專利名稱：羅氏沼蝦諾達(dá)病毒核酸點(diǎn)雜交檢測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蝦類病害檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羅氏沼蝦諾達(dá)病毒核酸點(diǎn)雜交檢測(cè)的方法，適用于羅氏沼蝦肌肉白濁病病原的診斷。
參考文獻(xiàn)(1)Arcier J.M.，Herman F.，Lightner D.V.，Redman R.M.，Mari J.&Bonami J.R.(1999).A viral disease associated with mortalities in hachery-reared postlarvaeof the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii.Diseases ofAquatic Organisms，38，177-181.
(2)Bonami J.R.(2002)A new viral disease in the giant freshwater prawnMacrobrachium rosenbergii.World Aquaculture 2002.Annual Meetings of theWorld Aquaculture Society and the China Society of Fisheries，April 23-27，2002.Beijing Convention Center，Beijing China.Abstract，p.79.
(3)錢冬 楊國梁 劉問等。羅氏沼蝦苗肌肉白濁病病原研究。水生生物學(xué)報(bào)，2002，26472-476(4)Romestand B.& Bonami J.R.(2002)A sandwich enzyme linked immunosorbentassay(S-ELISA)for detection of MrNV in the giant fresh water prawnMacrobrachium rosenbergii.Journal of Fish Diseases，(in press).
(5)Tung C.W.，Wang C.S.& Chen S.N.(1999)Histological and electronmicroscopic study on Macrobrachium muscle virus(MMV)infection in the giantfreshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii(de Man)，cultured in Taiwan.Journal of Fish Diseases，22，1-5.
參考資料(1)、(2)(3)和(5)主要側(cè)重于羅氏沼蝦肌肉白濁病的病原研究，在組織病理、病毒的超微結(jié)構(gòu)和生化特征的水平上對(duì)病毒進(jìn)行描述。資料(4)報(bào)道了一種羅氏沼蝦諾達(dá)病毒的免疫檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)單、快速，但靈敏度低。
為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案(1)制備試劑盒試劑盒含有所有檢測(cè)程序中的必要成分，包括病毒核酸探針、樣品處理液、雜交液，封閉液、抗地高辛抗體、洗滌液、顯色劑、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、1.5ml離心管、雜交膜、雜交帶、研磨小棒。
(2)建立最佳的雜交反應(yīng)體系。包括組織取材部位(整個(gè)幼苗或附肢)，最佳探針濃度(30-50ng/ml)，雜交溫度(42℃)，雜交液系統(tǒng)(雜交液采用50％甲醛，0.05M磷酸鈉2×SSC，2％封閉液，7％十二烷基硫酸酸鈉，0.1％十二烷基肌氨酸鈉)。
本發(fā)明主要技術(shù)難點(diǎn)(1)特異性病毒核酸探針的制備。地高辛探針的制備用多聚酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增(PCR)方法。在100μl反應(yīng)體積內(nèi)加入10μl 10x緩沖液，7μl 25mM氯化鎂，10μl地高辛核甘酸混合物，2μl l0μM的上下游質(zhì)粒通用引物(上游引物cgccagggttttcccagtcacgac；下游引物gagcggataacaatttcacacagg)，1μl耐高溫核糖核甘酸聚合酶(Tag DNA聚合酶)，1μl含羅氏沼蝦諾達(dá)病毒基因組(cDNA)片段的質(zhì)粒DNA(10-50ng)。PCR結(jié)束后，在PCR產(chǎn)物中加入10μl 200μM乙二胺四醋酸，pH8.0、1μl 4M氯化俚和2倍體積的無水乙醇沉淀并干燥DNA，然后溶在50μl的無菌蒸餾水中。
(2)組織樣品處理。(整個(gè)幼苗或成蝦的附肢)，放入1.5ml的離心管內(nèi)，加入樣品處理液(1∶10重量/體積)，用研磨小棒研磨直至組織被研碎。低速離心(3000g)后取上清1μl按1∶5稀釋，70℃處理15min并迅速放置冰上。
(3)點(diǎn)雜交程序的優(yōu)化。首先是探針濃度的確定，合適的探針濃度為30-50ng/ml雜交液；其次是雜交液的選擇，雜交液采用50％甲醛，0.05M磷酸鈉2xSSC，2％封閉液，7％十二烷基硫酸酸鈉，0.1％十二烷基肌氨酸鈉；再次是雜交溫度的選擇，根據(jù)雜交液成分和病毒核酸性質(zhì)，42℃為最佳雜交溫度。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有以下優(yōu)點(diǎn)靈敏度高，能檢測(cè)出少于26ng的病蝦組織中的諾達(dá)病毒和少于2.5ng的病毒RNA；樣品處理程序簡(jiǎn)單；不需要特殊昂貴的儀器；成本低；可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。
(2)探針的制備地高辛探針的制備用常規(guī)PCR方法，將PCR產(chǎn)物標(biāo)記上地高辛。擴(kuò)增引物來自質(zhì)粒通用引物，構(gòu)建羅氏沼蝦諾達(dá)病毒cDNA文庫。
(3)樣品處理稱取樣品(幼苗整個(gè)或成蝦的鰓)，放入1.5ml的離心管內(nèi)，加入樣品處理液(1∶10重量/體積)，樣品處理液為焦碳酸二乙酯處理的緩沖液，緩沖液配方為0.02M三氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)，0.4M氯化鈉(NaCl)，pH7.4)，用研磨小棒研磨直至組織被研碎。低速離心(3000g)后取上清1μl按1∶5稀釋，70℃處理15min并迅速放置冰上。
取不同稀釋度的點(diǎn)雜交樣品1μl，點(diǎn)在帶正電荷的尼龍膜上，紫外燈下處理3min。
(4)預(yù)雜交和雜交將雜交膜放入雜交帶內(nèi)，加入預(yù)雜交液使雜交膜被溶液覆蓋，預(yù)雜交液為50％甲醛，0.05M磷酸鈉2×SSC，2％封閉液，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.1％十二烷基肌氨酸鈉，封閉好雜交帶，在42℃預(yù)雜交1-4小時(shí)。然后用預(yù)雜交液稀釋探針(30-50ng/ml)，向雜交帶內(nèi)加入探針雜交液，42℃雜交過夜。
(5)洗滌將雜交膜放在干凈的平皿內(nèi)，用洗滌液在室溫條件下洗滌2次，洗滌液為2×SSC，0.1％SDS，每次15min。將雜交膜重新放回干凈的雜交帶內(nèi)，用洗滌液，洗滌液為0.1×SSC，0.1％SDS，在68℃洗滌2次，每次15min。
(6)封閉棄洗滌液，洗滌液為0.1×SSC，0.1％SDS，加入緩沖液，緩沖液為1％封閉液，室溫下孵育30min。
(7)抗體抗原反應(yīng)用緩沖液稀釋抗地高辛抗體(1∶5000稀釋)，緩沖液為1％封閉液，放入雜交帶內(nèi)，室溫下孵育30min。
(8)洗滌取出雜交膜放在干凈的平皿內(nèi)，用緩沖液在室溫下連續(xù)洗滌2次，緩沖液為100mM馬來酸(Maleic acid)，150mM Nacl，pH7.5(20℃)，每次15min。
(9)顯色用緩沖液配置顯色底物(2ml緩沖液中加入9ul氯化硝基四氮唑藍(lán)鹽(NBT)和7ul 5-溴-4氯-3吲哚磷酸鹽(BCIP)。緩沖液為100mM Tris-HCl，100mM NaCl，50mM MgCl2，pH9.5，將雜交膜放在干凈的雜交帶內(nèi)，放入顯色底物覆蓋雜交膜，在避光處顯色(30min-2hr)。肉眼觀察結(jié)果，顯棕色為弱陽性反應(yīng)，藍(lán)紫色為強(qiáng)陽性反應(yīng)。
(10)終止反應(yīng)棄顯色液，加入終止液。終止液為100mM Tris-Hcl；1mM乙二胺四乙酸(EDTA)；pH9.5(20℃)。記錄結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種羅氏沼蝦諾達(dá)病毒核酸點(diǎn)雜交檢測(cè)的方法，包括下列步驟(1)制備試劑盒包括病毒核酸探針、樣品處理液、雜交液，封閉液、抗地高辛抗體、洗滌液、顯色劑、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、1.5ml離心管、雜交膜、雜交帶、研磨小棒；(2)探針的制備地高辛探針的制備用常規(guī)PCR方法，將PCR產(chǎn)物標(biāo)記上地高辛，擴(kuò)增引物來自質(zhì)粒通用引物，構(gòu)建羅氏沼蝦諾達(dá)病毒cDNA文庫；(3)樣品處理稱取樣品，放入1.5ml的離心管內(nèi)，加入樣品處理液，用研磨小棒研磨直至組織被研碎，低速離心后取上清1μl按1∶5稀釋，70℃處理15min并放置冰上；(4)預(yù)雜交和雜交將雜交膜放入雜交帶內(nèi)，加入預(yù)雜交液使雜交膜被溶液覆蓋，封閉好雜交帶，在42℃預(yù)雜交1-4小時(shí)，然后雜交帶內(nèi)加入探針雜交液，42℃雜交過夜；(5)洗滌將雜交膜放在干凈的平皿內(nèi)，用洗滌液在室溫條件下洗滌2次，將雜交膜重新放回干凈的雜交帶內(nèi)，加入洗滌液在68℃洗滌2次，每次15min；(6)封閉棄洗滌液，加入1％封閉液，室溫下孵育30min；(7)抗體抗原反應(yīng)用緩沖液稀釋抗地高辛抗體，放入雜交帶內(nèi)，室溫下孵育30min；(8)洗滌取出雜交膜放在干凈的平皿內(nèi)，用緩沖液在室溫下連續(xù)洗滌2次；(9)顯色用緩沖液配置顯色底物，將雜交膜放在干凈的雜交帶內(nèi)，放入顯色底物覆蓋雜交膜，在避光處顯色，肉眼觀察結(jié)果，顯棕色為弱陽性反應(yīng)，藍(lán)紫色為強(qiáng)陽性反應(yīng)；(10)終止反應(yīng)；棄顯色液，終止液，記錄結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羅氏沼蝦諾達(dá)病毒核酸點(diǎn)雜交檢測(cè)的方法，其步驟是首先是探針的制備；其次是樣品處理；第三是預(yù)雜交和雜交；第四洗滌；第五是封閉；第六是抗體抗原反應(yīng)；第七是洗滌；第八是顯色反應(yīng)；最后終止反應(yīng)。本發(fā)明靈敏度高，成本低，適合于羅氏沼蝦肌肉白濁病病原的診斷以及親蝦、幼苗和成蝦的健康狀態(tài)檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1438330SQ0311873
公開日2003年8月27日 申請(qǐng)日期2003年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月6日
發(fā)明者石正麗, 寶納米·簡(jiǎn)·羅伯特 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所