專(zhuān)利名稱(chēng)：Trpc7基因第十八號(hào)外顯子多態(tài)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明還涉及分析TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的等位基因突變的方法。
背景技術(shù)：
TRPC7(transient receptor potential-related channels)是一種人腦中高表達(dá)的鈣通道蛋白。該蛋白有7個(gè)穿膜功能區(qū)。編碼此蛋白的TRPC7基因有32個(gè)外顯子。研究者認(rèn)為，該基因極有可能是一些遺傳疾病如遺傳性耳聾、Knobloch綜合癥等等的候選基因。(Genomics 1998 Nov 15；54(1)124-31)在本申請(qǐng)之前，還沒(méi)有TRPC7基因第十八號(hào)外顯子多態(tài)性的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的多態(tài)性及其檢測(cè)方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測(cè)人TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法，它包括步驟(a)確定在人TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第260位的核苷酸；(b)檢測(cè)在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。
在一優(yōu)選例中，所述的單核苷酸多態(tài)性是在第260位存在T。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離核酸，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第260位為T(mén)。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種等位基因特異性的核酸引物，其長(zhǎng)度為15-50bp，且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第260位單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其長(zhǎng)度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測(cè)含人TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第260位單核苷酸多態(tài)性。
一種試劑盒包括(1)特異性擴(kuò)增人TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的引物對(duì)，(2)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與正常的TRPC7基因第十八號(hào)外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第260位單核苷酸多態(tài)性。
另一種診斷試劑盒包括本發(fā)明上述的引物和/或本發(fā)明上述的寡核苷酸探針。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人通過(guò)廣泛而深入的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了TRPC7基因第十八號(hào)外顯子所編碼的蛋白序列中第26位His(H)->Tyr(Y)多態(tài)(即mRNA上260位C->T多態(tài)性)，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
根據(jù)對(duì)正常人TRPC7基因測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了該SNP。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該SNP導(dǎo)致26位氨基酸由His(H)->Tyr(Y)。由于這是不同性質(zhì)氨基酸的置換，因此，會(huì)導(dǎo)致TRPC7基因第十八號(hào)外顯子所編碼的蛋白的活性發(fā)生改變。
TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的cDNA序列列于SEQ ID NO1，其中開(kāi)放閱讀框?yàn)榈?85-316位，其所編碼的氨基酸序列列于SEQ ID NO2。TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的基因組序列可以從GenBank中獲得。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，有大量的分析技術(shù)可用于檢測(cè)TRPC7基因第十八號(hào)外顯子中所述位點(diǎn)是否存在單核苷酸多態(tài)性。這些技術(shù)包括(但并不限于)DNA測(cè)序、雜交測(cè)序；酶促錯(cuò)配切割、異源雙鏈分析、點(diǎn)雜交、寡核苷酸陣列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)等，變性高效液相色譜法(DHPLC)。
另一方面，本發(fā)明的檢測(cè)方法被用于評(píng)估個(gè)體患TRPC7基因第十八號(hào)外顯子相關(guān)疾病的易感性。
用于本發(fā)明的測(cè)試樣品沒(méi)有特別限制，對(duì)于檢測(cè)SNP而言，可以是從血液、組織等樣品中抽提出的DNA或mRNA。對(duì)于檢測(cè)TRPC7基因第十八號(hào)外顯子活性而言，可以任何含有TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的樣品，如血液等。
用于本發(fā)明方法或檢測(cè)試劑盒的引物和探針，根據(jù)TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的cDNA序列(SEQ ID NO1的序列)或基因組序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成即可。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1基因的抽提和測(cè)序用常規(guī)酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規(guī)PCR擴(kuò)增。引物是有義引物5’-aaagtgggag gctctattcc t-3’(SEQ ID NO3)反義引物5’-caaagatacg agaagggcat t-3’(SEQ ID NO4)擴(kuò)增出的482bp的產(chǎn)物，純化后進(jìn)行DNA測(cè)序。
實(shí)施例2SNP的獲得對(duì)TRPC7基因進(jìn)行直接測(cè)序。將測(cè)定的各樣本序列進(jìn)行比較，從而得出序列的差異，獲得SNP。
實(shí)施例3檢測(cè)試劑盒制備一檢測(cè)TRPC7基因相關(guān)疾病易感性的檢測(cè)試劑盒，其中，含有下列可擴(kuò)增出260位SNP的引物對(duì)有義引物5’-aaagtgggag gctctattcc t-3’(SEQ ID NO3)反義引物5’-caaagatacg agaagggcat t-3’(SEQ ID NO4)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物與正常對(duì)照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進(jìn)行色譜分析，可輕易地檢測(cè)出260位的C->T型SNP。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>上海人類(lèi)基因組研究中心<120>TRPC7基因第十八號(hào)外顯子多態(tài)性<130>030115<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>482<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(185)..(316)<223>
<400>1aaagtgggag gctctattcc tcaatctcat gccagctttg aacacctggg atgcagggcc 60caccagagcc ctttgcctcc agggcccacc tgggctagga caggtggagg ggcgacgggg120gacagctctg ggggctgctg tgagcaggtg gctgagatgt gtgtgcttct gcccggcggc180cagg ctc atc ccg gcg acg ctg tac ccc ggg cgc gtc atc ctc tct ctg 229Leu Ile Pro Ala Thr Leu Tyr Pro Gly Arg Val Ile Leu Ser Leu1 5 10 15gac ttc atc ctg ttc tgc ctc cgg ctc atg cac att ttt acc atc agt 277Asp Phe Ile Leu Phe Cys Leu Arg Leu Met His Ile Phe Thr Ile Ser20 25 30aag acg ctg ggg ccc aag atc atc att gtg aag cgg atg gtaagggggc 326Lys Thr Leu Gly Pro Lys Ile Ile Ile Val Lys Arg Met35 40gggggcaccg gctccatcgc ggcctgcagc ccagggtggg cctcggggag ggcaggcccc386ttgccagtgg ctcggactgg ggcttaaaca cacctgtagg ttccccgtcc ctgctttgcc446ccttgggctc ccaagaatgc ccttctcgta tctttg 482<210>2<211>44
<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Leu Ile Pro Ala Thr Leu Tyr Pro Gly Arg Val Ile Leu Ser Leu Asp1 5 10 15Phe Ile Leu Phe Cys Leu Arg Leu Met His Ile Phe Thr Ile Ser Lys20 25 30Thr Leu Gly Pro Lys Ile Ile Ile Val Lys Arg Met35 40<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3aaagtgggag gctctattcc t 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4caaagatacg agaagggcat t 2權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)人TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，它包括步驟(a)確定在人TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第260位的核苷酸；(b)檢測(cè)在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是在第260位存在T。
3.一種分離核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第260位為T(mén)。
4.一種等位基因特異性的核酸引物，其特征在于，其長(zhǎng)度為15-50bp，且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第260位單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
5.一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其特征在于，其長(zhǎng)度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測(cè)含人TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第260位單核苷酸多態(tài)性。
6.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括(1)特異性擴(kuò)增人TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的引物對(duì)，(2)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與正常的TRPC7基因第十八號(hào)外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第260位單核苷酸多態(tài)性。
7.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括權(quán)利要求4所述的引物和/或權(quán)利要求5所述的寡核苷酸探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。本發(fā)明提供了分析TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的SNP或其活性的方法。本發(fā)明的SNP是SEQ ID NO1所示序列的人TRPC7基因第十八號(hào)外顯子的第260位的C－＞T多態(tài)性。該SNP導(dǎo)致編碼蛋白第26位發(fā)生His(H)－＞Tyr(Y)改變，從而改變了蛋白活性。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1519373SQ03115068
公開(kāi)日2004年8月11日 申請(qǐng)日期2003年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月22日
發(fā)明者黃薇, 施錦繡, 奚慧峰, 金力, 薇 黃 申請(qǐng)人:上海人類(lèi)基因組研究中心