專利名稱：L－氨基酸的生產(chǎn)方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)L-氨基酸的方法和生產(chǎn)過程中使用的菌株。確切的說，本發(fā)明涉及了生產(chǎn)L-氨基酸能力增強的細菌和用這種細菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，利用短棒狀細菌的發(fā)酵作用生產(chǎn)L-氨基酸(如L-谷氨酸)，這種短棒狀細菌屬于短桿菌屬、棒狀桿菌屬或者微桿菌屬(“氨基酸發(fā)酵”，GakkaiShuppan Center，pp，195-215，1986)。進一步發(fā)展用芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、青霉素屬(U.S.Patente No.3220,929)、假單胞菌屬、節(jié)桿菌屬、沙雷菌屬、氣桿菌屬、念珠菌屬(U.S.Patent No.3,563,857)、埃希氏菌屬(Japanese PatentLaid-open Publication(kokai)No.5-244970)等細菌生產(chǎn)L-氨基酸。后來又用腸桿菌屬(EP1078989A2)克雷白菌屬，歐文菌屬和泛菌屬(Japanese patent Laid-openPublication No.2000-106869)的細菌生產(chǎn)L-氨基酸，如L-谷氨酸。
此外，已經(jīng)公開了許多通過應用DNA重組技術(shù)來增強L-氨基酸生物合成過程中所需要的酶，以便提高L-氨基酸的產(chǎn)量的技術(shù)。例如，已公開的一種方法是用導入了檸檬酸合酶基因的腸桿菌屬或克雷白菌屬細菌合成L-谷氨酸(EP0999282A2)；另一種方法是用導入了檸檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、谷氨酸脫氫酶基因的腸桿菌屬的細菌合成L-谷氨酸(EP 1 078 989A2)。
另外，通過導入編碼糖酵解酶的基因來增加L-氨基酸產(chǎn)量的方法也已得到廣泛認可，這些糖酵解酶例如是葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶(WO 01/02542 A1)、果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶(WO 01/48146 A1)和烯醇化酶(WO 01/02543 A1)。
同時，許多包括腸道桿菌在內(nèi)的革蘭氏陰性菌都可通過恩特納—道德洛夫途徑(Entner-Doudoroff)進行葡萄糖酵解。這個途徑包括6-磷酸葡糖酸脫水酶(簡稱EDD)和2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶(以下簡稱EDA)，前者可催化6-磷酸葡糖酸分解產(chǎn)生2-酮3-脫氧-6-磷酸葡糖酸，后者可將2-酮3-脫氧-6-磷酸葡糖酸分解為甘油醛-3-磷酸和丙酮酸。目前已經(jīng)從大腸埃希氏菌、運動發(fā)酵單胞發(fā)酵單孢菌等細菌中克隆了編碼EDD和EDA的基因，它們的核苷酸序列已有報導。來自大腸埃希氏菌的EDD(edd)和EDA(eda)基因的核苷酸序列已在GenBank注冊，編號為L20897。另外，在數(shù)據(jù)庫中，來自運動發(fā)酵單胞菌的EDA基因核苷酸序列在GenBank注冊，編號為X58364；編碼EDD基因核苷酸序列已在GeneBnk注冊，編號為M60615，M37982。
然而，恩特納—道德洛夫途徑和L-氨基酸產(chǎn)量的關系目前還不十分清楚。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種不同于已知技術(shù)的新技術(shù)，提高細菌中L-氨基酸的產(chǎn)率。
發(fā)明人關注的是革蘭氏陰性菌所具有的恩特納—道德洛夫途徑。在由糖轉(zhuǎn)化為L-氨基酸(如L-谷氨酸)的代謝途徑中，二氧化碳產(chǎn)生于6-磷酸葡糖酸脫氫酶催化6-磷酸葡糖酸分解產(chǎn)生核酮糖5-磷酸的反應中。在菌株中有大量的碳流入戊糖磷酸的路徑，尤其是上面提到的反應中有大量的二氧化碳產(chǎn)生。因此，他們認為可通過避免流入戊糖磷酸路徑的方法來提高細菌合成L-氨基酸(如L-谷氨酸)的能力。
發(fā)明人設計了兩種方法減少碳流入戊糖磷酸路徑(1)去除或降低葡糖-6-磷酸脫氫酶或6-磷酸葡糖酸脫氫酶的活性；(2)增強恩特納—道德洛夫途徑。期望這兩種方法都能有效繞開戊糖磷酸路徑。然而，在方法(2)中，需要考慮到一點就是，既然通過調(diào)節(jié)EDD和EDA的活性能夠改變與戊糖磷酸路徑相關的碳分布，那么戊糖磷酸路徑的中間物質(zhì)的衍生物例如核苷酸也能得到補充。另外，經(jīng)過大量研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)增強恩特納—道德洛夫途徑可提高細菌生產(chǎn)L-氨基酸的能力。這樣就完成了本項發(fā)明。
本發(fā)明提供如下內(nèi)容(1)生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生L-氨基酸的微生物，以在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和富集L-氨基酸，并從培養(yǎng)基收集L-氨基酸，其中培養(yǎng)的微生物為具有恩特納—道德洛夫途徑的革蘭氏陰性細菌，且它已經(jīng)被改造過，使得它的6-磷酸葡萄糖酸脫水酶或2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶的活性被分別或同時增強，并且以丙酮酸做中間物的生物合成途徑可產(chǎn)生多種L-氨基酸，從中選擇特定的L-氨基酸。(2)方法根據(jù)方法(1)，其中細菌為一種腸道桿菌。(3)方法根據(jù)方法(2)，其中細菌屬于腸桿菌屬。(4)方法根據(jù)方法(1)-(3)中的任一方法，通過增加編碼6-磷酸葡萄糖酸脫水酶基因或2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶基因的拷貝數(shù)提高這兩種酶的活性，或者通過修飾基因的表達調(diào)節(jié)序列，使細菌細胞中二者的表達量提高。(5)方法根據(jù)方法(1)，但其中的L-氨基酸是L-谷氨酸，或者是利用L-谷氨酸做為中間物或氨基供體經(jīng)生物合成的L-氨基酸。(6)方法根據(jù)方法(1)到(5)中的任一種方法，但其中的L-氨基酸是選自L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-丙氨酸的。(7)方法根據(jù)方法(6)，但其中的L-氨基酸是L-谷氨酸。
使用本發(fā)明方法，通過提高恩特納-道德洛夫途徑，可以提高具有此途徑的微生物合成L-氨基酸的能力。


圖1表示edd基因和eda基因表達增強菌株的生長情況(A)和合成L-谷氨酸的量(B)。圖2表示edd基因和eda基因表達增強菌株合成3-羥基丁酮和2，3-丁二醇的量(A)培養(yǎng)基中3-羥基丁酮的量，(B)培養(yǎng)基中2，3-丁二醇的量，(C)平均每單位細菌細胞(是指單位干細胞的重量)產(chǎn)生的3-羥基丁酮和2，3-丁二醇量的總和。
發(fā)明
具體實施例方式
以下為本發(fā)明的詳細描述<1>本發(fā)明中的細菌本發(fā)明所用的革蘭氏陰性細菌具有生產(chǎn)L-氨基酸的能力，并且具有恩特納—道德洛夫途徑。
術(shù)語“生產(chǎn)L-氨基酸的能力”在本發(fā)明中是指當用培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明所用細菌時，培養(yǎng)基中累積L-氨基酸的能力。這種生產(chǎn)L-氨基酸的能力可能是革蘭氏陰性菌野生株的特性或經(jīng)繁殖傳代后所獲得或增強的特性的。本發(fā)明中所用到的L-氨基酸是以丙酮酸做為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生的。其具體例包括L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-丙氨酸等等。
正如后面所述實施例顯示，具有通過增強EDD和EDA活性而增強恩特納—道德洛夫途徑的細菌，可增加3-羥基丁酮和2，3-丁二醇的產(chǎn)量。因為2，3-丁二醇是由3-羥基丁酮合成，而3-羥基丁酮是由丙酮酸合成的，3-羥基丁酮和2，3-丁二醇的產(chǎn)量增加表明增加了丙酮酸的供應量。因此，人們期望通過加強的恩特納—道德洛夫途徑的細菌來提高以丙酮酸做為中間產(chǎn)物的生物合成途徑生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
具體的具有恩特納—道德洛夫途徑的細菌主要屬于腸桿菌屬、克雷白菌屬、沙雷菌屬、歐文菌屬或泛菌屬、埃希氏菌屬、假單孢菌屬、節(jié)桿菌屬、氣桿菌屬等等。如何判別一種細菌是否具有恩特納—道德洛夫途徑，舉例來說就是將細胞碎片懸濁液與甘油醛-3-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸以及乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸混合，然后通過測定365nm處吸收增強來檢測是否有以6-磷酸葡萄糖酸為底物合成的3-磷酸甘油醛。如果一種細菌被證明可產(chǎn)生甘油醛3-磷酸，那么該細菌就具有恩特納—道德洛夫途徑。
本發(fā)明中所用到的細菌可以根據(jù)所需要合成的-L-氨基酸的種類而適當選擇。下面詳細的列舉了一些適合生產(chǎn)L-氨基酸的細菌。但本發(fā)明的范圍不受這些例子的限制。
腸桿菌屬中的具體細菌如下成團腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌河生腸桿菌阿氏腸桿菌陰溝腸桿菌溶解腸桿菌日勾維腸桿菌霍氏腸桿菌中間腸桿菌超壓腸桿菌阪崎腸桿菌泰洛腸桿菌更優(yōu)選下列細菌菌株成團腸桿菌ATCC12287成團腸桿菌AJ13355成團腸桿菌AJ13356成團腸桿菌AJ13601成團腸桿菌AJ13355和AJ13556于1998年2月19日在國家生物科學和人類技術(shù)研究所的工業(yè)科學技術(shù)代理處(National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science and Technology)(目前為一個獨立的管理公司，國際性專利組織保藏中心、國家高級工業(yè)科學技術(shù)研究所(International Patent Organism Depositary，National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology)，地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，postal code.305-5466)保藏，其受理登記號分別為FERM P-16644和FERM P-16645。然后根據(jù)布達佩斯條約(Budapest Treaty)的有關規(guī)定在1999年1月11日該保藏成為國際保藏，其受理登記號為FERM BP-6614和FERM BP-6615。1999年8月18日成團腸桿菌AJ13601在國家生物科學和人類技術(shù)研究所的工業(yè)科學技術(shù)代理處(National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science and Technology)開始保藏，其受理登記號為FERM P-17516。然后根據(jù)布達佩斯條約的有關規(guī)定在2000年7月6日該保藏成為國際性保藏，其受理登記號為FERMBP-7207。成團腸桿菌ATCC 12287可從ATCC獲得(美國模式培養(yǎng)物保藏所(Amedcan Type CultureCollection)，10801 Universityy Boulevard，Manassas，VA20110-2209，U.S.A.)。
克雷白菌屬細菌舉例如下植生克雷白菌土生克雷白菌更優(yōu)選植生克雷白菌AJ13399。植生克雷白菌AJ13399于1998年2月19日在國家生物科學和人類技術(shù)研究所的科學技術(shù)代理處(National Institute ofBioscience and Human-Technology，Agency of Science and Technology)(目前為一個獨立的管理公司，國際性專利組織保藏中心、國家高級工業(yè)科學技術(shù)研究所)保藏，其受理登記號為FERM P-16646。然后根據(jù)布達佩斯條約的有關規(guī)定在1999年1月11日該保藏成為國際保藏，其受理登記號為FERMBP-6616。
植生克雷白菌AJ13399菌株是從北海道札幌(Sapporo-Shi，Hokkaido)的土壤中分離得到的。
用于本發(fā)明的沙雷菌屬細菌的例子如下液化沙雷菌嗜蟲沙雷菌無花果沙雷菌居泉沙雷菌格氏沙雷菌變形斑沙雷菌氣味沙雷菌普利茅斯沙雷菌深紅沙雷菌更優(yōu)選下列細菌菌株液化沙雷菌ATCC 14460液化沙雷菌ATCC 14460可從ATCC獲得。
用于本發(fā)明的歐文菌屬細菌的例子如下草生歐文菌(現(xiàn)在已劃歸成團泛菌屬)菠蘿歐文菌仙人掌腐爛病歐文菌菊歐文菌野梧桐歐文菌桃色歐文菌番石榴歐文菌櫟歐文菌大黃歐文菌生紅歐文菌柳歐文菌噬夏孢歐文菌更優(yōu)選草生歐文菌IAM1595(成團泛菌AJ2666)。草生歐文菌IAM1595可從東京大學分子細胞生物學研究所(Institute of Molecular and Cellular Bioscience，the University of Tokyo)獲得。
在伯格的《鑒定細菌學手冊》第9版(Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology，9th.Ed)中沒有提到草生歐文菌，因為它已被劃歸為成團泛菌。歐文菌屬細菌和泛菌屬細菌彼此緊密相關，所以泛菌屬細菌可同樣做為歐文菌屬細菌使用。以上提到的成團泛菌和分散泛菌以及菠蘿泛菌就屬于這種泛菌屬。草生歐文菌IAM1595被指定為成團泛菌AJ2666，1999年2月25日，在國家生物科學和人類技術(shù)研究所的科學技術(shù)代理處(目前為一個獨立的管理公司，國際性專利組織的保藏中心、國家先進工業(yè)科學技術(shù)研究所(International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology))保藏，根據(jù)布達佩斯條約的有關規(guī)定申請獲得國際保藏，其受理登記號為FERMBP-6660。
用于本發(fā)明的埃希氏菌屬細菌的例子包括大腸埃希氏桿菌。
更優(yōu)選具有抗纈氨酸的大腸埃希氏桿菌，具體的例子包括以下菌株大腸埃希氏桿菌K-12(ATCC 10798)大腸埃希氏桿菌W(ATCC 9637)大腸埃希氏桿菌K-12(ATCC 10798)和大腸埃希氏桿菌W(ATCC 9637)可從ATCC獲得。
本發(fā)明中所用到的革蘭氏陰性細菌具有生產(chǎn)L-氨基酸的能力，和前面提到的恩特納—道德洛夫途徑，并且經(jīng)過修飾使得EDD和EDA的活性分別或同時得到增強。本發(fā)明中所用的細菌優(yōu)選革蘭氏陰性細菌，其經(jīng)過修飾使得EDD和EDA活性同時得到增強。
“經(jīng)過修飾使得EDD或EDA活性增強”的含義是指修飾過的菌株單位細胞中EDD或EDA活性比野生菌株的要高。例如可以提及的是單位細胞中EDD或EDA的分子數(shù)量增加，單位EDD或EDA分子中EDD或EDA特定活性的增強等等。另外，與之相比較的野生菌株沒有經(jīng)過任何以增強EDD或EDA活性為目的的處理。
可通過增加編碼EDD和/或EDA的基因的拷貝數(shù)來增強細菌的EDD和/或EDA活性。例如，將編碼EDD和/或FDA的基因片段與一個在靶細菌中有功能的載體(優(yōu)選多拷貝載體)相連接制備成重組DNA，然后可將重組DNA導入細菌使之轉(zhuǎn)化。為了使EDD和EDA的活性同時增強，可以將編碼EDD和EDA的基因片段分別引入到不同的載體上，但優(yōu)選將二者引入到相同的載體上?？蓪⒅亟MDNA導入具有生產(chǎn)L-氨基酸能力的細菌中，也可選擇性的導入野生菌株中獲得轉(zhuǎn)化菌株，賦予該轉(zhuǎn)化菌株生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
象編碼EDD和編碼EDA的基因一樣，可以使用具有恩特納—道德洛夫途徑的衍生自革蘭氏陰性菌的任何基因。特別要提及的是衍生自埃希氏菌屬細菌的基因。有研究報道衍生自大腸桿菌的編碼EDD的基因(edd)和編碼EDA的基因(eda)可組成一種操縱子(J.Bacteriol.，174(14)4638-46，July 1992)。在下文中edd就指編碼EDD的基因，eda就指編碼EDA的基因。此外，也有研究報道了從發(fā)酵單孢菌屬細菌中得到基因，通過PCR法(Polymerase ChainReaction，參見White，T.J.et al.，Trends Genet.5，185(1989))或雜交可得到edd和eda基因，前者所用的引物主要是來自這些基因的序列，后者所用探針基于前面所提到的基因序列。例如，可利用edd-F(SEQ ID NO1)和eda-R(SEQ ID NO2)作引物(描述見后)通過PCR方法獲得一個包含有大腸桿菌edd基因和eda基因的操縱子片段。也可通過類似的方法獲得其它微生物的edd基因和eda基因。研究表明適宜的雜交條件是在60℃，鹽離子濃度為1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC，0.1％SDS的條件下進行洗滌。
另外，本發(fā)明中所使用的edd基因和eda基因并不局限為野生型基因，它們也可以是突變型或人工改造的基因，這些基因編碼的產(chǎn)物包括氨基酸的置換、缺失、插入、疊加等，可以是在一個或多個位點出現(xiàn)有一個或幾個氨基酸的上述變化，但只要EDD和EDA的功能不被削弱即可。雖然上面所提到的“幾個”氨基酸數(shù)量的不同是由蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基的位置和類型所決定的，但這可能是特定的由2到60，優(yōu)選從2到40，更優(yōu)選從2到20。另外，因為這種DNA編碼的蛋白質(zhì)與前面所提到的EDD和或EDA基本上相同，可以用它和已知的edd或eda基因(例如GenBank accession L20897，X58364，M60615，M37892)的核苷酸序列或由這些核苷酸序列制備的探針在嚴格條件下進行DNA雜交，并合成與EDD或EDA活性相似的蛋白質(zhì)。這里所說的“嚴格條件”是指在此條件下只產(chǎn)生特異性的雜交，而不產(chǎn)生非特異性的雜交。很難用數(shù)字來清楚的描述這種反應條件，然而，舉例來說嚴格條件包括DNA具有高度同源性的情況，例如DNA的同源性達到50％或以上時可發(fā)生DNA間的雜交，但DNA的同源性低于50％則DNA之間不發(fā)生雜交。研究表明，可選擇的DNA之間雜交的嚴格條件是鹽離子濃度符合Southern雜交的常規(guī)洗滌條件，即在60℃，1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC，0.1％SDS。
利用Saito和Miura方法(參見H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)，Text for Bioengineering Experiments，Edited by the Society forBioscience and Bioengineering，Japan，pp.97-98，Baifukan，1992)或類似的方法，以細菌做為DNA供體制備染色體DNA。
如果通過PCR方法擴增的edd基因和/或eda基因片段與在大腸桿菌或類似細菌中具有DNA自主復制功能的載體連接，構(gòu)建重組DNA，然后再將重組DNA導入大腸桿菌細胞中，那么接下來的工作就比較容易了。在大腸桿菌中具有自主復制功能的載體主要有pMW219，pSTV28，pUC19，pUC18，pHSG299，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pBR322，pACYC184等等。
可以使用到目前為止文獻報道的轉(zhuǎn)化方法，將上面所提到的重組DNA導入革蘭氏陰性細菌中。例如，可提及的方法有DA Morrison(Methods inEnzymology，68，326(1979))方法，一種用氯化鈣處理受體細菌以增加DNA通透性的方法(Mandel.，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，電穿孔方法(Miller J.H.，″A Short Course in Bacterial Genetics；Handbook″，Cold Spring HarborLaboratory Press，U.S.A，p.279，1992)等等。
通過細菌染色體DNA容納edd基因和/或eda基因的多拷貝也能增加edd基因和/或eda基因的拷貝數(shù)。用染色體DNA中存在的多拷貝序列做為靶位點，進行同源重組，以便將edd和/或eda基因的多拷貝導入細菌的染色體DNA中。因為多拷貝序列是存在于染色體DNA上的，所以可以利用位于轉(zhuǎn)座因子末端的重復DNA或反向重復。另外，據(jù)日本專利局的公開出版物(Japanese PatentLaid-open Publication)No.2-109985的報道，可將edd和/或eda基因合并進一個轉(zhuǎn)座子中，然后轉(zhuǎn)化細菌，使基因的多拷貝插入染色體DNA中。
除了上面所提到的基因擴增的方法外，還可通過用更強的表達調(diào)節(jié)序列替代諸如染色體DNA或質(zhì)粒上調(diào)節(jié)edd和/或eda基因的啟動子的表達調(diào)節(jié)序列的方法來增加EDD和/或EDA的活性。例如，lac啟動子，trp啟動子、tr啟動子等都是公知的強啟動子。另外，國際專利出版物(International PatentPublication)WO00/18935中介紹了另外一種方法，在edd基因和/或eda基因的啟動子上取代幾個核苷酸，被修改的啟動子變?yōu)閺妴幼印@些啟動子的取代或修飾提高了edd基因和/或eda基因的表達水平，從而使EDD和/或EDA的活性增加?？蓪⑦@些表達調(diào)節(jié)序列進行修飾的方法與增加edd基因和/或eda基因拷貝數(shù)的方法結(jié)合使用。
將細胞碎片懸濁液與甘油醛-3-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡糖酸混合，然后檢測是否有以6-磷酸葡糖酸為底物合成的甘油醛3-磷酸，這樣可判斷EDD和EDA的活性是否增強。在該反應中，可通過對加入6-磷酸葡糖酸脫氫酶反應后殘存的6-磷酸葡糖酸定量來測定EDD的活性，或是使用乳酸脫氫酶在2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶過量時所產(chǎn)生的丙酮酸定量來測定EDD的活性。以在脫氫酶反應過程中NADH的增加來對6-磷酸葡糖酸和丙酮酸進行定量。另外，EDA的活性也可通過在乳酸脫氫酶作用下以2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸為底物合成丙酮酸的量來判定。
在本發(fā)明的革蘭氏陰性細菌中，除了EDD和EDA外，也可增強其它參與L-氨基酸的生物合成的酶活性，只要這種作用不會減低EDD和EDA的活性就行。
例如，當靶L-氨基酸是L-谷氨酸時，這些酶包括谷氨酸脫氫酶(以下簡稱為GDH)、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶、烏頭酸水合酶、檸檬酸合成酶(以下簡稱CS)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下簡稱PEPC)、磷酸烯醇丙酮酸合酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、果糖二磷酸醛縮酶、果糖磷酸激酶、葡糖磷酸異構(gòu)酶等等。當用于合成-L-谷氨酸的細菌屬腸桿菌菌屬時，優(yōu)選上面所提到的酶中CS、PEPC和GDH任何一種到三種。更優(yōu)選CS、PEPC和GDH這三種酶的活性都增強。特別優(yōu)選乳糖發(fā)酵短桿菌屬的CS，因為它不受α-酮戊二酸、L-谷氨酸和NADH的抑制。
至于哪些有機體能夠作為編碼CS的基因(gltA)、編碼GDH的基因(gdhA)和編碼PEPC的基因(ppc)的供體，只要有機體具有CS、PEPC和GDH活性，都可被利用。特別是那些屬于原核生物的細菌，例如腸桿菌屬、克雷白菌屬、歐文菌屬、泛菌屬、沙雷菌屬、埃希氏菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬或芽孢桿菌屬等。具體的菌株包括大腸桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌等等。從上面所提到的微生物染色體DNA中都可分離出gltA、ppc和gdhA基因。
通過不含CS，PEPC和GDH的突變株與前面所提到的微生物染色體DNA中分離出的DNA片段進行營養(yǎng)缺陷的補充作用可分別獲得gltA、ppc和gdhA基因。另外，因為大腸桿菌和棒狀桿菌的核苷酸序列已經(jīng)全部闡明(Biochemistry，22.5243-5249，1983J.Biochem.，95909-916，1984；Gene，27193-199，1984.Microbiology，1401817-1828，1994；Mol.Gen.Genet，218，330-339，1989；Molecular Microbiology，6317-326，1992)，就可通過其各自的核苷酸序列進行引物設計，以染色體DNA為模板通過PCR獲得這些基因片段。關于將這些基因?qū)肽c道桿菌等革蘭氏陰性細菌過程的詳細說明，可見EP 0 670 370 A2，U.S.Patent No.6,197,559，EP 0 999 282A2和EP 1 078 989 A2。
提高CS、PEPC、GDH以及前面所提到的其它酶的活性的方法與上面所介紹的增強EDD和EDA活性的方法相同。
另外，在本發(fā)明所用細菌中，可以減低或消除那些參與在合成靶L-氨基酸的生物途徑的分支中合成其它產(chǎn)物的酶活性，但只要不影響EDD和/或EDA活性的增強就可以。例如，在合成L-谷氨酸時，這些酶的例子包括α-酮戊二酸脫氫酶(以下簡稱αKGDH)，異檸檬酸裂合酶、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酸激酶、乙酰羥酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、L-谷氨酸脫羧酶、1-吡咯啉脫氫酶等等。
為了降低或消除前面所提到的酶活性，可采用紫外線照射處理微生物的方法，或者使用一些常規(guī)的誘變劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸進行誘變，然后選擇那些靶酶活性降低的突變株，也可采用基因裂解方法或類似的方法，在同源重組的基礎上進行基因置換。編碼αKGDH的基因的裂解方法詳見U.S.Patent No.5,977,331。
如果想要將除edd基因和eda基因以外的其它基因轉(zhuǎn)導入本發(fā)明中的細菌時，優(yōu)選使用盡可能少的載體種類。因為，一種載體通常都帶有一個標志基因，這就需要在培養(yǎng)基中加入所需的相應試劑。如果使用了多種載體，也就必須有大量的試劑加入培養(yǎng)基中。這可能會影響菌株的生長，所以，通常情況下優(yōu)選使用較少的載體種類。優(yōu)選使用兩種或兩種以下，更優(yōu)選一種載體或一個載體。
此外，當使用兩種或兩種以上具有不同拷貝數(shù)的載體時，優(yōu)選根據(jù)導入基因種類，來確定在高拷貝載體和低拷貝載體間的基因分布。
用于基因分離、基因?qū)胨拗骷毦?、基因裂解等的方法可以是本領域技術(shù)人員所熟知的通常方法，主要包括染色體DNA的制備、創(chuàng)建染色體DNA文庫、雜交、PCR、制備質(zhì)粒DNA、消化裂解DNA、轉(zhuǎn)化、設計一段寡核苷酸序列做為引物等方法。這些方法在1989年冷泉港實驗室出版的由Sambrook J.，F(xiàn)ritsch EF，and Maniatis T.編寫的《分子克隆與實驗技術(shù)指南》第二版等書中(Sambrook J.，F(xiàn)ritsch E F，and Maniatis T，“Molecular Cloning A LaboratoryManual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989))有詳細描述。<2>使用本發(fā)明的細菌生產(chǎn)L-氨基酸在培養(yǎng)基中培養(yǎng)前面所提到的通過本發(fā)明的方法獲得的細菌來生產(chǎn)L-氨基酸，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和累積了L-氨基酸，并從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸。
為了使用本發(fā)明的細菌生產(chǎn)L-氨基酸，可使用普通的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中主要含有一般培養(yǎng)基所需要的碳源、氮源、無機鹽、微量有機養(yǎng)分如氨基酸和維生素等。合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基都可以。只要是能被培養(yǎng)的細菌利用，可以使用任何碳源和氮源。
糖類可作為碳源使用，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和蜜糖。有機酸如醋酸、檸檬酸；醇類如乙醇等，可單獨使用這些物質(zhì)，也可與其它含碳源聯(lián)合使用。在這些物質(zhì)中優(yōu)選葡萄糖和蔗糖。
可以使用的氮源有氨水，銨鹽如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨和醋酸銨，硝酸鹽等。
微量有機養(yǎng)分可以是氨基酸、維生素、脂肪酸和核苷酸，還可有蛋白胨、酪蛋白氨基酸、和含有它們的酵母提取液和大豆蛋白分解產(chǎn)物等等。當培養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型變異株時，優(yōu)選提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)。
無機鹽可以使用磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等。
培養(yǎng)基主要是由所用細菌的類型來決定，需氧培養(yǎng)的條件通常是控制酵解溫度在20-45℃之間，PH值在5-9之間。在培養(yǎng)過程中當PH值降低時可加入碳酸鈣，或者用氨氣等堿性物質(zhì)來中和培養(yǎng)物。用這種方法培養(yǎng)10到120個小時，就可在肉湯培養(yǎng)基中積累大量的L-谷氨酸。
可以使用公知的方法從完成培養(yǎng)后的肉湯培養(yǎng)基中提取L-氨基酸，如利用離子交換樹脂法、沉淀法等等。
實施例下面將參照實施例更詳細地闡述本發(fā)明。<1>恩特納—道德洛夫途徑所涉及的酶的基因克隆已經(jīng)從大腸桿菌和運動發(fā)酵單孢菌等細菌中克隆出了edd基因和eda基因，它們分別編碼參與恩特納—道德洛夫途徑的兩種酶EDD和EDA。成團腸桿菌在分類上屬腸桿菌屬，但通常認為它與大腸桿菌緊密相關。另外有研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的基因可在成團腸桿菌中表達。因此，決定從大腸桿菌中克隆edd和eda基因。
在大腸桿菌中edd和eda基因構(gòu)成一個操縱子(J.Bacteriol.，174(14)4638-46，July 1992)，因此設計了edd-F(SEQ ID NO1)和eda-R(SEQ ID NO2)這樣一對引物，通過PCR的方法同時擴增兩個基因和包括兩個基因的DNA片段。PCR使用的是PyrobestDNA聚合酶(由Takara Shuzo生產(chǎn))，反應條件在94℃條件下反應1min，然后是在94℃條件下反應30sec，在60℃條件下反應30sec，在72℃條件下反應3min，重復30個循環(huán)。
然后將得到的擴增片斷用限制性內(nèi)切酶SalI和BamHI進行消化，將消化后的產(chǎn)物與同樣用限制性內(nèi)切酶SalI和BamHI消化的質(zhì)粒pMW219進行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(購自Takara Shuzo)。從轉(zhuǎn)化菌中篩選出五株含有目的片段的克隆菌株，從這些菌株中提取質(zhì)粒。
利用電穿孔方法將每個質(zhì)粒轉(zhuǎn)入成團腸桿菌AJ13601菌株中(Miller J.H,″AShort Course in Bacterial Genetics；Handbook″，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，U.S.A.，p.279，1992)，然后檢測EDD和EDA的活性，篩選出表達edd基因和eda基因的克隆菌株。
通過以下方法得到AJ13601菌株。從土壤中分離出成團腸桿菌AJ13355，這種菌的特點是在酸性環(huán)境下對L-谷氨酸耐受，并且其生長速度很快。然后從AJ13355菌株中得到一株低粘附力的變異株，將其αKGDH基因破壞從而得到AJ13356菌株。因為其αKGDH-E1蛋白亞單位的基因SUCA被破壞，所以該菌株不具有αKGDH酶活性。然后，將質(zhì)粒RSFCPG和pSTVCB共轉(zhuǎn)化AJ13356菌株，前者含有從大腸桿菌分離的檸檬酸合成酶基因(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)和谷氨酸脫氫酶基因(gdhA)，后者含有從乳糖發(fā)酵短桿菌分離的gltA基因，這樣就得到了SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株。由該菌株篩選出的AJ13601菌株在低PH的環(huán)境下對L-谷氨酸的抗性增強，其生長速度也達到最佳(EP 1 078 989 A2)。
用前面描述的含有edd基因和eda基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細菌，隨機挑選出幾株菌，在LBGM9液體培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基中包括10g/L的胰蛋白胨，5g/L的酵母提取液，5g/L NaCl和5g/L的葡萄糖，1/10體積的消毒的10倍的M9液(128g/L Na2HPO4·7H2O，30g/L KH2PO4，5g/L NaCl，10g/L of NH4Cl)中培養(yǎng)15個小時，同時培養(yǎng)基中加入了四環(huán)素、氯霉素和卡那霉素，濃度分別為12.5mg/L，25mg/L或25mg/L。然后離心肉湯培養(yǎng)基回收細胞，用50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.6)和10mM MgCl2洗兩次，再用同樣的緩沖液重懸。用超生波進行細胞破碎，15000rpm離心30分鐘，將上層清液作為粗制酶溶液。
利用分光光度法測定這兩種酶的反應產(chǎn)物來同時檢測EDD和EDA的活性。即將50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM MgCl2，1mM EDTA，1mM APAD(乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸)，5mM K2HPO4，20單位的甘油醛3-磷酸、6-磷酸葡糖酸和粗制酶溶液混合在一起，用測量365nm波長吸光度的增加值來測定以6-磷酸葡糖為底物合成的甘油醛3-磷酸的量。用同樣的方法可測定轉(zhuǎn)化一個載體的菌株，結(jié)果見表1。
表1

已經(jīng)證明所有菌株的活性都得到增強，活性最高增加了約7.2倍，該菌株所含質(zhì)粒稱為pMW-EDDA。<2>使用恩特納—道德洛夫途徑增強型菌株生產(chǎn)L-谷氨酸首先檢測恩特納—道德洛夫途徑增強型菌株對生產(chǎn)L-谷氨酸的影響。
上述章節(jié)提到的成團腸桿菌AJ13601菌株含有兩種質(zhì)粒，進一步又導入了edd基因和eda基因的菌株含有三種質(zhì)粒。因此，在培養(yǎng)基中就必須加入三種試劑，這就使細菌的生長受到抑制，即在產(chǎn)生L-谷氨酸的培養(yǎng)系統(tǒng)中幾乎沒有細菌生長。因此只能使用兩種質(zhì)粒，這就需要將乳酸發(fā)酵短桿菌的檸檬酸合成酶(以下簡稱CS)基因、edd基因和eda基因連接入一個質(zhì)粒。
載體pSTV28用來構(gòu)建含有乳酸發(fā)酵短桿菌CS基因的質(zhì)粒PSTVCB，載體pMW219用來克隆edd基因和eda基因，而前者是高拷貝載體。如果考慮在乳酸發(fā)酵短桿菌AJ13601菌株中利用pSTV28載體增加CS基因的數(shù)量，就必須利用pMW219載體導入這種基因來增加它的表達量。因此，構(gòu)建一個基因，其特點是用來自大腸桿菌的CS基因啟動子區(qū)域替代CS基因的啟動子區(qū)域。
首先，以大腸桿菌W3110的染色體DNA為模板，用GLTES1(SEQ ID NO3)和GLTEB0(SEQ ID NO.4)做引物擴增CS基因的啟動子片段。然后，以短桿菌屬乳酸發(fā)酵菌2256的染色體DNA為模板，用GLTBB0(SEQ ID NO5)和GLTBA1(SEQ ID NO6)作引物，擴增CS基因的ORF片段。用以上兩種片段做模板，以GLTES2(SEQ ID NO7)和GLTBA2(SEQ ID NO8)做引物，采用遺傳交換型PCR方法獲得靶片段。將該片段用限制性內(nèi)切酶SmaI和HindIII消化，然后連接到pSTV28載體上相同的位點，獲得了新的質(zhì)粒pSTV-CB(*)，這種質(zhì)粒再經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnI和HindIII消化，就可得到一段包含有大腸桿菌CS基因的啟動子和乳酸發(fā)酵短桿菌CS基因編碼區(qū)的融合基因片段，再用T4 DNA聚合酶將末端補平。將這段融合基因連接到pMW219載體上的SmaI位點構(gòu)成新的質(zhì)粒pMW-CB(*)。另外，將pMW-EDDA質(zhì)粒用BamHI消化后與上面的融合片段連接，再用T4 DNA聚合酶將末端補平，構(gòu)成新的質(zhì)粒pMW-CB(*)·ED。
接下來，將AJ13601菌株在LBGM9液體培養(yǎng)基中于31.5℃振蕩過夜，適當?shù)南♂尯笸康郊佑?2.5mg/L四環(huán)素的LBGM9培養(yǎng)皿中，要保證每個平皿中有100到200個克隆菌落。挑出合適的菌落在含有12.5mg/L四環(huán)素和25mg/L氯霉素的LBGM9培養(yǎng)皿中復制，從中再挑出耐氯霉素的菌株G106S。G106S菌株只含有RSFCPG不含有pSTVCB.在這種菌株中再轉(zhuǎn)化pMW-CB(*)或pMW-CB(*)·ED質(zhì)粒，分別構(gòu)建成G106S pMW-CB(*)和G106S pMW-CB(*)·ED。
為了評價這些菌株生產(chǎn)L-谷氨酸的能力，采用發(fā)酵罐方法進行評價。所用培養(yǎng)基是300ml的液體培養(yǎng)基，其包括了50g/L的蔗糖，0.4g/L MgSO4，0.1ml/L GD-113(消泡劑)，4g/L of(NH4)2SO4，2g/L KH2PO4，4g/L的酵母提取液，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L of MnSO4·4-5H2O，0.4g/L L-賴氨酸，0.4g/LDL-蛋氨酸0.4g/L二氨基庚二酸，12.5mg/L四環(huán)素和25mg/L氯霉素。培養(yǎng)條件是通氣量1/1VVM，1300rpm的轉(zhuǎn)速，用氨水調(diào)節(jié)PH在6.0直到蔗糖被分解完畢。培養(yǎng)基的660nm吸光度隨時間而變化，培養(yǎng)基中L-谷氨酸的產(chǎn)量，見圖1所示。L-谷氨酸的最終產(chǎn)量見表2。
表2

結(jié)果表明雖然培養(yǎng)的時間延長了，但通過加強恩特納—道德洛夫途徑，可以增強菌株生產(chǎn)L-谷氨酸的能力。<3>恩特納—道德洛夫途徑增強型菌株生產(chǎn)3-羥基丁酮和2，3-丁二醇的研究用與<2>中評價L-氨基酸生產(chǎn)能力的方法培養(yǎng)前面所提到的G106SpMW.-CB(*)和G106S pMW.-CB(*)·ED菌株，在培養(yǎng)過程中測定培養(yǎng)基和細胞中的3-羥基丁酮和2，3-丁二醇的產(chǎn)量。測量方法采用氣相色譜法(ShimadzuCorporation，GC-1700A)，具體條件如下色譜柱VARIAN PORAPLOTQ PLOT FS25×32(0.32mm×25M)溫度氣化室溫度250℃，柱內(nèi)溫度240℃，F(xiàn)ID250℃色譜柱進口壓力180kPa載氣流量1.6062ml/min結(jié)果見圖2A(培養(yǎng)基中3-羥基丁酮的量)，圖2B(培養(yǎng)基中2，3-丁二醇的產(chǎn)量)和圖2C(單位細胞中3-羥基丁酮和2，3-丁二醇的產(chǎn)量總和)。結(jié)果顯示增強恩特納—道德洛夫途徑可提高3-羥基丁酮和2，3-丁二醇的產(chǎn)量。
序列列表<110>味之素株式會社<120>L-氨基酸的生產(chǎn)方法<130>OP1517<140><141>2003-03-<150>JP 2002-88668<151>2002-03-27<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>1cgctagtcga ccaattttta cactttcagg cctcg35<210>2<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>2gggggggatc cagtcagaat gtcacgtttg ataat 35<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>3cccccgggtc tgttacctgc agacgtcg 28<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>4acgcacgata tccctttcaa acatttaagg tctccttagc gc 42<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>5gtttaaagg gatatcgtgg ct22<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>6aaaagcttat cgacgctccc ctcccca 27<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>7cccccgggat ttccttcctc cggtctgctt30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>8taaagcttgg tcagggcgtt ggcggtggcg30
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生L-氨基酸的微生物，在培養(yǎng)基中累積L-氨基酸，從培養(yǎng)基收集L-氨基酸，其中培養(yǎng)的微生物為具有恩特納—道德洛夫途徑的革蘭氏陰性細菌，且它已經(jīng)被改造過，使得它的6-磷酸葡糖酸脫水酶或2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶的活性被分別或同時增強，以丙酮酸做中間物的生物合成途徑可產(chǎn)生多種L-氨基酸，從中選擇此特定的L-氨基酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中細菌為一種腸道桿菌。
3.權(quán)利要求2的方法，其中細菌屬于腸桿菌屬。
4.權(quán)利要求1-3的任何一種方法，其中通過增加編碼6-磷酸葡糖酸脫水酶或2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶基因的拷貝數(shù)提高這兩種酶的活性，或者通過修飾基因的表達調(diào)節(jié)序列，使細菌細胞中二者的表達量提高。
5.權(quán)利要求1的方法，其中的L-氨基酸是L-谷氨酸，或者是由L-谷氨酸做為中間物或氨基供體經(jīng)生物合成的L-氨基酸。
6.權(quán)利要求1-5的任何一種方法，其中的L-氨基酸選自L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-丙氨酸。
7.權(quán)利要求6的方法，其中的L-氨基酸是L-谷氨酸。
全文摘要
一種生產(chǎn)L－氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生L－氨基酸的微生物，在培養(yǎng)基中積累L－氨基酸，從培養(yǎng)基收集L－氨基酸。培養(yǎng)的微生物為具有恩特納—道德洛夫途徑的革蘭氏陰性細菌，且它已經(jīng)被改造過，使得它的6－磷酸葡糖酸脫水酶或2－酮－3－脫氧－6－磷酸葡糖酸醛縮酶的活性被分別或同時增強。
文檔編號C12N1/21GK1446920SQ03122688
公開日2003年10月8日 申請日期2003年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月27日
發(fā)明者原吉彥, 泉井裕, 淺野貴弘, 渡邊保之, 中松亙 申請人:味之素株式會社