專利名稱：重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子在抑制成人成肌細(xì)胞自然分化中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(rhCNTF)的一種新的生物學(xué)作用，具體為rhCNTF在抑制成人成肌細(xì)胞的自然分化中的用途。
背景技術(shù)：
睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(Ciliary neurotrophic factor，CNTF)是神經(jīng)生長因子家族以外的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子。CNTF的主要生物學(xué)作用是支持神經(jīng)細(xì)胞的存活和誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞分化。
有關(guān)CNTF在骨骼肌中的生物學(xué)作用報道較少。但由于CNTF及其受體在骨骼肌中有較高表達(dá)，因此人們一直推測CNTF在骨骼肌生長發(fā)育過程中可能起著重要的作用。Guillet等(Guillet C，Auguste，P，Mayo W，et al.Ciliaryneurotrophic factor is a regulator of muscular strength in aging.JNeurosci，1999，191257-1262)發(fā)現(xiàn)給老年肌萎縮患者反復(fù)皮下注射rhCNTF蛋白，能改善患者的肌肉萎縮和增強(qiáng)肌張力。皮下注射rhCNTF蛋白也可降低去神經(jīng)引起的肌萎縮(P.Rajan，A.J.Symes，J.S.Fink.Stat proteins are activatedby ciliary neurotrophic factor in cells of central nervous system origin.J NeurosciRes，1996，43403-411)。Fraysse等(B.Fraysse，C.Guillet，C.Huchet，et al.Ciliaryneurotrophic factor prevents unweighting-induced functional changes in rat soleusmuscle.J Appl Physio，2000，881623-1630)給尾懸吊3周造成肌萎縮的大鼠皮下持續(xù)供給rhCNTF，能顯著改善失重引起的肌萎縮和骨骼肌收縮功能的降低。可是，rhCNTF對骨骼肌肌萎縮或收縮功能改善等作用是通過改善支配骨骼肌的神經(jīng)而間接作用于肌細(xì)胞還是對肌細(xì)胞的直接作用仍不清楚。鄧小華等報道(鄧小華，侍堅，蔣春雷等.睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子對體外骨骼肌細(xì)胞的促增殖作用.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2000，16(1)59-63)將rhCNTF直接作用于體外培養(yǎng)的L6大鼠成肌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)增加外源性rhCNTF含量能促進(jìn)L6體外增殖，但迄今未見有關(guān)rhCNTF對成人成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下，特別是無血清培養(yǎng)時分化的影響的報道。

發(fā)明內(nèi)容
成人成肌細(xì)胞作為一種自體單能干細(xì)胞的新來源在治療多種肌肉損傷和退行性疾病中的良好應(yīng)用前景。但成人個體骨骼肌內(nèi)成肌細(xì)胞含量較少，不易獲取。而且成肌細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下，特別是在無血清條件下，會很快自然分化，難以擴(kuò)增。為滿足臨床需要，活檢組織量就要加大，病人的承受能力隨之下降。
本發(fā)明的發(fā)明人在通過實(shí)驗證明了適宜濃度的rhCNTF對體外培養(yǎng)的克隆化成人成肌細(xì)胞自然分化具有抑制作用，使這些細(xì)胞繼續(xù)保持增殖狀態(tài)。
首先進(jìn)行成人成肌細(xì)胞的分離和單克隆擴(kuò)增。從人胸小肌取樣，經(jīng)消化酶液消化等處理后接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，然后采用有限稀釋法接種細(xì)胞到96孔板，挑選Desmin+單個細(xì)胞，進(jìn)行單克隆擴(kuò)增，每株克隆傳代≥25代。將單克隆細(xì)胞進(jìn)行Desmin染色鑒定，Desmin+率約為100％。這些細(xì)胞在分化液中培養(yǎng)后形成肌管，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定表明myosin呈均一陽性?？梢姀某扇诵匦〖碓吹某杉〖?xì)胞能形成單克隆細(xì)胞株，且傳25代以上能保持其表型不變。
然后進(jìn)行成人成肌細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化?？寺U(kuò)增的成人成肌細(xì)胞在生長液中生長到亞融合，細(xì)胞被轉(zhuǎn)換到分化液中培養(yǎng)進(jìn)行誘導(dǎo)分化。將rhCNTF或MAPK信號通路抑制劑直接加到亞融合的細(xì)胞孵育，來觀察rhCNTF或MAPK信號通路抑制劑對成肌細(xì)胞分化的影響。按一定濃度接種單克隆細(xì)胞，待生長達(dá)亞融合時，用無血清DMEM液洗細(xì)胞，分別加入含不同濃度rhCNTF的分化液，培養(yǎng)誘導(dǎo)分化。為進(jìn)一步分析分化抑制作用是否可逆，在誘導(dǎo)分化一定時間后換不含或含一定濃度的rhCNTF的分化液繼續(xù)培養(yǎng)。采用Kitzmann等的方法分離肌管和未分化的肌細(xì)胞。成肌細(xì)胞在不含或含一定濃度rhCNTF的分化液中培養(yǎng)后，用胰酶消化獲得肌管及未分化的肌細(xì)胞。
統(tǒng)計分析及免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定表明rhCNTF可抑制克隆化成人成肌細(xì)胞的體外分化，且這種抑制作用是可逆的，并呈劑-效依賴關(guān)系。
在實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)rhCNTF誘導(dǎo)產(chǎn)生的未分化細(xì)胞與骨骼肌中的正常儲備細(xì)胞相似，提示rhCNTF處理能實(shí)現(xiàn)成肌細(xì)胞的體外批量擴(kuò)增。
通過本發(fā)明建立的抑制成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下自然分化的方法，可望實(shí)現(xiàn)少量取樣、無血清培養(yǎng)、批量獲取，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)應(yīng)用自體成肌細(xì)胞治療多種臨床肌肉損傷和退行性疾病，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。


圖1成肌細(xì)胞單克隆及其鑒定.單個成肌細(xì)胞(a)及其克隆(d)。這些克隆化細(xì)胞被分散接種在蓋玻片上12h(b)or誘導(dǎo)分化72h(e)，并分別用Desmin(c)或Myosin(f)進(jìn)行免疫組化鑒定，結(jié)果表明生長12h or誘導(dǎo)分化72h的細(xì)胞對Desmin或Myosin的反應(yīng)呈均一陽性。
圖2外源性rhCNTF抑制成肌細(xì)胞的體外分化。
A成肌細(xì)胞在含rhCNTF(0-10ng/ml)的分化液中誘導(dǎo)分化72h，細(xì)胞然后被Hoechst染色去顯示核，肌細(xì)胞的分化用融合率表示，融合率為融合細(xì)胞核的量占總細(xì)胞核數(shù)量的百分比，融合細(xì)胞為包含≥3個核的細(xì)胞。*p＜0.05，n＝5。
B成肌細(xì)胞在含(b)或不含(a)5ng/ml rhCNTF分化液中誘導(dǎo)分化72h，然后用Myogenin(green)and Myosin(red)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定(d，e)。為分析這種抑制作用是否可逆，細(xì)胞在含5ng/ml rhCNTF分化液中72h后再換為含(c)或不含(f)5ng/ml rhCNTF分化液中繼續(xù)培養(yǎng)72h。成肌細(xì)胞(箭)；肌管(箭頭)。
圖3rhCNTF誘導(dǎo)產(chǎn)生的未分化細(xì)胞與儲備細(xì)胞相似。
ArhCNTF誘導(dǎo)產(chǎn)生的未分化細(xì)胞被接種在生長液中增殖過夜(MB)，然后換分化液誘導(dǎo)分化72h(MT)。
BWestern blot分析儲備細(xì)胞(MBO)或未分化細(xì)胞(MB)及其誘導(dǎo)分化72h的肌管(MTO)或(MT)中特異成肌分化蛋白Myf5，MyoD，Myogenin和p21表達(dá)的變化。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 成人成肌細(xì)胞的分離和單克隆擴(kuò)增取男性42歲自愿者胸小肌稱重并剪成約1mm3碎片，按每克組織加入2ml混合消化酶液(dispasegrade II，2.4U ml-1，Boehringer Mannheim Corp；collagenaseclass II，1％；Boehringer Mannheim Corp.；2.5mM.CaCl2)，37℃消化45min，且每15min用槍頭吹打。加入5倍體積10％FCS并用6號針頭反復(fù)吹打，200目網(wǎng)過濾，濾液300g離心10min，底層細(xì)胞用生長液(GM；HamsF10加10％馬血清，10％胎牛血清，1％雞胚滲出液，1％青鏈霉素和bFGF 2.5ngml-1)重懸，生長液中馬血清、胎牛血清、雞胚滲出液和青鏈霉素均為HyClone公司產(chǎn)品，人bFGF為R&D Systems產(chǎn)品。按5×105cells ml-1密度接種細(xì)胞于涂有collagen I(Sigma-Aldrich)的培養(yǎng)瓶，接種后2h(preplate 1pp1)，將含有未貼壁細(xì)胞的懸液轉(zhuǎn)入涂有collagen I的培養(yǎng)瓶(pp2)，以后每隔24h收集未貼壁細(xì)胞懸液到涂有collagen I的培養(yǎng)皿獲得pp3-5，去除pp1-2。
采用有限稀釋法(Chen XP，Liu H，Guo Q，et al.Isolation and clonalanalysis of satellite cells from adult rats.Chin J Biomed Engeneering.2001，10(2)56-59)，接種細(xì)胞到涂有collagen I的96孔板，挑選Desmin+單個細(xì)胞，進(jìn)行單克隆擴(kuò)增，每株克隆傳代≥25代，凍存?zhèn)溆谩?br> 分離提取的骨骼肌細(xì)胞中成肌細(xì)胞特異標(biāo)記Desmin的陽性率為＞97％，提示有約3％的其它種類細(xì)胞存在，為更準(zhǔn)確地探討rhCNTF對成肌細(xì)胞體外分化的影響，我們挑選Desmin+細(xì)胞進(jìn)行單克隆擴(kuò)增。Fig.1是成肌細(xì)胞單克隆的活細(xì)胞及Desmin和Myosin免疫細(xì)胞化學(xué)染色照片，可見單個成肌細(xì)胞(Fig.1a)及其擴(kuò)增的克隆團(tuán)(Fig.1d)，細(xì)胞呈小圓球形有較強(qiáng)折光度，傳代擴(kuò)增25代以上形成單克隆細(xì)胞株。為鑒定成肌細(xì)胞的純度，將單克隆細(xì)胞接種在涂有collagen I的蓋玻片上，貼壁后(Fig.1b)12h進(jìn)行Desmin染色鑒定，Desmin+率接近100％(Fig.1c)。這些細(xì)胞在分化液中72h培養(yǎng)后形成肌管(Fig.1e)，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定表明myosin呈均一陽性(Fig.1f)?？梢姀某扇诵匦〖碓吹某杉〖?xì)胞能形成單克隆細(xì)胞株，且傳25代以上能保持其表型不變。
實(shí)施例二 成人成肌細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化及外源性rhCNTF對克隆化成人成肌細(xì)胞體外分化的影響克隆擴(kuò)增的成人成肌細(xì)胞被保持在生長液中生長，為鑒定成肌細(xì)胞，克隆擴(kuò)增的細(xì)胞按2×104cells/cm2接種在蓋玻片上過夜。為誘導(dǎo)分化，生長到亞融合的細(xì)胞被轉(zhuǎn)換到分化液(DMDMEM/2％HS)中培養(yǎng)72h去形成肌管。分化程度由細(xì)胞的膜融合率(Fusion％)表示，膜融合率為融和細(xì)胞核的數(shù)目占總核數(shù)目的百分比，而融合細(xì)胞定義為含有≥3個核的細(xì)胞。為觀察rhCNTF(R&D System)對成肌細(xì)胞分化的影響，rhCNTF(0-10ng)被直接加到亞融合的細(xì)胞孵育72h，每12h更換含rhCNTF的新鮮培養(yǎng)基。按5×105cells ml-1接種單克隆細(xì)胞，待生長達(dá)亞融合時，用無血清DMEM液(GIBCO-BRL)洗細(xì)胞2-3次，分別加入終濃度為rhCNTF0，1.25，2.5，5，10ng ml-1的分化液，培養(yǎng)72h誘導(dǎo)分化。為進(jìn)一步分析分化抑制作用是否可逆，在以上方法誘導(dǎo)分化72h后換含0和5ng ml-1rhCNTF的分化液繼續(xù)培養(yǎng)72h。
采用Kitzmann等(Kitzmann，M，Carnac，G，Vandromme，M，et al.The muscleregulation factors MyoD and Myf-5 undergo distinct cell Cycle-specificexpression in muscle cells.J Cell Biol，1998，1421447-1459)的方法分離肌管和未分化的肌細(xì)胞。成肌細(xì)胞被培養(yǎng)在含或不含5ng/ml rhCNTF的分化液中72h后，用0.15％胰酶消化5min獲得肌管，此后再用0.25％胰酶消化10min獲得未分化的肌細(xì)胞。
分析不同濃度的rhCNTF對成肌細(xì)胞體外分化的影響，0-10ng ml-1rhCNTF處理組中成肌細(xì)胞的分化率分別為74.4±10.44％，65.5±11.84％，45.1±8.49％，40.7±6.73％，30.1±7.21％，與對照組相比2.5，5和10ng ml-1rhCNTF均顯著抑制成肌分化(p＜0.01)，且呈劑效關(guān)系(Fig.2A)。與對照組(Fig.2B，a)相比，rhCNTF處理組(Fig.2B，b)中粗大、多核的膜融合細(xì)胞即肌管形成明顯減少，且含大量梭形單核細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定(Fig.2B，d，e)也證明了rhCNTF對成肌細(xì)胞分化的抑制作用。Fig.2B也提示去除rhCNTF作用后成肌細(xì)胞可分化成肌管(Fig.2B，f與c相比)。因此，rhCNTF可抑制克隆化成人成肌細(xì)胞的體外分化，且這種抑制作用是可逆的，并呈劑-效依賴關(guān)系。去除rhCNTF后，成人成肌細(xì)胞可進(jìn)入正常分化階段，成為正常肌細(xì)胞。
統(tǒng)計結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。應(yīng)用SAS6.12統(tǒng)計軟件，以兩因素重復(fù)測量ANOVA分析法進(jìn)行組間差異分析，p＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
實(shí)施例三 免疫細(xì)胞化學(xué)分析為分析克隆的成肌細(xì)胞及其分化形成的肌管的純度，在生長液中12h和在分化液中72h的細(xì)胞被4％多聚甲醛固定，室溫30min，用0.01M PBS洗3次。0.1％Triton X-100/0.01M PBS室溫30min，加5％正常馬血清封閉4℃過夜，然后進(jìn)行一抗反應(yīng)desmin(1∶200；Zymed)和myosin(1∶1000；Zymed)單克隆抗體，加入0.1％Triton X-100/0.01M PBS和2％正常馬血清4℃過夜。PBS洗3-4次，進(jìn)行二抗反應(yīng)生物素標(biāo)記的抗小鼠IgG(1∶1000；Zymed)室溫1.5h，PBS洗3-4次，與A，B復(fù)合物(1∶1000；Zymed)室溫反應(yīng)3h，PBS洗3-4次，進(jìn)行常規(guī)ABC法染色。
為分析rhCNTF對成肌細(xì)胞分化的影響，4％多聚甲醛固定樣品，室溫30min，用0.01M PBS洗3次。0.1％Triton X-100/0.01M PBS室溫30min，加5％正常羊血清封閉4℃過夜，然后進(jìn)行一抗反應(yīng)(雙標(biāo))myosin(1∶200；Zymed)單克隆抗體和myogenin(1∶1000；Santa Cruz)多克隆抗體，加入0.1％TritonX-100/0.01M PBS和2％正常羊血清4℃過夜。PBS洗3-4次，進(jìn)行二抗反應(yīng)Alexa 488結(jié)合的羊抗兔IgG和Texas Red結(jié)合的羊抗鼠IgG抗體(Molecular Probes)，加入0.1％Triton X-100/0.01M PBS和2％正常羊血清4℃，2h。用0.01M PBS洗3次后，在RADIANCE2100共聚焦顯微鏡(BIO-RAD)下觀察。
實(shí)施例四 Western Blot分析采用Gredinger等(Gredinger，E，Gerber，AN，Tamir，Y，et al.Mitogen-activatedprotein kinase pathway is involved in the differentiation of muscle cells.J BiolChem，1998，27310436-10444)報道的方法收集細(xì)胞裂解液，并置冰浴搖床1h，加入等體積2×SDS loading buffer，100℃15min，然后12,000rpm離心15min，收集上清并取等量蛋白(50-100μg)在10％SDS-PAGE上電泳，用semidrytransfer(Bio-Rad)轉(zhuǎn)到PVDF膜(Millipore)。膜在含10％脫脂奶粉，0.5％BSA(Sigma)，0.1％Tween 20和0.1％NaN3的TBS中封閉過夜，一抗小鼠單克隆抗p21(1∶400；PharMingen)抗體，兔多克隆抗myf5，MyoD和myogenin抗體(1∶200；Santa Cruz)以及抗磷酸化p44/p42抗體(1∶1000；New EnglandBiolabs)室溫3h，TBS洗3次，二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記的抗小鼠或抗兔IgG；1∶5000，Sigma)室溫孵育2h。ECL Kit(Amersham)顯色。
實(shí)施例五 rhCNTF誘導(dǎo)的未分化細(xì)胞與正常儲備細(xì)胞比較正常儲備細(xì)胞是指在骨骼肌分化期間保持安靜和未分化狀態(tài)但仍具有自我更新和分化能力的亞細(xì)胞群。rhCNTF抑制成肌細(xì)胞的正常分化，產(chǎn)生大量的未分化細(xì)胞，比較這些細(xì)胞與骨骼肌中的正常儲備細(xì)胞的相似性。從形態(tài)上看，這些未分化細(xì)胞與正常儲備細(xì)胞相似，即梭形單核細(xì)胞(Fig.2B，b)，且這些單核細(xì)胞在生長液中能快速增殖，在分化液中也能分化成肌管(Fig.3A)。
為進(jìn)一步比較這些未分化細(xì)胞與正常儲備細(xì)胞的相似性，用Western blot法分析了未分化細(xì)胞與正常儲備細(xì)胞及其肌管中特異蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，兩種細(xì)胞無論在增殖還是分化條件下的蛋白表達(dá)均相似(Fig.3B)。因此，rhCNTF誘導(dǎo)產(chǎn)生的未分化細(xì)胞與骨骼肌中的正常儲備細(xì)胞相似，提示rhCNTF處理能實(shí)現(xiàn)成肌細(xì)胞的體外批量擴(kuò)增。
序列表<110>軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子在抑制成人成肌細(xì)胞自然分化中的用途<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>600<212>DNA<213>
<400>1atggctttca cagagcattc accgctgacc cctcaccgtc gggacctctg tagccgctct 60atctggctag caaggaagat tcgttcagac ctgactgctc ttacggaatc ctatgtgaag 120catcagggcc tgaacaagaa catcaacctg gactctgcgg atgggatgcc agtggcaagc 180actgatcagt ggagtgagct gaccgaggca gagcgactcc aagagaacct tcaagcttat 240cgtaccttcc atgttttgtt ggccaggctc ttagaagacc agcaggtgca ttttacccca 300accgaaggtg acttccatca agctatacat acccttcttc tccaagtcgc tgcctttgca 360taccagatag aggagttaat gatactcctg gaatacaaga tcccccgcaa tgaggctgat 420gggatgccta ttaatgttgg agatggtggt ctctttgaga agaagctgtg gggcctaaag 480gtgctgcagg agctttcaca gtggacagta aggtccatcc atgaccttcg tttcatttct 540tctcatcaga ctgggatccc agcacgtggg agccattata ttgctaacaa caagaaaatg 600
權(quán)利要求
1.重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子在抑制成人成肌細(xì)胞自然分化中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，適宜濃度的重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子對體外培養(yǎng)的克隆化成人成肌細(xì)胞自然分化具有抑制作用，使這些細(xì)胞繼續(xù)保持增殖狀態(tài)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因具有在序列表中序列1所示的核苷酸序列基礎(chǔ)上發(fā)生一點(diǎn)或多點(diǎn)的突變所產(chǎn)生的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子在抑制成人成肌細(xì)胞自然分化中的用途。發(fā)明人通過實(shí)驗證明了重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的一種新的生物學(xué)作用，適宜濃度的rhCNTF對體外培養(yǎng)的克隆化成人成肌細(xì)胞自然分化具有抑制作用，使這些細(xì)胞繼續(xù)保持增殖狀態(tài)。通過本發(fā)明建立的抑制成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下自然分化的方法，可望實(shí)現(xiàn)少量取樣、無血清培養(yǎng)、批量獲取，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)應(yīng)用自體成肌細(xì)胞治療多種臨床肌肉損傷和退行性疾病，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
文檔編號C12N5/08GK1537936SQ0310974
公開日2004年10月20日 申請日期2003年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月15日
發(fā)明者陳曉萍, 范明, 劉紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)