專利名稱：解淀粉芽胞桿菌ch-2菌株的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是解淀粉芽胞桿菌CH-2菌株的制備方法和應(yīng)用。本專利用的解淀粉芽胞桿菌CH-2(Bacillus amyloliquetaciens CH-2)，已由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期是2003年6月16日，保藏號是CCTCC NOM 203055。
背景技術(shù)：
核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]是一種重要的植物病原真菌，可寄生450多種植物，包括油菜、大豆、向日葵等重要的油料作物，由其引起的菌核病是一種世界性分布的毀滅性病害。核盤菌以菌核的形式在土壤中越冬越夏，當(dāng)溫度以及濕度條件適宜時，菌核萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤，散發(fā)的子囊孢子侵染植物。核盤菌對一些重要的經(jīng)濟作物如油菜、大豆、向日葵等的產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成了極大的威脅。在歐洲春油菜發(fā)病嚴重，一般可使油菜減產(chǎn)5～10％，嚴重時可減產(chǎn)50％。在中國所有油菜產(chǎn)區(qū)的油菜生產(chǎn)都受核盤菌危害，其中尤以長江流域和東南沿海地區(qū)最為嚴重，發(fā)病率為10～80％，可導(dǎo)致減產(chǎn)5～30％，且油菜籽含油量銳減，已成為制約我國油菜生產(chǎn)、提高油菜產(chǎn)量的主要限制因素。特別是近年來雙低油菜的大規(guī)模推廣種植，硫甙的降低使油菜更容易感染核盤菌。
在油菜菌核病的防治方面，由于油菜對菌核病不表現(xiàn)垂直抗性，目前還沒有有效的抗病品種問世。長期以來，對油菜菌核病的防治主要采用化學(xué)方法，如苯并咪唑類殺菌劑。但采用化學(xué)防治不僅污染環(huán)境，而且殺菌劑的長期使用可以導(dǎo)致抗藥性菌株的產(chǎn)生，目前已經(jīng)在多個油菜種植區(qū)分離到具有抗藥性的毒力菌株。由于目前還沒有克隆針對菌核病的有效的抗性基因，通過基因工程的方法防治也沒有理想的效果。
通過有益微生物防治油菜菌核病不僅可以彌補常規(guī)油菜育種存在的缺陷，還可以有效降低化學(xué)農(nóng)藥的使用及抗藥性菌株的產(chǎn)生。在目前研究的菌核病生防菌中，國外有通過真菌盾殼霉(Coniothyrium minitans)進行防治的報道(Whipps and Gerlagh，1992)，該菌通過寄生核盤菌菌核，使其喪失產(chǎn)生子囊盤的能力，近年來，一些盾殼霉商品制劑已經(jīng)在國外登記，如德國登記的CONTANS和匈牙利登記的KONI。在我國，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所分離出一株編號為2-16的菌株，定名為不吸水鏈霉菌黃山變種(Streptomyces ahygroscopicus var.huangsanensis)，該菌對油菜菌核病具有一定的防治效果。從油菜抗病品種中油821分離的一株產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)對核盤菌菌絲擴展具有一定的阻礙作用。草酸降解菌對菌核病的防治也有一定的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株解淀粉芽胞桿菌CH-2菌株，該菌株不僅能夠防治菌核病，而且可抑制核盤菌的生長，從而可作為油菜、大豆、向日葵等經(jīng)濟作物的有效的生物防治手段，使其產(chǎn)量和品質(zhì)提高。同時，制備該菌菌株的方法簡單，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題的方案是用于制備防治由核盤菌引起的經(jīng)濟作物菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)的生物制品。
解淀粉芽胞桿菌CH-2菌株的制備方法，包括如下步驟a.病原菌的活化與培養(yǎng)
核盤菌菌核經(jīng)0.1～0.2％HgCl2消毒5～10min，無菌水沖洗2～3次，將菌核剖開，置PDA培養(yǎng)基于28～30℃培養(yǎng)至菌絲長出，再將菌絲挑至新的PDA培養(yǎng)基生長待用。
b.芽孢桿菌的培養(yǎng)從不同來源的土壤樣品中分離出若干株芽孢桿菌菌株，然后將其接種到LB或PDA培養(yǎng)基，于搖床150～200rpm、28～30℃過夜培養(yǎng)。
c.培養(yǎng)24～48h的核盤菌菌絲用刀片切成小塊，接種到PDA培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)的芽孢桿菌菌液接種1環(huán)于平皿中央，28～30℃培養(yǎng)48～72h后觀察并記錄抑菌圈的大小。
d.從中篩選能夠抑制核盤菌菌絲生長的菌株，該菌株即為解淀粉芽孢桿菌CH-2菌株。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點其一.具有很強的抑制核盤菌生長的能力，其抑菌圈直徑為30mm。可消除油菜減產(chǎn)5～30％的危害因素，并能提高油菜籽含油量，對于大豆、向日葵等經(jīng)濟作物來說，也能提高其產(chǎn)量和品質(zhì)。
其二.具有抑制菌核形成的能力，可作為防治油菜菌核病的有效的生物防治手段。
其三.利于雙低油菜的大規(guī)模推廣種植。
其四.可消除因化學(xué)防治所帶來的環(huán)境污染的問題，以及長期使用化學(xué)殺菌劑所導(dǎo)致的抗藥性菌株的產(chǎn)生。
其五.制備方法簡單，操作方便，適于工業(yè)化生產(chǎn)，具有開發(fā)利用的潛在價值。


圖1是解淀粉芽孢桿菌CH-2菌株抑制核盤菌的效果示意圖。
圖2是解淀粉芽孢桿菌CH-2菌株培養(yǎng)液稀釋后的抗菌效果比較示意圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
在進行油菜生防菌的分離與篩選研究中，從不同來源的土壤樣品中分離出若干株(例如17株)芽孢桿菌菌株，并檢測了這些菌株抑制核盤菌的效果，其中4株對油菜核盤菌表現(xiàn)出不同程度的抑制。這些菌株包括2株枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis，F(xiàn)10，L5)，1株地衣芽孢桿菌(B.licheniformis AJH-1)，1株解淀粉芽胞桿菌CH-2菌株(B.amyloliquetaciens)。其中解淀粉芽孢桿菌CH-2菌株不僅具有很強的抑制核盤菌生長的能力，而且還能夠抑制菌核的形成。
一.實施例實驗一.抗性菌株的篩選1.病原菌的活化與培養(yǎng)核盤菌菌核(由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所提供)經(jīng)0.1～0.2％HgCl2消毒5～10min，無菌水沖洗2～3次，將菌核剖開，置PDA培養(yǎng)基于28～30℃培養(yǎng)至菌絲長出，再將菌絲挑至新的PDA培養(yǎng)基生長待用。
2.芽孢桿菌的培養(yǎng)將不同芽孢桿菌接種到LB或PDA培養(yǎng)基，于搖床150～200rpm、28～30℃過夜培養(yǎng)。
3.抑制菌絲效果培養(yǎng)24～48h的核盤菌菌絲用刀片切成小塊，接種到PDA培養(yǎng)基。過夜培養(yǎng)的芽孢桿菌菌液接種1環(huán)于平皿中央，28～30℃培養(yǎng)48～72h后觀察并記錄抑菌圈的大小。經(jīng)檢測，有4株能夠抑制核盤菌菌絲的生長。從表1可以看出，不同芽孢桿菌菌株抑制的效果差別較大，其中解淀粉芽孢桿菌CH-2菌株(以下簡稱CH-2菌株)和地衣芽孢桿菌菌株AJH-1的抑制效果最好。但這2種菌株的抑菌方式明顯不同。AJH-1雖然能夠抑制油菜核盤菌菌絲的生長，但菌絲最后仍能夠形成菌核。而CH-2菌株不僅能夠抑制菌絲的生長，還具有強烈抑制油菜核盤菌菌核形成的能力(見圖1)；因此CH-2菌株的這種抑制菌核形成的能力在該菌的實際應(yīng)用過程中可能具有重要的意義。其它2株枯草芽孢桿菌菌株具有一定的抑制效果，但沒有CH-2菌株的效果顯著。
實驗二.不同菌株不同培養(yǎng)時間上清液抗菌活性比較為了證實抑菌物質(zhì)是否為胞外分泌型，選取具有抑制菌絲生長的4株芽孢桿菌，在LB(AJH-1，F(xiàn)10，L5)或PDA(CH-2)培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)72、96、120h，于8000rpm離心2min，上清液加入100mg/L抗菌素特美汀(Timentin)，取100μl加入打孔的PDA培養(yǎng)基中央，48h后觀察抑菌圈大小，結(jié)果見表2?？梢钥闯?，4種菌株的抑菌物質(zhì)均為胞外分泌型，但隨著培養(yǎng)時間的延長，CH-2菌株的抑菌效果有所降低，而其它3種菌株則變化不大。
實驗三.上清液粗蛋白的抗菌效果為了檢測上清液抑菌物質(zhì)是否為抗菌蛋白，在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的CH-2(PDA培養(yǎng)基)以及AHJ-1(LB培養(yǎng)基)培養(yǎng)48h的菌液于4℃、8000rpm離心10min，上清液加入60％的(NH4)2SO4至飽和，置4℃18-20h，再于10000rpm離心10min。棄上清液，沉淀加入原體積10％的5mM磷酸緩沖液(pH7.0)，經(jīng)Milipore細菌過濾器(0.2μm)過濾，采用實驗二的打孔法測定抗菌效果，結(jié)果見表3?？梢钥闯鼋?jīng)硫酸銨沉淀后的上清液仍具有抗菌效果，因此兩種拮抗菌分泌的抗菌物質(zhì)的主要成分可以認為是抗菌蛋白。
實驗四.CH-2菌株在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后過濾液抗菌活性比較為了提高CH-2菌株抗菌蛋白的含量，在PDA培養(yǎng)基中加入0.5％的牛肉膏，酵母膏或蛋白胨，培養(yǎng)48h后上清液經(jīng)細菌過濾器過濾，通過打孔法測定抗菌效果，結(jié)果見表4。結(jié)果表明加入不同氮源的培養(yǎng)基降低了抗菌效果，而且CH-2菌株在M32培養(yǎng)基上培養(yǎng)不表現(xiàn)出抗菌效果。
實驗五.CH-2菌株培養(yǎng)液稀釋后的抗菌效果比較在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)48h的CH-2菌液按實驗三的方法經(jīng)(NH4)2SO4沉淀，加入原體積10％的磷酸緩沖液(1X)，在此基礎(chǔ)上再用磷酸緩沖液稀釋10倍或100倍，通過打孔法測定稀釋后的抑菌效果(見圖2)，結(jié)果見表5。CH-2菌株培養(yǎng)液稀釋100倍后仍然具有抗菌活性。
二.附表表1.不同芽孢桿菌菌株對油菜核盤菌的抑制效果

表2，不同菌株不同培養(yǎng)時間上清液抗菌活性比較

表3.上清液經(jīng)硫酸銨沉淀后的抗菌效果

表4.CH-2菌株在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后過濾液抗菌活性比較

表5.CH-2菌株硫酸銨沉淀稀釋后的抗菌效果比較

權(quán)利要求
1.一種解淀粉芽胞桿菌CH-2菌株(Bacillus amyloliquetaciens)CCTCC M203055，其特征在于用于制備防治由核盤菌引起的經(jīng)濟作物菌核病的生物制品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉芽胞桿菌CH-2菌株CCTCC M203055，其特征在于所述的經(jīng)濟作物是油菜，或大豆，或向日葵。
3.解淀粉芽胞桿菌CH-2菌株CCTCC M203055的制備方法，包括如下步驟a.病原菌的活化與培養(yǎng)核盤菌菌核經(jīng)0.1～0.2％HgCl2消毒5～10min，無菌水沖洗2～3次，將菌核剖開，置PDA培養(yǎng)基于28～30℃培養(yǎng)至菌絲長出，再將菌絲挑至新的PDA培養(yǎng)基生長待用，b.芽孢桿菌的培養(yǎng)從不同來源的土壤樣品中分離出若干株芽孢桿菌菌株，然后將其接種到LB或PDA培養(yǎng)基，于搖床150～200rpm、28～30℃過夜培養(yǎng)，c.培養(yǎng)24～48h的核盤菌菌絲用刀片切成小塊，接種到PDA培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)的芽孢桿菌菌液接種1環(huán)于平皿中央，28～30℃培養(yǎng)48～72h后觀察并記錄抑菌圈的大小，d.從中挑出能夠抑制核盤菌菌絲生長的菌株，該菌株即為解淀粉芽孢桿菌CH-2菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及解淀粉芽胞桿菌CH－2菌株(Bacillusamyloliquetaciens)CCTCC M203055的制備方法和應(yīng)用。該菌株用于防治油菜、大豆、向日葵等經(jīng)濟作物菌核病或核盤菌病的生物制品。該菌株的制備方法包括病原菌的活化與培養(yǎng)、芽孢桿菌的分離、培養(yǎng)及篩選步驟。本發(fā)明獲得的解淀粉芽胞桿菌CH－2菌株具有很強的抑制核盤菌生長的能力和抑制菌核形成的能力，利于雙低油菜的大規(guī)模推廣種植，同時還具有制備方法簡單、操作方便等優(yōu)點，并且適于工業(yè)化生產(chǎn)，開發(fā)利用潛在價值大。
文檔編號C12N1/20GK1526813SQ0312544
公開日2004年9月8日 申請日期2003年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月23日
發(fā)明者陳士云, 楊寶玉, 宋冬林, 王瑤, 高梅影, 戴順英 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所