專利名稱：一種基因組dna為模板的pcr方法及其反應液的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學技術，特別是涉及對基因組DNA的聚合酶鏈式反應的方法及其反應液。
背景技術：
聚合酶鏈反應(PCR)是一種簡單，快速，靈敏和專一的擴增特定DNA的方法。完成PCR反應只需普通的生化試劑和一臺能在三個不同溫度循環(huán)的儀器即可，與分子生物學其他技術相比可謂簡單之極。PCR反應的每一循環(huán)通常只需2-3分鐘，能在1-2小時內完成全部反應，所需時間是其他基因擴增方法的幾十分之一。PCR反應產物呈指數(shù)方式累積，理論上經25循環(huán)能放大800萬倍(223)能檢出僅幾個拷貝的基因可謂非常靈敏。PCR的這三項優(yōu)點幾乎無可挑剔也非其他方法能匹比。PCR能從成千上萬個基因中擴增出特定的DNA片段的確也稱得上專一。但是，標準PGR方法在擴增目標基因產物的同時往往伴隨形成非專一產物，有時嚴重到比目標產物更強甚至抑制了目標產物的形成。所以，從擴增產物的純一性角度而言，標準PCR方法在專一性方面還存在著嚴峻的問題。正因為非專一擴增產物相當普遍地存在，就使得在PCR后用電泳分離或探針雜交等方法來鑒別和檢測目標擴增產物成為常規(guī)和必要。這種復雜的PCR后檢測步驟往往比PCR本身耗費多得多的時間和勞力，極大影響了PCR在醫(yī)學核酸檢測上的廣泛應用。
非專一擴增產物的形成是由于在并非十分嚴謹?shù)臏囟龋缭谝镌O計軟件推薦的最適溫度下退火，引物不僅與完全匹配的目標模板退火，也能與有一些錯配甚至是有嚴重錯配的非目標模順序退火從而引發(fā)DNA聚合酶啟動，形成非專一的半擴增鏈和最初的非專一擴增產物。由于最初形成的非專一擴增產物的二側已與引物完全匹配，在隨后的循環(huán)中非專一產物就能以與目標擴增產物一樣甚至更高的效率繼續(xù)擴增。試驗表明在較低的退火溫度下，即使在引物的3’端第一個核苷酸發(fā)生錯配仍能完成擴增；在引物不同部位有連續(xù)的或間隔的2，3，4，5個或更多的錯配也能完成擴增。Scott等(Protocols for GeneAnalysis，Methods in Molecular Biology，1991，P307)報導當引物堿基有50％錯配包括3’端第4位和第10-14位的錯配也能完成擴增。為了減少和消除非專一擴增產物提高PCR專一性，從而能簡化PCR后的檢測步驟和產物分離過程擴大PCR的應用，已發(fā)展了多種技術和方法，但都有較大局限和缺陷。
各種各樣的引物設計軟件能根據(jù)理論計算，各種經驗和試驗數(shù)據(jù)從輸入的順序中尋找出那些3’端堿基內部穩(wěn)定性合適，與模板順序假性結合率低于一定數(shù)值的引物。但是，各種軟件只能在數(shù)千堿基的模板順序范圍內進行比較和篩選，而人和其他高等生物基因組DNA的總順序高達幾十億堿基，輸入軟件進行分析的順序的堿基數(shù)只是引物在反應中實際面對的順序的十萬分之一。所以，引物軟件選擇的高嚴謹性引物確實克服了引物3’端互補和發(fā)夾結構造成的弊端，但往往不能避開與非目標順序有較高的匹配，從擴增產物專一性角度講各種引物設計軟件篩選的優(yōu)選引物帶有相當大的隨機性和盲目性。即任一種原件不能解決標準PCR非專一產物的問題。
不少研究者用BLAST對所設計的引物和整個基因庫所儲存的順序進行同源性分析，用以進一步判斷引物在與非目標順序假性結合方面的優(yōu)劣。但是對于20堿基左右的寡核苷酸順序，BLAST所指出的同源順序遠遠少于實際上可能與引物退火的順序，極大影響了該方法實際使用價值。
各種熱啟動PCR技術包括在低溫下配制反應溶液，將DNA聚合酶等和反應液的其他成分用低熔點石蠟分開，用含抗體的Taq酶和用熱激活酶等方法能有效防止那些在室溫下引物與非目標順序結合引發(fā)反應而導至的非專一產物，但不能克服在通常PCR反應退火溫度下仍與引物結合的非目標順序的干擾。
用有溫度梯度功能的基因擴增儀來確定PCR反應的最高允許退火溫度，然后選擇在既能高效高擴增而又不形成非專一條帶的退火溫度下進行擴增常常能得到理想的效果。但是符能合要求的最適溫度范圍往往很窄，有時則找不到一個合適的退火溫度能完全消除非專一產物的形成。
以上方法都是從改進引物設計和反應條件角度來提高PCR的專一性。本發(fā)明則采用了與上面各種方法完全不同的思路和角度。本發(fā)明用對擴增產物順序不切割的一種或幾種限制性核酸內切酶，特別是識別順序為4個堿基的內切酶，將基因組DNA切割成短片段后再進行PCR。該方法簡單能普遍應用，能有效減少或完全消除在通常PCR反應條件下形成的非專一擴增產物，應用前景廣泛。
發(fā)明構思本發(fā)明基于以下幾點原理和事實1.非專一擴增產物形成的必要條件之一是在一段核酸順序的上下游與正反引物分別有較高程度的匹配。如果用限制性核酸內切酶在正反引物的假性結合部位之間將該核酸順序切割為二個或更多的片段，則正反引物雖能分別退火卻不能以該核酸順序為模板完成擴增，原來可能形成的非專一產物就流產。
2.非專一擴增產物形成的另一必要條件是在既定的延伸時間內完成擴增鏈的延伸。標準PCR的延伸反應時間通常為30秒至2分種，無論使用那一種DNA聚合酶在該時間內最多能延伸2000堿基左右。出現(xiàn)與正反引物高度匹配順序的幾率與順序的長短直接有關，順序較短如小于500堿基，在其上下游同時與正反引物有高度匹配的可能性就相當?shù)?。順序較長如超過幾千甚至幾萬堿基，在其上下游同時與正反引物有高度匹配的可能性就較高，但因為正反引物相隔的距離太長不可能在30秒至2分鐘內完成鏈的延伸。所以，標準PCR的非專一產物長度實際上主要落在500至2000堿基的范圍內。如果將基因組DNA切割成小于500-2000堿基長的片段則形成非專一產物的機會就大大減小。
3.對每一個指定的識別順序為4，5或6個堿基的限制性核酸內切酶，平均每隔256，1024或4096堿基就會出現(xiàn)一次，換言之，理論上用一個上述內切酶可將基因組DNA切割成平均長度為256，1024或4096堿基的片段。同時使用二個或更多的內切酶特別是識別順序為4個堿基的內切酶，就能使總順序為幾十億堿基對平均長度為5萬堿基的DNA原始模板切割成平均長度低于幾百堿基的片段。假定基因組DNA總順序為30億堿基對則用一個識別順序為4個堿基的酶切割平均能產生1000萬以上的小片段，在這1000萬片段中那些本來上下游二側存在與正反引物高度匹配順序，因而可能形成非專一產物的機會因順序被內切酶切割而阻斷了。
4.至今已商業(yè)化的識別專一性不同的限制性核酸內切酶有200多種，其中，識別順序為4個堿基的也有20多種，概率計算和實際測試均表明在標準PCR擴增產物長度為150-800堿基范圍內，幾乎每一擴增片段都能找到一種或幾種識別順序為4個堿基的內切酶對該擴增順序不切割，使用這些內切酶就能在將基因組DNA切割成小片段的同時保持目標基因片段完整。
5.從技術層面看限制性核酸內切酶反應和PCR反應的條件有相當程度的相互兼容性，所以，基因組DNA經內切酶處理后可直接用于PCR反應，甚至可在PCR反應管內先進行酶切然后轉換至PCR反應能以單管操作完成全部反應。本發(fā)明的簡便特點使他有廣泛實際應用價值。

發(fā)明內容
發(fā)明所要解決的技術問題本發(fā)明所要解決的技術問題是提供用限制性核酸內切酶水解的基因組DNA作模板的PCR方法，以克服標準PCR方法在擴增目標基因產物的同時往往伴隨形成非專一產物、抑制目標產物形成的缺陷，避免在PCR后用電泳分離或探針雜交等方法來鑒別和檢測目標擴增產物的過程中引入不確定的誤差因素。
技術方案本發(fā)明的以基因組DNA為模板的聚合酶鏈式反應方法，依次包括如下步驟(1)選擇對目標擴增順序沒有切割位點的限制性內切酶對模板DNA進行酶切；(2)模板變性；(3)引物退火；(4)DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈；(5)步驟(2)-(4)循環(huán)進行擴增反應；上述限制性內切酶采用識別順序為4-6個堿基的酶，優(yōu)選識別順序為4個堿基的酶。可以在同一酶切反應中使用1-5種限制性內切酶，優(yōu)選同時使用2-4種限制性內切酶。
酶切反應完成后移出模板DNA，在另一管中進行PCR，也可以在同一反應管內直接繼續(xù)進行PCR反應。
酶切反應完成后可采用加熱的方法滅活限制性內切酶，比如65-95℃加熱20分鐘，也可不加熱直接接續(xù)PCR。
在采用單一反應管方法完成本發(fā)明酶切和PCR反應的技術方案中，酶切反應液與PCR反應液相同；酶的總用量體積為反應體積的1-10％。
進行本發(fā)明所述的酶切模板DNA和聚合酶鏈式反應的反應液，其包含如下組分PCR緩沖液、4種脫氧核糖核苷酸、耐熱DNA聚合酶、限制性內切酶和模板DNA，其中內切酶的總用量體積為反應體積的1-10％。
為理解上述技術方案的操作過程及其原理，現(xiàn)就幾個關鍵步驟說明如下第一，首先確定對目標擴增順序沒有切割位點的所有限制性內切酶，特別是識別順序為4個堿基的酶。
對于每一個引物確定、順序已知的擴增產物，用限制性內切酶圖譜分析軟件如WebCutter2.0(www.firstmarket.com/cutter/cut2.html)或NEBcutter1.0(www.neb.com)等列出對目標順序不切割的酶，特別是識別順序為4個堿基的那些酶。表1列出16種識別順序為4個堿基的已商品化的限制性內切酶的主要特征。根據(jù)概率任何一個指定的4堿基順序在核酸序列中出現(xiàn)的平均頻率是1/256。對一個指定的識別順序為4個堿基的內切酶和一個指定的256堿基核酸序列，最大的可能是有一個切點，但也可能沒有切點或有2個、3個或更多的切點。我們用New-England-Labs提供的軟件(www.neb.com)測試表1所列16種酶對從人肌動球蛋白基因(基因庫編號BC016045)隨機選取的9個長度為128堿基的核酸片段，從人腫瘤抑制基因P53的第二外顯子(基因庫編號AF136270)中隨機選取的9個長度為256堿基的核酸片段，和從人RNA結合蛋白2基因全mRNA(基因庫編號NM 006267)中隨機選取的9個長度為512堿基的核酸片段進行了測試，切割情況的統(tǒng)計結果例于表2。
表1.16種識別順序為4個堿基的限制性內切酶

表2.16種酶對隨機選擇的核酸片段的切割情況

表2說明當測試核酸順序長度在500堿基以下時，至少有2個列于表1的內切酶對測試順序不切割，平均有5個以上的酶對測試順序不切割。核酸順序越短不切割順序的酶就越多。
第二，用上述內切酶特別是識別順序為4個堿基的酶來分解模板DNA。
用一個或幾個對目標擴增順序不切割的酶或他們的同功酶與模板DNA保溫2小時左右。目標擴增順序DNA被完整保留下來而基因組DNA的其他部位則被切成大小不等的小片段。我們用NEB提供的軟件測試了表1所列16種酶對Lamda噬菌體的切割情況分析結果列于表3，表中各個豎項的數(shù)據(jù)均以數(shù)值的大小為序列出。
表3.16種酶對Lamda噬菌體的切割

表3說明識別順序為4個堿基的酶能將含5萬堿基對的Lamda噬菌體切割成幾十至幾百個片段，平均值為196個片段，與按隨機原則計算的片段數(shù)189(48,506/256)非常接近。以人基因組順序為30億堿基對來計算則一個識別順序為4個堿基的內切酶酶能將基因組DNA平均分解成1千余萬個片段。通過酶切阻斷了那些本來在這些片段的上下游與正、反引物均有較高互補順序形成非專一產物的機會。基因組DNA酶切后的殘留片段大多數(shù)是短片段，與正反引物均有較高互補的可能性就相當?shù)?。?顯示殘留片段中大于500堿基的片段平均占總片段數(shù)的15％，而大于1000堿基的片段平均只占5％。
第三，確定同時使用2種或2種以上的限制性內切酶。
從宏觀來看各種內切酶的切割位點的出現(xiàn)是彼此獨立互不關聯(lián)的。所以，如果同時用2，3，4或5種的上述內切酶來切割基因組DNA，目標擴增順序仍能不受任一種酶切割而保持其完整，但基因組DNA中的非目標順序則被切割成更大量的更短的片段，這些小片段成為非專一擴增的模板的可能性就更小。按數(shù)學推算如果使用2至5種酶來分解基因組DNA，大于500堿基的片段比例將遠小于0.1％，而大于1000堿基的片段的比例將小于0.001％。為了達到較好的效果通常使用2-5種內切酶，這些酶可以分別在其最適條件下先后作用。為了使操作簡便，優(yōu)選使用幾種酶混合同時作用的方法。下述事實使幾種酶同時使用具有普遍的現(xiàn)實可行性。1.許多限制性內切酶有識別順序相同的各種同功酶(表1)，同功酶之間的最適作用緩沖液種類可能不同，這就提供了較多的選擇機會。2.雖然每一種內切酶都有其最適緩沖液種類，但是在其他種類緩沖液中往往也顯示100％的活力或相當高的活力(表4)。3.通過增加酶量或延長反應時間能使一些在非最適緩沖液中作用的酶也完成對模板的完全切割。
表4列出16種識別順序為4個堿基的內切酶的技術數(shù)據(jù)。
表4.16種酶的主要技術數(shù)據(jù)

表4說明對任何一個指定的擴增產物通過選擇酶及他們的同功酶，不難找到一種緩沖液使所使用的2，3，4或5種不同識別順序的酶均顯示最大的或較高的活力。從本發(fā)明的原理看即使某一種或幾種酶在水解模板DNA時未能發(fā)揮出最佳效果，實際上對克服和消除非專一產物也不一定有負面影響。
第四，混合使用的酶的數(shù)量的限制。
理論上對混合使用的酶的數(shù)量沒有限制，但是從必要性、方便性和效果等方面考慮，一般混合使用的酶不宜超過5種。為了保持限制性核酸內切酶在儲存期間的穩(wěn)定性，商品化內切酶溶液均含有50％的甘油，而當酶切液甘油濃度大于5％時，一部分限制性內切酶可能會切割正常切點以外的位點，即出現(xiàn)所謂的“星活力”。為了避免這種現(xiàn)象發(fā)生導至可能對目標模板的切割，無論使用一種還是幾種內切酶，酶的總用量體積應不超過反應體積的10％。表5列出當使用的酶從1-5種時反應液的配制。其中DNA的加量根據(jù)模板DNA的濃度和PCR反應液所需濃度決定。以高等生物基因組DNA為模板時，模板DNA的加量通常為每50微升PCR反應液0.2-1微克。表5列出使用1-5種內切酶時酶切溶液的配制。
表5.內切酶反應液的配制


第五，酶切反應液完成后可以直接作為PCR反應的模板。
含基因組DNA酶切片段的反應液可以在65℃保溫20分種使酶失活，或者直接加入PCR反應液啟動反應。表6列出有代表性的PCR反應緩沖液組成和NEB的4種緩沖液做成，及按表5操作時對PCR反應液的影響。
表6.PCR和酶切反應液組成

表6表明PCR反應緩沖液的強度比從酶切反應帶入的強4-20倍，pH不會受到可檢測的或顯著的影響。酶切反所帶的鎂離子、鉀離子和巰基乙醇濃度低而且對PCR沒有負面影響。Promega和Roche等公司所推薦的各種緩沖液的組成與表6所述大同小異，也均可在酶切反應后直接用于PCR反應。不同公司產品的內切酶溶液中還含有50-300mM的鉀或鈉鹽，10mM緩沖液，0.1mMEDTA和200-500ng/ml的白蛋白。在酶總用量不超過酶切反應液體積10％的情況下，對PCR反應沒有負面影響。
第六，酶切反應可直接在PCR反應液中進行。
在PCR克隆和PCR-限制性內切長度多態(tài)性(PCR-RFLP)等的研究中常常在PCR反應后直接加限制性內切酶來分解擴增片段，說明內切酶也能在PCR反應液中分解DNA。NEB公司的研究指出在20微升含1微克DNA，1單位Vent-DNA聚合酶，dNTPs和緩沖液(pH8.8)等各種成份的PCR反應液中加5U的限制性內切酶，在經測定的近百種內切酶包括列于表1的13種酶中有8種能使DNA被完全分解，另5種酶也能將約50％的DNA分解。在含各種成份包括基因組DNA，引物和含抗體的TaqDNA聚合酶的PCR反應液種加入一種或幾種選定的內切酶，先在基因擴增儀中37℃保溫2小時然后切換至通常的PCR反應程序，即能完成酶切和PCR反應。
有益效果1.本發(fā)明所需試劑有商品出售操作簡單也不需要摸索反應條件，但能有效減少或消除標準PCR方法通常會形成的非專一產物。
2.本發(fā)明能廣泛普遍被應用，既可在標準PCR擴增產物長度范圍的150-800堿基內應用，又可擴展至更短或更長的產物。應用于長擴增產物時應考慮引物的選擇使擴增產物順序內含一定數(shù)量的不切割順序的限制性核酸內切酶。
3.本發(fā)明對引物設計和PCR反應條件沒有特殊要求，只在原有的引物和PCR條件下加入酶切步驟即可。
4.本發(fā)明對與其他各種改善標準PCR專一性的技術如熱啟動，嵌套式PCR等完全兼容。應用本發(fā)明不影響其他新技術的應用又可在各項新技術上增加本技術。
5.本發(fā)明提高PCR專一性是基于一種隨機性的原則，除了需要知道目標擴增產物的順序外，不需要考慮擴增對象的其他各種背景和數(shù)據(jù)。
6.長度為幾萬堿基的大分子DNA在變性步驟后成為單鏈DNA，在與引物退火或自身退火之間會有復雜的空間構型。PCR反應之初在DNA聚合酶和引物與目標DNA的退火部位之間可能存在位阻現(xiàn)象使擴增的起始受到抑制。但DNA聚合酶能在一些與引物雖然不完全匹配但無空間位阻的非目標順序結合部位引發(fā)擴增。限制性內切酶將大分子核酸切割成小片段，使引物的目標和與非目標順序的結合部位充分暴露，從而充分發(fā)揮引物與完全匹配順序結合的優(yōu)勢。
具體實施例方式
實施例1.
非專一產物形成與模板DNA的復雜性有關。
本實施例使用從人肌動球蛋白基因(1841堿基對，基因庫編號BC016045)中找到的特殊引物進行試驗。正反引物完全相同引物順序為5’GCCCAGCGGGTGACGATGCC 3’，引物的解鏈溫度82.9℃，3’端堿基互補為2個核苷酸，能量為每克分子-3.1千卡，引物3’端堿基內部穩(wěn)定度為9.6。引物與人肌動球蛋基因的第134-153順序有16個匹配堿基和4個錯配堿基，引物與模板的結合效率為349點。該引物同時又與人肌動球蛋基因的第295-314位的互補順序有17個匹配堿基和3個錯配堿基，引物與模板的結合效率為356點。使用該引物以互補DNA得到的擴增產物長度為181堿基，由于擴增產物順序在同一外顯子內，所以用基因組DNA為模板能得到相同長度的擴增產物。本實施例用此引物分別以人基因組DNA和由人組織總RNA以poly(dT)為引物反轉錄得到的互補DNA為模板，在完全相同條件下作PCR比較非專一產物的形成。人基因組DNA為Roche公司產品每微升0.2微克。總RNA為ClonTech產品每微升1.0微克，用該公司的反轉錄試劑盒合成互補DNA。無論基因組DNA還是互補DNA均用ClonTech公司的Advantage2-PCR試劑盒進行擴增。每50微升反應液加基因組DNA或互補DNA5微升。引物終濃度為0.8uM。PCR反應參數(shù)首次變性94℃1分鐘，循環(huán)變性94℃10秒，退火52-72℃1分鐘，延伸72℃1分鐘，循環(huán)數(shù)30，每管反應體積為5微升。試驗結果列于表7。
表7.實施例1試驗結果

##多少表示目標條帶的強度++多少表示非專一條帶數(shù)的多少-表示沒有條帶互補DNA不含有不表達的基因順序，也不含內含子順序，其總順序量約為基因組DNA的十分之一。表7說明以互補DNA為模板時由于模板DNA比基因組DNA簡單目標模板相對豐度又較高，在所試的寬達20℃的退火溫度范圍內均能有效擴增。非專一產物隨溫度升高而降低，當退火溫度大于約67℃時非專一產物完全消失。當退火溫度較低時雖有大量非專一產物但均不競爭抑制目標產物的擴增。以基因組DNA為模板時在同樣反應件下非專一產物合成要嚴重得多。在較低退火溫度下大量的非專一產物的形成甚至完全抑制了目標產物的擴增，在較高退火溫度下非專一產物擴增有所降低，但仍強于目標擴增產物。這一結果提示降低基因組DNA的復雜性有可能改善PCR的專一性。
實施例2.
各種限制性內切酶對基因組DNA的酶切試驗。
選擇了若干種識別順序為4-6堿基的酶單獨、2種或3種酶混合分解基因組DNA，每一反應管總反應體積10微升，每管加基因組DNA2微升內含人和小鼠基因組DNA各0.5微克，無離子水6微升，緩沖液1微升。緩沖液種類和內切酶的加量列于表8。在37℃保溫2小時用1％Agarose凝膠電泳然后用溴乙錠染色，用圖象分析儀測定不同區(qū)域的掃描強度分布，測試和計算結果結果列于表9。
表8.限制性內切酶分解基因組DNA的反應液組成

表9.實施例2試驗結果

*接近點樣槽區(qū)域的核酸**以掃描區(qū)域的強度除以該區(qū)域核酸長度的算術平均值來計算表9說明用識別順序為6個堿基的BamHI來分解基因組DNA，分解產物主要是較大分子DNA，1000堿基以上片段的掃描強度占總強度的90％。用識別順序為4個堿基的內切酶分解DNA，則切割后主要是小分子DNA，小于1000堿的DNA的掃描強度占總強度的40-60％。幾個酶同時作用則所產生的片段更小，以Sacll(識別順序6個堿基〕和3個識別順序為4個堿基的酶聯(lián)合作用，小于500堿基的片段數(shù)占總片段數(shù)的95％。
實施例3.
基因組DNA酶切后PCR擴增人甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因。
從人甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(1283堿基對，基因庫編號XM 006959〕借助引物設計軟件得到一對嚴謹性良好的引物，其順序和特性列于表10和11，擴增產物的長度為348堿基。
表10.實施例3引物順序

表11.實施例3引物特性

用NEBCutter1.0得到對該擴增產物不切割的識別順序為4個堿基的內切酶有Bfal，Taql，Hhal，Mbol，Rsal，和Tru9l。本例使用后4種酶混合來分解人基因組DNA，酶分解液組成列于表12。
表12.實施例3酶分解液組成

將上述反應液在37℃保溫2小時，然后65℃加熱20分鐘使酶失活，對照組每50微升PCR反應液加基因組DNA5微升，試驗組加上述酶分解液10微升，內含相當于5微升的基因組DNA。PCR反應液的組成和反應條件與實施例1相同，正反引物濃度均為0.4uM。PCR結束后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳，用溴乙錠染色后用圖像掃描儀分析目標條帶和非專一條帶的強度，試驗結果列于表13。
表13.實施例3試驗結果

-沒有目標擴增條帶上述結果說明隨退火溫度升高非專一產物減少，當退火溫度大于69℃時沒有非專一產物條帶，但目標產物條帶也消失。退火溫度為52-67℃時，常規(guī)方法的對照組在500-1500堿基區(qū)域內有嚴重的非專一產物形成，在低退火溫度下，非專一產物的總量甚至是目標產物的幾倍，基因組DNA經內切酶水解后在所試退火溫度范圍內非專一產物相對量均比對照組顯著減少。當退火溫度較高時，長度為1000-1500堿基的非專一產物幾乎完全消失，突顯了內切酶水解對阻斷該區(qū)段長度非專一產物的作用。
實施例4.
基因組酶切后擴增人beta-2-腎上腺素受體基因擴增。
從人的beta-2-腎上腺素受體基因(3451堿基對，基因庫編號M15169〕借助引物設計軟件得到一對嚴謹性良好的引物，其順序和特性列于表14和15，擴增產物的長度為252堿基。
表14.實施例4引物順序

表15.實施例4引物特性

用WebCutter2.0得到不切割目標順序的酶譜，分別選用2-5種酶來分解基因組DNA。酶分解液的配制列于表16。
表16.實施例4酶分解液配制

酶分解條件，試驗組與對照組的PCR反應液組成和反應條件均與實施例3相同。試驗結果列于表17。
表17.實施例4結果

表17結果說明無論對照組還是試驗組在所試的52-72℃的退火溫度下均有擴增產物，但對照組在任一試驗溫度下都有可檢測的非專一條帶，在低退火溫度下，大量非專一產物對引物的競爭甚至明顯影響了目標擴增產物的強度。在各試驗組中非專一產物的數(shù)量隨退火溫度升高而降低，也隨混合使用的內切酶種類增加而減少，當使用Alul等5種酶時，在60-72℃的退火溫度范圍內都得到強的目標產物條帶而無任何非專一產物條帶。
實施例5.
限制性核酸內切酶水解反應與PCR在同一管進行。
實施例5的PCR引物和反應條件與實施例4相同，但每反應管體積為10微升。分解基因組DNA的酶的種類與實施例4的試驗C相同，即用5種不同的識別順序為5或4堿基的內切酶。內切酶直接加在PCR反應液中，每100微升PCR反應液加每一種內切酶1微升，PCR反應液的其他組成成分的濃度均不變。在基因擴增儀上先37℃保溫2小時，然后轉入常規(guī)PCR程序。試驗結果列于表18。
表18.實施例5結果

+陽性條帶，其數(shù)量表示強度-陰性表18說明在PGR反應液中內切酶仍顯示活力，對克服非專一產物形成有明顯效果。
權利要求
1.一種以基因組DNA為模板的聚合酶鏈式反應方法，依次包括如下步驟(1)選擇對目標擴增順序無切點的限制性內切酶對基因組DNA進行酶切；(2)模板變性；(3)引物退火；(4)DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環(huán)進行擴增反應。
2.根據(jù)權利要求1所述的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于限制性內切酶是識別順序為4-6個堿基的酶。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于限制性內切酶是識別順序為4個堿基的酶。
4.根據(jù)權利要求1所述的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于在同一反應中使用1-5種限制性內切酶。
5.根據(jù)權利要求1、2或4所述的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于在同一反應中使用2-4種限制性內切酶。
6.根據(jù)權利要求1、2或4中任一項所述的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于酶切反應完成后移出模板DNA進行PCR或者在同一反應管內直接進行PCR反應。
7.根據(jù)權利要求1、2或4中任一項所述的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于酶切反應完成后加熱滅活限制性內切酶。
8.根據(jù)權利要求1、2或4中任一項所述的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于酶切反應液與PCR反應液相同。
9.根據(jù)權利要求1或8所述的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于內切酶的總用量體積為反應體積的1-10％。
10.進行權利要求1所述的聚合酶鏈式反應的反應液，包含如下組分PCR緩沖液、4種脫氧核糖核苷酸、耐熱DNA聚合酶、限制性內切酶和模板DNA，其特征在于內切酶的總用量體積為反應體積的1-10％。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用限制性核酸內切酶水解的基因組DNA作模板的PCR方法及其反應液，以克服標準PCR方法在擴增目標基因產物的同時往往伴隨形成非專一產物、抑制目標產物形成的缺陷。通過選擇對目標擴增順序無切點的1－5種內切酶，特別是識別4－6堿基序列的酶對模板DNA進行酶切，然后直接接續(xù)PCR的方法，即可避免在PCR后用電泳分離或探針雜交等方法來鑒別和檢測產物的過程中引入不確定的誤差因素。利用PCR儀完成反應，步驟簡便易于控制，檢測專一性大大提高，適用于核酸樣品的快速分析和微量病原體檢測。
文檔編號C12Q1/68GK1536086SQ0311632
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月11日 優(yōu)先權日2003年4月11日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 孫崇榮, 徐文慧 申請人:徐定邦, 徐文慧