專利名稱：有條件復制型腺病毒及其構(gòu)建方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學領(lǐng)域，涉及一種用于腫瘤基因治療的腺病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。具體涉及一種可以在腫瘤細胞內(nèi)選擇性復制、而在正常細胞中不復制的、用于腫瘤基因治療的腺病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用基因治療被認為是很有希望的新方法，其最大的優(yōu)勢在于利用正常與腫瘤細胞間在分子水平方面的差異，可以有效地、選擇性地攻擊腫瘤細胞，大大拓寬了腫瘤的“治療窗”，在增強治療效果的同時減少副作用。不過，現(xiàn)有的各種基因治療方法在臨床應(yīng)用方面仍然面臨著許多的困難和障礙。其中最關(guān)鍵的問題是缺乏針對腫瘤細胞的、高效的基因傳遞載體或系統(tǒng)。
腺病毒是一種毒性較小的感冒病毒，對人體危害不大。它的最突出的優(yōu)點是能夠以非常高的效率感染各種人類細胞。因此，重組腺病毒是目前世界各國腫瘤基因治療研究人員的首選基因?qū)牍ぞ摺Ｒ延醒芯?，從生物安全性的角度出發(fā)，采用復制缺陷型腺病毒作為基因傳遞的載體。但是，在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)復制缺陷型腺病毒傳遞基因的效率和治療效果仍然不理想。有文獻報道腫瘤局部注射復制缺陷型腺病毒，即使在最優(yōu)化的狀態(tài)下也僅僅只有10-15％的病毒能感染腫瘤細胞。因此，應(yīng)用復制缺陷型腺病毒作腫瘤基因治療，不僅要求病毒用量很大，而且并非所有的腫瘤細胞均能被同時感染，故難以達到治療目的。采用具有“旁觀者效應(yīng)”的治療基因，可以改善或增強治療效果，但仍然不能完全克服復制缺陷型病毒固有的弱點。
隨著非復制型腺病毒的大量應(yīng)用，人們對腺病毒在人體內(nèi)的分布特點和安全性有了更深入的了解和認識。為了提高治療基因在腫瘤局部的傳遞效率和表達水平，研究人員開始使用具有復制能力的腺病毒作為基因傳遞載體。采用復制型腺病毒必須解決的關(guān)鍵問題是使病毒的復制嚴格限制在腫瘤細胞內(nèi)。目前，為了獲得腫瘤特異性的復制已有許多不同的方案或策略。典型實例如onyx-015病毒，它能夠選擇性地在p53基因功能已喪失的腫瘤細胞內(nèi)復制。由于50％以上的腫瘤均有p53基因失活，理論上講onyx-015病毒可用于治療一半以上的腫瘤。不過，目前對onyx015病毒腫瘤特異性問題存在爭議，有人觀察到onyx-015病毒在p53基因完整的腫瘤細胞內(nèi)也有復制。盡管如此，onyx-015病毒目前已進入II期臨床試驗階段。另一種很有希望的策略是使用腫瘤或組織特異性的啟動子控制病毒復制所必須的基因的表達。如CN706病毒，該病毒利用前列腺特異抗原(PSA)基因啟動子驅(qū)使E1A基因表達，這一病毒已被證實具有前列腺細胞選擇毒性。
盡管前述的復制型腺病毒有明顯的優(yōu)越性，但它們?nèi)匀挥幸欢ǖ娜毕荨Ｊ紫?，目前很多組織特異性啟動子的活性，在腫瘤和同源組織中相同如PSA。含有這些啟動子的復制型病毒也會在正常組織中復制。這就大大局限了這些病毒的應(yīng)用前景。另外，許多啟動子的控制并不是特別的嚴格，會造成在非靶向的正常細胞里也有一定的病毒復制，從而關(guān)窄了治療窗口。因此，為了加強有條件復制性病毒的療效并減少其毒性，有必要采取新的策略以進一步改進現(xiàn)有的病毒設(shè)計。
本發(fā)明使腺病毒能夠選擇性地在腫瘤中復制，其攜帶的各種治療基因也選擇性地在腫瘤中表達，從而達到有效治療腫瘤而無副作用的目的。本發(fā)明利用近三十年腫瘤生物學研究進展，模仿各種腫瘤細胞或組織特異性基因的遺傳調(diào)控方式，重新構(gòu)建腺病毒。從而達到使腺病毒在腫瘤細胞內(nèi)能夠有效復制而在正常細胞里則不復制的目的。
本發(fā)明所解決的主要問題，是增強有條件復制性病毒在腫瘤細胞中的復制特異性。其核心是通過同時控制兩個或兩個以上的病毒復制所必需的基因，達到顯著增加病毒復制的靶向性。本發(fā)明根據(jù)不同類型腫瘤的遺傳特點，在有條件復制性腺病毒里嵌入兩個或兩個以上腫瘤細胞或狀態(tài)或組織特異性的啟動子來控制那些必需基因，使病毒能夠高度特異性地在腫瘤細胞中復制。
本發(fā)明的技術(shù)方案通過下述方法和步驟實現(xiàn)，1、通過PCR反應(yīng)和克隆技術(shù)，分離腫瘤特異性啟動子，2、構(gòu)建腫瘤特異性的復制型腺病毒載體，3、包裝、擴增、純化病毒，以及其感染和復制的鑒定，4. 構(gòu)建和鑒定攜帶治療基因的、腫瘤特異性復制型腺病毒載體，5.腫瘤特異性復制型腺病毒載體在活體腫瘤內(nèi)的復制，6.腫瘤特異性復制型病毒對腫瘤生長的抑制。
本發(fā)明所述的有條件復制性腺病毒，可用于與腫瘤的放射線治療(radiation therapy)相結(jié)合，對腫瘤進行綜和治療。復制性病毒可以在放射治療以前，放射治療期間，或放射治療以后直接注射入腫瘤中。
本發(fā)明所述的有條件復制性腺病毒，可用于與腫瘤的光動力學治療(photodynamic therapy)結(jié)合，對腫瘤進行綜和治療。復制性病毒可以在光動力學治療以前，光動力學治療期間，或光動力學治療以后直接注射入腫瘤中。
本發(fā)明所述的有條件復制性腺病毒，可用于與腫瘤的自殺基因化學治療(suicide gene chemotherapy)結(jié)合，對腫瘤進行綜合治療。其中，自殺基因包括細菌或及酵母的cytosine deaminase基因；皰疹病毒的thymidine kinase基因；以及p450基因。與它們相關(guān)的化療藥物分別是5-fluorocytidine(5-FC)，gancyclovir，cyclophosphamide。
實施例2構(gòu)建腫瘤特異性的復制型腺病毒載體將實施例1中所分離出的腫瘤特異性啟動子通過遺傳工程的方法嵌入腺病毒的DNA中，用其控制腺病毒復制必需的早期基因的表達。

圖1所述的是重組病毒的構(gòu)建方法。所述病毒的特點是它們的E1A和E4基因同時被腫瘤組織特異性的啟動子所調(diào)控。其中控制E1A和E4的啟動子，可以是同一個啟動子，也可以是不同的啟動子。下述組合是本發(fā)明采用的有條件復制性腺病毒的組合。
1)AdHRPE1aTERTE4-dsRed2，TSP1為缺氧誘導性啟動子，TSP2為端粒酶啟動子；
2)AdAFPE1aTERTE4-dsRed2，TSP1為α-胚胎蛋白啟動子，TSP2為端粒酶啟動子；3)AdE2F1E1aTERTE4-dsRed2，TSP1為E2F1啟動子，TSP2為端粒酶啟動子；4)AdMuc1E1aTERTE4-dsRed2，TSP1為MUC1基因啟動子，TSP2為端粒酶啟動子，5)AdTERTE1a-E4-dsRed2，TSP1為端粒酶啟動子，TSP2為端粒酶啟動子。上述組合的共同特點是它們的E4基因都在端粒酶啟動子的控制之下。因此，它們的復制主要局限在有端粒酶活性的腫瘤細胞內(nèi)。在此基礎(chǔ)上再加上第二個啟動子，賦予病毒更高的組織或細胞復制特異性。
為了能夠準確、客觀地觀察和分析病毒的存在、感染和復制，本發(fā)明還可在腺病毒載體中加入熒光蛋白報告基因dsRed2。所述報告基因是來源于珊瑚礁、能自發(fā)紅色熒光的蛋白基因。其有CMV啟動子及SV40多聚腺苷尾。它的存在使所述病毒對細胞的感染及其在細胞內(nèi)的復制等均可通過熒光顯微鏡和流式細胞儀進行觀察和評估。
實施例3包裝、擴增、純化病毒，以及感染和復制的鑒定采用人胚腎293細胞對上述構(gòu)建病毒進行包裝，經(jīng)過噬菌斑(plaquepurification)篩選后再進行擴增，采用氯化銫密度梯度離心及透析純化病毒。純化的病毒滴度均可達3~5×1010pfu/ml。觀測病毒在各種腫瘤和正常細胞中的復制情況。其結(jié)果如下
1)AdTERTE1a-E4-dsRed2能夠感染下述腫瘤細胞，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等細胞，并在這些細胞中大量復制。感染后3~5天出現(xiàn)明顯的細胞病變，然后細胞裂解并繼續(xù)感染周圍的腫瘤細胞，3~7天之內(nèi)所有的腫瘤細胞幾乎都被殺死。所述病毒也可感染人的成纖維細胞和正常的上皮細胞，但不復制或只有極少量的復制，被感染的細胞存活狀態(tài)良好，證明沒有毒性。圖2，3和4顯示的是經(jīng)過病毒感染的腫瘤和成纖維細胞的情況。從圖2可以清楚地看到，成纖維細胞中的熒光蛋白遠較腫瘤細胞中少，而且隨時間增加基本上沒有變化。證明病毒在成纖維細胞中沒有復制。相反，Du145細胞中的熒光蛋白則隨時間變得越來越亮，證明病毒在細胞中進行復制。證明E1a在腫瘤細胞里明顯表達，在成纖維細胞則幾乎沒有表達。
2)AdAFPE1aTERTE4-dsRed能感染人類肝癌細胞，如HepG2，并在其中復制并殺死宿主細胞。而在其他腫瘤細胞中，感染效率并沒有降低，但它的復制效率極低。
3)AdE2F1E1aTERTE4-dsRed2能感染所有檢驗過的腫瘤細胞，并在其中復制并殺死宿主細胞，盡管它能夠有效地感染正常成纖維細胞或上皮細胞，但它在這些細胞中卻極少復制。
4)AdMuc1E1aTERTE4-dsRed2能有效地感染有MUC1基因表達的乳腺癌細胞，如MCF-7，并在其中復制和殺死宿主細胞。但在沒有MUC1基因表達的乳腺癌細胞中，如MDA-MB-231細胞中，它盡管能感染這些細胞，但并不能在其中復制和殺死這些細胞。
5)AdHRPE1aTERTE4-dsRed2能有效地感染各種腫瘤細胞。但是，在正常生長情況下該病毒的復制很少，而在缺氧的情況下該病毒的復制迅速增加。嗜菌斑檢測證明所述病毒在缺氧情況下的復制(滴度)是常氧情況下的500倍。
實施例4構(gòu)建和鑒定攜帶治療基因的、腫瘤特異性復制型腺病毒載體按本領(lǐng)域常規(guī)方法構(gòu)建下述攜帶治療基因的復制型腺病毒，1)攜帶具有刺激機體免疫能力的GM-CSF編碼基因TERT-E1aE4-GM-CSF。
2)攜帶腫瘤壞死因子TNFα編碼基因TERT-E1aE4-TNFα。
將上述病毒感染腫瘤細胞和正常的成纖維細胞，觀察病毒的復制和治療基因的表達。結(jié)果證明，上述病毒能夠在腫瘤細胞里有效地復制，但在成纖維細胞里幾乎不復制。用ELISA進行治療基因的表達水平檢測，結(jié)果證明，GM-CSF和TNFα的表達量都非常高。與非復制型病毒相比，其表達量高出350(TNF-α)到970倍(GM-CSF)。
實施例5腫瘤特異性復制型腺病毒載體在活體腫瘤內(nèi)的復制將5×106人的腫瘤細胞(LnCap)注射到裸鼠體內(nèi)，當腫瘤生長至1cm直徑大小后，分別向腫瘤內(nèi)注射1×108pfu的復制型腺病毒(AdTERT-E1A-dsRed2)與非復制型腺病毒(Ad-dsRed2)，注射病毒后5天切片檢查腫瘤組織RFP表達情況。如圖5所示，注射AdTERT-E1A-dsRed2，腫瘤內(nèi)幾乎90％以上的區(qū)域表達RFP；注射Ad-dsRed2，腫瘤內(nèi)僅10％表達RFP。熒光定量分析顯示，注射AdTERT-E1A-dsRed2的腫瘤RFP的亮度是注射Ad-dsRed2的腫瘤的100倍以上。
實施例6腫瘤特異性復制型病毒對腫瘤生長的抑制將純化后的復制型和非復制型病毒注射到已經(jīng)在裸鼠體內(nèi)生長到5~10毫米直徑的人結(jié)腸癌HCT116腫瘤內(nèi)，然后對腫瘤的生長進行跟蹤。將1×107HCT116細胞接種到裸鼠皮下，7~10天后腫瘤生長至5~10毫米直徑大小。此時，將2×109腺病毒注射到腫瘤內(nèi)，跟蹤觀察腫瘤生長情況。每2~3天測量腫瘤大小一次。結(jié)果表明，端粒酶特異性的腺病毒與攜帶抗腫瘤新生血管形成基因Ex-FLK1的非復制型病毒聯(lián)合應(yīng)用療效最佳，超過一半的腫瘤在觀察末期仍然處于消失狀態(tài)。結(jié)果表明，腫瘤特異性的復制型病毒本身就具有抑制腫瘤生長的能力。當復制型病毒攜帶了治療基因時，所取得的抗癌效果明顯增強。顯示了新型復制型病毒在腫瘤治療中的優(yōu)越性。這一類病毒的單獨使用或與現(xiàn)有的腫瘤治療方法結(jié)合使用，能夠顯著地提高腫瘤治療效果并減少副作用。
其中，E1A基因由第一個組織特異性基因啟動子(TSP1)調(diào)控，而E4基因由第二個組織特異性基因啟動子(TSP2)調(diào)控。dsRed基因作為監(jiān)測病毒感染和復制的標記，也被嵌入到E1區(qū)域。
圖2是AdTERTE1a-E4-dsRed2選擇性地在腫瘤細胞內(nèi)復制。
其中A利用AdTERTE1a-E4-dsRed2感染人成纖維細胞GM8429和人前列腺癌細胞Du145后，在不同時間點經(jīng)熒光顯微鏡觀察紅色熒光蛋白基因的表達情況，B各種不同的腫瘤細胞(人乳腺癌細胞株MCF-7，人結(jié)腸癌細胞株HCT116，人前列腺癌細胞株LnCap)和人成纖維細胞經(jīng)AdTERTE1a-E4-dsRed2和Ad-GFP感染后E1A表達的Western blot檢測結(jié)果。
圖3是經(jīng)復制型AdTERTE1a-E4-dsRed2感染腫瘤細胞及成纖維細胞后產(chǎn)生的活性病毒數(shù)。
其中不同的腫瘤細胞及人成纖維細胞(GM8429，GM5658)經(jīng)AdTERTE1a-E4-dsRed2(實驗組)或Ad-dsRed(對照組)感染后，將細胞裂解并進一步感染人胚腎293細胞，通過噬菌斑數(shù)目來統(tǒng)計有活性的病毒的滴度。直方圖代表實驗組與對照組的比值。
圖4是復制型腺病毒復制所導致的腫瘤細胞裂解。
其中腫瘤細胞(人前列腺癌細胞株LnCap，Du145)和人成纖維細胞(GM8429，GM5658)受AdTERTE1a-E4-dsRed2感染后10天，結(jié)晶紫染色顯示腫瘤細胞大部分裂解、消失，而成纖維細胞保存完好。
圖5是AdTERTE1a-E4-dsRed2選擇性地在動物體內(nèi)腫瘤組織中復制圖。
其中裸小鼠皮下接種5×106人前列腺癌LnCap細胞后生長至直徑1cm左右，腫瘤內(nèi)注射1×108pfu AdTERTE1a-E4-dsRed2或Ad-dsRed2，5天后腫瘤切片熒光顯微鏡觀察。受AdTERTE1a-E4-dsRed2感染的腫瘤顯示明顯的紅色熒光，受Ad-dsRed2感染的腫瘤僅很少的區(qū)域發(fā)出微弱的紅色熒光。
圖6是AdTERTE1a-E4-dsRed2抑制裸鼠體內(nèi)人結(jié)腸癌HCT116細胞的生長圖。
其中顯示的是各種治療情況下腫瘤的相對生長曲線。
SEQUENCE LISTING<110>川源，李倩，黃<120>有條件復制型腺病毒及其構(gòu)建方法和用途<130><160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>454<212>DNA<213>Human<400>1tcatggcccc tccctcgggt taccccacag cctaggccga ttcgacctct ctccgctggg60gccctcgctg gcgtccctgc accctgggag cgtgagcggt gcgcgggcgg ggaaacgcgg120cccagaaccc cgggtccgcc cggagcagct gcgctgtcgg gccaggccgg gctcccagtg180gattcgcggg cacagacgcc caggaccgcg cttccacgtg gcggaggact gggacccggg240caccgtcctg cccccttcac cttccagttc cgcttcttcc gcgcggaccc cgccccgtcc300cgacccttcc cgggtccccg gcccagcccc ttccgggccc tcccagccct tccccttcct360ttccgcggcc ccgccctctc ctcgcggcgc gagtttcagg cagcgctgcg tcctgctgcg420cacgtgggaa gccctggccc cggccacccc cgcg454<210>2<211>265<212>DNA<213>Human<400>2ccgttgttcc cgtcacggcc ggggcagcca attgtggcgg cgccggcggc tcgtggctct60ttcgcggcaa aaaggatttg gcgcgtaaaa gtggccggga cttgcaggca gcggcggccg120ggggcggagc gggatcgagc cctcgccgag gcctgccgcc agggcccgcg ccgccgccgc180cgcctgtcac ccgggccgcg cgggccgtga gcgtcatggc tggccggggc ccctgcgggc240ggcccatgcg cgccggcgct ggagg265<210>3<211>2024<212>DNA<213>Human<400>3ggggtgctag aggcgcacaa ggaggaaagt tagtggcttc ccttccatat cccgttcata60gcctagagca tggagcccag gtgaggaggc ctgcctggga gggggccctg agccaggaat120aaacatttac taactgtaca aagaccttgt ccctgctgct ggggagcctg ccaagtgtgg180agacaggact agtgcacgaa tgatggaaag ggagggttgg ggtgggtggg agccagcttt240tcctcataag ggccttagga caccataccg atggaactgg gggtactggg gaggaaccta300gcacctccac caaaccacag caacatgtgc tgaggatggg gctgactagg taactccctg360gagcgttttg gttaaattga gggaaattgc tgcattccca ttctcagtcc atcctccaca420gaggctatgc cagctgtagg ccagaccctg gcaagatctg ggtggataat cgactgactg480gcctcagagc cccaactttg ttccctgggg cagcctggaa atagccaggt agaaaccagc540caggaatttt tccaagctgc ttcctatatg caagaatggg atgggggcct tgggagcact600tagggaagat gtggagagtt ggaggaaaag ggggcttgga ggtaaggggg ggactggggg660aaggataggg gagaagctgt gagcctggag aagtagccaa gggatccgag ggaatggggg720agctgagacg aaacccccat ttctattcag aagatgagct atgagttggg cttgggctga780tagaagcctt ggcccctggc ctggtgggag ctctgggcag ctggctacag acgttcctta840gtgctggcgg gtaggtttga atcatcacgc aggccctggc ctcccccgcc cccaccagcc900ccctggcctc agttccctgg caacatctgg ggttgggggg gcacaggaac aagggcctct960gtctgcccag ctgcctcccc ctttgggttt tgccagactc caagtgcata cgtgggctcc1020aacaggtcct cttccctccc agtcactgac taaccccgga aacacagctt cccgttctca1080gctccacaaa cttggtgcca aattcttctc ccctgggaac atccctggac acttcccaaa1140ggaccccagt cactccagcc tgttggctgc cgctcactga tgtctgcagg ccagatgagg1200gctccagatg gcacattgtc agagggacac actgtgcccc tgtgcccagc cctgggctct1260ctgtacatga agcaactcca gtcccaaata tgtagtgttt gggaggtcag aaataggggg1320tccaggagca aactcccccc accccctttc caaagcccat tccctcttta gccagagccg1380gggtgtgcag acggcagtca ctagggggcg ctcgccacca cagggaagct gggtgaatgg1440agcgagcagc gtcttcgaga gtgaggacgt gtggtctgtg tgggtgagtg agtgtgtgcg1500tgtggggttg agggtgttgg agcggggaga agccaggggt cactccagga ttccaacaga1560tctgtgtgtc cctctcccca cccgtccctg tcggctctcc gccttcccct gcccccttca1620atattcctag caaagaggga acggctctca gccctgtccg cacgtaacct cactttcctg1680ctccctcctc gccaatgccc cgcgggcgct gtctctggac agagtttccg ggggcggatg1740ggtaattttc aggctgtgaa ccttggtggg gtcgagcttc cccttcattg cggcgggctg1800cgggccaggc ttcactgggc gtccgcaagc ccgggcccga gccgcgtgtg gaggggctga1860ggctcgcctg tccccgcccc ccgggggggc cgggggcggg gtcccggcgg ggcggagcca1920tgcgcccccc cctttttttt ttaaagtcgg ctggtagcgg ggaggatcgc ggaggcttgg1980ggcagccggg tagctcggag gtcgtggcgc tgggggctag cacc2024<210>4<211>341<212>DNA<213>Human<400>4ttaacttaat ttgagagaaa ttaattattc tgcaacttag ggacaagtca tctctttgaa60tattctgtag tttgaggaga atatttgtta tatttgcaaa ataaaataag tttgcaagtt120ttttttttct gccccaaaga gctctgtgtc cttgaacata aaatacaaat aaccgctatg180ctgttaatta ttggcaaatg tcccattttc aacctaagga aataccataa agtaacagat240ataccaacaa aaggttacta gttaacaggc attgcctgaa aagagtataa aagaatttca300gcatgatttt ccatattgtg cttccaccac tgccaataac a341<210>5<211>832<212>DNA<213>Human<400>5cccgcaaggc tcccggtgac cactagaggg cgggaggagc tcctggccag tggtggagag60tggcaaggaa ggaccctagg gttcatcgga gcccaggttt actcccttaa gtggaaattt120cttcccccac tccctccttg gctttctcca aggagggaac ccaggctgct ggaaagtccg180gctggggcgg ggactgtggg tttcagggta gaactgcgtg tggaacggga cagggagcgg240ttagaagggt ggggctattc cgggaagtgg tggggggagg gagcccaaaa ctagcaccta300gtccactcat tatccagccc tcttatttct cggccccgct ctgcttcagt ggacccgggg360agggcgggga agtggagtgg gagacctagg ggtgggcttc ccgaccttgc tgtacaggac420ctcgacctag ctggctttct tccccatccc cacgttagtt gttgccctga ggctaaaact480agagcccagg ggccccaagt tccagactgc ccctcccccc tcccccggag ccagggagtg540gttggtgaaa gggggaggcc agctggagaa caaacgggta gtcagggggt tgagcgatta600gagcccttgt accctaccca ggaatggttg gggaggagga ggaagaggta ggaggtaggg660gagggggcgg ggttttgtca cctgtcacct gctccggctg tgcctagggc gggcgggcgg720ggagtggggg gaccggtata aagcggtagg cgcctgtgcc cgctccacct ctcaagcagc780cagcgcctgc ctgaatctgt tctgccccct ccccacccat ttcaccacca cc83權(quán)利要求
1.一種有條件復制型腺病毒，其特征是其中的兩個或兩個以上的復制必需的早期基因的啟動子，分別被腫瘤細胞或腫瘤組織的啟動子所取代，它能夠特異性地在腫瘤細胞中復制，而在正常細胞或組織中基本不復制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有條件復制型腺病毒，其特征是其中的兩個或兩個以上的復制必需的早期基因的啟動子，分別被人腫瘤細胞或腫瘤組織的啟動子所取代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有條件復制型腺病毒，其特征是所述的腺病毒必需基因是腺病毒早期基因E1A，E1B，E2，或E4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有條件復制型腺病毒，其特征是所述的啟動子包括腫瘤細胞或微環(huán)境特異性的啟動子和腫瘤組織特異性啟動子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的有條件復制型腺病毒，其特征是所述的腫瘤細胞或微環(huán)境特異性的啟動子包括低氧誘導性基因的啟動子，E2F1基因啟動子，Midikin基因啟動子，端粒酶(TERT)基因啟動子和熱休克蛋白基因啟動子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的有條件復制型腺病毒，其特征是所述的腫瘤組織特異性啟動子包括前列腺組織特異性抗原基因啟動子，MUC1基因啟動子，肺細胞表面蛋白基因啟動子，α-胚胎蛋白，甲狀腺球蛋白基因啟動子，Tyrosinase基因的啟動子，神經(jīng)鞘基礎(chǔ)蛋白基因啟動子，乳球白蛋白基因啟動子，癌胚胎抗原蛋白(CEA)基因啟動子和GFAP基因的啟動子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有條件復制型腺病毒，其特征是所述腺病毒DNA的E1或E3區(qū)域嵌入抗癌基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有條件復制型腺病毒，其特征是所述抗癌基因包括細胞凋亡誘導基因，抗新生血管形成基因，自殺基因，細菌毒素基因，腫瘤抑制基因，免疫調(diào)節(jié)因子和放射線增敏基因的反義基因或干擾RNA片段。
9.根據(jù)權(quán)力要求1和2所述的有條件復制型腺病毒在制備治療腫瘤藥物中的用途。
10.根據(jù)權(quán)力要求1和2所述的有條件復制型腺病毒在制備治療人類原位或轉(zhuǎn)移腫瘤的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)學領(lǐng)域，涉及一種可以在腫瘤細胞內(nèi)選擇性復制、而在正常細胞中不復制的、用于腫瘤基因治療的腺病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明所述腺病毒，其中的兩個或兩個以上的復制必需的早期基因的啟動子，分別被腫瘤細胞或腫瘤組織的啟動子所取代，病毒能夠通過本身的細胞裂解作用，或攜帶其它治療基因，有效地殺傷腫瘤細胞而對正常的組織或細胞基本無害?？蓡为毷褂没蚺c現(xiàn)有的腫瘤治療方法結(jié)合使用，能夠顯著地提高腫瘤治療效果并減少副作用。
文檔編號C12N15/12GK1424401SQ0311475
公開日2003年6月18日 申請日期2003年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月6日
發(fā)明者李川源, 黃倩 申請人:李川源, 黃倩