專利名稱：人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子和細(xì)胞生物學(xué)，細(xì)胞克隆和基因工程技術(shù)，更具體地說是涉及一種由來源于經(jīng)5型腺病毒(Ad5)DNA轉(zhuǎn)染的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株。
背景技術(shù)：
原代人胚胎腎上皮(The primary human embryonic kidney，HEK)293細(xì)胞系，是一種經(jīng)5型腺病毒(Ad5)DNA片段轉(zhuǎn)染，含有Ad55’端的11％的基因組包括E1a的原代人胚胎腎細(xì)胞，該細(xì)胞特別對人腺病毒敏感，并對腺病毒DNA是高度許可的，其含有和表達(dá)Ad5的轉(zhuǎn)染基因(transforminggenes)。目前，美國細(xì)胞培養(yǎng)庫(American Type Culture Collection，ATCC)已將該細(xì)胞系開發(fā)成商業(yè)化，并廣泛用于體外(in vitro)檢測和生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)和病毒。然而，ATCC 293細(xì)胞在細(xì)胞生長周期和細(xì)胞貼壁生長方面存在周期長，貼壁不牢固，易脫落被沖洗掉的弱點，并直接影響該細(xì)胞廣泛應(yīng)用，尤其是大規(guī)模生產(chǎn)重組病毒體和蛋白質(zhì)。應(yīng)用基因工程技術(shù)和分子克隆技術(shù)，改進(jìn)293細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，特別是建立一種新型的、適合于規(guī)模化生產(chǎn)用的人胚胎腎293細(xì)胞已變得愈來愈必要和可行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在解決上述問題，而提供一種應(yīng)用基因工程技術(shù)和分子克隆技術(shù)改進(jìn)的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株，使其具有明顯增強細(xì)胞貼壁生長的功能和細(xì)胞生長倍增時間短的優(yōu)點，并得到更廣泛的應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)重組腺病毒制品的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株，該細(xì)胞株是由ATCC 293細(xì)胞經(jīng)亞克隆方法制得，它含有下列序列的人三磷酸甘油醛脫氫酶(humanglyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPD)1 ctctctgctc ctcctgttcg acagtcagcc gcatcttctt ttgcgtcgcc agccgagcca61 catcgctcag acaccatggg gaaggtgaag gtcggagtca acggatttgg tcgtattggg121 cgcctggtca ccagggctgc ttttaactct ggtaaagtgg atattgttgc catcaatgac181 cccttcattg acctcaacta catggtttac atgttccaat atgattccac ccatggcaaa241 ttccatggca ccgtcaaggc tgagaacggg aagcttgtca tcaatggaaa tcccatcacc301 atcttccagg agcgagatcc ctccaaaatc aagtggggcg atgctggcgc tgagtacgtc361 gtggagtcca ctggcgtctt caccaccatg gagaaggctg gggctcattt gcagggggga421 gccaaaaggg tcatcatctc tgccccctct gctgatgccc ccatgttcgt catgggtgtg481 aaccatgaga agtatgacaa cagcctcaag atcatcagca atgcctcctg caccaccaac541 tgcttagcac ccctggccaa ggtcatccat gacaactttg gtatcgtgga aggactcatg601 accacagtcc atgccatcac tgccacccag aagactgtgg atggcccctc cgggaaactg661 tggcgtgatg gccgcggggc tctccagaac atcatccctg cctctactgg cgctgccaag721 gctgtgggca aggtcatccc tgagctgaac gggaagctca ctggcatggc cttccgtgtc781 cccactgcca acgtgtcagt ggtggacctg acctgccgtc tagaaaaacc tgccaaatat841 gatgacatca agaaggtggt gaagcaggcg tcggagggcc ccctcaaggg catcctgggc901 tacactgagc accaggtggt ctcctctgac ttcaacagcg acacccactc ctccaccttt961 gacgctgggg ctggcattgc cctcaacgac cactttgtca agctcatttc ctggtatgac1021 aacgaatttg gctacagcaa cagggtggtg gacctcatgg cccacatggc ctccaaggag1081 taagacccct ggaccaccag ccccagcaag agcacaagag gaagagagag accctcactg1141 ctggggagtc cctgccacac tcagtccccc accacactga atctcccctc ctcacagttg1201 ccatgtagac cccttgaaga ggggaggggc ctagggagcc gcaccttgtc atgtaccatc1261 aataaagtac cctgtgctca acc其中，(1)自76-1083是編碼GAPD1-335氨基酸序列(如下所示)的基因組序列MGKVKVGVNGFGRIGRLVTRAAFNSGKVDIVAINDPFIDLNYMVYMFQYDSTHGKFHGTVKAENGKLVINGNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEYVVESTGVFTTMEKAGAHLQGGAKRVIISAPSADA
PMFVMGVNHEKYDNSLKIISNASCTTNCLAPLAKVIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQKTVDGPSGKLWRDGRGALQNIIPASTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMAFRVPTANVSVVDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKQASEGPLKGILGYTEHQVVSSDFNSDTHSSTFDAGAGIALNDHFVKLISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE(2)自1261-1266為多聚腺苷腺尾polyA。
該細(xì)胞株由下列方法培養(yǎng)制得a、將ATCC 293細(xì)胞(P32)復(fù)蘇后進(jìn)行細(xì)胞擴增傳代至第33代次(P33)，然后將P33細(xì)胞懸液用FACS流式細(xì)胞儀進(jìn)行亞克??；b、用2個96孔板，每孔中0.2ml培養(yǎng)基中放置一個細(xì)胞，在36～38℃、3～6％CO2條件下培養(yǎng)6～10天；c、挑選出細(xì)胞形態(tài)均一、生長良好的、已達(dá)到不低于60％鋪滿生長的克??；d、重復(fù)上述步驟四次，最后挑選出1個亞克隆的細(xì)胞柱(P37)，繼續(xù)培養(yǎng)擴增并制成原代細(xì)胞庫(P38)，置于-80℃凍存；e、以原代細(xì)胞庫(P38)為基礎(chǔ)制備主代細(xì)胞庫及工作細(xì)胞庫。
所述培養(yǎng)基是DMEM(GIBCO/BRL)與胎牛血清(GIBCO/BRL)的混合物。
用于細(xì)胞培養(yǎng)的ATCC 293細(xì)胞的傳代次數(shù)在55代次以下。
該細(xì)胞的倍增時間為18小時。
本發(fā)明通過基因工程技術(shù)和分子克隆技術(shù)的改造，有效改進(jìn)了ATCC 293細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。通過定性并鑒定該細(xì)胞中的蛋白與多肽的組成，特別是應(yīng)用雙向電泳(2D-Ge)和質(zhì)譜技術(shù)研究了蛋白在該細(xì)胞中的的表達(dá)情況，可清楚地表明，與ATCC 293細(xì)胞相比，本發(fā)明的細(xì)胞具有明顯增強細(xì)胞貼壁生長的功能和細(xì)胞生長倍增時間短的優(yōu)點。本發(fā)明還同時發(fā)現(xiàn)了僅在亞克隆人胚腎293細(xì)胞中檢測到的蛋白三磷酸甘油醛脫氫酶(humanglyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPD)，它在本發(fā)明的細(xì)胞中的表達(dá)量較高，而由于GAPD參與糖酵解的過程，并參與細(xì)胞的多項調(diào)節(jié)功能特別是與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)功能有關(guān)，因而具有重要意義。本發(fā)明的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株可用于研究和生產(chǎn)重組腺病毒制品。


圖1是本發(fā)明的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株與ATCC 293細(xì)胞2-D圖譜比較示意圖。
圖2是MALDI-MS檢測本發(fā)明的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株中蛋白點(編號144)的肽質(zhì)量指紋圖譜示意圖。
圖3是本發(fā)明的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株與ATCC 293細(xì)胞細(xì)胞倍增時間檢測比較示意圖。
圖4是本發(fā)明的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株與ATCC 293細(xì)胞細(xì)胞貼壁功能比較示意圖。
具體實施例方式
一、細(xì)胞株來源及培養(yǎng)條件(一)、細(xì)胞株的來源本發(fā)明的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株來源于亞克隆的ATCC 293細(xì)胞系。293細(xì)胞系(ATCC CRL-1573，第32代次，1997年6月13日從ATCC訂購)，來源于經(jīng)5型腺病毒(Ad5)DNA片段轉(zhuǎn)染的原代人胚胎腎細(xì)胞，含有Ad5 5端的11％的基因組，包括E1a。該細(xì)胞對干人病毒的感染和生長是高度許可的。經(jīng)亞克隆篩選后建立人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞庫，主代細(xì)胞庫為傳代40次(P40)的細(xì)胞，工作細(xì)胞庫為傳代43次(P43)的細(xì)胞，而生產(chǎn)細(xì)胞為第46代次(P46)。
(二)、培養(yǎng)細(xì)胞株所用的成分及條件培養(yǎng)人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株和ATCC 293細(xì)胞所需用的培養(yǎng)基成份包括DMEM(GIBCO/BRL)，胎牛血清(GIBCO/BRL)，青霉素及鏈霉素(GIBCO/BRL)。在37℃，5％ CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
(三)、細(xì)胞株生長的穩(wěn)定性293細(xì)胞傳代生長的穩(wěn)定性研究表明用于生產(chǎn)的293細(xì)胞的傳代次數(shù)在55代次以下為好，其中以P37-P47代次最好。傳代次數(shù)大于55代次以上后，細(xì)胞生長的密度(cell/cm2)與每個細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒數(shù)(VP/cell)不成正比，會導(dǎo)致病毒產(chǎn)量下降，形成RCA的幾率上升。
(四)、質(zhì)量控制主代細(xì)胞庫及工作細(xì)胞庫已由中國藥品和生物制品檢定所檢定合格，符合國家藥品和食品監(jiān)督管理局(SFDA)的規(guī)定。
二、人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株按如下具體方法培養(yǎng)制得1、將從ATCC購入的293細(xì)胞(P32)在37℃化凍復(fù)蘇，在室溫離心1100rpm，1分鐘，沉淀細(xì)胞。
2、真空吸除上清液，向沉淀細(xì)胞內(nèi)加入1.0mlPBS并懸浮細(xì)胞，再1100rpm離心1分鐘。棄上清后，向沉淀細(xì)胞加入1.0mlDMEM培養(yǎng)介質(zhì)(含10％FBS，1％青霉素和鏈霉素)，懸浮細(xì)胞。轉(zhuǎn)移懸浮細(xì)胞到75cm2平皿中，補加新鮮介質(zhì)10ml。
3、置于37℃，5％ CO2孵育箱，培養(yǎng)二天。
4、待第三天時，可見除約有5-10％的細(xì)胞死亡漂浮外，細(xì)胞已貼壁生長良好，形態(tài)較均一。吸除上清介質(zhì)，用PBS洗滌細(xì)胞一次，再加入1mlTrypsin-EDTA液，并使其履蓋細(xì)胞30秒鐘，吸除Trypsin-EDTA液。靜置30秒鐘后，輕拍打平皿，使細(xì)胞脫離平皿壁。進(jìn)入10ml新鮮培養(yǎng)介質(zhì)，充分勻散細(xì)胞。該細(xì)胞為第33代次(P33)。
5、將P33細(xì)胞懸液用FACS流式細(xì)胞儀進(jìn)行亞克隆。預(yù)先準(zhǔn)備好2個96孔板，向每一孔中0.2ml培養(yǎng)介質(zhì)中放置一個細(xì)胞。共放置192個孔(細(xì)胞)。
6、在37℃，5％ CO2條件下培養(yǎng)8天，在顯微鏡下觀察。第一次挑選出54個細(xì)胞形態(tài)均一、生長良好的、已達(dá)到60％鋪滿生長的克隆。在這些培養(yǎng)孔中，外觀培養(yǎng)介質(zhì)已變。另外的138個孔，其中101個克隆生長較為緩慢，37個孔中無細(xì)胞生長。這138個孔的培養(yǎng)介質(zhì)仍為紅色。從生長較為緩慢到克隆中，我們亦篩選出一株慢長293株，稱之為293s。在研究中，293s主要用于做空斑形成實驗。
7、吸除上述的54個孔的培養(yǎng)介質(zhì)，用200μlPBS洗滌一次，加入20μlTryps in-EDTA液作用1分鐘后，加入200μl新鮮培養(yǎng)介質(zhì)。用吸管上下吹打以懸浮細(xì)胞(P34)。
8、將亞克隆的懸浮細(xì)胞(P34)移入預(yù)盛有1ml新鮮介質(zhì)/孔的24孔板中，每孔一株亞克隆的細(xì)胞。37℃，5％ CO2條件下培養(yǎng)三天。
9、第二次挑選出生長良好，細(xì)胞形態(tài)均一的克隆細(xì)胞31株，制成第35代次(P35)細(xì)胞懸液。
10、將P35細(xì)胞移入6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)三天。
11、第三次挑選生長良好，細(xì)胞形態(tài)均一的克隆細(xì)胞株14株，移入14個75Gm2平皿中，繼續(xù)培養(yǎng)三天(P36)，每平皿1株細(xì)胞。
12、最后，第四次挑選出1個亞克隆的細(xì)胞柱(P37)，移入12個150cm2平皿(2個平皿/株)中，培養(yǎng)三天，當(dāng)達(dá)到90％鋪商生長狀態(tài)時，用Trypsin-EDTA處理，使細(xì)胞脫離平皿。然后向每一平皿中加入12ml凍存液(5％DFMO-95％FBS)，將同一克隆的2個平皿的細(xì)胞懸液混合，然后分裝，2ml/支凍存管，共11管。該細(xì)胞為第38代次(P38)細(xì)胞，將其編號并置于-80℃凍存。
13、選取在-80℃凍存管(1×107/2ml/管)進(jìn)行復(fù)蘇，在2個75cm2平皿和5個150cm2平皿各擴增傳代一次(即從38代傳代為第40代)。然后，進(jìn)行凍存。從5個150cm2中共獲得約3×108個細(xì)胞。每個凍存管分裝1ml，3×106個細(xì)胞，共分裝100管，在液氮保存。該細(xì)胞(第40代次，P40)即為主代細(xì)胞庫。
14、從主代細(xì)胞庫中取出1管凍存細(xì)胞，復(fù)蘇后在1個75cm2平皿，2個150cm2平皿和4個225cm2培養(yǎng)瓶中傳遞3代，即從P40傳代至P43，凍成100管，2×106個細(xì)胞/管，制成工作細(xì)胞庫。
15、在每次通過CellCube系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)時，從工作細(xì)胞庫由取出1管，再經(jīng)3代次擴增，即從第43代(P43)培養(yǎng)至第46代(P46)，共獲得6×108個細(xì)胞，稱之為生產(chǎn)細(xì)胞。
三、人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株與ATCC 293細(xì)胞在功能上的差異(一)、細(xì)胞倍增時間檢測
1、材料ATCC 293細(xì)胞，人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株，胰酶(GIBCO)，DMILD萊卡顯微鏡，T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶(CORNING)。
2、方法2.1、分別接種等量1×104細(xì)胞于21個T25瓶中，分為7組(分別觀察培養(yǎng)24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h)，每組3瓶。
2.2、從次日起，每隔24小時，取一組細(xì)胞(3瓶)用胰酶消化后，進(jìn)行計數(shù)。計算每一瓶細(xì)胞的總數(shù)，取3瓶計算均值，如此至第7組結(jié)束。為提高細(xì)胞計數(shù)精確性，每瓶細(xì)胞數(shù)量應(yīng)計算2-3次取均值。
測試結(jié)果如圖3所示，圖中，以日期為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞數(shù)目為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)圖紙上繪制細(xì)胞生長曲線，確定細(xì)胞倍增時間(細(xì)胞倍增時間，即細(xì)胞數(shù)量增加1倍的時間)。
3、結(jié)果如表1所示，表124h48h 72h 96h 120h 144h 168hATCC29323.4±1.1 36.9±0.673.3±0.6125.9±6.4 260.8±7.7 399.5±18.4 838.7±22.0本發(fā)明細(xì)胞35.2±2.7 96.7±3.8263.1±20.7 669.6±61.7株通過換算，ATCC293細(xì)胞倍增時間為25.8小時，人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株倍增時間為18小時。
4、結(jié)論人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株較ATCC293細(xì)胞倍增時間短。
(二)細(xì)胞貼壁功能細(xì)胞生長狀態(tài)對比實驗1、目的通過培養(yǎng)ATCC293細(xì)胞、人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株，觀察兩組細(xì)胞生在長狀態(tài)上的差異。
2、材料2.1、細(xì)胞人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株(來源工作細(xì)胞庫細(xì)胞，復(fù)蘇后第4代)，ATCC293細(xì)胞(來源工作細(xì)胞庫細(xì)胞，復(fù)蘇后第4代)2.2、培養(yǎng)液DMEM+10％FBS
2.3、細(xì)胞消化液Typsin-EDTA2.4、儀器CO2培養(yǎng)箱、生物工作臺、顯微鏡。
3、步驟將已預(yù)熱的Typsin-EDTA、DMEM+10％FBS，移液管、T75培養(yǎng)瓶置生物工作臺內(nèi)。分別取ATCC293、人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株各1個T75瓶細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長至80％～90％。在超凈臺內(nèi)操作，分別吸出細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基。加入3mlTypsin-EDTA，消化3分鐘，輕輕拍擊瓶壁，細(xì)胞成粉沫狀脫落時，加入10ml DMEM+10％FBS終止消化。上下吸打細(xì)胞懸液10次，使細(xì)胞呈單個存在。分別將兩瓶細(xì)胞懸液移至無菌離心管，1000rpm離心10min。吸去上清液，各加10ml新鮮DMEM+10％FBS，反復(fù)吹打5次，使細(xì)胞散在。分別取2.5ml細(xì)胞懸液置新的T75培養(yǎng)瓶，補加適量新鮮培養(yǎng)基。置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24小時后，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。
人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株與ATCC293細(xì)胞細(xì)胞貼壁功能比較如圖4所示。
4、結(jié)論由圖4(其中圖4A為人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株，圖4B為ATCC293細(xì)胞)可見，人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株單層無圓細(xì)胞，ATCC293細(xì)胞單層可見有少量圓細(xì)胞，故人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株較ATCC293細(xì)胞貼壁能力強。人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株單層細(xì)胞分布均勻，ATCC293細(xì)胞單層細(xì)胞分布不均勻，故在細(xì)胞貼壁生長時，人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株較ATCC293細(xì)胞分布更均勻。
(三)病毒產(chǎn)率試驗1、材料人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株、ATCC293細(xì)胞，培養(yǎng)液DMEM(GIBCO)、FBS(HYCLON)，T75培養(yǎng)瓶、(CORENING)CO2培養(yǎng)箱、(法瑪西亞)離心機、(SIGMA)WATERS2690分離系統(tǒng)及996PDA檢測器。
2、方法2.1、取同代次人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株及ATCC293細(xì)胞分別接種T75培養(yǎng)瓶，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后，細(xì)胞數(shù)增至1.5×107個。
2.2同時感染病毒，感染量7.5×109/瓶，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
2.3培養(yǎng)51小時，細(xì)胞完全CPE，各收集5ml細(xì)胞懸液。
2.4將細(xì)胞懸液置-80℃，37℃凍融2次，3000rpm離10min，取上清。
2.5用HPLC檢測收獲上清液中病毒濃度。
3、結(jié)果見表2表2本發(fā)明細(xì)胞株 ATCC293病毒產(chǎn)量 12×1010vp 9×1010vp病毒產(chǎn)率 8000vp/cell 6000vp/cell4、結(jié)論相同條件下，人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株較ATCC293細(xì)胞生產(chǎn)病毒產(chǎn)量高。
四、人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株與ATCC293細(xì)胞在蛋白質(zhì)表達(dá)模式的差異我們研究了人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株和ATCC293細(xì)胞，分別抽提處理，將10mg處理的樣品懸浮于1ml樣品緩沖液中，樣品緩沖液成份為40MmTrisbase、7Murea、2Mthiourea、4％CHAPS、10mM 1、4-dithioerythritol、1mM EDTA。懸浮液超聲約30s后15000xg室溫離20min。
雙向電泳約1mg樣品用杯上樣的方法在IPG膠條陽極端上樣，(pH3-10NL，24cm)，蛋白在500V聚焦1分鐘，然后電壓逐漸上升到3500V聚焦1.5小時，并維持3500V，14小時。第二向?qū)Ω叻肿恿康鞍缀偷头肿恿康鞍追謩e使用12.5％和14.0％的聚丙烯酰胺凝膠分離。電泳后凝膠在室溫下固定1小時(40％ methanol，10％ acetic acid)，用考馬氏亮藍(lán)法染色。
凝膠成像樣品電泳后的凝膠用ImageScanner掃描后，檢測點并作比較，選中的點用自動切膠儀切出并轉(zhuǎn)移到96孔板中。
蛋白酶解和脫鹽蛋白用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，然后用50％乙睛，1％TFA萃取酶解后的肽段，用C18填充的微量吸液管(ZipTipTM)脫鹽，最后用dried-droplet法點樣至MALDI樣品靶上，采用的基質(zhì)為被50％乙睛、0.5％TFA溶液飽和的a-氰基-4-羥基肉桂酸。
質(zhì)譜采用反射MALDI-TOF(EttanTM，Amersham Biosciences)質(zhì)譜測肽質(zhì)量指紋圖譜，胰蛋白酶自酶解的肽片段峰用作圖譜測量的內(nèi)標(biāo)，用Mascot搜索引擎進(jìn)行蛋白鑒定。
(一)、人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株和ATCC293細(xì)胞的蛋白組份的雙向圖譜的比較由圖1(其中圖1A為2D-gel分離人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株蛋白圖譜，圖1B為2D-gel分離ATCC293細(xì)胞蛋白圖譜)可見，分別在二塊膠內(nèi)用圖像軟件分析得出約有800個離散的蛋白點，主要表現(xiàn)出明顯差異的其中一個蛋白，為圖1A中編號為144點，此蛋白點僅在人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株樣品中出現(xiàn)，圖1B中ATCC293細(xì)胞樣品中無此蛋白點。
(二)、用胰蛋白酶酶解后的肽質(zhì)量指紋譜及數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果結(jié)果如圖2所示，該圖為MALDI-MS檢測人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株中蛋白點(編號144)的肽質(zhì)量指紋圖譜。與ATCC293不同，人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株樣品存在明顯差異點(編號144蛋白)，經(jīng)用胰蛋白酶進(jìn)行水解，進(jìn)樣后質(zhì)譜測得肽質(zhì)量指紋圖譜。圖中所示，胰蛋白酶水解的肽片段峰及該肽片段的分子量(數(shù)字代表，單位Dalton)，用Mascot搜索進(jìn)行蛋白鑒定，圖中所示多個肽段均與庫中三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPD)相匹配。
MALDI-ToF肽質(zhì)量指紋圖譜顯示人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株樣品中出現(xiàn)并表現(xiàn)明顯的差異的一個蛋白分子量為36kDa蛋白為人三磷酸甘油醛脫氫酶(human glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPD)，GAPD是人們熟知的介導(dǎo)糖酵解過程中的酶，在能量代謝中起關(guān)鍵作用，它已被看作“看家蛋白”，并且其正常功能包括核RNA外移(nuclear RNA export)，DNA復(fù)制(DNA replication)，DNA修復(fù)(DNA repair)，細(xì)胞胞吞作用的膜融合(exocytotic membrane fusion)，細(xì)胞骨架成份(Cytoskeletalorganization)和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性(phosphotransferase activity)。病理上，GAPD涉及細(xì)胞凋亡，神經(jīng)退行性病變，前列腺癌及病毒性病變。Mansur等報導(dǎo)GAPD基因作為調(diào)節(jié)細(xì)胞周期與DNA合成有關(guān)聯(lián)的系列表達(dá)基因。結(jié)合我們的細(xì)胞功能學(xué)的實驗結(jié)果，GAPD可能參與細(xì)胞的周期調(diào)節(jié)功能和細(xì)胞的粘壁功能有關(guān)。
如上所述，本發(fā)明的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株含有下列序列的人三磷酸甘油醛脫氫酶(human glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase，GAPD)的mRNA全序列1 ctctctgctc ctcctgttcg acagtcagcc gcatcttctt ttgcgtcgcc agccgagcca61 catcgctcag acaccatggg gaaggtgaag gtcggagtca acggatttgg tcgtattggg121 cgcctggtca ccagggctgc ttttaactct ggtaaagtgg atattgttgc catcaatgac181 cccttcattg acctcaacta catggtttac atgttccaat atgattccac ccatggcaaa241 ttccatggca ccgtcaaggc tgagaacggg aagcttgtca tcaatggaaa tcccatcacc301 atcttccagg agcgagatcc ctccaaaatc aagtggggcg atgctggcgc tgagtacgtc361 gtggagtcca ctggcgtctt caccaccatg gagaaggctg gggctcattt gcagggggga421 gccaaaaggg tcatcatctc tgccccctct gctgatgccc ccatgttcgt catgggtgtg481 aaccatgaga agtatgacaa cagcctcaag atcatcagca atgcctcctg caccaccaac541 tgcttagcac ccctggccaa ggtcatccat gacaactttg gtatcgtgga aggactcatg601 accacagtcc atgccatcac tgccacccag aagactgtgg atggcccctc cgggaaactg661 tggcgtgatg gccgcggggc tctccagaac atcatccctg cctctactgg cgctgccaag721 gctgtgggca aggtcatccc tgagctgaac gggaagctca ctggcatggc cttccgtgtc781 cccactgcca acgtgtcagt ggtggacctg acctgccgtc tagaaaaacc tgccaaatat841 gatgacatca agaaggtggt gaagcaggcg tcggagggcc ccctcaaggg catcctgggc901 tacactgagc accaggtggt ctcctctgac ttcaacagcg acacccactc ctccaccttt961 gacgctgggg ctggcattgc cctcaacgac cactttgtca agctcatttc ctggtatgac1021 aacgaatttg gctacagcaa cagggtggtg gacctcatgg cccacatggc ctccaaggag1081 taagacccct ggaccaccag ccccagcaag agcacaagag gaagagagag accctcactg1141 ctggggagtc cctgccacac tcagtccccc accacactga atctcccctc ctcacagttg1201 ccatgtagac cccttgaaga ggggaggggc ctagggagcc gcaccttgtc atgtaccatc1261 aataaagtac cctgtgctca acc
其中，(1)自76-1083是編碼GAPD1-335氨基酸序列(如下所示)的基因組序列MGKVKVGVNGFGRIGRLVTRAAFNSGKVDIVAINDPFIDLNYMVYMFQYDSTHGKFHGTVKAENGKLVINGNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEYVVESTGVFTTMEKAGAHLQGGAKRVIISAPSADAPMFVMGVNHEKYDNSLKIISNASCTTNCLAPLAKVIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQKTVDGPSGKLWRDGRGALQNIIPASTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMAFRVPTANVSVVDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKQASEGPLKGILGYTEHQVVSSDFNSDTHSSTFDAGAGIALNDHFVKLISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE(2)自1261-1266多聚腺苷腺尾polyA。
由試驗可知1、我們建立和分析了人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株和ATCC293細(xì)胞的蛋白質(zhì)成份差異，結(jié)合雙向電泳和MALDI質(zhì)譜分析的蛋白組學(xué)方法來研究人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株功能。
2、在最初的研究中從2-D膠中鑒定出的蛋白，其中對僅在人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株中檢測到的蛋白三磷酸甘油醛脫氫酶(humanglyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPD)，它在人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株中的表達(dá)量較高。GAPD參與糖酵解的過程，并參與細(xì)胞的多項調(diào)節(jié)功能特別是與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)功能有關(guān)。
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)重組腺病毒制品的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株，其特征在于，該細(xì)胞株是由ATCC 293細(xì)胞經(jīng)亞克隆方法制得，它含有下列序列的人三磷酸甘油醛脫氫酶(human g1yceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase，GAPD)1 ctctctgctc ctcctgttcg acagtcagcc gcatcttctt ttgcgtcgcc agccgagcca61 catcgctcag acaccatggg gaaggtgaag gtcggagtca acggatttgg tcgtattggg121 cgcctggtca ccagggctgc ttttaactct ggtaaagtgg atattgttgc catcaatgac181 cccttcattg acctcaacta catggtttac atgttccaat atgattccac ccatggcaaa241 ttccatggca ccgtcaaggc tgagaacggg aagcttgtca tcaatggaaa tcccatcacc301 atcttccagg agcgagatcc ctccaaaatc aagtggggcg atgctggcgc tgagtacgtc361 gtggagtcca ctggcgtctt caccaccatg gagaaggctg gggctcattt gcagggggga421 gccaaaaggg tcatcatctc tgccccctct gctgatgccc ccatgttcgt catgggtgtg481 aaccatgaga agtatgacaa cagcctcaag atcatcagca atgcctcctg caccaccaac541 tgcttagcac ccctggccaa ggtcatccat gacaactttg gtatcgtgga aggactcatg601 accacagtcc atgccatcac tgccacccag aagactgtgg atggcccctc cgggaaactg661 tggcgtgatg gccgcggggc tctccagaac atcatccctg cctctactgg cgctgccaag721 gctgtgggca aggtcatccc tgagctgaac gggaagctca ctggcatggc cttccgtgtc781 cccactgcca acgtgtcagt ggtggacctg acctgccgtc tagaaaaacc tgccaaatat841 gatgacatca agaaggtggt gaagcaggcg tcggagggcc ccctcaaggg catcctgggc901 tacactgagc accaggtggt ctcctctgac ttcaacagcg acacccactc ctccaccttt961 gacgctgggg ctggcattgc cctcaacgac cactttgtca agctcatttc ctggtatgac1021 aacgaatttg gctacagcaa cagggtggtg gacctcatgg cccacatggc ctccaaggag1081 taagacccct ggaccaccag ccccagcaag agcacaagag gaagagagag accctcactg1141 ctggggagtc cctgccacac tcagtccccc accacactga atctcccctc ctcacagttg1201 ccatgtagac cccttgaaga ggggaggggc ctagggagcc gcaccttgtc atgtaccatc1261 aataaagtac cctgtgctca acc其中，(1)自76-1083是編碼GAPD 1-335氨基酸序列(如下所示)的基因組序列MGKVKVGVNGFGRIGRLVTRAAFNSGKVDIVAINDPFIDLNYMVYMFQYDSTHGKFHGTVKAENGKLVINGNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEYVVESTGVFTTMEKAGAHLQGGAKRVIISAPSADAPMFVMGVNHEKYDNSLKIISNASCTTNCLAPLAKVIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQKTVDGPSGKLWRDGRGALQNIIPASTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMAFRVPTANVSVVDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKQASEGPLKGILGYTEHQVVSSDFNSDTHSSTFDAGAGIALNDHFVKLISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE(2)自1261-1266為多聚腺苷腺尾polyA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株，其特征在于，該細(xì)胞株由下列方法培養(yǎng)制得a、將ATCC293細(xì)胞(P32)復(fù)蘇后進(jìn)行細(xì)胞擴增傳代至第33代次(P33)，然后將P33細(xì)胞懸液用FACS流式細(xì)胞儀進(jìn)行亞克隆；b、用2個96孔板，每孔中0.2ml培養(yǎng)基中放置一個細(xì)胞，在36～38℃、3～6％CO2條件下培養(yǎng)6～10天；c、挑選出細(xì)胞形態(tài)均一、生長良好的、已達(dá)到不低于60％鋪滿生長的克??；d、重復(fù)上述步驟四次，最后挑選出1個亞克隆的細(xì)胞柱(P37)，繼續(xù)培養(yǎng)擴增并制成原代細(xì)胞庫(P38)，置于-80℃凍存；e、以原代細(xì)胞庫(P38)為基礎(chǔ)制備主代細(xì)胞庫及工作細(xì)胞庫。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株，其特征在于，所述培養(yǎng)基是DMEM(GIBCO/BRL)與胎牛血清(GIBCO/BRL)的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株，其特征在于，用于細(xì)胞培養(yǎng)的ATCC 293細(xì)胞的傳代次數(shù)在55代次以下。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株，其特征在于，該細(xì)胞的倍增時間為18小時。
全文摘要
一種用于生產(chǎn)重組腺病毒制品的人胚腎293細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株，該細(xì)胞株是由ATCC 293細(xì)胞經(jīng)亞克隆方法制得，它含有人三磷酸甘油醛脫氫(human glyceraldehydes－3－phosphate dehydrogenase，GAPD)，該細(xì)胞株由下列方法培養(yǎng)制得a、將ATCC 293細(xì)胞(P32)復(fù)蘇后進(jìn)行細(xì)胞擴增傳代至第33代次(P33)，然后將P33細(xì)胞懸液用FACS流式細(xì)胞儀進(jìn)行亞克??；b、用2個96孔板，每孔中0.2ml培養(yǎng)基中放置一個細(xì)胞，在36～38℃、3～6％CO
文檔編號C12N15/50GK1513985SQ03126889
公開日2004年7月21日 申請日期2003年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月13日
發(fā)明者張曉志, 彭朝暉 申請人:張曉志, 彭朝暉