專利名稱：一種利用基因工程手段制備人干擾素ω的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種利用基因工程手段制備人干擾素ω的方法。
背景技術(shù)：
人干擾素ω發(fā)現(xiàn)于1985年，是同α干擾素功能相近但抗原性不同的一類干擾素分子(Hauptmann R，Swetly P.A novel class of human type Iinterferons[J].Nucleic Acids Res，1985，13(13)4739-4749.)。利用標(biāo)準(zhǔn)抗病毒試驗(yàn)，已經(jīng)測(cè)定出人干擾素ω的比活性為2.7～4×108U/mg。通過(guò)仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)，已經(jīng)成功地利用人外周血白細(xì)胞產(chǎn)生并純化出了人干擾素ω(Adolf G R，Maurer-Fogy I，Kalsner I et al.Purification and characterization of natural humaninterferon omega 1.Two alternative cleavage sites for the signal peptidase[J].JBiol Chem，1990，265(16)9290-9295.)。另外，利用不同的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，分別在大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞和CHO細(xì)胞中表達(dá)了重組的人干擾素ω。這些使得對(duì)該蛋白的深入研究成為可能。在幾種人腫瘤的小鼠模型中，包括卵巢癌、黑色素瘤和皮膚癌等，證實(shí)了人干擾素ω具有體內(nèi)的抗腫瘤功能(Horton H M，Hemandez P，Parker S E，et al.Antitumor effects of interferon-omegain vivotherapy of human tumor xenografts in nude mice[J].Cancer Res，1999，59(16)4064-4068.)。利用人的肝癌細(xì)胞系，Hagelstein J等(Hagelstein J，Kist A，Stremmel W，et al.Antiviral potential of interferon-omega on hepatitis B virusreplication in human hepatoma cells[J].Arzneimittelforschung，1998，48(3)343-347.)比較了各種干擾素對(duì)乙肝病毒復(fù)制的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人干擾素ω具有同α干擾素、γ干擾素以及腫瘤壞死因子α相似的抑制病毒復(fù)制作用。在體外對(duì)HIV病毒的抑制實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)人干擾素ω有比α干擾素更強(qiáng)的抑制病毒蛋白合成的作用。由于人干擾素ω具有較強(qiáng)的抗病毒復(fù)制，抗細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)等作用，該細(xì)胞因子有望用于治療多種腫瘤、病毒性疾病以及對(duì)α干擾素耐藥的患者。
畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)(Pichia pastoris)是近幾年建立的一種真核表達(dá)系統(tǒng)(Cereghino J L，Cregg J M.Heterologous protein expression in themethylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMS Microbiol Rev，2000，24(1)45-66.)，是用于表達(dá)外源蛋白的最成功的表達(dá)系統(tǒng)之一。由于它既具有原核表達(dá)系統(tǒng)，如常用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，繁殖迅速，費(fèi)用低廉及操作方便的特點(diǎn)，又具有真核表達(dá)系統(tǒng)能對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確加工、折疊及適度糖基化的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，重組蛋白易于純化。因此正越來(lái)越廣泛地用于蛋白質(zhì)的大量表達(dá)。目前已有200多種蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中得以表達(dá)(Cregg JM，Cereghino JL，Shi JY，et al.Recombinant protein expression in Pichia pastoris[J].Mol Biotechnol，2000，16(1)23-52.)。
畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)包括胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)兩種方式，其中分泌表達(dá)由于其表達(dá)量高，糖基化完全，二硫鍵和高級(jí)結(jié)構(gòu)形成正確，尤其是后續(xù)分離純化簡(jiǎn)單方便而備受青睞。
畢赤酵母是一種甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母菌，其生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，可以高密度連續(xù)培養(yǎng)；其遺傳操作與釀酒酵母相似，技術(shù)已相當(dāng)成熟；表達(dá)載體中普遍使用的醇氧化酶基因的啟動(dòng)子(pAOX1)為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，受葡萄糖抑制，甲醇誘導(dǎo)后才開(kāi)始轉(zhuǎn)錄、翻譯，非常適合于外源基因的表達(dá)。
pPIC9K是Invitrogen公司推出的多拷貝分泌型表達(dá)載體。大小為9.3kb。該載體含有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)Col E1和氨芐青霉素及卡那霉素兩個(gè)抗性基因，其中卡那霉素抗性基因還可以使畢赤酵母對(duì)G418產(chǎn)生抗性，可用于多拷貝插入的篩選。pPIC9K利用α因子的分泌信號(hào)將目的基因分泌至胞外。由于畢赤酵母本身僅分泌約占總量5％的蛋白至胞外，因此對(duì)分泌表達(dá)的蛋白進(jìn)行分離純化極為方便。
目前，尚沒(méi)有利用Pichia pastoris酵母表達(dá)系統(tǒng)制備人干擾素ω的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次利用Pichia pastoris酵母表達(dá)系統(tǒng)制備了人干擾素ω。
制備方法包括以下步驟構(gòu)建分泌型酵母表達(dá)載體pMEX9K。利用分泌型表達(dá)載體pPIC9K表達(dá)的外源蛋白存在著不正確的N端，這些多出的氨基酸殘基會(huì)影響和改變所表達(dá)的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能(Goda S，Takano K，Yamagata Y.et al.Effect of extraN-terminal residues on the stability and folding of human lysozyme expressed inPichia pastoris[J].Protein Eng，2000，13(4)299-307.)。為了糾正這個(gè)缺陷，發(fā)明人對(duì)分泌型表達(dá)載體pPIC9K進(jìn)行了改構(gòu)，構(gòu)建成了新的表達(dá)載體pMEX9K。分泌型酵母表達(dá)載體pMEX9K的構(gòu)建方法參見(jiàn)文章(齊連權(quán)，陳薇，于長(zhǎng)明等。兩個(gè)新型多拷貝畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2002，26(4)264-266.)。
構(gòu)建重組載體pMEX9Kω。構(gòu)建方法見(jiàn)附圖1。用PCR的方法擴(kuò)增人干擾素ω基因，分別酶切載體pMEX9K和PCR產(chǎn)物并回收酶切產(chǎn)物，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。對(duì)轉(zhuǎn)化子的酶切鑒定和序列測(cè)定表明，重組載體構(gòu)建成功。
重組載體pMEX9Kω經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)化受體菌GS115，進(jìn)行表達(dá)。
目的蛋白的分離純化。將發(fā)酵上清過(guò)預(yù)平衡的大顆粒陽(yáng)離子交換層析柱，用氯化鈉洗脫目的蛋白峰，目的蛋白峰可直接上樣于疏水層析柱，洗脫后上樣于小顆粒的陽(yáng)離子交換柱，再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的凝膠層析，目的蛋白得到了很好的分離。
目的蛋白的活性測(cè)定。按照文獻(xiàn)(中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)編.中國(guó)生物制品規(guī)程[M].北京化學(xué)工業(yè)出版社，2000，373-375.)進(jìn)行。
發(fā)明人還探索了高表達(dá)菌株的誘導(dǎo)表達(dá)條件及純化工藝。發(fā)現(xiàn)在酵母培養(yǎng)上清液中，目的蛋白的含量在誘導(dǎo)后48～60h達(dá)到最高，占培養(yǎng)上清液中總蛋白的20％～30％。在經(jīng)過(guò)四步層析純化后，目的蛋白的純度達(dá)到95％以上，回收率在30％以上。
本發(fā)明提供的人干擾素ω的制備方法具有產(chǎn)量高，表達(dá)及純化簡(jiǎn)單易行，費(fèi)用低廉，便于擴(kuò)大生產(chǎn)等特點(diǎn)，具有廣闊的市場(chǎng)前景。


圖1為人干擾素ω表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程示意圖。其中Kan+為卡那霉素抗性基因；IFNW為人干擾素ω基因SS為α-因子信號(hào)肽圖2為畢赤酵母轉(zhuǎn)化子表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖譜。
a.b.c.誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)化子的表達(dá)上清d.誘導(dǎo)前轉(zhuǎn)化子的表達(dá)上清e(cuò).目的蛋白m.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)圖3為人干擾素ω的分離純化后的SDS-PAGE分析a.純化后的目的蛋白；b.經(jīng)PNGase F糖苷酶消化后；c.PNGase F糖苷酶；m.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)具體實(shí)施方式
實(shí)施例一人干擾素ω重組表達(dá)載體的構(gòu)建1材料和方法1.1質(zhì)粒，菌種，病毒和細(xì)胞株大腸桿菌DH5α，畢赤酵母Pichia pastoris購(gòu)自華美公司。
1.2酶，載體，引物和主要試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、質(zhì)粒抽提和回收試劑盒和pGEMT載體均購(gòu)自Promega公司。引物由上海生工公司合成。FICOLL，TRIZOL，瓊脂糖購(gòu)自華美公司。YNB為Difico公司產(chǎn)品。低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為AmershamPharmacia公司產(chǎn)品。糖苷酶PNGase F購(gòu)自New England Biolabs公司。MEM培養(yǎng)基和新生牛血清購(gòu)自Hyclone公司。其他所有化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> 1.3培養(yǎng)基1.3.1大腸桿菌培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基1％蛋白胨，1％氯化鈉，0.5％酵母提取粉；LBAK培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基中分別加入氨芐青霉素和卡那霉素至終濃度為100μg/mL。
1.3.2酵母培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基1％酵母提取粉，1％蛋白胨，2％葡萄糖。BMGY培養(yǎng)基1％酵母提取粉，1％蛋白胨，1.34％YNB，1％甘油，100mmol/LpH6.0的磷酸鹽緩沖液，4×10-5％生物素。BMMY培養(yǎng)基1％酵母提取粉，1％蛋白胨，1.34％YNB，1％甲醇，100mmol/L pH6.0的磷酸鹽緩沖液，4×10-5％生物素。
1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)基采用MEM培養(yǎng)基，添加3％～10％的新生牛血清。
1.4方法1.4.1有關(guān)質(zhì)粒DNA的提取、酶切、回收、連接和轉(zhuǎn)化等均按參考文獻(xiàn)(Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T.Molecular cloninga laboratory manual[M].New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，16-56)操作。
1.4.2采用FICOLL試劑，從人血中分離白細(xì)胞，用TRIZOL提取總RNA，采用RT-PCR方法擴(kuò)增人干擾素ω基因，連接pGEMT載體，構(gòu)建pGEMTω質(zhì)粒。
1.4.3用PCR的方法從攜帶人干擾素ω基因的質(zhì)粒pGEMTω上擴(kuò)增出該基因，人干擾素ω基因的DNA序列為序列表中序列1的核苷酸序列。序列表中序列3和序列4分別為擴(kuò)增人干擾素ω的5’端和3’端引物。同時(shí)添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上游加入Xho I切點(diǎn)，下游加入Eco R I切點(diǎn)，序列3中5’第一個(gè)CTG密碼子為編碼人干擾素ω的第一個(gè)密碼子。分別用Xho I和Eco R I酶切載體pMEX9K和PCR產(chǎn)物并回收酶切產(chǎn)物，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。對(duì)轉(zhuǎn)化子的酶切鑒定和序列測(cè)定表明，重組載體構(gòu)建成功。重組載體的構(gòu)建過(guò)程如附圖1。
1.4.4重組質(zhì)粒pMEX9Kω DNA的酶切鑒定重組質(zhì)粒pMEX9Kω DNA用Xho I和Eco R I酶切鑒定，然后經(jīng)Sal I酶切，分離純化。
實(shí)施例二 重組人干擾素ω的高效表達(dá)一、材料同上實(shí)施例二、方法將上面實(shí)施例中經(jīng)過(guò)酶切的重組質(zhì)粒pMEX9Kω回收，用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。
重組克隆的篩選轉(zhuǎn)化后的GS115經(jīng)MD平板篩選得到his+重組克隆，將每個(gè)克隆同時(shí)點(diǎn)種于MD、MM平板，30℃培養(yǎng)2～3d，確定每一個(gè)菌株的Mut表型。
重組人干擾素ω的誘導(dǎo)表達(dá)將篩選出的重組克隆接種于5ml BMGY中，30℃300r/min培養(yǎng)至OD600為2.0～6.0；室溫6,000r/min離心4min。收集的菌體用BMMY懸浮并稀釋至OD600為1.0后，30℃300r/min誘導(dǎo)。每12h補(bǔ)加甲醇至0.5％。誘導(dǎo)48h后收集培養(yǎng)上清，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)并測(cè)定其生物活性。
三、結(jié)果將經(jīng)過(guò)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化的畢赤酵母GS115進(jìn)行篩選，篩選到三個(gè)表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)化子，分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)，離心并收集上清?；钚詼y(cè)定結(jié)果表明，三個(gè)陽(yáng)性克隆上清活性分別為3.2×106，1.6×106和3.0×106U/mL；利用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)，并和低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)相比較，結(jié)果如圖2。圖中在22,000處的蛋白條帶為目的蛋白，該蛋白分子量大于理論分子量，推測(cè)可能為糖基化所致(在目的蛋白的氨基酸序列中，有一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)Asn80-Met81-Thr82)。利用糖苷酶PNGase F對(duì)目的蛋白的消化證實(shí)了該推測(cè)的正確(圖3)。經(jīng)過(guò)PNGase F消化后的目的蛋白經(jīng)MALDI-TOF測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量與理論值基本一致(MALDI-TOF測(cè)定目的蛋白在PNGase F消化前后的分子量分別是22,166.10和20,340.71)。
實(shí)施例三 重組人干擾素ω的分離純化一、材料同實(shí)施例一。
二、方法將誘導(dǎo)后48h的菌液，10,000r/min離心10min后，取上清用0.45μm濾膜過(guò)濾，上樣于乙酸鈉預(yù)平衡的大顆粒陽(yáng)離子層析柱，用0.5M氯化鈉洗脫目的蛋白峰；目的蛋白峰上樣于疏水層析柱，洗脫峰上樣于小顆粒離子交換柱，500mol/L氯化鈉洗脫目的蛋白峰；目的蛋白峰上樣于Superdex 75凝膠過(guò)濾柱，并用20mmol/L PBS，150mol/L氯化鈉，pH7.2洗脫目的蛋白峰。
三、結(jié)果目的蛋白得到了很好的分離，經(jīng)薄層掃描發(fā)現(xiàn)，目的蛋白純度大于95％，如圖3。
實(shí)施例四 重組人干擾素ω的鑒定一、材料見(jiàn)實(shí)施例一。
二、方法結(jié)果人干擾素ω的N端氨基酸序列分析。利用PE公司的491蛋白序列分析儀，采用自動(dòng)Edman降解法，發(fā)明人測(cè)定了目的蛋白的氨基端的15個(gè)氨基酸殘基，其順序?yàn)長(zhǎng)GCDLPQNHGLLSRN。說(shuō)明目的蛋白具有同天然蛋白一致的氨基端氨基酸序列。
人干擾素ω的活性測(cè)定 按照文獻(xiàn)(中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)編.中國(guó)生物制品規(guī)程[M].北京化學(xué)工業(yè)出版社，2000，373-375.)進(jìn)行?；钚詼y(cè)定結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)三步層析純化后，目的蛋白的回收率在35％以上，最終目的蛋白的比活性達(dá)到了2.2×108U/mL，同文獻(xiàn)(Horton H M，Hernandez P.Parker S E，et al.Antitumor effects of interferon-omegain vivo therapy of human tumorxenografts in nude mice[J].Cancer Res，1999，59(16)4064-4068.)報(bào)道結(jié)果相似。
人干擾素ω的理化鑒定。對(duì)純化后的重組蛋白用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜技術(shù)確定其相對(duì)分子質(zhì)量，進(jìn)行了N端氨基酸序列測(cè)定和糖苷酶PNGase F消化。結(jié)果見(jiàn)實(shí)施例二。
序列表<110>軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所<120>一種利用基因工程手段制備人干擾素ω的方法<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>525<212>DNA<213>
<400>1ctgggctgtg atctgcctca gaaccatggc ctacttagca ggaacacctt ggtgcttctg 60caccaaatga ggagaatctc ccctttcttg tgtctcaagg acagaagaga cttcaggttc120ccccaggaga tggtaaaagg gagccagttg cagaaggccc atgtcatgtc tgtcctccat180gagatgctgc agcagatctt cagcctcttc cacacagagc gctcctctgc tgcctggaac240atgaccctcc tagaccaact ccacactgga cttcatcagc aactgcaaca cctggagacc300tgcttgctgc aggtagtggg agaaggagaa tctgctgggg caattagcag ccctgcactg360accttgagga ggtacttcca gggaatccgt gtctacctga aagagaagaa atacagcgac420tgtgcctggg aagttgtcag aatggaaatc atgaaatcct tgttcttatc aacaaacatg480caagaaagac tgagaagtaa agatagagac ctgggctcat cttga525<210>2<211>174<212>PRT<213>
<400>2Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Asn His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr1 5 10 15
Leu Val Leu Leu His Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Leu20 25 30Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Met Val Lys Gly Ser35 40 45Gln Leu Gln Lys Ala His Val Met Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln50 55 60Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asn65 70 75 80Met Thr Leu Leu Asp Gln Leu His Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Gln85 90 95His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly Glu Gly Glu Ser Ala100 105 110Gly Ala Ile Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu Arg Arg Tyr Phe Gln Gly115 120 125Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu130 135 140Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met145 150 155 160Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser165 170<210>3<211>29<212>DNA<213>
<400>3gcctcgagaa aagactgggc tgtgatctg 29
<210>4<211>19<212>DNA<213>
<400>4gggaattctt atcaagatg 19
權(quán)利要求
1.一種利用基因工程手段制備人干擾素ω的方法，包括以下步驟(1)構(gòu)建酵母表達(dá)載體；(2)構(gòu)建人干擾素ω的重組酵母表達(dá)載體；(3)重組人干擾素ω的表達(dá)；(4)重組人干擾素ω的分離純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的人干擾素ω具有序列表中序列2的氨基酸序列或其基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的酵母表達(dá)載體為能使表達(dá)的目的蛋白質(zhì)具有正確氨基酸序列的酵母表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的酵母表達(dá)載體為pMEX9K。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的人干擾素ω重組酵母表達(dá)載體為利用權(quán)利要求4所述載體構(gòu)建的載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的人干擾素ω重組酵母表達(dá)載體為pMEX9Kω。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用基因工程手段制備人干擾素ω的方法。本發(fā)明通過(guò)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，利用經(jīng)過(guò)改造的分泌型表達(dá)載體pMEX9K，對(duì)人干擾素ω進(jìn)行了高效表達(dá)。本發(fā)明公開(kāi)的方法具有產(chǎn)量高，簡(jiǎn)便易行，費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，有良好的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)C12N15/19GK1539971SQ03123299
公開(kāi)日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2003年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月25日
發(fā)明者陳薇, 齊連權(quán), 于長(zhǎng)明, 付玲, 來(lái)大志, 陳 薇 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所, 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物