專利名稱：離子通道抑制劑在治療心律失常中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學和醫(yī)學領域，更具體地本發(fā)明涉及家族性房顫病人KCNQ1基因的增效突變及其應用。
背景技術：
根據(jù)世界衛(wèi)生組織的定義，心房顫動(atrial fibrillation)是心房不規(guī)則的、雜亂無章的電活動，心電圖上P波消失，代之以基線上形狀、大小、方向和時程不一的顫動波，在沒有高度或完全性房室傳導阻滯情況下心室率完全不等。
心房顫動是臨床上最常見的心律失常之一，它促發(fā)心力衰竭或血流動力學障礙，誘發(fā)室速或室顫等致命性心律失常，導致血栓和栓塞事件，增加基礎心臟病的死亡率，心房顫動本身還可以引起心臟擴大。根據(jù)統(tǒng)計，美國心房顫動發(fā)生率為0.9％。隨著年齡的增長，心房顫動發(fā)生率激劇增高，在65歲以上者則高達5.9％。根據(jù)Framinham研究，老年人(＞65歲)卒中1/3由心房顫動引起。歐洲心房顫動發(fā)生率與美國相仿，亞洲略低。心房顫動嚴重地危害著人類的健康，也給社會帶來了相當?shù)慕洕摀?br> 作為心房顫動的特殊類型，特發(fā)性心房顫動指無明碗的心臟病變基礎的心房顫動。其命名比較混亂，其他的名稱有孤立性特發(fā)性心房顫動、良性特發(fā)性心房顫動和家族性特發(fā)性心房顫動。多達三分之一的心房顫動歸類為特發(fā)性心房顫動(Lip GYH，Beevers DG(1995)ABC of atrial fibrillationhistory，epidemiology，and importance of atrial fibrillation. BMJ 3111361)。
房顫(AF)作為人類一種常見的心律失常，它的分子致病基礎至今沒有被很好的闡明。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是提供一種導致房顫的分子致病機理，該機理就是KCNQ1基因發(fā)生了致病突變(S140G)，從而導致心肌鉀離子IKs離子通道的離子流增大。
本發(fā)明的另一目的就是提供了基于該分子致病機理的藥物篩選方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種篩選心肌KCNQ1鉀離子通道的抑制劑的方法，包括步驟(a)將α亞基表達載體和β亞基表達載體轉入哺乳動物細胞，獲得轉化的哺乳動物細胞，其中α亞基表達載體是KCNQ1表達載體，而β亞基表達載體選自下組KCNE1表達載體或KCNE2的表達載體；(b)在步驟(a)的轉化的哺乳動物細胞的培養(yǎng)基中，添加候選物質，并測定添加候選物質前后的電生理鉀離子流，其中，如果加入候選物質后的電生理鉀離子流減小，則表明該活性物質是心肌KCNQ1鉀離子通道的抑制劑。
在一優(yōu)選例中，所述的KCNQ1表達載體表達野生型的KCNQ1。
在另一優(yōu)選例中，所述的KCNQ1表達載體表達突變型的KCNQ1。更佳地，所述的KCNQ1表達載體表達S140G突變型的KCNQ1。
在另一優(yōu)選例中，所述的β亞基表達載體表達KCNE1。
在另一優(yōu)選例中，所述的β亞基表達載體表達KCNE2。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中的測定方法為膜片鉗法。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種篩選心肌KCNQ1鉀離子通道的促進劑的方法，包括步驟(a)將α亞基表達載體和β亞基表達載體轉入哺乳動物細胞，獲得轉化的哺乳動物細胞，其中α亞基表達載體是KCNQ1表達載體，而β亞基表達載體選自下組KCNE1表達載體或KCNE2的表達載體；(b)在步驟(a)的轉化的哺乳動物細胞的培養(yǎng)基中，添加候選物質，并測定添加候選物質前后的電生理鉀離子流，其中，如果加入候選物質后的電生理鉀離子流增大，則表明該活性物質是心肌KCNQ1鉀離子通道的促進劑。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種S140G突變型KCNQ1蛋白的用途，它被用于篩選心肌KCNQ1鉀離子通道的抑制劑或促進劑。


圖1顯示S140G-KCNQ1/KCNE1離子通道的離子流，比野生型KCNQ1/KCNE1離子通道的離子流有極大的增大。
圖2顯示S140G-KCNQ1/KCNE2離子通道的離子流，比野生型KCNQ1/KCNE2離子通道的離子流有極大的增大。
圖3顯示了色原烷醇293B對S140G-KCNQ1/KCNE1離子通道的抑制效果。
圖4顯示了色原烷醇293B對S140G-KCNQ1/KCNE2離子通道的抑制效果。
圖5顯示了色原烷醇293B對KCNQ1/KCNE2離子通道的抑制效果。
具體實施例方式
本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，對一個中國遺傳性房顫家系的病人進行了遺傳分析，通過全基因組掃描把致病位點定位在11p15.5，并在該區(qū)域的KCNQ1基因中找到了一個致病突變S140G。KCNQ1基因編碼心肌鉀離子通道IKs(KCNQ1/KCNE1)、KCNQ1/KCNE2、KCNQ1/KCNE3離子通道的α亞基。該突變存在于所有的病人中，不存在于正常人中。
為了闡明這種突變的發(fā)病機制，本發(fā)明人進一步做了突變體離子通道流分析。功能分析表明S140G突變增強KCNQ1/KCNE1、KCNQ1/KCNE2離子通道的離子流。這與先前發(fā)現(xiàn)的引起LQT綜合癥的KCNQ1突變不同，引起LQT綜合癥的KCNQ1突變降低KCNQ1/KCNE1、KCNQ1/KCNE2離子通道的離子流。
動物實驗與臨床研究結果表明大多數(shù)房顫是由心房肌電傳導多元折返形成， 而動作電位持程和有效不應期的縮短有利于多元折返形成。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的房顫突變S140G引起IKs離子通道(KCNQ1/KCCNE1)與KCNQ1/KCNE2通道的功能的增強，這些增強可以引起心房肌動作電位持程與有效不應期的縮短，從而引發(fā)房顫。
基于以上結果，針對KCNQ1/KCNE2離子流的離子通道抑制劑，可能對房顫及其他心律失常有緩解，治療效果。因此，本發(fā)明還提供了一種篩選治療房顫的候選藥物的方法，即篩選心肌KCNQ1鉀離子通道的抑制劑的方法，它包括步驟(a)將α亞基表達載體和β亞基表達載體轉入哺乳動物細胞，獲得轉化的哺乳動物細胞，其中α亞基表達載體是KCNQ1表達載體，而β亞基表達載體選自下組KCNE1表達載體或KCNE2的表達載體；(b)在步驟(a)的轉化的哺乳動物細胞的培養(yǎng)基中，添加候選物質，并測定添加候選物質前后的電生理鉀離子流，其中，如果加入候選物質后的電生理鉀離子流減小，則表明該活性物質是心肌KCNQ1鉀離子通道的抑制劑。
如本文所用，術語“野生型KCNQ1”指具有SEQID NO1所示氨基酸序列的蛋白。KCNQ1編碼心肌鉀離子IKs離子通道，KCNQ1/KCNE2及KCNQ1/KCNE3離子通道中的α亞基。
如本文所用，術語“S140G-KCNQ1”指具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白，其對應的編碼序列如SEQID NO9所示。發(fā)生S140G時，SEQ ID NO9中核苷酸418由A→G，SEQ ID NO2中140位氨基酸由S→G。功能分析表明S140G突變使KCNQ1/KCNE2、KCNQ1/KCNE3的離子流增大，這與原先發(fā)現(xiàn)的導致LQT綜合癥的突變的離子流降低效應相反。所以S140G突變可能通過縮短心房肌的動作電位持程(Action Potentia1 Duration，APD)與有效不應期(Effective Refratory Period，ERP)來引發(fā)與維持房顫。
如本文所用，術語“KCNE1”指GenBank NM_000219序列編碼的蛋白，即Potassium(K)ChaNnel ClassE，Member 1。
如本文所用，術語“KCNE2”指GenBank NM_005136序列編碼的蛋白，即Potassium(K)ChaNnel ClassE，Member 2。
如本文所用，術語“KCNE3”指GenBank NM_005472序列編碼的蛋白，即Potassium(K)ChaNnel ClassE，Member 3。
可用于本發(fā)明篩選方法的細胞沒有特別限制。代表性的例子包括哺乳動物細胞，如COS-7細胞，CHO細胞，或脊椎動物爪蟾(Xenopus)的卵母細胞。
可用于本發(fā)明篩選方法的離子流測定技術沒有特別限制。代表性的例子包括膜片鉗法(用于哺乳動物細胞)、或微雙電極壓鉗法(用于爪蟾卵母細胞)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于可有效地大量篩選治療房顫的候選藥物。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1野生型KCNQ1表達載體的制備從人腎臟cDNA庫中(Clontech Inc.)，用同位素32P標記的KCNQ1 DNA探針(PCR片段)篩選陽性克隆。所得陽性克隆，進行直接測序，確定與GenBank中的標準公布序列(Accession No.AF000571)相同，并具有完整的編碼序列。
在cDNA序列ATG起始子前設計一個引物，并帶有ECoRI切點序列(引物F5’-tc gag aat tcc tca cca tgg ccg cgg cct cct c(SEQ ID NO3))，在終止子TGA后設計一個引物，并帶有XbaI切點(引物R5’-ggt cga ctc tag acc cca tcc cct cct cagg (SEQ ID NO4))。
用引物對(F，R)，以人腎臟cDNA庫(Clontech Inc.)為模板，進行PCR擴增(HotStarTaq試劑盒，Qiagen公司)，所得PCR產物由QIAquick PCRPurification Kit純化(Qiagen公司)。
純化后的PCR產物經EcoRI，XbaI混合酶切后，與經同樣酶處理的pCI載體(Promega Inc.)連接，轉入XL1-Blue感受態(tài)細胞，在氨芐青霉素LB板上接種并培養(yǎng)，挑取抗藥性克隆，測序證實克隆的正確性。
結果獲得了插入了野生型KCNQ1編碼序列的表達載體pCI-KCNQ1。
實施例2突變型S140G-KCNQ1表達載體的制備在本實施例中，以實施例1中制備的野生型KCNQ1表達質粒為模板，利用定點致變技術(Site-directed Mutagenesis)在編碼的第140位改變編碼子序列，將編碼Serine(絲氨酸)改成編碼Glycin(甘氨酸)，制成S140G突變型表達質粒。具體過程如下
設計合成二對PCR擴增引物。第一對引物(由正向引物1和含S140G突變位點的反向引物1組成)用于擴增含從ECoRI切點至S140G突變位點片段的產物是5’-gct agc ctc gag aat tcc tca c(SEQ ID NO5)5’-gga cag cac gcc gaa gat g(SEQ ID NO6)第二對引物(由含S140G突變位點的正向引物2和反向引物2組成)用于擴增含從S140G突變位點至XbaI切點的片段，序列如下5’-cat ctt cgg cgt gct gtc c(SEQ ID NO7)5’-ggt cga ctc tag acc cca tcc(SEQ ID NO8)含有S140G突變位點的引物序列在突變位引入相應的突變核苷酸。以實施例1中制備的表達載體pCI-KCNQ1為模板，分別以第一對引物(SEQ ID NO5和6)和第二對引物(SEQ ID NO7和8)進行PCR擴增。將PCR擴增的二個片段混合，用正向引物1和反向引物2(SEQ ID NO5和8)擴增出完整編碼片段。所得PCR產物由QIAquick PCR Purification Kit純化(Qiagen Inc)。純化后的PCR產物經EcoRI，XbaI混合酶切后，與經同樣酶處理的pCI載體(PromegaInc.)連接，轉入XL1-Blue感受態(tài)細胞，在氨芐青霉素LB板上接種并培養(yǎng)，挑取抗藥性克隆，測序證實克隆的正確性。
結果獲得了插入了突變型KCNQ1編碼序列的表達載體pCI-S140G-KCNQ1。
實施例3KCNQ1的S140G突變導致KCNQ1/KCNE1離子流增強將實施例1和2中制備的S140G-KCNQ1表達載體pCI-S140G-KCNQ1和野生型KCNE1表達質粒(pIRES-KCNE1-CD8)轉入哺乳類細胞COS-7細胞中。在另一對照組實驗中，將野生型KCNQ1表達載體pCI-KCNQ1和KCNE1表達質粒轉入哺乳類細胞COS-7細胞中。在細胞轉染后約48小時后，進行電生理鉀離子流測定(利用膜片鉗技術)。方法如下在一個濕潤的含5％CO2環(huán)境中，COS-7細胞被培養(yǎng)在Dulbecco’smodified Eagle培養(yǎng)劑中(補充成分10％胎牛血清，100U/mL鏈霉素，100U/mL青霉素)。用DEAE-Dextran沉淀法轉染細胞。用0.75μg的pCI-KCNQ1或pCI-S140G-KCNQ1質粒DNA，O.25μg的pIRES-KCNE1-CD8質粒DNA(該質粒是在pIRES載體(Clontech Inc.)中同時插入分別編碼KCNE1基因和編碼CD8基因的二個片段而形成的質粒)。轉染一盤35mm的細胞。被轉染的COS-7細胞通過用抗-CD8抗體來識別。離子流記錄在室溫(～22℃)進行，采用全細胞(Whole-Cell)記錄模式(VP500 Amplifier，BioLogic Inc)。電極內液含(mM)150mM KCl，0.5mM MgCl2，5mM EDTA，和10mM HEPES，pH7.3。水浴含(mM)150mM NaCl，5mM KCl，2mM CaCl2，1mM MgCl2和10mMHEPES，pH7.3。電極電阻2.5-5MΩ。通過去極化引發(fā)膜電流(膜去極化從-130mV至+50mV，維持電壓為-80mV)。
結果如圖1所示，S140G-KCNQ1/KCNE1離子通道的離子流，比野生型KCNQ1/KCNE1離子通道的離子流有極大的增大。
實施例4KCNQ1的S140G突變導致KCNQ1/KCNE2離子流增強按實施例3相同方法，將S140G-KCNQ1表達載體和KCNE2表達質粒(pIRES-KCNE2-CD8)轉入合適的哺乳類細胞COS-7細胞中。在另一對照組實驗中，將野生型KCNQ1的表達載體和KCNE2表達質粒轉入合適的哺乳類細胞COS-7細胞中。在細胞轉染后約48小時后，進行電生理鉀離子流測定(利用膜片鉗技術)。
結果如圖2所示，S140G-KCNQ1/KCNE2離子通道的離子流，比野生型KCNQ1/KCNE2離子通道的離子流有極大的增大。
實施例5突變型S140G-KCNQ1/KCNE1(IKs)離子通道抑制劑的篩選在本實施例中，將S140G-KCNQ1表達載體(pCI-S140G-KCNQ1)和KCNE1表達質粒轉入合適的哺乳類細胞(如COS-7細胞)中，在細胞轉染后約48小時后，進行電生理鉀離子流測定。比較加人待選抑制劑前后，離子流強度及特性有否改變，可判斷該化合物是否有S140G-KCNQ1/KCNE1離子通道抑制效果。此外，本方法也可用來比較不同抑制劑的相對抑制效果。
重復實施例3的過程，不同點在于加入候選物質，色原烷醇293B(Chromanol293B)(化學名稱為trans-6-cyano4-{N-ethylsulfonyl-N-methylamino}-3-hydroxy-2，2-dimethyl-chromanane)后。結果發(fā)現(xiàn)，離子流則被完全抑制(圖3)。因此，色原烷醇293B是心肌鉀離子通道IKs(KCNQ1/KCNE1)的抑制劑。
實施例6突變型S140G KCNQ1/KCNE2離子通道抑制劑的篩選在本實施例中，將S140G-KCNQ1表達載體(pCI-S140G-KCNQ1)和KCNE2表達質粒轉入合適的哺乳類細胞(如COS-7細胞)中，在細胞轉染后約48小時后，進行電生理鉀離子流測定。比較加人待選抑制劑前后，離子流強度及特性有否改變，可判斷該化合物是否有S140G-KCNQ1/KCNE2離子通道抑制效果。此外，本方法也可用來比較不同抑制劑的相對抑制效果。
重復實施例4的過程，不同點在于加入候選物質，色原烷醇293B(Chromanol293B)(化學名稱為trans-6-cyano4-{N-ethylsulfonyl-N-methylamino}-3-hydroxy-2，2-dimethyl-chromanane)后。結果發(fā)現(xiàn)，離子流則被完全抑制(圖4)。因此，色原烷醇293B是心肌鉀離子通道KCNQ1/KCNE2的抑制劑。
實施例7野生型KCNQ1/KCNE2離子通道抑制劑的篩選在本實施例中，將野生型KCNQ1的表達載體(pCI-KCNQ1)和KCNE2表達質粒轉入合適的哺乳類細胞(如COS-7細胞)中，在細胞轉染后約48小時后，進行電生理鉀離子流測定。比較加人待選抑制劑前后，離子流強度及特性有否改變，可判斷該化合物是否有KCNQ1/KCNE2離子通道抑制效果。此外，本方法也可用來比較不同抑制劑的相對抑制效果。
重復實施例4的過程，不同點在于加入候選物質，色原烷醇293B(Chromanol293B)(化學名稱為trans-6-cyano4-{N-ethyIsuIfonyl-N-methylamino}-3-hydroxy-2，2-dimethyl-chromanane)后。結果發(fā)現(xiàn)，離子流則被完全抑制(圖5)。因此，色原烷醇293B是心肌鉀離子通道KCNQ1/KCNE2的抑制劑。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>同濟大學國家人類基因組南方研究中心<120>離子通道抑制劑在治療心律失常中的應用<130>028027<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>676<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Ala Ala Ala Ser Ser Pro Pro Arg Ala Glu Arg Lys Arg Trp Gly1 5 10 15Trp Gly Arg Leu Pro Gly Ala Arg Arg Gly Ser Ala Gly Leu Ala Lys20 25 30Lys Cys Pro Phe Ser Leu Glu Leu Ala Glu Gly Gly Pro Ala Gly Gly35 40 45Ala Leu Tyr Ala Pro Ile Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Pro His50 55 60Val Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Pro Val Ala Ser Asp Leu Gly65 70 75 80Pro Arg Pro Pro Val Set Leu Asp Pro Arg Val Ser Ile Tyr Ser Thr85 90 95Arg Arg Pro Val Leu Ala Arg Thr His Val Gln Gly Arg Val Tyr Asn100 105 110Phe Leu Glu Arg Pro Thr Gly Trp Lys Cys Phe Val Tyr His Phe Ala
115 120 125Val Phe Leu Ile Val Leu Val Cys Leu Ile Phe Ser Val Leu Ser Thr130 135 140Ile Glu Gln Tyr Ala Ala Leu Ala Thr Gly Thr Leu Phe Trp Met Glu145 150 155 160Ile Val Leu Val Val Phe Phe Gly Thr Glu Tyr Val Val Arg Leu Trp165 170 175Ser Ala Gly Cys Arg Ser Lys Tyr Val Gly Leu Trp Gly Arg Leu Arg180 185 190Phe Ala Arg Lys Pro Ile Ser Ile Ile Asp Leu Ile Val Val Val Ala195 200 205Ser Met Val Val Leu Cys Val Gly Ser Lys Gly Gln Val Phe Ala Thr210 215 220Ser Ala Ile Arg Gly Ile Arg Phe Leu Gln Ile Leu Arg Met Leu His225 230 235 240Val Asp Arg Gln Gly Gly Thr Trp Arg Leu Leu Gly Ser Val Val Phe245 250 255Ile His Arg Gln Glu Leu Ile Thr Thr Leu Tyr Ile Gly Phe Leu Gly260 265 270Leu Ile Phe Ser Ser Tyr Phe Val Tyr Leu Ala Glu Lys Asp Ala Val275 280 285Asn Glu Ser Gly Arg Val Glu Phe Gly Ser Tyr Ala Asp Ala Leu Trp290 295 300Trp Gly Val Val Thr Val Thr Thr Ile Gly Tyr Gly Asp Lys Val Pro305 310 315 320
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Thr Ile Lys Val Ile Arg Arg Met Gln Tyr Phe Val Ala Lys Lys Lys515 520 525Phe Gln Gln Ala Arg Lys Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val Ile 6lu Gln530 535 540Tyr Ser Gln Gly His Leu Asn Leu Met Val Arg Ile Lys 6lu Leu Gln545 550 555 560Arg Arg Leu Asp Gln Ser Ile Gly Lys Pro Ser Leu Phe Ile Ser Val565 570 575Ser Glu Lys Ser Lys Asp Arg Gly Ser Asn Thr Ile Gly Ala Arg Leu580 585 590Ash Arg Val Glu Asp Lys Val Thr Gln Leu Asp Gln Arg Leu Ala Leu595 600 605Ile Thr Asp Met Leu His Gln Leu Leu Ser Leu His Gly Gly Ser Thr610 615 620Pro Gly Ser Gly Gly Pro Pro Arg Glu Gly Gly Ala His Ile Thr Gln625 630 635 640Pro Cys 6ly Ser Gly Gly Ser Val Asp Pro Glu Leu Phe Leu Pro Ser645 650 655Asn Thr Leu Pro Thr Tyr Glu Gln Leu Thr Val Pro Arg Arg Gly Pro660 665 670Asp Glu Gly Ser675<210>2<211>676<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)
<400>2Met Ala Ala Ala Ser Ser Pro Pro Arg Ala Glu Arg Lys Arg Trp Glyl 5 10 15Trp Gly Arg Leu Pro Gly Ala Arg Arg Gly Ser Ala Gly Leu Ala Lys20 25 30Lys Cys Pro Phe Ser Leu Glu Leu Ala Glu Gly Gly Pro Ala Gly Gly35 40 45Ala Leu Tyr Ala Pro Ile Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Pro His50 55 60Val Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Pro Val Ala Ser Asp Leu Gly65 70 75 80Pro Arg Pro Pro Val Ser Leu Asp Pro Arg Val Ser Ile Tyr Ser Thr85 90 95Arg Arg Pro Val Leu Ala Arg Thr His Val Gln Gly Arg Val Tyr Asn100 105 110Phe Leu Glu Arg Pro Thr Gly Trp Lys Cys Phe Val Tyr His Phe Ala115 120 125Val Phe Leu Ile Val Leu Val Cys Leu Ile Phe Gly Val Leu Ser Thr130 135 140Ile Glu Gln Tyr Ala Ala Leu Ala Thr Gly Thr Leu Phe Trp Met Glu145 150 155 160Ile Val Leu Val Val Phe Phe Gly Thr Glu Tyr Val Val Arg Leu Trp165 170 175Ser Ala Gly Cys Arg Ser Lys Tyr Val Gly Leu Trp Gly Arg Leu Arg180 185 190
Phe Ala Arg Lys Pro Ile Ser Ile Ile Asp Leu Ile Val Val Val Ala195 200 205Ser Met Val Val Leu Cys Val Gly Ser Lys Gly Gln Val Phe Ala Thr210 215 220Ser Ala Ile Arg Gly Ile Arg Phe Leu Gln Ile Leu Arg Met Leu His225 230 235 240Val Asp Arg Gln Gly Gly Thr Trp Arg Leu Leu Gly Ser Val Val Phe245 250 255Ile His Arg Gln Glu Leu Ile Thr Thr Leu Tyr Ile Gly Phe Leu Gly260 265 270Leu Ile Phe Ser Ser Tyr Phe Val Tyr Leu Ala Glu Lys Asp Ala Val275 280 285Asn Glu Ser Gly Arg Val Glu Phe Gly Ser Tyr Ala Asp Ala Leu Trp290 295 300Trp Gly Val Val Thr Val Thr Thr Ile Gly Tyr Gly Asp Lys Val Pro305 310 315 320Gln Thr Trp Val Gly Lys Thr Ile Ala Ser Cys Phe Ser Val Phe Ala325 330 335Ile Ser Phe Phe Ala Leu Pro Ala Gly Ile Leu Gly Ser Gly Phe Ala340 345 350Leu Lys Val Gln Gln Lys Gln Arg Gln Lys His Phe Asn Arg Gln Ile355 360 365Pro Ala Ala Ala Ser Leu Ile Gln Thr Ala Trp Arg Cys Tyr Ala Ala370 375 380
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Ser Glu Lys Ser Lys Asp Arg Gly Ser Asn Thr Ile Gly Ala Arg Leu580 585 590Asn Arg Val Glu Asp Lys Val Thr Gln Leu Asp Gln Arg Leu Ala Leu595 600 605Ile Thr Asp Met Leu His Gln Leu Leu Ser Leu His Gly Gly Ser Thr610 615 620Pro Gly Ser Gly Gly Pro Pro Arg Glu Gly Gly Ala His Ile Thr Gln625 630 635 640Pro Cys Gly Ser Gly Gly Ser Val Asp Pro Glu Leu Phe Leu Pro Ser645 650 655Asn Thr Leu Pro Thr Tyr Glu Gln Leu Thr Val Pro Arg Arg Gly Pro660 665 670Asp Glu Gly Ser675<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>7catcttcggc gtgctgtcc 19<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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1.一種篩選心肌KCNQ1鉀離子通道的抑制劑的方法，其特征在于，包括步驟(a)將α亞基表達載體和β亞基表達載體轉入哺乳動物細胞，獲得轉化的哺乳動物細胞，其中α亞基表達載體是KCNQ1表達載體，而β亞基表達載體選自下組KCNE1表達載體或KCNE2的表達載體；(b)在步驟(a)的轉化的哺乳動物細胞的培養(yǎng)基中，添加候選物質，并測定添加候選物質前后的電生理鉀離子流，其中，如果加入候選物質后的電生理鉀離子流減小，則表明該活性物質是心肌KCNQ1鉀離子通道的抑制劑。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的KCNQ1表達載體表達野生型的KCNQ1。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的KCNQ1表達載體表達突變型的KCNQ1。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的KCNQ1表達載體表達S140G突變型的KCNQ1。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的β亞基表達載體表達KCNE1。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的β亞基表達載體表達KCNE2。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)中的測定方法為膜片鉗法。
8.一種篩選心肌KCNQ1鉀離子通道的促進劑的方法，其特征在于，包括步驟(a)將α亞基表達載體和β亞基表達載體轉入哺乳動物細胞，獲得轉化的哺乳動物細胞，其中α亞基表達載體是KCNQ1表達載體，而β亞基表達載體選自下組KCNE1表達載體或KCNE2的表達載體；(b)在步驟(a)的轉化的哺乳動物細胞的培養(yǎng)基中，添加候選物質，并測定添加候選物質前后的電生理鉀離子流，其中，如果加入候選物質后的電生理鉀離子流增大，則表明該活性物質是心肌KCNQ1鉀離子通道的促進劑。
9.一種S140G突變型KCNQ1蛋白的用途，其特征在于，用于篩選心肌KCNQ1鉀離子通道的抑制劑或促進劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種突變型KCNQ1，即S140G－KCNQ1。還公開了利用KCNQ1來篩選心肌KCNQ1鉀離子通道的抑制劑的方法，它包括步驟(a)將(i)表達KCNQ1表達載體和(ii)KCNE1表達載體或KCNE2表達載體轉入哺乳動物細胞；(b)在轉化的哺乳動物細胞的培養(yǎng)基中，添加候選物質，并測定添加前后的電生理鉀離子流，其中，如果加入候選物質后的電生理鉀離子流減小，則表明該物質是心肌KCNQ1鉀離子通道的抑制劑。該方法可快速篩選治療房顫的候選藥物。
文檔編號C12N15/12GK1515680SQ03114730
公開日2004年7月28日 申請日期2003年1月6日 優(yōu)先權日2003年1月6日
發(fā)明者陳義漢, 徐世杰, 黃薇, 徐文淵, 謝陪俐 申請人:同濟大學, 國家人類基因組南方研究中心