專利名稱：一種多重引物的pcr方法及其反應(yīng)液和在制備檢測試劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，特別是涉及一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法及其反應(yīng)液和在制備檢測試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
經(jīng)典聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法發(fā)明于八十年代中期，它采用正、反引物各一個(gè)來擴(kuò)增特定的基因片段。不久，又發(fā)展了在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)用二對(duì)或二對(duì)以上引物同時(shí)擴(kuò)增幾種產(chǎn)物的多重PCR(Multiplex-PCR)方法?，F(xiàn)行的多重PCR的幾個(gè)引物對(duì)通常與幾個(gè)不同的目標(biāo)基因順序互補(bǔ)，這些目標(biāo)基因順序承載于各自獨(dú)立的cDNA上，或承載于同一基因組DNA上但彼此相隔的距離相當(dāng)遠(yuǎn)?，F(xiàn)行的多重PCR常用于比較不同基因的表達(dá)水平，在臨床檢測上則可用多重PCR同時(shí)檢測二種或二種以上的病源體，如同時(shí)檢測HAV，HBV和HCV?，F(xiàn)行多重PCR除了同時(shí)使用幾對(duì)引物外，在引物的設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件上與標(biāo)準(zhǔn)PCR幾乎完全一致，在標(biāo)準(zhǔn)PCR方法中擴(kuò)增產(chǎn)物的專一性主要是靠退火溫度來控制的，因而非專一產(chǎn)物的形成在現(xiàn)行的多重引物PCR中往往難以避免，這使得多重PCR的引物對(duì)數(shù)不能太多，否則，多對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物和每一對(duì)引物所形成的非專一產(chǎn)物使PCR反應(yīng)本身趨于復(fù)雜化，最后產(chǎn)物也難以從電泳條帶上得到確認(rèn)。現(xiàn)行的多重PCR方法更不適合用于擴(kuò)增同一基因，因?yàn)檫@種情況下除了目標(biāo)產(chǎn)物和非專一產(chǎn)物外，還常常會(huì)形成目標(biāo)基因的非配對(duì)引物之間的擴(kuò)增產(chǎn)物。然而，用多重PCR擴(kuò)增同一目標(biāo)基因在臨床檢驗(yàn)上特別是在減少病毒基因檢測的假陰性上有極大的應(yīng)用價(jià)值。
PCR已廣泛用于人體內(nèi)微生物的檢測包括感染性疾病病原體的檢測，其原理是病毒、細(xì)菌或其他微生物的基因順序與人體不同，根據(jù)目標(biāo)微生物的某種基因順序可以設(shè)計(jì)高度專一的引物，如果人感染該微生物，則從人體某些部位如血液中提取DNA或RNA，通過PCR方法能擴(kuò)增得到特定的基因片段，反之則否。但是，臨床檢驗(yàn)實(shí)踐表明用PCR方法檢測微生物特別是檢測病毒時(shí)存在著嚴(yán)重的假陰性問題。例如已有數(shù)十篇論文指出根據(jù)臨床及免疫方法檢測已證明為乙型肝炎陽性的病人，卻往往PCR方法檢測為陰性。假陰性產(chǎn)生除了技術(shù)層面的原因如核酸提純失誤和樣品含抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)外，主要是病毒基因的多變性所造成的。已發(fā)現(xiàn)并闡明其順序的HBV，HCV和HIV等病毒基因的變種是如此之多，以至于任何一對(duì)引物即使是在最保守的區(qū)域選擇，也幾乎不可能與所有的變種完全匹配，如在非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臏囟认峦嘶鹁涂赡茉斐杉訇幮?。所以采用一?duì)引物的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法不可能克服由于變種順序多樣性而造成的假陰性。
我們從文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的35對(duì)檢測HBV的引物中選取正引物和反應(yīng)物各六個(gè)，用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo分析他們與7個(gè)HBV基因型中的每一個(gè)基因型的代表性菌株順序的互補(bǔ)情況，結(jié)果如表1。
表1.12條HBV引物與7個(gè)代表性菌株順序的互補(bǔ)情況分析

表1的結(jié)果說明文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的大多數(shù)引物只與少數(shù)或個(gè)別基因型完全或高度匹配，有些引物則與所有代表菌株有大量錯(cuò)配存在，在所選12個(gè)引物中僅S8(-〕與所有基因型代表株完全匹配。但是，用軟件BLAST對(duì)S8(-〕作同源性分析表明它也與相當(dāng)一部分變種順序有嚴(yán)重錯(cuò)配。這些事實(shí)表明即使在病毒基因的保守區(qū)也極難找到一對(duì)引物，能與所有已知順序的變種完全匹配，何況基因庫雖已存有大量變種的順序但并非涵蓋所有的變種。顯然，在一個(gè)病毒基因的不同區(qū)域設(shè)計(jì)多對(duì)引物在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)作多重PCR，可以在不增加檢測步驟的情況下有效地減少或消除由于變種順序多樣性導(dǎo)致的假陰性。假定設(shè)計(jì)的3對(duì)引物與20％，30％或40％的變種有嚴(yán)重錯(cuò)配，則應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法時(shí)分別有20％，30％或40％的假陰性，如果用三對(duì)引物作多重PCR假陰性必然有不同程度的降低。進(jìn)一步假定變異是隨機(jī)的，則假陰性可降低至2.4％。
本發(fā)明的多重PCR方法在每一對(duì)引物的設(shè)計(jì)上，將擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度較低作為考量標(biāo)準(zhǔn)之一，每一對(duì)引物能在較低的后續(xù)變性溫度下完成擴(kuò)增，從而通過退火溫度和變性溫度雙重篩選機(jī)制有效地控制每一對(duì)引物的非專一擴(kuò)增。將這種超低變性溫度的多重PCR用于擴(kuò)增同一基因時(shí)可有效阻止非配對(duì)引物之間的擴(kuò)增，使采用多重PCR來克服微生物檢測的假陰性缺陷得以實(shí)現(xiàn)。應(yīng)用同樣的原理可以用一對(duì)或一對(duì)以上的共同引物來檢測病毒，而同時(shí)用另外的分型引物對(duì)病毒進(jìn)行分型，或者同時(shí)用另外的(耐藥)序列特異性引物來鑒別某些有臨床價(jià)值的突變菌株如耐藥性菌株。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種多重引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法及其反應(yīng)液和在制備檢測試劑中的應(yīng)用，以突破現(xiàn)有多重PCR方法中多重引物設(shè)計(jì)的限制，克服單管內(nèi)PCR反應(yīng)不能獨(dú)立地互不影響地同時(shí)擴(kuò)增同一或不同DNA序列的多個(gè)片段的缺陷。
發(fā)明構(gòu)思本發(fā)明的多重引物PCR方法也使用二對(duì)以上的引物，但是在引物設(shè)計(jì)原理、產(chǎn)物特性和PCR反應(yīng)過程上均與現(xiàn)有多重PCR大不相同。本發(fā)明的多重引物中的每一對(duì)引物都是根據(jù)目標(biāo)模板的順序，把擴(kuò)增產(chǎn)物的變性溫度特性作為主要考量標(biāo)準(zhǔn)而設(shè)計(jì)的，引物的數(shù)量比常規(guī)的多重PCR大大增加，目標(biāo)模板之間可以相鄰，且能使PCR在2或3個(gè)循環(huán)后使前期合成的非特異擴(kuò)增產(chǎn)物因無法解鏈而在后續(xù)循環(huán)中失去其模板的功能，從而減少或消除多重PCR擴(kuò)增過程中由于非配對(duì)引物相互作用而造成的PCR產(chǎn)物的復(fù)雜性，增加反應(yīng)的特異性和靈敏度。
技術(shù)方案本發(fā)明的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法是由2對(duì)以上引物同時(shí)針對(duì)模板DNA鏈進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中模板變性溫度在前2或3個(gè)循環(huán)為92-97℃，在后續(xù)的循環(huán)中為65-87℃，優(yōu)選75-83℃。反應(yīng)中引物對(duì)為2-10對(duì)，設(shè)計(jì)于不同的DNA鏈，或者所有引物均設(shè)計(jì)于同一模板DNA鏈。
用于上述的的多重引物PCR的反應(yīng)液，各條引物在反應(yīng)液中的最適濃度為0.02-0.2μM。
上述的多重引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法適用于制備各種病毒、細(xì)菌、衣原體、支原體等微生物的檢測試劑，用于減少和消除檢測的假陰性，所說的病毒可以是乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒人類免疫缺陷病毒、乳頭瘤病毒等，所說的細(xì)菌可以是結(jié)核桿菌、淋病雙球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、肺炎雙球菌、大腸桿菌等，所說的衣原體可以是沙眼衣原體等，所說的支原體可以是解脲支原體等。
上述的多重引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法適合用于制備以上病毒、細(xì)菌、衣原體、支原體等各種微生物的血清型、基因型及其亞型或耐藥性的檢測試劑，方法是將多重引物之一設(shè)計(jì)于血清型、基因型及其亞型或耐藥性的特異性序列，同時(shí)滿足擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度為65-87℃。
引物與產(chǎn)物設(shè)計(jì)方法是首先，選定目標(biāo)基因的一個(gè)典型株，在其順序的不同區(qū)域包括保守區(qū)域和亞型特征區(qū)域和位點(diǎn)，用引物軟件尋找，或借助引物軟件根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度等特性初步構(gòu)劃滿足上述技術(shù)方案要求的多重PCR引物對(duì)的區(qū)域和長度；然后，在該典型株及2-5個(gè)或更多的具不同亞型特征或其他特征的變異株的某一個(gè)或若干區(qū)域，包括保守區(qū)域和亞型特征區(qū)域，初選一對(duì)或若干對(duì)引物。最后，考慮引物對(duì)與各種變異株的順序的互補(bǔ)性，引物對(duì)之間的3’端互補(bǔ)特性等因素，選定多重PCR的引物對(duì)。
本發(fā)明的PCR反應(yīng)均采用Clontech公司Advantage 2試劑盒。
有益效果(2與4重復(fù)較多)1.本發(fā)明的多重PCR用于擴(kuò)增不同模板時(shí)，根據(jù)每一模板順序設(shè)計(jì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度均很低，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饻囟群统偷淖冃詼囟入p重機(jī)制來控制擴(kuò)增的專一性，PCR的電泳條帶數(shù)與引物對(duì)數(shù)一致，多重引物對(duì)的對(duì)數(shù)比現(xiàn)行多重PCR大大提高。
2.在上述情況下，如果使用比最高允許退火溫度低3至12℃左右的溫度退火，即使引物與模板順序有1至4個(gè)左右的錯(cuò)配，仍能順利完成擴(kuò)增，這就減少或消除了因模板順序變異而導(dǎo)致的假陰性。在非常低退火溫度的情況下，通過控制變性溫度可使PCR最初2至3個(gè)循環(huán)中形成的非專一產(chǎn)物在后續(xù)循環(huán)中流產(chǎn)，從而確保擴(kuò)增產(chǎn)物的專一性。而在標(biāo)準(zhǔn)PCR和現(xiàn)行的多重PCR中，降低退火溫度導(dǎo)致非專一產(chǎn)物和采取嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饻囟葧r(shí)造成的假陰性無法兩全其美。
3.本發(fā)明多重PCR用于擴(kuò)增同一模板時(shí)，如果每一對(duì)引物均與模板匹配，可以在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饻囟群统妥冃詼囟认掠行У貙Ｒ坏財(cái)U(kuò)增各個(gè)目標(biāo)序列，獲得來自同一目標(biāo)基因的電泳條帶。比較同一樣品的不同條帶，可以判斷各對(duì)引物的擴(kuò)增效率；比較不同樣品間的各個(gè)條帶，可以通過一個(gè)管次的試驗(yàn)同時(shí)得到幾組數(shù)據(jù)，對(duì)不同樣品的病毒數(shù)量或基因表達(dá)進(jìn)行半定量比較。
4.在上述情況下，如使用比最高允許退火溫度低3至12℃左右的溫度退火，則每一對(duì)引物即使與模板順序有1至4個(gè)左右的錯(cuò)配仍能完成擴(kuò)增而且不出現(xiàn)非專一條帶。因?yàn)樵诙嘀豍CR的若干對(duì)引物中只要有一對(duì)能擴(kuò)增得到一條目標(biāo)擴(kuò)增條帶，就表明目標(biāo)基因是存在的。所以，超低變性溫度和低退火溫度多重PCR為檢測任一種病毒的各種變異株提供了十分廣闊的空間。不難分析，如果在一個(gè)病毒基因的幾個(gè)相對(duì)保守的區(qū)域選到3對(duì)左右的引物，使每一擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度都相當(dāng)?shù)?，那么，不論病毒順序的變異多?fù)雜，因引物順序與目標(biāo)基因順序錯(cuò)配而導(dǎo)致的假陰性可以完全克服和避免。換言之，設(shè)計(jì)良好的超低變性溫度多重PCR可以檢測各種變異株而毋需擔(dān)心假陰性。
5.針對(duì)同一模板的超低變性溫度的多重PCR也可用于同時(shí)檢出目標(biāo)基因并鑒別其等位基因突變。在這種情況下可以設(shè)計(jì)含二對(duì)或更多對(duì)引物的超低變性溫度多重PCR，其中一對(duì)引物對(duì)二個(gè)等位基因來說是共同的，另一對(duì)引物的一個(gè)引物或二個(gè)引物的3’端堿基或鄰近3’端的若干個(gè)堿基是野生(或突變)等位基因所特有的，在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饻囟群统妥冃詼囟认隆Ｒ吧?或突變)等位基因擴(kuò)增得到二條帶，而突變(或野生)等位基因只擴(kuò)增得到一條帶，這樣，就簡化掉了陽性對(duì)照的PCR反應(yīng)。常規(guī)的PCR方法也能鑒別等位基因，但出現(xiàn)陰性結(jié)果時(shí)必須作一個(gè)陽對(duì)照試驗(yàn)以表明陰性結(jié)果不是由于PCR技術(shù)方面的原因造成的。
6.病毒和細(xì)菌往往可分成不同的基因型或血清型，在臨床診斷和治療上有較大意義，現(xiàn)有的多重PCR在基因組較小的同一病毒序列的檢測中有所限制，設(shè)計(jì)引物檢測病毒同時(shí)鑒別其亞型特異性基因也較困難。本發(fā)明解決了這一問題。如果對(duì)各種亞型能找出區(qū)別于其他亞型的特征性的順序則用第5點(diǎn)的方法，可同時(shí)檢測病毒并鑒別病毒的亞型。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
超低變性溫度多重引物PCR與常規(guī)多重PCR的比較。
在人肌動(dòng)球蛋白基因(基因庫編號(hào)BC016045)上設(shè)計(jì)三對(duì)引物，其順序和特性分別列于表2和3。
表2.實(shí)施例1的引物順序

表3.實(shí)施例1的引物特性


由于三對(duì)基因針對(duì)同一目標(biāo)基因而且相隔較近，常規(guī)多重PCR條件下會(huì)形成非配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物，其長度和解鏈溫度測算示于表4。
表4.實(shí)施例1非配對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物特性

實(shí)施例1的PCR反應(yīng)采用Clontech的Advantage-2試劑盒，每管反應(yīng)體積為5微升，每一引物終濃度為0.1uM，每一反應(yīng)管含cDNA1微升，cDNA由人組織總RNA以Poly(dT)18為引物用Clontech的反轉(zhuǎn)錄試劑盒按其規(guī)定合成。
PCR反應(yīng)條件分二組，第一組為常規(guī)多重PCR方法，即首次變性95℃1分鐘，循環(huán)變性95℃30秒鐘，退火62℃30秒鐘，延伸72℃1分鐘，共28個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃3分鐘。第二組為超低變性溫度多重PCR方法，首次變性，循環(huán)退火，循環(huán)延伸和最后延伸的條件與第一組相同，最初三個(gè)循環(huán)變性也為95℃30秒鐘，但其后的25個(gè)循環(huán)的變性改為80℃30秒鐘。試驗(yàn)結(jié)果見表5。
表5.實(shí)施例1對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

+表示有一或若干條帶，0表示無條帶，數(shù)字代表?xiàng)l帶數(shù)實(shí)施例2.
6對(duì)引物的多重PCR。
引物設(shè)計(jì)見表6。
引物特性見表7。
非配對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物特性見表8。
表6.實(shí)施例2引物順序

表7.實(shí)施例2引物特性


人肌動(dòng)球蛋白基長小于2000堿基，6對(duì)引物有15種非配對(duì)組合擴(kuò)增的可能，測算的擴(kuò)增產(chǎn)物長度和解鏈溫度示于表8。
表8.實(shí)施例2非配對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物特性


6個(gè)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度均低于76.8℃，而15個(gè)非配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度均高于80.9℃。實(shí)施例2反應(yīng)試劑和條件與實(shí)施例1相同，但后續(xù)循環(huán)變性為79℃30秒鐘，結(jié)果以A04-A09引物對(duì)的任意組合包括6對(duì)引物的多重PC均得到擴(kuò)增產(chǎn)物，而無非配對(duì)產(chǎn)物和非專一擴(kuò)增產(chǎn)物。
實(shí)施例3.
含10對(duì)引物的超低變性溫度多重PCR設(shè)計(jì)方案和實(shí)施條件。
用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo對(duì)Cyclin-D基因(基因庫編號(hào)NC_053056)進(jìn)行分析，搜尋到10對(duì)具有高嚴(yán)謹(jǐn)性而擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度均低于81℃的引物。10對(duì)引物的位置、特性和45個(gè)非配對(duì)干擾擴(kuò)增產(chǎn)物的特性列于表9和表10。
表10.對(duì)Cyclin D基因測試獲得的10對(duì)引物

表11.各對(duì)引物之間相互干擾產(chǎn)物的測試結(jié)果



結(jié)果表明干擾產(chǎn)物的Tm值介于82.1-92.1℃，且大部分介于83-87℃，顯著與正常產(chǎn)物不在同一溫度范圍，也就是說，在該基因的4300堿基的序列中已可能獲得10對(duì)引物，滿足擴(kuò)增產(chǎn)物和干擾產(chǎn)物的解鏈溫度不在同一范圍的設(shè)計(jì)要求。如后續(xù)循環(huán)變性溫度為81℃可排除干擾產(chǎn)物變性僅得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物。
實(shí)施例4.
多重引物PCR減少或消除乙型肝炎病毒檢測假陽性設(shè)計(jì)方案和實(shí)施條件。
將常用的檢測HBV的引物(表1)，按本發(fā)明的設(shè)計(jì)思想對(duì)其長度和順序進(jìn)行修改，重新配合組成三對(duì)引物，其順序和特性示于表12和13。粗黑體字母代表經(jīng)改動(dòng)的核苷酸，引物位置均以基因庫編號(hào)為E00010的病毒變株順序?yàn)闇?zhǔn)。
三對(duì)引物的三個(gè)非配對(duì)干擾產(chǎn)物的特性列于表14。
表12.實(shí)施例4引物序列

表13.實(shí)施例4引物序列特性


表14.實(shí)施例4非配對(duì)干擾擴(kuò)增產(chǎn)物特性

由此可見，配對(duì)產(chǎn)物解鏈溫度均小于79℃，而非配對(duì)干擾擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度均大于84℃。根據(jù)這些數(shù)據(jù)和實(shí)施例1和2的結(jié)果，將退火溫度控制在50-63℃，后續(xù)變性溫度控制在80-83℃，每一對(duì)引物均能以與其完全匹配或高度匹配的變種為模板專一地?cái)U(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物。
實(shí)施例5.
用多重引物方法檢測乙肝病毒同時(shí)檢測聯(lián)合突變的設(shè)計(jì)方案和實(shí)施條件。
(背景說明基因庫儲(chǔ)存的1000余個(gè)乙型肝炎病毒基因順序和國內(nèi)外的臨床檢測分析表明，約四分之一的乙型肝炎病毒在C基因啟動(dòng)子的1762位和1764位同時(shí)發(fā)生A轉(zhuǎn)變?yōu)門和G轉(zhuǎn)變?yōu)锳的所謂聯(lián)合突變，使HBV的mRNA的轉(zhuǎn)錄合成速度有所降低，因而與疾病的嚴(yán)重性和治療有關(guān)有一定的臨床關(guān)系。通常用PCR-RFLP，即PCR-限制性內(nèi)切酶片段多態(tài)性方法來鑒別野生株和C基因啟動(dòng)子的聯(lián)合突變株(見中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2000，14(2)163p；中華學(xué)檢驗(yàn)雜志1999，22(5))。這種方法需進(jìn)行二次PCR，其中一次人為地在第1767位引進(jìn)T至A突變，使突變株的PCR產(chǎn)物含有一個(gè)Bcl-I的酶切點(diǎn)順序TGATCA，而野生株P(guān)CR產(chǎn)物順序?yàn)锳GTTCA，不被Bcl-I酶所切，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶解和然后電泳鑒能鑒別野生型和突變型。復(fù)雜的操作過程限制了它在臨床診斷上的推廣應(yīng)用。另外，有些變種在第1763，1765和1766位也發(fā)生突變，使得在人為引進(jìn)1767位的突變后，1762和1764位聯(lián)合突變株仍得不到TGATCA順序，因而不被酶所切而出現(xiàn)假陰性判斷。)本實(shí)施例設(shè)計(jì)一對(duì)共用引物，用以檢查HBV病毒的存在。設(shè)計(jì)二組引物用于鑒別野生型和聯(lián)合突變型，其中一組的正引物有二個(gè)，均以1764位作為其3’端。而另一組的反引物有二個(gè)，均以1762位作為其3’端，共有引物和用于檢測聯(lián)合突變的引物的順序和特性列于表15和表16。
表15.實(shí)施例5的引物順序

注HBV04引物位置以基因擴(kuò)編號(hào)為E00010的變種順序?yàn)闇?zhǔn)；HBV05和HBV06引物的位置以基因庫編號(hào)為AF479684變種順序?yàn)闇?zhǔn)。
表16.實(shí)施例5的引物的特性

檢測HBV的共用引物HBV04及檢測聯(lián)合突變引物HBV05和HBV06的目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度均低于82℃，后續(xù)變性溫度為83℃時(shí)，均能完成變性步驟。HBV05的“野生型”反引物和HBV06的“野生型”正引物均能在65℃與野生型模板退火，而在同樣溫度下均不能與聯(lián)合突變型模板退火完成擴(kuò)增。同樣，HBV05的“突變型”反引物和HBV06“突變型”正引物能在65℃與聯(lián)合突變型模板退火，而在同樣溫度下不能與野生型模板退火。檢測時(shí)每一個(gè)樣品分二管，每一管都含HBV04引物對(duì)，HBV05正引物和HBV06反引物。其中甲管還含有二個(gè)“野生型”引物，而乙管還含有二個(gè)“突變型“引物。如甲管PCR結(jié)果出現(xiàn)119，46和68三個(gè)條帶說明樣品為野生型，如乙管出現(xiàn)三個(gè)條帶說明樣品為1762和1764位聯(lián)合突變型。如甲乙二管均無條帶說明樣品為HBV陰性。
實(shí)施例6.
多重引物PCR減少或消除丙型肝炎病毒檢測假陽性的設(shè)計(jì)方案和實(shí)施條件。
HCV基因上游的非編碼區(qū)相當(dāng)保守，文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的大量引物取自該區(qū)域，按本發(fā)明的設(shè)計(jì)思想從其中的4對(duì)引物中選取4條，并在引物長度等方面稍作調(diào)整后，重新配成2對(duì)引物，其順序和特性列與表17和表18。
表17.實(shí)施例6引物順序

*以基因庫編號(hào)為177039的HCV變種順序?yàn)闇?zhǔn)表18.實(shí)施例6引物特性

HCV01正引物和HCV02反引物之間的擴(kuò)增產(chǎn)物長284堿基，擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度89.7℃。所以當(dāng)控制退火溫度55-64℃，后續(xù)變性溫度84℃，能完成目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的合成。在反應(yīng)最初形成的非配對(duì)干擾擴(kuò)增產(chǎn)物，在后續(xù)變性溫度84℃時(shí)流產(chǎn)。
實(shí)施例7.
多重引物PCR減少和消除人免疫缺陷病毒檢測假陰性的設(shè)計(jì)方案和實(shí)施條件。
分別在HIV病毒的保守區(qū)域gag和env基因各設(shè)計(jì)2對(duì)引物，其中，HIV01選自文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的引物對(duì)，僅對(duì)引物長度稍作修改。其他三對(duì)引物的正引物均選自文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)引物，對(duì)其長度也稍作修改。4對(duì)引物的順序和特性列于表19和20。
表19.實(shí)施例7引物順序

*順序位置以基因庫編號(hào)為U23487的HIV變種為準(zhǔn)表20.實(shí)施例7引物特性

4對(duì)引物的目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度均低于78℃，當(dāng)退火溫度為55-68℃，后續(xù)變性溫度為80℃時(shí)，能專一地完成擴(kuò)增。gag基因和env基因相隔超過5000個(gè)堿基，所以，HIV01和HIV02的引物不會(huì)與HIV03和HIV04的引物發(fā)生非配對(duì)的干擾性擴(kuò)增，而HIV01正引物與HIV02反引物及HIV03正引物與HIV04反引物的非配對(duì)干擾擴(kuò)增產(chǎn)物的長度和解鏈溫度經(jīng)測算分別為280堿基、82.3℃和557堿基、83.3℃，當(dāng)后續(xù)變性溫度為80℃時(shí)，因在變性步驟受阻而不能完成擴(kuò)增。
實(shí)施例8.
多重引物PCR同時(shí)檢測不同型人乳頭瘤病毒的設(shè)計(jì)方案和實(shí)施條件。
人乳頭瘤病毒已鑒定的約有70種，每一種型內(nèi)的順序較保守，而型間的區(qū)別較大。其中，6型，11型和16型等比較常見或與惡性腫瘤有關(guān)。實(shí)施例8設(shè)計(jì)一對(duì)引物與16型匹配，它取自文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的引物僅在長度上作調(diào)整，命名為HPV16-01。另設(shè)計(jì)二對(duì)引物與11和6型匹配，命名為HPV11-01和HPV11-02。HPV11-01的正引物和HPV11-02的反引物根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)引物在長度上稍作調(diào)整。HPV11-01的反引物和HPV11-02的正引物相接，該部位順序在文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)中被用作探針。三對(duì)引物的順序和特性示于表21和表22。
表21.實(shí)施例8引物順序

*HPV16引物順序和位置以基因庫編號(hào)為NC_001526的16型HPV為準(zhǔn)，HPV11引物的順序和位置以基因庫編號(hào)為M14119的11型HPV為準(zhǔn)表22.實(shí)施例8引物特性

上述3對(duì)引物目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度均低于78.1℃，當(dāng)控制退火溫度為50-64℃，后續(xù)溫度為80℃時(shí)，能專一地?cái)U(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物。PCR反應(yīng)液電泳染色后出現(xiàn)210bp條帶，說明為HPV16型，出現(xiàn)43或/和64bp條帶說明樣品為HPV11或6型，若無條帶說明不存在上述三型HPV。若提高后續(xù)變性溫度至82℃，也會(huì)出現(xiàn)107bp條帶，是HPV11-01正引物和HPV11-02反引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，也說明樣品存在HPV11型或HPV6型病毒。
實(shí)施例9.
多重引物PCR同時(shí)檢測乙型肝炎病毒HBV、丙型肝炎病毒HCV和人免疫缺陷病毒HIV設(shè)計(jì)方案和實(shí)施條件。
將上述表16的引物對(duì)HBV04，表17的引物對(duì)HCV01和表19的引物對(duì)HIV03作多重PCR，在退火溫度為50-64℃，后續(xù)變性溫度為84℃的條件下，三對(duì)引物均能專一地?cái)U(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物。電泳染色后的119bp，70bp和146bp條帶分別指示HBV，HCV和HIV的存在。
權(quán)利要求
1.一種多重引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，由2對(duì)以上引物同時(shí)針對(duì)模板DNA鏈進(jìn)行如下反應(yīng)(1)模板變性；(2)引物退火；(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈；(4)按步驟(1)-(3)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；其特征在于，模板變性溫度在前2或3個(gè)循環(huán)為92-97℃，在后續(xù)的循環(huán)中為65-87℃。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于反應(yīng)中引物對(duì)為2-10對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所有引物均設(shè)計(jì)于不同模板或同一模板DNA鏈。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于后續(xù)的循環(huán)中變性溫度為75-83℃。
5.用于權(quán)利要求1所述的多重引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)液，其特征在于各條引物在反應(yīng)液中的濃度為0.02-0.2μM。
6.權(quán)利要求1所述的多重引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法在制備病毒、細(xì)菌、衣原體、支原體等各種微生物的變異株、血清型、基因型及其亞型或耐藥菌株檢測試劑中的應(yīng)用，其特征在于多重引物設(shè)計(jì)于變異株、血清型、基因型及其亞型或耐藥菌株的的特異性序列，且各產(chǎn)物解鏈溫度均為65-87℃。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的反應(yīng)方法的應(yīng)用，其特征在于所說的各種微生物包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒、結(jié)核桿菌、淋病雙球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、肺炎雙球菌、大腸桿菌、沙眼衣原體和解脲支原體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多重引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法及其反應(yīng)液和在制備微生物檢測試劑中的應(yīng)用，特別涉及在PCR過程中采用92－97℃和65－87℃兩種變性溫度分別進(jìn)行最初2或3個(gè)循環(huán)和其他后續(xù)循環(huán)，克服了現(xiàn)有的針對(duì)同一DNA鏈的多重PCR中正反引物間相互非專一性配對(duì)擴(kuò)增，形成非特異產(chǎn)物的缺陷。通過合適的產(chǎn)物設(shè)計(jì)和兩種變性溫度的設(shè)置，顯著降低了PCR前期合成的非目標(biāo)產(chǎn)物參與后續(xù)循環(huán)的可能性，適用于制備單管式多重PCR快速檢測試劑，在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒等病毒各種變異株、血清型、基因型或其亞型檢測和結(jié)核桿菌等細(xì)菌耐藥基因檢測等方面有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1536088SQ0311632
公開日2004年10月13日 申請(qǐng)日期2003年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月11日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 陳有容, 徐文慧 申請(qǐng)人:徐定邦, 徐文慧