專利名稱：生物芯片檢測腫瘤基因的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測腫瘤基因的方法，具體發(fā)明涉及一種cDNA芯片檢測非何杰金氏淋巴瘤基因的方法。
非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的診斷多年來一直是病理醫(yī)師公認的難題。主要原因有兩個一方面，由于淋巴組織增生性疾病的形態(tài)學變化極其復雜且缺乏有效的輔助指標，使得鑒別診斷比較困難；另一方面，由于不同的國家/地區(qū)使用的分類標準不盡相同，也人為增加了NHL診斷的復雜性。世界衛(wèi)生組織(WHO)2001年版的惡性淋巴瘤新分類，在相當程度上改善了NHL診斷的混亂狀態(tài)。但由于對許多問題認識不足，該分類中仍然存在不少不盡完美之處。cDNA芯片能夠同時檢測上千個基因的表達情況，因此被廣泛應用于許多研究領域，用來了解與基因表達相關的各種問題。因此，cDNA芯片技術為我們的進一步研究NHL提供了強有力的手段。
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種用cDNA芯片檢測非何杰金氏淋巴瘤基因的方法。進一步可為臨床提供一種非何杰金氏淋巴瘤可靠的診斷指標。
本發(fā)明的基本技術方案是采用多次疊加辦法，自行設計一種cDNA芯片，用于檢測NHL與淋巴組織反應性增生(LRH)之間基因表達的差異，同時采用免疫組化染色的方法、在蛋白水平驗證差異基因的表達情況。
首先，用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法將從組織中提取的總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA；然后將NHL的cDNA分別標記以紅色熒光染料Cy5，同時為使對照均一化以便不同NHL標本間相互比較，將LRH的cDNA混合均勻并標記以綠色熒光染料Cy3；將兩種不同熒光標記的cDNA混合，與芯片進行雜交，經(jīng)過清洗與掃描，就可讀取信息芯片中每一個點上紅色與綠色熒光強度的比值，即與NHL和LRH標本中mRNA相對含量的比值成比例。結果需經(jīng)過均一化處理，方法如下計算每個內(nèi)參基因紅、綠色熒光強度比值Ri(即Ratio值)的自然對數(shù)值Ri’(Ri’＝In(Ri))，算出Ri’的平均值R’，均一化系數(shù)ND即為R’的指數(shù)函數(shù)即ND＝EXP(R’)。將芯片上所有可讀取數(shù)據(jù)項的綠色熒光標記強度Cy3乘以均一化系數(shù)ND，得出調(diào)整后的Cy3*。算出所有基因調(diào)整后的Ratio值(Cy5/Cy3*)。該值＞2.0或＜0.5的基因，方視為其在NHL與LRH間有差異表達，其中Ratio值＞2.0時視為該基因的mRNA在NHL中表達上調(diào)，＜0.5時則視為表達下調(diào)。
本發(fā)明的積極效果在于制作的cDNA芯片篩選出的10個差異表達基因本身或其蛋白產(chǎn)物，有望成為NHL診斷、預后的新的生物學指標。UBE1蛋白表達與否可協(xié)助判斷淋巴組織增生性疾病的良、惡性，但對于區(qū)分NHL中不同的組織學類型則作用不大。表明新方法對有關差異表達基因篩選的研究有很大促進價值。
下面給出本發(fā)明的實施例。
收集未經(jīng)治療的NHL淋巴結，用GIBCO公司TRIZOL試劑盒進行總RNA的抽提。
自行設計的cDNA芯片共包含512個基因克隆，包括①NHL中異常表達的27個基因如UBE1，TGF-β，CD4等；②出現(xiàn)表達上調(diào)或下調(diào)的重要基因，如CD10，BCL-6，CyclinD1；③少數(shù)基因如IL-2R，BLMH(博萊霉素水解酶)；④原癌/抑癌基因、‘看家基因’及表達序列標簽(ESTs)等。為提供一種內(nèi)參照以保證基因表達定量的重復性，芯片中的部分基因由2-3個不同的cDNA克隆代表。
基因表達情況通過競爭性雜交的機制進行檢測。首先，用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法將從組織中提取的總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA；然后將NHL的cDNA分別標記以紅色熒光染料Cy5，同時為使對照均一化以便不同NHL標本間相互比較，將LRH的cDNA混合均勻并標記以綠色熒光染料Cy3；將兩種不同熒光標記的cDNA混合，與芯片進行雜交，經(jīng)過清洗與掃描，就可讀取信息芯片中每一個點上紅色與綠色熒光強度的比值，即與NHL和LRH標本中mRNA相對含量的比值成比例。結果需經(jīng)過均一化處理，方法如下計算每個內(nèi)參基因紅、綠色熒光強度比值Ri(即Ratio值)的自然對數(shù)值Ri’(Ri’＝In(Ri))，算出Ri’的平均值R’，均一化系數(shù)ND即為R’的指數(shù)函數(shù)即ND＝EXP(R’)。將芯片上所有可讀取數(shù)據(jù)項的綠色熒光標記強度Cy3乘以均一化系數(shù)ND，得出調(diào)整后的Cy3*。算出所有基因調(diào)整后的Ratio值(Cy5/Cy3*)。該值＞2.0或＜0.5的基因，方視為其在NHL與LRH間有差異表達，其中Ratio值＞2.0時視為該基因的mRNA在NHL中表達上調(diào)，＜0.5時則視為表達下調(diào)。
采用Chi-Sqaure檢驗，分析UBE1蛋白在NHL與LRH之間，以及在NHL不同組織學類型之間的表達差異。
結果顯示，在我們前期研究的NHL中，出現(xiàn)的差異表達基因分別為67、185和126個；而在利用自行設計的cDNA芯片進行的本研究中，我們發(fā)現(xiàn)分別有28、106、41和27個基因在NHL中表達上調(diào)或下調(diào)。為了避免受測標本間的個體差異，同時簡化對于芯片所提供的龐大信息量的分析，我們選擇那些在兩次檢測的總共7例NHL中，至少有3例都出現(xiàn)了差異表達(同時上調(diào)或/和下調(diào))的基因作為重點分析對象。結果發(fā)現(xiàn)有10個基因符合要求，它們是AMFR(autocrine mobilityfactor receptor，自分泌移動因子受體)，TLN2(talin 2)，BLMH(bleomycin hydrolase，博萊霉素水解酶)，MKP1(MAP kinasephosphatase 1，MAP激酶磷酸化酶1)，PAIP-1(polyadenylate-bindingprotein-interact ing protein 1，polyA結合蛋白交互蛋白1)，hnRNPA1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1，異質(zhì)性核糖核苷蛋白A1)，SMAD7(sma-and mad-related protein 7，sma與mad相關蛋白7)，UBE1(ubiquitin-activating enzyme 1，泛有素活化酶1)，CUL5(cullin5)以及ASH2L(ash2-like)。這些基因中，有些已知與細胞移動、耐藥、蛋白質(zhì)合成、細胞周期進展/增殖/凋亡的調(diào)節(jié)等功能相關，有些則其結構與功能尚不清楚。至于上述基因在NHL中發(fā)揮了什么樣的作用，迄今為止相關的研究還很少見。
鑒于DLBCL與FL(濾泡性淋巴瘤)均是NHL中最常見的類型，因此我們在以往及本研究中，均將它們作為主要對象，擬從中尋找一些有價值的線索，再推及到其它類型的NHL中予以驗證，探討對于指導NHL的診斷或預后有意義的新指標。
權利要求
1.一種生物芯片檢測腫瘤基因的方法，其特征在于采用多次疊加辦法，設計cDNA芯片，檢測非何杰金氏淋巴瘤與淋巴組織反應性增生之間基因表達的差異，同時采用免疫組化染色的方法、在蛋白水平驗證差異基因的表達。
2.根據(jù)權利要求1所述的生物芯片檢測腫瘤基因的方法，其特征在于先用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法將從組織中提取的總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA；然后將NHL的cDNA分別標記以紅色熒光染料Cy5，同時為使對照均一化以便不同NHL標本間相互比較，將LRH的cDNA混合均勻并標記以綠色熒光染料Cy3；將兩種不同熒光標記的cDNA混合，與芯片進行雜交，經(jīng)過清洗與掃描，讀取芯片中每一個點上紅色與綠色熒光強度的比值，即NHL和LRH標本中mRNA相對含量的比值；結果經(jīng)過均一化處理，方法如下計算每個內(nèi)參基因紅、綠色熒光強度比值Ri的自然對數(shù)值Ri’(Ri’＝In(Ri))，算出Ri’的平均值R’，均一化系數(shù)ND即為R’的指數(shù)函數(shù)即ND＝EXP(R’)；將芯片上所有可讀取數(shù)據(jù)項的綠色熒光標記強度Cy3乘以均一化系數(shù)ND，得出調(diào)整后的Cy3*；算出所有基因調(diào)整后的Ratio值(Cy5/Cy3*)；該值＞2.0或＜0.5的基因，方視為其在NHL與LRH間有差異表達，其中Ratio值＞2.0時視為該基因的mRNA在NHL中表達上調(diào)，＜0.5時則視為表達下調(diào)。
全文摘要
本發(fā)明為一種生物芯片檢測腫瘤基因的方法。采用多次疊加辦法，設計cDNA芯片，檢測非何杰金氏淋巴瘤與淋巴組織反應性增生之間基因表達的差異，同時采用免疫組化染色的方法、在蛋白水平驗證差異基因的表達情況。本發(fā)明為臨床提供一種非何杰金氏淋巴瘤可靠的診斷指標。
文檔編號C12Q1/68GK1468966SQ0312693
公開日2004年1月21日 申請日期2003年6月20日 優(yōu)先權日2003年6月20日
發(fā)明者蘇祖蘭, 肖暢, 龍捷, 羅東蘭, 金亦, 游景玉 申請人:中山大學