專利名稱：殼聚糖酶生產(chǎn)菌及低聚殼聚糖的生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及殼聚糖的降解方法，特別是能產(chǎn)生高活性殼聚糖酶的微生物以及利用該微生物和其產(chǎn)生的高活性殼聚糖酶對殼聚糖進行降解，使之得到性能優(yōu)異的水溶性低聚殼聚糖的生產(chǎn)方法。
背景技術：
殼聚糖是由甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，它在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、特別是食品、醫(yī)藥等領域都具有重要的應用價值。但由于殼聚糖分子量大、水溶性差、不易被人體或動物吸收，使其應用受到限制。而殼聚糖經(jīng)降解后得到的低聚殼聚糖(又稱甲殼低聚糖、殼寡糖、氨基寡糖素等)，其聚合度(D.P.)一般為2-20。這種低聚合度的水溶性殼聚糖具有多種優(yōu)異的性能，除了作為人體的功能性食品和作為紡織、造紙等輕工業(yè)原料外，近年來發(fā)現(xiàn)其更具有促進脾臟抗體生成、抑制腫瘤細胞生長的生理功能；可有效地降低肝臟和血清中的膽固醇以及降低血壓、血糖和血脂；增強免疫力和抗疾病的能力；強化肝臟功能，防止痛風和胃潰瘍；促進雙歧桿菌的增殖，抑制大腸桿菌及引起腸內(nèi)感染的一些其它細菌的生長；抑制成人病的發(fā)生等。
在農(nóng)業(yè)上，低聚合度的殼聚糖可作為性能良好的水果和食物保鮮劑，有專利文獻報道，將降解的殼聚糖加入適量的殺菌劑，能使荔枝、芒果、草莓、龍眼等難保鮮的水果在常溫下保鮮10-15天；將其單獨使用或與一些農(nóng)藥組合，可作為植物誘導抗病劑和植物生長調(diào)節(jié)劑。
在日用工業(yè)上，將低聚合度的殼聚糖與聚乙烯、聚丙烯等塑料混煉，可得到生物降解塑料，這種降解塑料強度和生物降解性能優(yōu)于摻入變性淀粉的降解塑料；低聚合度的殼聚糖還可以作為優(yōu)良的紡織助劑和造紙助留劑等?？傊S著科學的進步，低聚殼聚糖將會得到越來越廣泛的應用。
怎樣制備性能優(yōu)異的低聚殼聚糖，多年來一直是化學家和生物學家的研究熱點，通常的降解殼聚糖的方法有化學法、物理法和生物法。生物法又通常稱為酶法，它優(yōu)于化學法和物理法，其原因是酶法降解可特異性地、選擇性地切斷β-(1，4)-糖苷鍵，降解過程和降解產(chǎn)物的分子量易于控制，條件也比較溫和，因而可以方便地對降解過程進行監(jiān)控，得到所需分子量分布范圍的低聚殼聚糖。降解過程不需要加入大量的試劑，對環(huán)境基本不會造成污染。目前已發(fā)現(xiàn)多種酶可降解殼聚糖，其中包括專一性酶如殼聚糖酶、非專一性酶如纖維素酶、脂肪酶和蛋白酶等。
公開文獻報道了一些殼聚糖酶的制備，主要是從一些微生物中經(jīng)過篩選，選擇那些能以殼聚糖為原料的，培養(yǎng)條件不復雜的，又可得到高活性殼聚糖酶的菌種，如《工業(yè)微生物》2002年第12期公開了經(jīng)過篩選出的假單孢菌作為產(chǎn)生殼聚糖酶的菌種，以及培養(yǎng)條件包括溫度、PH、時間、接種量對產(chǎn)酶的影響，其酶活力一般可達0.4u/ml左右?！吨袊Ｑ笏幬铩?999年第2期以球孢白僵菌作為產(chǎn)生殼聚糖酶的菌種，其種子培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，固體誘導培養(yǎng)基采用蛋白胨、膠體殼聚糖、馬鈴薯、瓊脂等，復篩液體培養(yǎng)基采用硫酸鹽、膠體殼聚糖以及蛋白胨、酵母膏等。按此方法得到的殼聚糖酶活力為0.2u/ml。
技術內(nèi)容本發(fā)明人多年來一直從事對殼聚糖酶的研究，1993年在《微生物學通報》上發(fā)表了對球孢白僵菌產(chǎn)生酶的文章，最早認識到球孢白僵菌對殼聚糖的降解作用，但這種菌由于產(chǎn)生的殼聚糖酶活力較低，還不能應用于酶解法制備低聚殼聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明人于是又重新尋找適合殼聚糖作為培養(yǎng)基誘導物的菌種，經(jīng)過多年的艱苦探索和試驗，終于在自然界(我國沿海地區(qū)的海灘上)尋找到一些菌株，采集后進行了初步試驗，終于發(fā)現(xiàn)了一株能在以殼聚糖和甲殼素為唯一碳、氮源的培養(yǎng)基中生長，并分泌出幾丁質(zhì)酶(chitinase)和殼聚糖酶(chitosanase)的優(yōu)良菌株來。
經(jīng)對上述篩選出來的優(yōu)良菌株在誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其誘導物為殼聚糖，發(fā)現(xiàn)其分泌出的殼聚糖酶具有較高的活性和十分穩(wěn)定的遺傳性，初步鑒定為芽孢桿菌。
本申請人目前已將該菌種送到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期為2002年8月16日，保藏編號為0790，建議的分類命名為芽孢桿菌。
該芽孢桿菌的表面特征是芽孢囊膨大，芽孢橢圓形，芽孢一般次端生，革蘭氏陽性。在PDA培養(yǎng)基上生長，菌落的顏色由白色轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色。
本發(fā)明的殼聚糖酶生產(chǎn)菌的菌種培養(yǎng)以及低聚殼聚糖的生產(chǎn)方法如下先將上述提及的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號為0790的殼聚糖酶產(chǎn)生菌擴大培養(yǎng)，再用兩步法制備低聚殼聚糖第一步使用誘導產(chǎn)酶發(fā)酵，制備粗制液體型殼聚糖酶制劑；第二步使用第一步產(chǎn)生的粗制殼聚糖液體型酶制劑對殼聚糖溶液進行降解，制備低聚殼聚糖。
上述所說殼聚糖酶產(chǎn)生菌的擴大培養(yǎng)是將篩選的菌種在介質(zhì)中培養(yǎng)，培養(yǎng)的介質(zhì)可以是固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基。所述的固體培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，或者由豆餅粉、麩皮、殼聚糖和無機鹽組成的培養(yǎng)基，其中重量百分含量為豆餅粉1-5％，麩皮1-3％，玉米粉或薯類淀粉1-5％，鈣、鐵、銨鹽，其含量各占0.01-0.1％，磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀0.1-0.5％，其余為殼聚糖粉。
所述的液體培養(yǎng)基為CTNP培養(yǎng)基氯化鉀、氯化鈉、硫酸鎂各0.05-0.1％，磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀0.1-0.5％及適量的鈣、鐵、銨鹽，其含量各占0.01-0.1％，殼聚糖0.5-2.0％，其PH為6-8?；蚴怯?-2％蛋白胨、0.5-2％牛肉膏、0.5％-1鈉鹽配制的pH6-8的肉汁胨培養(yǎng)基。
在擴大培養(yǎng)基培養(yǎng)的溫度為25-38℃，時間為1-3天。
從擴大培養(yǎng)得到的菌種選少量留種保存于4℃的冰箱中，大部分可直接用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶制劑。工業(yè)化生產(chǎn)殼聚糖酶制劑的設備采用帶攪拌器和加熱器裝置的發(fā)酵罐，生產(chǎn)過程首先是配制誘導產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，方法是在CTNP培養(yǎng)基的基礎上，再加入0.5-2％的其它氮源，如氯化銨、硫酸銨、尿素等，并加入促酶釋放因子(ZSY)0.01-0.1％，然后加入擴大培養(yǎng)的菌種，加入菌種的量按總殼聚糖總量的0.5-1％。調(diào)節(jié)PH為6-8，最佳為6.5-7.5，溫度保持20-40℃，發(fā)酵時間24-48小時，發(fā)酵過程定時對物料進行分析，一般當發(fā)酵液中出現(xiàn)芽孢時，發(fā)酵液中的殼聚糖酶活力達到高峰時即可結(jié)束發(fā)酵。離心除渣除菌后的發(fā)酵液即為粗制液體型殼聚糖酶制劑。
將此粗酶液與3％-6％殼聚糖溶液按一定比例(如1∶10V/V)混勻，在40℃-50℃，pH5-6條件下進行殼聚糖的酶解反應，由于底物殼聚糖的分子量不同，酶解反應終止的時間不同，一般不超過4-12小時，殼聚糖即已全部轉(zhuǎn)化為水溶性低聚殼聚糖。利用不同的酶底比和酶解反應時間，可獲得不同分子量分布范圍的低聚殼聚糖產(chǎn)物。
酶解反應混合物進行50-70℃的高溫滅酶活，經(jīng)超濾、納濾濃縮和純化，噴霧干燥得到低聚殼聚糖產(chǎn)品(殼寡糖，氨基寡糖素)，此產(chǎn)品可用作制藥、.農(nóng)藥、食品或輕工業(yè)原料等。
與目前所公開文獻的技術相比，本發(fā)明具有突出的實質(zhì)性特點和進步是1.本發(fā)明篩選的菌種為芽孢桿菌，其遺傳性十分穩(wěn)定；用PDA培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)5年，產(chǎn)酶能力不下降，在室溫15-40℃的條件下密封保存半年以上不失活，產(chǎn)酶能力也不下降。
2.用誘導產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明的菌種，其產(chǎn)酶能力高，單位發(fā)酵液所含殼聚糖酶活力高，并能抑制雜菌的生長，殼聚糖消耗少，培養(yǎng)條件容易控制。
3.產(chǎn)酶發(fā)酵及酶解反應的時間短，一般40-48小時即可完成發(fā)酵及酶解的全過程，對工業(yè)化生產(chǎn)很有利，表明可在短時間內(nèi)提高生產(chǎn)效率，節(jié)約生產(chǎn)成本。
4.酶解反應條件溫和，易于控制反應條件以獲得不同的分子量分布范圍的低聚殼聚糖產(chǎn)物。
5.產(chǎn)物好，用本發(fā)明菌種及方法獲得的低聚殼聚糖，制備2-10聚合度的產(chǎn)率可達90％以上，基本不產(chǎn)生單糖。
以下是
具體實施例方式實施例一1、液體培養(yǎng)基擴大菌種。將菌種從PDA斜面接入液體CTNP培養(yǎng)基中，氯化鉀、氯化鈉、硫酸鎂各0.05-0.1％，磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀0.1-0.5％及適量的鈣、鐵、銨鹽，其含量占0.01-0.1％，殼聚糖0.5-2.0％，其PH為6-8。或是由1-2％蛋白胨、0.5-2％牛肉膏、0.5％-1鈉鹽配制的pH6-8的肉汁胨培養(yǎng)基，在擴大培養(yǎng)基培養(yǎng)的溫度為25-38℃，時間為1-3天。
2.產(chǎn)酶發(fā)酵生產(chǎn)。將上述的擴大菌種培養(yǎng)液300ml加入600L發(fā)酵罐(罐內(nèi)有上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基400升和硫酸銨2公斤，促酶釋放因子(ZSY)0.01-0.1％)調(diào)節(jié)PH為6.0-7.8，溫度20-40℃，發(fā)酵時間為36小時，此時發(fā)酵液中殼聚糖酶活性達到高峰，終止發(fā)酵，然后離心除渣除菌即得粗制液體型殼聚糖酶制劑。
3.酶解產(chǎn)糖生產(chǎn)。在5000升反應釜內(nèi)，將上述粗酶液與3-6％殼聚糖溶液按1∶10的體積比混勻，40-50℃，pH5-6條件下反應9小時，升溫至60℃滅酶活，超濾濃縮10倍后噴霧干燥得到粗制低聚殼聚糖粉劑。
實施例二1、固體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種。配制由豆餅粉、麩皮、殼聚糖和無機鹽組成的培養(yǎng)基，其中重量百分含量為豆餅粉1-5％，麩皮1-3％，玉米粉或薯類淀粉1-5％，鈣、鐵、銨鹽，其含量占0.01-0.1％，磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀0.1-0.5％，促酶釋放因子(ZSY)0.01-0.1％，其余為殼聚糖粉。將菌種接入此培養(yǎng)基上，26-30℃培養(yǎng)3-5天，得到擴大菌種。
2.產(chǎn)酶發(fā)酵生產(chǎn)。
將上述的擴大菌種50公斤加到事先放有產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(罐內(nèi)有上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基400升和氯化銨2公斤，促酶釋放因子(ZSY)0.01-0.1％，不含殼聚糖)的4噸的發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)PH在6.5-8.0，溫度25-35℃，發(fā)酵時間為36小時，當分析產(chǎn)物中殼聚糖酶活性達到高峰時終止發(fā)酵，離心除渣除菌即得粗制液體型殼聚糖酶制劑。
3.酶解產(chǎn)糖生產(chǎn)。按實施例一的方法進行。
實施例三1.液體培養(yǎng)基擴大菌種。將菌種由PDA斜面接入事先放有實施例一肉汁胨培養(yǎng)液的200L的種罐中，28-38℃通氣培養(yǎng)24小時，得到液體擴大菌種。
2.產(chǎn)酶發(fā)酵生產(chǎn)。將上述的擴大菌種加到事先放有3噸產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(罐內(nèi)有上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基400升和尿素2公斤，促酶釋放因子(ZSY)0.01-0.1％，不含殼聚糖))的發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)PH為6.5-8.0，溫度為20-40℃，發(fā)酵時間36小時，離心除渣除菌得到粗制液體型殼聚糖酶制劑。
3.酶解產(chǎn)糖生產(chǎn)。按實施例一的方法進行。
實施例四1.固體培養(yǎng)基擴大菌種。將PDA培養(yǎng)基在500毫升的茄形瓶內(nèi)鋪成斜面，將菌種由試管PDA斜面接入茄形瓶PDA斜面，28℃-30℃培養(yǎng)3-5天，得到固體擴大菌種。
2.產(chǎn)酶發(fā)酵生產(chǎn)。將上述的一個茄形瓶的擴大菌種接入有400L誘導產(chǎn)酶培養(yǎng)基的0.6噸發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)PH7-8，溫度為30-40℃，發(fā)酵36小時后終止發(fā)酵。離心除渣除菌，經(jīng)硫酸胺鹽析、透析除鹽后得到較為純化的液體型殼聚糖酶制劑。
3.酶解產(chǎn)糖生產(chǎn)。將上述酶液與6％純化殼聚糖溶液混勻，40-50℃，pH5-6條件下酶解4小時，調(diào)pH值至8.0終止反應。離心除渣，超濾除蛋白質(zhì)及濃縮糖液，納濾除單糖及無機鹽后，噴霧干燥或真空冷凍干燥制備純凈的低聚殼聚糖固體制劑。
應用實例1.將上述制得的低聚殼聚糖作為生防農(nóng)藥的主成分，可將防治能力提高20％以上。
2.將上述制得的低聚殼聚糖作為醫(yī)藥用品，做成口服液糖漿，具有效控制肝炎、糖尿病的病情。
3.將上述制得的低聚殼聚糖加入5％的2，4-D，做成5-10％溶液，將采摘后的荔枝鮮果浸泡其中10分鐘，晾干，自然放置，其保鮮期可延長7-10天。
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖酶生產(chǎn)菌，其特征在于它是芽孢桿菌，是將從自然界提取分離得到的菌株，用pDA或其它培養(yǎng)基培養(yǎng)，在4℃或常溫下保存，菌種的送保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏日為2002年8月16日，保藏號為0790。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖生產(chǎn)菌，其特點在于其菌種特征芽孢囊膨大，芽孢橢圓形，一般次端生，革蘭氏陽性，在PDA培養(yǎng)基上生長，菌落的顏色由白色轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色。
3.一種使用權(quán)利要求1所述殼聚糖酶生產(chǎn)菌制備低聚殼聚糖的方法，其特征在于先將中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號為0790的殼聚糖酶產(chǎn)生菌擴大培養(yǎng)，再用兩步法制備低聚殼聚糖第一步使用誘導產(chǎn)酶發(fā)酵，制備粗制液體型殼聚糖酶制劑；第二步使用第一步產(chǎn)生的粗制殼聚糖液體型酶制劑對殼聚糖溶液進行降解，制備低聚殼聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殼聚糖酶生產(chǎn)菌制備低聚殼聚糖的方法，其特征在于殼聚糖酶生產(chǎn)菌的擴大菌種方法是將采集得到的菌種加入到固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中，在溫度為25-38℃，時間為1-3天得到擴大菌種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3和4所述的殼聚糖酶生產(chǎn)菌制備低聚殼聚糖的方法，其特征在于殼聚糖酶生產(chǎn)菌的擴大菌種方法采用的固體培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，或者由豆餅粉、麩皮、殼聚糖和無機鹽組成的培養(yǎng)基，其中重量百分含量為豆餅粉1-5％，麩皮1-3％，玉米粉或薯類淀粉1-5％，鈣、鐵、銨鹽，其含量各占0.01-0.1％，磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀0.1-0.5％，其余為殼聚糖粉；采用的液體培養(yǎng)基為CTNP培養(yǎng)基氯化鉀、氯化鈉、硫酸鎂各0.05-0.1％，磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀0.1-0.5％及適量的鈣、鐵、銨鹽，其含量各占0.01-0.1％，殼聚糖0.5-2.0％，其pH為6-8，或是由1-2％蛋白胨、0.5-2％牛肉膏、0.5％-1鈉鹽配制的pH6-8的肉汁胨培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殼聚糖酶生產(chǎn)菌制備低聚殼聚糖的方法，其特征在于使用誘導產(chǎn)酶發(fā)酵，制備粗制液體型殼聚糖酶制劑的過程是將擴大培養(yǎng)得到的菌種放到事先加有誘導產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在PH6-8，溫度20-40℃的條件下發(fā)酵24-48小時，得到的發(fā)酵液經(jīng)離心除渣除菌后得到粗制液體型殼聚糖酶制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求3和6所述的殼聚糖酶生產(chǎn)菌制備低聚殼聚糖的方法，其特征在于誘導產(chǎn)酶培養(yǎng)基包括CTNP培養(yǎng)基并添加0.5-2％的氯化銨、硫酸銨、尿素和其它氮源物質(zhì)以及0.01-0.1％的促酶釋放因子(ZSY)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殼聚糖酶生產(chǎn)菌制備低聚殼聚糖的方法，其特征在于用粗制殼聚糖液體型酶制劑對殼聚糖溶液進行降解，制備低聚殼聚糖的過程是按粗酶液與3％-6％殼聚糖溶液的體積比1∶10，混勻，在40℃-50℃，pH5-6條件下進行殼聚糖的酶解反應。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用微生物培養(yǎng)得到殼聚糖酶和生產(chǎn)低聚殼聚糖(或稱氨基寡糖素、殼寡聚糖)的方法，所述的微生物是從海灘上獲得的芽孢桿菌，獲得菌種后誘導產(chǎn)酶發(fā)酵的方法是加入適量殼聚糖和氮源、無機營養(yǎng)鹽的溶液中，在常溫下培養(yǎng)30－40小時即可得到具有高活性的殼聚糖酶制劑，酶解產(chǎn)糖的方法是將酶液與殼聚糖溶液按一定比例混勻，在十分溫和的條件下進行酶解反應，短時間內(nèi)(4－12小時)即可將殼聚糖轉(zhuǎn)化為低聚殼聚糖，濃縮或干燥得到產(chǎn)品。該方法的菌種遺傳性穩(wěn)定，產(chǎn)酶率高，發(fā)酵及酶解條件常規(guī)化、速度快，產(chǎn)品質(zhì)量好。
文檔編號C12P19/00GK1492039SQ03128199
公開日2004年4月28日 申請日期2003年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月21日
發(fā)明者杜聲亮, 王士奎, 王世全, 章玉萍, 陳書勤 申請人:北海國發(fā)海洋生物產(chǎn)業(yè)股份有限公司