專利名稱：唾液酸的重組酶法生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是屬于生物化學(xué)領(lǐng)域中，一種生化制品——唾液酸的酶法生產(chǎn)工藝，尤其是指一種用在酶促合成法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的多酶工程菌和酶催化技術(shù)來(lái)生產(chǎn)唾液酸的一種生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
唾液酸是廣泛存在于自然界中的碳水化合物，也是許多糖蛋白、糖肽和糖脂的基本組成部分，具有廣泛的生物功能，如血蛋白半衰期的調(diào)節(jié)、多種毒素的中和、細(xì)胞粘附、免疫的抗原抗體反應(yīng)和對(duì)細(xì)胞溶解的保護(hù)。唾液酸的生化衍生物也常用于藥物的合成。唾液酸及以唾液酸為母體的藥物在國(guó)外已應(yīng)用于臨床，可用于治療流感等病毒性傳染病、神經(jīng)性疾病、炎癥、腫瘤等。由于唾液酸存在于人乳中，并且大量的研究已經(jīng)證明唾液酸對(duì)于增強(qiáng)嬰兒的免疫力和提高嬰兒的大腦發(fā)育有重要作用。因此唾液酸還可用于食品添加劑，特別是母親的初乳中含量較高，所以唾液酸可以加入到嬰兒奶粉中使嬰兒乳粉更加接近母乳。因此，加速唾液酸產(chǎn)品的開發(fā)與生產(chǎn)對(duì)于醫(yī)藥領(lǐng)域及食品領(lǐng)域均具有重大的意義。
現(xiàn)有的生產(chǎn)方法有兩種，用兩種酶促方法合成。兩種方法之不同處在于由葡萄糖胺生成中間產(chǎn)物甘露糖胺的方法。一種是在堿作用下的異構(gòu)化，另一種是在異構(gòu)化酶作用下的轉(zhuǎn)化。在此合成中使用葡萄糖胺作為起始原料，通過(guò)異構(gòu)化得到甘露糖胺，再與丙酮酸進(jìn)行酶促反應(yīng)生產(chǎn)唾液酸。反應(yīng)原理見附

圖1、2所示，工藝流程見附圖3所示。
采用這兩種方法步驟煩瑣、工藝流程復(fù)雜，條件難控，成本較高。急需要一種更先進(jìn)的方法來(lái)生產(chǎn)唾液酸，以滿足唾液酸廣大的市場(chǎng)需求，本發(fā)明就在這種情況下產(chǎn)生了，本發(fā)明工藝的基本流程如附圖4所示。
本項(xiàng)目的這一改進(jìn)技術(shù)已經(jīng)很成熟，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室小試、中試，可以穩(wěn)定地生產(chǎn)公斤級(jí)的唾液酸。產(chǎn)品的質(zhì)量通過(guò)核磁共振檢測(cè)能夠達(dá)到95％以上的純度，通過(guò)本項(xiàng)目提供的技術(shù)能夠批量的生產(chǎn)唾液酸。穩(wěn)定性經(jīng)過(guò)NMR、TLC、IR以及UV監(jiān)測(cè)，獲得很滿意的結(jié)果。唾液酸的成品率達(dá)到100％，收率穩(wěn)定在70％左右。本項(xiàng)目產(chǎn)品廣泛存在于人體內(nèi)，包括人的唾液內(nèi)，產(chǎn)品的安全可靠性完全可以保障。這為確定將來(lái)作為藥物的有效性及安全性提供了依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用在酶促合成法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的多酶工程菌和酶催化技術(shù)。將以前多步反應(yīng)的幾種酶通過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建方法，在一個(gè)大腸肝菌的菌種內(nèi)表達(dá)出來(lái)，從而大大的簡(jiǎn)化了生產(chǎn)流程。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所采用的的一個(gè)具體技術(shù)方案是將以前多步反應(yīng)所需要的幾種酶的基因通過(guò)基因構(gòu)建的方法構(gòu)建在同一質(zhì)粒中，并且最終在同一個(gè)大腸肝菌菌種內(nèi)表達(dá)出來(lái)。之后通過(guò)離心收集菌體來(lái)作為催化劑催化唾液酸合成，最后通過(guò)純化工藝得到最終所需的唾液酸純品。這與傳統(tǒng)方法(化學(xué)合成法)相比就大大的簡(jiǎn)化了生產(chǎn)流程，從而降低了生產(chǎn)成本。
本發(fā)明公開的一個(gè)技術(shù)方案是基因構(gòu)建(1)基因片斷獲取后分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中含5ul模板DNA，1uM引物，2.5mM MgCl，5ul 10×buffer(100mMTris-HCl，50mM KCl PH8.3)1mM dNTPs，2.5U Taq DNA聚合酶。反應(yīng)體積50ul，混合均勻后加入礦物油50ul覆蓋，擴(kuò)增周期為30個(gè)循環(huán)，退火溫度55℃。(2)從(1)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板分別再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將再次擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，分別對(duì)其予以分離和純化。(3)將純化后得到的異構(gòu)酶和醛縮酶的DNA片段進(jìn)行基因操作，同時(shí)連接入PBV220載體質(zhì)粒中，酶切位點(diǎn)為EcoRI和BamHI，質(zhì)粒中含PRPL啟動(dòng)子。(4)將構(gòu)建好的新質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸肝菌DH5a菌中，擴(kuò)種后提取質(zhì)粒檢測(cè)，通過(guò)特異性酶切位點(diǎn)特征和DNA測(cè)序選擇DNA序列正確的質(zhì)粒。(5)選擇正確DNA序列質(zhì)粒的工程菌，用于目的產(chǎn)物的表達(dá)實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)。
工程菌發(fā)酵(1)單細(xì)胞菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、250rpm搖床培養(yǎng)。(2)培養(yǎng)液濃度檢測(cè)OD600達(dá)0.8～1時(shí)，向搖瓶?jī)?nèi)加入IPTG，使其在培養(yǎng)液中濃度達(dá)400uM，37℃，250rpm培養(yǎng)誘導(dǎo)。(3)誘導(dǎo)完畢后，離心收集菌體(4000rpm×20min)。(4)洗滌菌體washingbuffer(PH8.5，20mMTris-HCl，20％sucrose(蔗糖))。
酶催化(1)將葡萄糖胺加入到反應(yīng)器中，加凈化水溶解。(2)待葡萄糖胺充分溶解后，將丙酮酸和洗滌后的發(fā)酵菌體，加入反應(yīng)器中，(此時(shí)的菌體中已經(jīng)包含各步反應(yīng)所需要的催化酶，包括異構(gòu)酶與醛縮酶)。利用攪拌器攪拌，并控制溫度、壓力等條件，使其充分反應(yīng)。(3)中間需要在線檢測(cè)，控制溫度等反應(yīng)條件。最終生成唾液酸。(4)經(jīng)過(guò)分離提純得到唾液酸純品。
這個(gè)發(fā)明的特征在于將以前多步反應(yīng)所需要的幾種酶的基因通過(guò)基因構(gòu)建的方法構(gòu)建在同一表達(dá)質(zhì)粒中，并且最終在同一大腸肝菌中通過(guò)發(fā)酵的方法表達(dá)出來(lái)，之后再收集、洗滌菌體，得到各步所需要的酶，最后通過(guò)幾步酶促合成工藝得到最終所需的唾液酸純品。這與傳統(tǒng)合成方法相比就大大的簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝流程，從而降低了生產(chǎn)成本。對(duì)加速唾液酸產(chǎn)品的開發(fā)與生產(chǎn)以及在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域的應(yīng)用均具有重要的意義。
權(quán)利要求
1.一種采用重組酶法生產(chǎn)唾液酸的生產(chǎn)工藝，其獨(dú)特之處在于本工藝采用在酶促合成法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的多酶工程菌和酶催化技術(shù)。將以前多步反應(yīng)的幾種酶在一個(gè)工程菌種內(nèi)表達(dá)出來(lái)。從而顯著地簡(jiǎn)化生產(chǎn)流程和降低生產(chǎn)成本。
2.如權(quán)利要求1所述的多酶工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于將以前多步反應(yīng)所需要的幾種酶的基因構(gòu)建在同一表達(dá)質(zhì)粒中，并經(jīng)轉(zhuǎn)化后在一個(gè)菌種內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。
3.如權(quán)利要求1所述的酶促方法，其特征在于使用了多酶工程菌中表達(dá)的異構(gòu)化酶和醛縮酶進(jìn)行酶催化合成唾液酸，大大簡(jiǎn)化了工藝流程。
4.如權(quán)利要求3所述的唾液酸合成方法，其特征是在酶促合成過(guò)程中，首先將葡萄糖胺加入到反應(yīng)器中，加凈化水溶解。待葡萄糖胺充分溶解后，將丙酮酸和洗滌后的發(fā)酵菌體，加入反應(yīng)器中，攪拌器攪拌，并控制溫度、壓力等條件，使其充分反應(yīng)，最終生成唾液酸。再經(jīng)過(guò)分離提純得到唾液酸純品。
全文摘要
一種采用重組酶法生產(chǎn)唾液酸的生產(chǎn)工藝，其獨(dú)特之處在于本工藝采用在酶促合成法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的多酶工程菌和酶催化技術(shù)。將以前催化多步反應(yīng)的幾種酶克隆到一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒中構(gòu)建成多酶工程菌，利用多酶工程菌中表達(dá)的異構(gòu)化酶和醛縮酶進(jìn)行酶催化合成唾液酸，從而大大簡(jiǎn)化了生產(chǎn)流程和降低了生產(chǎn)成本。采用本發(fā)明作為唾液酸的生產(chǎn)方法，能使生產(chǎn)效率顯著提高。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1566355SQ03112419
公開日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月12日
發(fā)明者苗祖英 申請(qǐng)人:苗祖英