專(zhuān)利名稱(chēng)：Prkcbp2基因第一號(hào)外顯子多態(tài)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明還涉及分析PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的等位基因突變的方法。
背景技術(shù)：
PRKCBP2，即蛋白激酶C結(jié)合蛋白2(Protein Kinase C Binding Protein 2)，又名少突細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄因子2(Oligodendrocyte lineage transcription factor 2，Olig2 or Oligo2)，是一種基本的“螺旋-環(huán)形-螺旋”(Helix-Loop-Helix，HLH)轉(zhuǎn)錄因子。已經(jīng)有研究者指出，該轉(zhuǎn)錄因子在神經(jīng)上皮中少突細(xì)胞前體形成的區(qū)域特異性表達(dá)，以及在少突細(xì)胞前體內(nèi)也有特異性表達(dá)。從而，解決了先前神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤無(wú)法用細(xì)胞形態(tài)學(xué)或者其它傳統(tǒng)標(biāo)記方法標(biāo)記的問(wèn)題，這種轉(zhuǎn)錄因子可能被用作少突細(xì)胞腫瘤的理想標(biāo)記，用于檢測(cè)或者診斷腦部腫瘤。(Proc.Nat.Acad.Sci.9810851-10856，2001)。
在本申請(qǐng)之前，還沒(méi)有PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子多態(tài)性的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的多態(tài)性及其檢測(cè)方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測(cè)人PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法，它包括步驟(a)確定在人PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第353位的核苷酸；(b)檢測(cè)在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。
在一優(yōu)選例中，所述的單核苷酸多態(tài)性是在第353位存在G。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離核酸，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第353位為G。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種等位基因特異性的核酸引物，其長(zhǎng)度為15-50bp，且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第353位單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其長(zhǎng)度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測(cè)含人PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的SEQ IDNO1所示序列中第353位單核苷酸多態(tài)性。
一種試劑盒包括(1)特異性擴(kuò)增人PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的引物對(duì)，(2)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與正常的PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第353位單核苷酸多態(tài)性。
另一種診斷試劑盒包括本發(fā)明上述的引物和/或本發(fā)明上述的寡核苷酸探針。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人通過(guò)廣泛而深入的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子所編碼的蛋白序列中第118位Thr(T)->Ala(A)多態(tài)(即mRNA上353位A->G多態(tài)性)，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
根據(jù)對(duì)正常人PRKCBP2基因測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了該SNP。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該SNP導(dǎo)致第118位氨基酸由Thr(T)->Ala(A)。由于這是不同性質(zhì)氨基酸的置換，因此，會(huì)導(dǎo)致PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子所編碼的蛋白活性發(fā)生改變。
PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的cDNA序列列于SEQ ID NO1，其中開(kāi)放閱讀框?yàn)榈?-517位，其所編碼的氨基酸序列列于SEQ ID NO2。PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的基因組序列可以從GenBank中獲得。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，有大量的分析技術(shù)可用于檢測(cè)PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子中所述位點(diǎn)是否存在單核苷酸多態(tài)性。這些技術(shù)包括(但并不限于)DNA測(cè)序、雜交測(cè)序；酶促錯(cuò)配切割、異源雙鏈分析、點(diǎn)雜交、寡核苷酸陣列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)等，變性高效液相色譜法(DHPLC)。
另一方面，本發(fā)明的檢測(cè)方法被用于評(píng)估個(gè)體患PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子相關(guān)疾病的易感性。
用于本發(fā)明的測(cè)試樣品沒(méi)有特別限制，對(duì)于檢測(cè)SNP而言，可以是從血液、組織等樣品中抽提出的DNA或mRNA。對(duì)于檢測(cè)PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子活性而言，可以任何含有PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的樣品，如血液等。
用于本發(fā)明方法或檢測(cè)試劑盒的引物和探針，根據(jù)PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的cDNA序列(SEQ ID NO1的序列)或基因組序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成即可。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1基因的抽提和測(cè)序用常規(guī)酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規(guī)PCR擴(kuò)增。引物是有義引物5’-caccaagaag gacaagaagc a-3’(SEQ ID NO3)反義引物5’-cagacggaga cttgagtagg c-3’(SEQ ID NO4)擴(kuò)增出的518bp的產(chǎn)物，純化后進(jìn)行DNA測(cè)序。
實(shí)施例2SNP的獲得對(duì)PRKCBP2基因進(jìn)行直接測(cè)序。將測(cè)定的各樣本序列進(jìn)行比較，從而得出序列的差異，獲得SNP。
實(shí)施例3檢測(cè)試劑盒制備一檢測(cè)PRKCBP2基因相關(guān)疾病易感性的檢測(cè)試劑盒，其中，含有下列可擴(kuò)增出353位SNP的引物對(duì)有義引物5’-caccaagaag gacaagaagc a-3’(SEQ ID NO3)反義引物5’-cagacggaga cttgagtagg c-3’(SEQ ID NO4)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物與正常對(duì)照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進(jìn)行色譜分析，可輕易地檢測(cè)出353位的A->G型SNP。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>上海人類(lèi)基因組研究中心<120>PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子多態(tài)性<130>030115<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>518<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(2)..(517)<223>
<400>1c acc aag aag gac aag aag caa atg aca gag ccg gag ctg cag cag ctg 49Thr Lys Lys Asp Lys Lys Gln Met Thr Glu Pro Glu Leu Gln Gln Leu1 5 10 15cgt ctc aag atc aac agc cgc gag cgc aag cgc atg cac gac ctc aac 97Arg Leu Lys Ile Asn Ser Arg Glu Arg Lys Arg Met His Asp Leu Asn20 25 30atc gcc atg gat ggc ctc cgc gag gtc atg ccg tac gca cac ggc cct 145Ile Ala Met Asp Gly Leu Arg Glu Val Met Pro Tyr Ala His Gly Pro35 40 45tcg gtg cgc aag ctt tcc aag atc gcc acg ctg ctg ctg gcg cgc aac 193Ser Val Arg Lys Leu Ser Lys Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Arg Asn50 55 60tac atc crc atg ctc acc aac tcg ctg gag gag atg aag cga ctg gtg 241Tyr Ile Leu Met Leu Thr Asn Ser Leu Glu Glu Met Lys Arg Leu Val65 70 75 80agc gag atc tac ggg ggc cac cac gct ggc ttc cac ccg tcg gcc tgc 289Ser Glu Ile Tyr Gly Gly His His Ala Gly Phe His Pro Ser Ala Cys85 90 95ggc ggc ctg gcg cac tcc gcg ccc ctg ccc gcc gcc acc gcg cac ccg 337Gly Gly Leu Ala His Ser Ala Pro Leu Pro Ala Ala Thr Ala His Pro100 105 110
gca gca gca gcg cac acc aca cat cac ccc gcg gtg cac cac ccc atc 385Ala Ala Ala Ala His Thr Thr His His Pro Ala Val His His Pro Ile115 120 125ctg ccg ccc gcc gcc gca gcg gct gct gcc gcc gct gca gcc gcg gct 433Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala130 135 140gtg tcc agc gcc tct ctg ccc gga tcc ggg ctg ccg tcg gtc ggc tcc 481Val Ser Ser Ala Ser Leu Pro Gly Ser Gly Leu Pro Ser Val Gly Ser145 150 155 160atc cgt cca ccg cac ggc cta ctc aag tct ccg tct g518Ile Arg Pro Pro His Gly Leu Leu Lys Ser Pro Ser165 170<210>2<211>172<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Thr Lys Lys Asp Lys Lys Gln Met Thr Glu Pro Glu Leu Gln Gln Leu1 5 10 15Arg Leu Lys Ile Asn Ser Arg Glu Arg Lys Arg Met His Asp Leu Asn20 25 30Ile Ala Met Asp Gly Leu Arg Glu Val Met Pro Tyr Ala His Gly Pro35 40 45Ser Val Arg Lys Leu Ser Lys Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Arg Asn50 55 60Tyr Ile Leu Met Leu Thr Asn Ser Leu Glu Glu Met Lys Arg Leu Val65 70 75 80Ser Glu Ile Tyr Gly Gly His His Ala Gly Phe His Pro Ser Ala Cys85 90 95Gly Gly Leu Ala His Ser Ala Pro Leu Pro Ala Ala Thr Ala His Pro
100 105 110Ala Ala Ala Ala His Thr Thr His His Pro Ala Val His His Pro Ile115 120 125Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala130 135 140Val Ser Ser Ala Ser Leu Pro Gly Ser Gly Leu Pro Ser Val Gly Ser145 150 155 160Ile Arg Pro Pro His Gly Leu Leu Lys Ser Pro Ser165 170<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3caccaagaag gacaagaagc a 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4cagacggaga cttgagtagg c 2權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)人PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，它包括步驟(a)確定在人PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第353位的核苷酸；(b)檢測(cè)在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是在第353位存在G。
3.一種分離核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第353位為G。
4.一種等位基因特異性的核酸引物，其特征在于，其長(zhǎng)度為15-50bp，且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第353位單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
5.一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其特征在于，其長(zhǎng)度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測(cè)含人PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第353位單核苷酸多態(tài)性。
6.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括(1)特異性擴(kuò)增人PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的引物對(duì)，(2)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與正常的PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第353位單核苷酸多態(tài)性。
7.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括權(quán)利要求4所述的引物和/或權(quán)利要求5所述的寡核苷酸探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。本發(fā)明提供了分析PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的SNP或其活性的方法。本發(fā)明的SNP是SEQ ID NO1所示序列的人PRKCBP2基因第一號(hào)外顯子的第353位的A－＞G多態(tài)性。該SNP導(dǎo)致編碼蛋白第118位發(fā)生Thr(T)－＞Ala(A)改變，從而改變了蛋白活性。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1519377SQ0311507
公開(kāi)日2004年8月11日 申請(qǐng)日期2003年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月22日
發(fā)明者黃薇, 施錦繡, 奚慧峰, 金力, 薇 黃 申請(qǐng)人:上海人類(lèi)基因組研究中心