專利名稱：提高用畢赤酵母分泌表達成纖維細胞生長因子表達量的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于一種提高用畢赤酵母分泌表達成纖維細胞生長因子表達量的方法。
背景技術：
成纖維細胞生長因子(FGF)是由多種多肽因子組成的一個大家族，除了主要的酸性FGF(aFGF)和堿性FGF(bFGF，F(xiàn)GF2)，至少還包括以下成員hst/ks3、int-2、FGF-5、FGF-6及角質細胞生長因子(KGF，F(xiàn)GF-7)。它們分布于多種組織并具有廣泛的生物學作用，可誘導大多數(shù)來自中胚層和神經外胚層細胞的有絲分裂，如間充質細胞(血管內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞)，內分泌細胞(卵泡粒層細胞、腎上腺皮質細胞等)，神經細胞(星形膠質細胞、少突膠質細胞、神經元等)；及毛細血管內皮細胞的增生和細胞的分化。FGF在胚胎形成、分化、血管形成及心臟損傷修復、創(chuàng)傷愈合等方面起著重要作用，在神經系統(tǒng)的生長發(fā)育、損傷與疾病中，尤其是腦與脊髓損傷、Alzheimer’s病、Parkinson’s病、糖尿病性神經病變等方面都有廣闊的應用。
畢赤酵母表達系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的一種以甲醇為唯一碳源的新型表達體系，它兼有原核細胞良好的分子生物學可操作性和真核系統(tǒng)的后加工作用。它能利用很強的啟動子，具有極快的細胞生長速度，而且該系統(tǒng)的載體能和核基因進行整合，所以構建的菌株較穩(wěn)定，此外通過分泌信號肽的引導，外源蛋白可以在內質網和高爾基體中經修飾加工后分泌到胞外，從而免除了純化時繁瑣的細胞破碎及提取工作。但是令人遺憾的現(xiàn)象是很多外源蛋白的分泌表達效率低下，尤其是相對于胞內表達來說。
中國專利CN 1345927A中公開了李效坤等題為“重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)基因工程酵母菌及生產方法”，該方法用畢赤酵母表達系統(tǒng)構建了一種能夠在胞內或胞外表達bFGF的酵母工程菌，表達量約為20-100mg/L。姜穎等在中國免疫學雜志2001年第17卷517-521頁題為“重組人aFGF的克隆、表達及活性測定”一文中報道其使用畢赤酵母分泌型酵母表達系統(tǒng)表達了重組人aFGF，表達量為12mg/L。這為我們進一步提高用畢赤酵母表達體系表達FGF產量奠定了基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種提高用畢赤酵母分泌表達成纖維細胞生長因子表達量的方法。
本發(fā)明使用的畢赤酵母工程菌為GS115或KM71，其分泌型表達載體為pPICZα-A，pHIL-S1，pPIC9，或pPIC9K。這類表達體系具有很強的啟動子，同時其載體能和酵母核基因整合，因此非常穩(wěn)定。畢赤酵母的生物學特性和一般的釀酒酵母很相似，這就節(jié)省了購置發(fā)酵設備和探索發(fā)酵技術所需的巨額花費，使其進行大規(guī)模的商品化生產非常有利。本發(fā)明通過添加氨基酸組分增加了在表達過程中的營養(yǎng)物質，使酵母細胞具有較強的生產力；另外這種方法避免了在使用甲醇+甘油混合培養(yǎng)恢復細胞生產力時，醇氧脫氫酶(AOX)啟動子受甘油的抑制的問題；同時由于細胞生物量的提高也增加了對甲醇的利用，從而使這種通過AOX啟動子嚴緊誘導表達的產量隨著甲醇利用率的提高而提高。
本發(fā)明首先將分泌型表達載體為pPICZα-A，pHIL-S1，pPIC9，或pPIC9K的畢赤酵母工程菌GS115或KM71，在BMGY培養(yǎng)基中，溫度為28-31℃，搖床轉數(shù)為250-300rpm培養(yǎng)至菌體密度為OD600＝5.0-9.0，培養(yǎng)時間為24-32小時，這保證了進入誘導表達前所需要的生物量；然后在室溫3000-5000rpm離心5-10min，再將菌體重懸于復合誘導培養(yǎng)基(BMMAY)開始誘導表達蛋白，BMMAY培養(yǎng)基的組成甲醇、BMMY培養(yǎng)基、疏水性氨基酸丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、或蛋氨酸(Met)；誘導溫度為30-31℃；搖床轉數(shù)200-300rpm；誘導時間72-144小時；每隔24小時補加誘導劑甲醇及氨基酸，使甲醇終濃度為0.5-1.5％，氨基酸終濃度為0.05-0.1％；達到誘導時間后10000-12000rpm離心收獲上清液進行分離純化；上清液直接用肝素瓊脂糖(Heparin Sepharose)CL-6B親和層析柱純化，分別用含0.5和3.0mol/L氯化鈉的20mmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收集第二洗脫峰，將洗脫峰蛋白用10mmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液透析除鹽，凍干保存。所得蛋白凍干粉經SDS-PAGE電泳鑒定為單一電泳純，同時鑒定了其促3T3細胞增殖的生物學活性，并用Folin酚法測定其蛋白濃度，計算出每升發(fā)酵液所得FGF產量80-200mg。這一方法使FGF在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的條件下的表達量提高4-16倍。
本發(fā)明的優(yōu)點在于工藝簡單易行、生產產量大幅度提高，從而使生產成本降低，利潤提高。這使FGF家族做為基因工程藥物進行大規(guī)模產業(yè)化生產具有決定性意義；同時對于指導其它以畢赤酵母表達體系分泌表達的外源蛋白的表達量提高具有重要意義。
為了更清楚的說明本發(fā)明，列舉以下實施例。
具體實施例方式
實施例1含aFGF基因的畢赤酵母GS115，其分泌型表達載體為pPIC9的分泌表達本方案添加的氨基酸為Ala。
挑取工程菌的一個單菌落接種于1L BMGY培養(yǎng)基中，在28℃，300rpm培養(yǎng)至菌體密度為OD600＝6.0，培養(yǎng)時間為26h；室溫3000rpm離心6min收獲菌體，菌體重懸于1L BMMAY培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基含0.5％甲醇，0.05％Ala，于30℃，300rpm培養(yǎng)；每隔24h補加甲醇終濃度為0.5％，Ala終濃度為0.05％，于30℃，300rpm繼續(xù)培養(yǎng)；120h后10000rpm 4℃離心30分鐘，棄掉沉淀，將上清4℃保存；上清液直接過Heparin Sepharose CL-6B親和層析柱純化，分別用含0.5和3.0mol/L氯化鈉的20mmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收集第二洗脫峰；將洗脫的蛋白用10mmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液透析除鹽，凍干保存；凍干粉用SDS-PAGE電泳鑒定純度，用Folin酚法測定蛋白濃度，確定其產量。
此種方案獲得的aFGF為0.10±0.005g/L。
實施例2含aFGF基因的畢赤酵母 GS115，其分泌型表達載體為pPICZα-A的分泌表達。
本方案BMMAY中添加的氨基酸為phe。
挑取工程菌的一個單菌落接種于1L BMGY培養(yǎng)基中，在30℃，250rpm培養(yǎng)至菌體密度為OD600＝5.0，培養(yǎng)時間為24h；室溫4000rpm離心5min收獲菌體，菌體重懸于1L BMMAY培養(yǎng)基中。此培養(yǎng)基含0.5％甲醇，0.08％Phe，于31℃，250rpm培養(yǎng)；每隔24h補加甲醇終濃度為0.5％，Phe終濃度為0.08％，于31℃，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)；120h后12000rpm 4℃離心30分鐘，棄掉沉淀，將上清4℃保存，其它步驟同實施例1。
此種方案獲得的aFGF約為80±5mg/L。
實施例3含aFGF基因的畢赤酵母GS115，其分泌型表達載體為pPIC9的分泌表達本方案BMMAY中添加的氨基酸為Tyr。挑取工程菌的一個單菌落接種于1L BMGY培養(yǎng)基中，在30℃，280rpm培養(yǎng)至菌體密度為OD600＝7.0，培養(yǎng)時間約為28h；室溫5000 rpm離心10min收獲菌體，菌體重懸于1L BMMAY培養(yǎng)基中。此培養(yǎng)基含1.0％甲醇，0.1％Tyr，于31℃，280rpm培養(yǎng)；每隔24h補加甲醇至終濃度為1.0％，Tyr終濃度為0.1％，于30.5℃，280rpm繼續(xù)培養(yǎng)；144h后12000rpm 4℃離心30分鐘，棄掉沉淀，將上清4℃保存，其它步驟同實施例1。
此種方案獲得的aFGF約為150±10mg/L。
實施例4含aFGF基因的畢赤酵母GS115，其分泌型表達載體為pHIL-S1的分泌表達本方案BMMAY中添加的氨基酸為Val。挑取工程菌的一個單菌落接種于1L BMGY培養(yǎng)基中，在30℃，300rpm培養(yǎng)至菌體密度為OD600＝6.0，培養(yǎng)時間為24h；室溫4000rpm離心收獲菌體，菌體重懸于1L BMMAY培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基含0.8％甲醇，0.08％Val，于30℃，300rpm培養(yǎng)；每隔24h補加甲醇終濃度為0.8％；Val終濃度為0.08％，于30℃，300rpm繼續(xù)培養(yǎng)；120h后12000rpm 4℃離心30分鐘，棄掉沉淀，將上清4℃保存，其它步驟同實施例1。
此種方案獲得的aFGF約為100±5mg/L。
實施例5含bFGF基因的畢赤酵母KM71，其分泌型表達載體為pPIC9K的分泌表達本方案BMMAY中添加的氨基酸為Leu。挑取工程菌的一個單菌落接種于1L BMGY培養(yǎng)基中，在30℃，300rpm培養(yǎng)至菌體密度為OD600＝9.0，培養(yǎng)時間為32h；室溫5000rpm離心收獲菌體，菌體重懸于1L BMMAY培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基含1.0％甲醇，0.1％Leu，于30℃，300rpm培養(yǎng)；每隔24h補加甲醇終濃度為1.0％；Val終濃度為0.1％，于30℃，300rpm繼續(xù)培養(yǎng)；144h后12000rpm 4℃離心30分鐘，棄掉沉淀，將上清4℃保存，其它步驟同實施例1。
此種方案獲得的bFGF約為0.15±0.01g/L。
實施例6含bFGF基因的畢赤酵母KM71，其分泌型表達載體為pPIC9的分泌表達本方案BMMAY中添加的氨基酸為Ala。挑取工程菌的一個單菌落接種于1L BMGY培養(yǎng)基中，在30℃，300rpm培養(yǎng)至菌體密度為OD600＝6.0，培養(yǎng)時間為26h；室溫4000rpm離心8min收獲菌體，菌體重懸于1LBMMAY培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基含1.0％甲醇，0.1％Ala，于30℃，300rpm培養(yǎng)；每隔24h補加甲醇終濃度為1.0％；Ala終濃度為0.1％，于30℃，300rpm繼續(xù)培養(yǎng)；144h后11000rpm 4℃離心30分鐘，棄掉沉淀，將上清4℃保存，其它步驟同實施例1。
此種方案獲得的bFGF約為0.20±0.01g/L。
實施例7含bFGF基因的畢赤酵母GS115，其分泌型表達載體為pHIL-S1的分泌表達本方案BMMAY中添加的氨基酸為Tyr。挑取工程菌的一個單菌落接種于1L BMGY培養(yǎng)基中，在30℃，300rpm培養(yǎng)至菌體密度為OD600＝8.0，培養(yǎng)時間約為30h；室溫4000rpm離心收獲菌體，菌體重懸于1L BMMAY培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基含1.2％甲醇，0.1％Tyr，于30℃，300rpm培養(yǎng)；每隔24h補加甲醇終濃度為1.2％；Tyr終濃度為0.1％，于30℃，300rpm繼續(xù)培養(yǎng)；144h后12000rpm 4℃離心30分鐘，棄掉沉淀，將上清4℃保存，其它步驟同實施例1。
此種方案獲得的bFGF約為0.18±0.01g/L實施例8含bFGF基因的畢赤酵母GS115，其分泌型表達載體為pPIC9K的分泌表達本方案BMMAY中添加的氨基酸為Met。挑取工程菌的一個單菌落接種于1L BMGY培養(yǎng)基中，在30℃，300rpm培養(yǎng)至菌體密度為OD600＝7.0，培養(yǎng)時間約為26h；室溫4000rpm離心收獲菌體，菌體重懸于1L BMMAY培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基含0.8％甲醇，0.1％Val，于30℃，300rpm培養(yǎng)；每隔24h補加甲醇終濃度為0.8％；Val終濃度為0.1％，于30℃，300rpm繼續(xù)培養(yǎng)；120h后12000rpm 4℃離心30分鐘，棄掉沉淀，將上清4℃保存，其它步驟同實施例1。
此種方案獲得的bFGF約為0.15±0.01g/L實施例9含KGF基因的畢赤酵母GS115，其分泌型表達載體為pHIL-S1的分泌表達本方案BMMAY中添加的氨基酸為Ala。挑取工程菌的一個單菌落接種于1L BMGY培養(yǎng)基中，在30℃，280rpm培養(yǎng)至菌體密度為OD600＝6.0，培養(yǎng)時間為24h。室溫4000rpm離心收獲菌體，菌體重懸于1L BMMAY培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基含1.0％甲醇，0.1％Ala，于30℃，300rpm培養(yǎng)；每隔24h補加甲醇終濃度為1.0％；Ala終濃度為0.1％，于30℃，300rpm繼續(xù)培養(yǎng)；120h后12000rpm 4℃離心30分鐘，棄掉沉淀，將上清4℃保存，此種方案獲得的KGF約為90±5mg/L。
權利要求
1.一種提高用畢赤酵母分泌表達成纖維細胞生長因子表達量的方法，首先將分泌型表達載體為pPICZα-A，pHIL-S1，pPIC9，或pPIC9K的畢赤酵母工程菌GS115或KM71，在BMGY培養(yǎng)基中，溫度為28-31℃，搖床轉數(shù)為250-300rpm培養(yǎng)至菌體密度為OD600＝5.0-9.0，培養(yǎng)時間為24-32小時，然后在室溫3000-5000rpm離心5-10min，再將菌體重懸于復合誘導培養(yǎng)基開始誘導表達蛋白，復合誘導培養(yǎng)基的組成甲醇、復合誘導培養(yǎng)基、疏水性氨基酸丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或蛋氨酸；誘導溫度為30-31℃；搖床轉數(shù)200-300rpm；誘導時間72-144小時；每隔24小時補加誘導劑甲醇及氨基酸，使甲醇終濃度為0.5-1.5％，氨基酸終濃度為0.05-0.1％；達到誘導時間后10000-12000rpm離心收獲上清液進行分離純化。
全文摘要
本發(fā)明屬于一種提高用畢赤酵母分泌表達成纖維細胞生長因子表達量的方法。使用的畢赤酵母工程菌為GS115或KM71，其分泌型表達載體為pPICZα－A，pHIL－S1，pPIC9，或pPIC9K。先將畢赤酵母工程菌在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將菌體重懸于復合誘導培養(yǎng)基(BMMAY)開始誘導表達蛋白，BMMAY培養(yǎng)基的組成甲醇終濃度為0.5－1.5％BMMY培養(yǎng)基，終濃度為0.05－0.1％疏水性氨基酸丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)或蛋氨酸(Met)；誘導溫度為30－31℃；誘導時間72－144小時；每隔24小時補加誘導劑甲醇及氨基酸，達到誘導時間后離心收獲上清液進行分離純化。
文檔編號C12N15/81GK1492050SQ03127139
公開日2004年4月28日 申請日期2003年9月9日 優(yōu)先權日2003年9月9日
發(fā)明者孫立偉, 張曉宇, 趙大慶 申請人:中國科學院長春應用化學研究所