以僅僅二號(hào)染色體上整合有Gal4啟動(dòng)子Scabrous-Gal4的Gal4果蠅(基因型為Scabrous-Gal4/Scabrous-Gal4)，作為親本果蠅對(duì)照。雌性rut1；Scabrous-Gal4的處女蠅與雄性UAS-tau R406W果蠅進(jìn)行雜交，其子I代果蠅同時(shí)表達(dá)rut和人R406W tau蛋白，從而建立了與AD相關(guān)的果蠅疾病模型(基因型為rut1；scabrous-Gal4/+；UAS-tau R406W/+)。該果蠅疾病模型的對(duì)照果蠅為scabrous-Gal4果蠅的處女蠅或雄蠅分別與UAS-tau WT果蠅的雄蠅或處女蠅雜交后的子I代蠅(基因型為scabrous-Gal4/+；UAS-tau WT/+)。該疾病模型特征是在子I代果蠅的蛹(pupae)階段出現(xiàn)致死性，導(dǎo)致不能發(fā)育出成蠅。
實(shí)施例2、將果蠅疾病模型用于藥物篩選該疾病模型特征是在子I代果蠅的蛹(pupae)階段出現(xiàn)致死性，導(dǎo)致不能發(fā)育出成蠅。通過(guò)藥物篩選實(shí)驗(yàn)找到有效藥物，抑制腦區(qū)神經(jīng)元的毒性，使子I代果蠅能出成蠅。具體的實(shí)施方法如圖1所示。在圖中，A-C表示轉(zhuǎn)基因果蠅處于不同發(fā)育階段的蛹每幅圖中上部的為對(duì)照用蠅，基因型為Scab-Gal4/+；UAS-tau wt 2/+；下左為轉(zhuǎn)基因果蠅(不飼喂藥物)，基因型為rut1；Scab-Gal4/+，UAS-tau R406W1/+；下右為轉(zhuǎn)基因果蠅(飼喂藥物)，基因型為rut1；Scab-Gal4/+，UAS-tau R406W1/+。D表示轉(zhuǎn)基因果蠅成蠅上部的為對(duì)照用蠅，基因型為Scab-Gal4/+；UAS-tauwt 2/+；下部的為轉(zhuǎn)基因果蠅(飼喂藥物)，基因型為rut1；Scab-Gal4/+，UAS-R406Wtau 1/+。采取的喂藥方式為親本蠅雜交后放在有藥的培養(yǎng)基中(分為藥種類(lèi)系列和同種藥的濃度系列)。由此就可以依據(jù)凋亡神經(jīng)元的修復(fù)程度作為有效藥物篩的指標(biāo)。其系統(tǒng)和技術(shù)的流程如圖2所示。
權(quán)利要求
1.一種篩選抗癡呆藥物的果蠅疾病模型，其特征在于它具有rutabaga位點(diǎn)的突變(rut1)，同時(shí)也表達(dá)人tau突變蛋白(R406W tau)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的果蠅疾病模型，其特征在于該果蠅模型出現(xiàn)蛹階段致死性。
3.一種構(gòu)建篩選抗癡呆藥物的果蠅疾病模型的方法，是由雌性rut1；Scabrous-Gal4的處女蠅與雄性UAS-tau R406W果蠅進(jìn)行雜交，得到具有rutabaga位點(diǎn)的突變(rut1)，同時(shí)也表達(dá)人tau突變蛋白的子I代果蠅。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于將rutabaga等位基因rut1和Gal4啟動(dòng)子Scabrous-Gal4分別整合在果蠅一號(hào)染色體上和二號(hào)染色體上，得到Scabrous-Gal4果蠅，該果蠅的基因型為rut；Scab-Gal4/rut；Scab-Gal4。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于以只在二號(hào)染色體上整合有Gal4啟動(dòng)子Scabrous-Gal4的Gal4果蠅作為親本蠅對(duì)照，該果蠅的基因型為Scabrous-Gal4/Scabrous-Gal4)，。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述果蠅疾病模型的對(duì)照果蠅為scabrous-Gal4的處女蠅或雄蠅分別與UAS-tau WT果蠅的雄蠅或處女蠅雜交后的子I代蠅，其基因型為scabrous-Gal4/+；UAS-tau WT/+。
7.一種篩選抗癡呆藥物的方法，是由雌性rut1；Scabrous-Gal4的處女蠅與雄性UAS-tau R406W果蠅進(jìn)行雜交，得到具有rutabaga位點(diǎn)的突變(rut1)，同時(shí)也表達(dá)人tau突變蛋白的子I代果蠅；在該子I代果蠅發(fā)育期的不同階段，飼喂待篩選藥物，篩選出修復(fù)神經(jīng)元凋亡的藥物及其有效濃度。
8.據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于待篩選的藥物參雜在果蠅培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種篩選抗癡呆藥物的果蠅疾病模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，目的是提供用于針對(duì)老年性癡呆疾病藥物篩選的轉(zhuǎn)基因果蠅模型。本發(fā)明所提供的篩選抗癡呆藥物的果蠅疾病模型，它具有rutabaga位點(diǎn)的突變(rut
文檔編號(hào)C12N15/12GK1521259SQ0310223
公開(kāi)日2004年8月18日 申請(qǐng)日期2003年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月30日
發(fā)明者謝佐平, 鐘毅, 陳健 申請(qǐng)人:清華大學(xué), 北京卓凱生物技術(shù)有限公司