專利名稱：蛙病毒基因診斷試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水生經(jīng)濟(jì)動物病害的診斷試劑盒及檢測方法，主要是針對蛙病毒(TFV，Tiger Frog Virus)基因診斷的試劑盒及檢測方法。
早期快速診斷蛙病毒是目前虎紋蛙養(yǎng)殖的主要預(yù)防措施和減少虎紋蛙損失的有效途徑，因此，簡便快速、特異性好又靈敏度高的診斷試劑盒及其檢測方法是廣大水產(chǎn)養(yǎng)殖者急切盼望的。
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，簡稱PCR技術(shù))，是近年來發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，由于具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點，所以這種方法建立后，很快被應(yīng)用于實踐中。
本發(fā)明的蛙病毒的基因診斷試劑盒由下列部件構(gòu)成1).樣品稀釋液A液，2管，內(nèi)裝磷酸緩沖液(1×PBS)，pH7.4；2).模板抽提液B液，1管，內(nèi)裝酚/氯仿/異戊醇，比例為25∶24∶1。3).C液，1管，內(nèi)裝5M NaCL；4).D液，1管，內(nèi)裝無水乙醇；5).E液，1管，內(nèi)裝70％乙醇；6).F液，1管，內(nèi)裝滅菌雙蒸水；7).PCR反應(yīng)液G液，1管，內(nèi)裝PCR-擴(kuò)反應(yīng)液，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、引物F1、引物R1和TaqE；8).陽性對照(H液)，1管，20μl/管，內(nèi)裝TFV陽性模板。9).盒子；10).一塊泡沫板，其大小與上述盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數(shù)量的小孔，上述各小管分別對應(yīng)放置于這些小孔中。
上述TFV基因診斷試劑盒中所述的引物F1和R1是根據(jù)TFV基因保守區(qū)序列設(shè)計的，其DNA序列分別如下F15’-GAC TTG GCC ACT TAT GACR15’-TGT CTC TGG AGA AGA AGA A用本發(fā)明上述試劑盒檢測蛙病毒的方法，按下列步驟進(jìn)行1).取樣品，加入樣品稀釋液A液稀釋10～20倍，于勻漿器中冰浴勻漿；2).4000～6000r/min離心10～15min；3).取上清600μl用模板抽提液B液抽提，上下顛倒幾次混勻；4).10000～12000r/min離心10～15min；5).取500μl上清加入20ul C液，再加入1ml D液，于-20℃沉淀1小時；6).10000～12000r/min離心10～15min；7).棄上清，加E液沖洗，10000～12000r/min離心5～10min，沖洗兩次；8).棄上清，自然干燥或在超凈工作臺上吹干；9).加20～30μlF液重懸溶解作為模板；10).分別取模板和H液，加入到PCR反應(yīng)液G液中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR上；11).按下列條件擴(kuò)增95℃ 2min預(yù)變性，→94℃ 30sec 30個循環(huán)→72℃ 10min→4℃保存55℃ 30sec72℃ 1min12).反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加4μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘(5V/cm)后于紫外儀上觀察。若在532bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶(與陽性對照在同一位置)，則為TFV陽性，說明待測樣品攜帶蛙病毒，否則為陰性。
本發(fā)明的蛙病毒基因診斷試劑盒及檢測方法，是以根據(jù)TFV基因保守區(qū)序列設(shè)計的兩對引物為主體而設(shè)計的。利用該兩對引物，可以特異性地擴(kuò)增攜帶TFV病毒的待測樣品的有關(guān)基因片段，所建立的優(yōu)化的PCR檢測體系保證檢測結(jié)果的快速性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。因此使用本發(fā)明的試劑盒及檢測方法，可以簡便、快速、靈敏而特異地檢測感染TFV的虎紋蛙，大大高于傳統(tǒng)和常規(guī)的生物學(xué)方法，可運(yùn)用于虎紋蛙各時期養(yǎng)殖過程中的病毒跟蹤檢測，也可用于環(huán)境監(jiān)測，避免病毒傳播流行，提高科學(xué)管理效率，具有很高的實用價值。
實施例1蛙病毒的基因診斷試劑盒該試劑盒由下列部件構(gòu)成(10樣份)1).樣品稀釋液(A液)，2管，5ml/管，內(nèi)裝磷酸緩沖液(1×PBS)，pH7.4。2).模板抽提液(B液)，自備或配制，酚/氯仿/異戊醇，比例為25∶24∶1。3).C液，1管，200μl/管，內(nèi)裝5M NaCL。4).D液，自備，1ml/份×10份，10ml，主要為無水乙醇。5).E液，自備，主要為70％乙醇。6).F液，1管，30μl/份×10份，300μl/管，內(nèi)裝滅菌雙蒸水。7).PCR反應(yīng)液(G液)，1管，25μl/份×10份，250μl/管，內(nèi)裝PCR一擴(kuò)反應(yīng)液(25μl體系)，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、引物F1、引物R1和TaqE。8).陽性對照(H液)，1管，20μl/管，內(nèi)裝TFV陽性模板。9).長方體盒子，8.5×5.8×6.2cm3。10).一塊泡沫板，其大小與長方體盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四個孔，孔徑1.3cm，第二排五個孔，孔徑1.0cm，第三、四排分別六個孔，孔徑0.6cm。上述各小管分別對應(yīng)放置于泡沫板的孔內(nèi)，裝于長方體盒子中。
該試劑盒中的引物F1和R1的DNA序列如下F15’-GAC TTG GCC ACT TAT GACR15’-TGT CTC TGG AGA AGA AGAAPCR反應(yīng)液體系(25μl體系)如下ddH2O20μl10×Buffer(含mg2+) 2.5μldNTP 0.4μl
引物F1 0.4μl引物R1 0.4μlTaqE0.3μl實施例2蛙病毒的檢測方法使用實施例1的試劑盒，按下列步驟進(jìn)行1).取樣品0.1g，加入樣品稀釋液(A液)1ml稀釋10倍，于勻漿器中冰浴勻漿。2).4000r/min離心10min。3).取上清600μl用模板抽提液(B液)抽提，上下顛倒幾次混勻。4).12000r/min離心10min。5).取500ul上清加入20μl C液，再加入1ml D液，于-20℃沉淀1小時。6).12000r/min離心10min。7).棄上清，加E液沖洗，12000r/min離心5min，沖洗兩次。8).棄上清，自然干燥或在超凈工作臺上吹干。9).加20～30μlF液重懸溶解作為模板。10).分別取模板和H液2μl，加入到PCR反應(yīng)液(G液)中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR上。11).按下列條件擴(kuò)增95℃ 2min預(yù)變性，→94℃ 30sec 30個循環(huán)→72℃ 10min→4℃保存55℃ 30sec72℃ 1min12).反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加4μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘(5V/cm)后于紫外儀上觀察。若在532bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶(與陽性對照在同一位置)，則為TFV陽性，說明待測樣品攜帶蛙病毒，否則為陰性(見

圖1)。
權(quán)利要求
1.種蛙病毒的基因診斷試劑盒，其特征是該試劑盒包括下列部件1).樣品稀釋液A液，2管，內(nèi)裝磷酸緩沖液(1×PBS)，pH7.4；2).模板抽提液B液，1管，內(nèi)裝酚/氯仿/異戊醇，比例為25∶24∶1；3).C液，1管，內(nèi)裝5M NaCL；4).D液，1管，內(nèi)裝無水乙醇；5).E液，1管，內(nèi)裝70％乙醇；6).F液，1管，內(nèi)裝滅菌雙蒸水；7).PCR反應(yīng)液G液，1管，內(nèi)裝PCR一擴(kuò)反應(yīng)液，包括ddH2O、含mg2+的10×Buffer、dNTP、引物F1、引物R1和TaqE；F1為5’-GAC TTG GCC ACT TAT GAC，R15’-TGT CTC TGGAGA AGA AGAA；8).陽性對照H液，1管，20μl/管，內(nèi)裝TFV陽性模板；9).盒子；10).一塊泡沫板，其大小與上述盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數(shù)量的小孔，上述各小管分別對應(yīng)放置于這些小孔中。
2.一種檢測蛙病毒的方法，其特征是使用權(quán)利要求1所述試劑盒，按下列步驟進(jìn)行1).取樣品，加入樣品稀釋液A液稀釋10～20倍，于勻漿器中冰浴勻漿；2).4000～6000r/min離心10～15min；3).取上清600μl用模板抽提液B液抽提，上下顛倒幾次混勻；4).10000～12000r/min離心10～15min；5).取500μl上清加入20ulC液，再加入1ml D液，于-20℃沉淀1小時；6).10000～12000r/min離心10～15min；7).棄上清，加E液沖洗，10000～12000r/min離心5～10min，沖洗兩次；8).棄上清，自然干燥或在超凈工作臺上吹干；9).加20～30μlF液重懸溶解作為模板；10).分別取模板和H液，加入到PCR反應(yīng)液G液中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR上；11).按下列條件擴(kuò)增95℃ 2min預(yù)變性，→94℃ 30sec 30個循環(huán)→72℃ 10min→4℃保存55℃ 30sec72℃ 1min12).反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加4μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘后于紫外儀上觀察；若在與陽性對照同一位置的532bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶，則為TFV陽性，說明待測樣品攜帶蛙病毒，否則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蛙病毒(TFV，Tiger Frog Virus)的基因診斷試劑盒及檢測方法。該試劑盒及檢測方法是以根據(jù)蛙病毒基因保守區(qū)序列設(shè)計的兩對引物為主體而設(shè)計的。本發(fā)明采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，對蛙病毒的特異性DNA核酸片段進(jìn)行定性檢測，簡便快速，特異性好，靈敏度高；可用于虎紋蛙各時期養(yǎng)殖過程中的病毒跟蹤檢測，也可用于環(huán)境監(jiān)測，避免病毒傳播流行，提高科學(xué)管理效率，具有很高的實用價值。
文檔編號C12Q1/70GK1448519SQ03114368
公開日2003年10月15日 申請日期2003年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月6日
發(fā)明者何建國, 呂玲, 黃志堅, 鄧敏, 翁少萍 申請人:中山大學(xué)