專利名稱：白菜育性相關(guān)基因及用于構(gòu)建白菜類作物的人工雄性不育系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種白菜育性相關(guān)基因及用該基因構(gòu)建白菜類作物的人工雄性不育系的方法。
背景技術(shù)：
雜種優(yōu)勢的利用在以提高作物的產(chǎn)量與品質(zhì)，增強(qiáng)品種的抗病性與抗逆性等為目標(biāo)的作物育種中具有重要意義。目前作物生產(chǎn)上利用雜種優(yōu)勢配制和生產(chǎn)雜種一代的方法主要有人工去雄、化學(xué)殺雄、利用自交不親和系以及雄性不育系。然而，人工去雄的方法耗時耗力，制種成本高；化學(xué)去雄為雜交制種提供了一種新方法，但存在去雄效果不好，抑制植物生長，污染環(huán)境等缺點；作物自交不親和性易受環(huán)境的影響而不穩(wěn)定，用其制種存在雜種不純，親本繁種困難等不利因素；利用植物雄性不育系是雜交制種的一條比較好的途徑，但優(yōu)良的不育源在自然界非常缺乏，且雄性不育、保持系及其恢復(fù)系的選育也存在很大的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種白菜育性相關(guān)基因及用該基因構(gòu)建白菜類作物的人工雄性不育系的方法。
本發(fā)明提供的白菜育性相關(guān)基因具有SEQ ID No.1的序列。該基因長1667bp，含有起始密碼子和完整的3’端序列，具有一個完整的長1578bp的開放閱讀框；經(jīng)GenBank BLAST查詢表明，該基因與位于擬南芥第一條染色體上的編碼細(xì)胞色素P450基因CYP86C4核苷酸序列有85.3％的同源性，氨基酸同源率為84.9％；Northern驗證顯示，該基因在白菜兩用系不育株的表達(dá)受到了明顯地抑制，并且該基因在花蕾中特異表達(dá)，而在葉片和莖中不表達(dá)。
本發(fā)明用白菜育性相關(guān)基因構(gòu)建白菜類作物的人工雄性不育系的方法，包括以下步驟(1)根據(jù)育性相關(guān)基因的全長序列，在育性相關(guān)基因的內(nèi)部第901個堿基至第1338個堿基之間設(shè)計引物，擴(kuò)增438bp序列作為反義基因片段；(2)根據(jù)植物雙元載體pBI121的多克隆酶切位點，分別設(shè)計兩條含有BamHI和Xba I限制性內(nèi)切酶位點以及三個保護(hù)堿基的PCR擴(kuò)增引物，其序列為P15’-GCT GGA TCC ACC ATT AGG TTT TTT AGA CA-3’；P2 5’-GAT TCT AGA GCCACT AAC AAA CTT CCC TG-3’，回收PCR產(chǎn)物，并連接在T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽性克隆經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定后，提取質(zhì)粒備用；(3)將陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行BamH I和Xba I雙酶切，酶切片段電泳分離后回收，取該回收片段和經(jīng)BamH I和Xba I雙酶切的pBI121載體用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽性克隆經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，陽性克隆質(zhì)粒命名為pBI35S-AMF；(4)按常規(guī)方法進(jìn)行三親雜交，將步驟3)構(gòu)建的pBI35S-AMF質(zhì)粒引入含Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌中；(5)將上述三親雜交的克隆轉(zhuǎn)化白菜蔬菜作物的外植體，用組織培養(yǎng)的方法從轉(zhuǎn)化的外植體中再生出植株，并通過PCR和Southern雜交等分子檢測手段對育性相關(guān)基因反義片段是否整合在受體植物染色體中進(jìn)行驗證；(6)在轉(zhuǎn)基因植株中觀察其花粉的育性，并進(jìn)行花粉萌發(fā)試驗和剝蕾授粉試驗，即可獲得雄性不育植株。
上述的擴(kuò)增的438bp反義基因片段來自育性相關(guān)基因，該反義基因片段具有SEQ ID No.2的序列；所說的農(nóng)桿菌菌株可以采用LBA4404或EHA105；所說的外植體可以是帶柄子葉；步驟6)中使用的花粉萌發(fā)試驗液體培養(yǎng)基為15％蔗糖+0.01％硼酸+1mg/L GA3。
本發(fā)明利用植物基因工程的方法能快速構(gòu)建各種白菜類蔬菜作物的雄性不育系，克服了從自然界尋找不育源所受的限制，同時也為植物基因工程技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用開辟了一條新的途徑。


圖1是植物表達(dá)載體pBI121的圖譜；圖2是反義育性相關(guān)基因植物表達(dá)載體pBI35S-AMF的構(gòu)建示意圖具體實施方式
以構(gòu)建‘上海青’普通白菜和‘油青’菜心為例。
育性相關(guān)基因反義片段的獲得根據(jù)白菜育性相關(guān)基因的全長序列(SEQ ID No.1)，在該基因的內(nèi)部第901個堿基至第1338個堿基之間設(shè)計引物，擴(kuò)增438bp序列作為反義基因片段(SEQID No.2)。并根據(jù)植物雙元載體pBI121的多克隆酶切位點(圖1)，分別設(shè)計兩條含有BamH I和Xba I限制性內(nèi)切酶位點以及三個保護(hù)堿基的PCR擴(kuò)增引物，其序列為P1 5’-GCT GGA TCC ACC ATT AGG TTT TTT AGA CA-3’；P2 5’-GATTCT AGA GCC ACT AAC AAA CTT CCC TG-3’。PCR擴(kuò)增條件為94℃，預(yù)變性3min；94℃，變性1min；50℃，退火45s；72℃，延長45s；72℃，延長10min；4℃保存；35個循環(huán)。
PCR產(chǎn)物在1.2％的瓊脂糖凝膠中電泳分離后，切下含目的片段的膠塊，采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收。取100ng-150ng回收產(chǎn)物與50ngpGEM-T Easy Vector(購自美國Promega公司)在T4連接酶作用下連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞，在LB/Amp/IPTG/X-gal平板上篩選重組子。挑選4~6個白色菌落，經(jīng)LB液體培養(yǎng)后，堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA，分別經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，提取質(zhì)粒備用。
pBI35S-AMF表達(dá)載體的構(gòu)建(1)雙酶切pBI121載體制備pBI121用BanH I和Xba I雙酶切，酶切產(chǎn)物用氯仿/異戊醇(24∶1)溶液抽提一次，乙醇沉淀，離心后用70％的乙醇清洗一次，空氣干燥后溶解于適量的dd H2O中備用。
(2)反義育性相關(guān)基因片段的制備將上述提取的質(zhì)粒進(jìn)行BanH I和XbaI雙酶切，酶切產(chǎn)物在1.5％的瓊脂糖凝膠中電泳分離后，切下含目的片段的膠塊，采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收。
(3)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程取上述制備好的的反義育性相關(guān)基因片段和經(jīng)BamH I和Xba I雙酶切的pBI121以摩爾比1∶1混合，用T4連接酶連接。連接條件按照T4連接酶的說明書進(jìn)行，4℃下反應(yīng)過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞；經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂于含Kan 50mg/L的固體LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。用牙簽挑取菌落，在5mL含Kan50mg/L的液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜，堿裂解法少量抽提其質(zhì)粒DNA，采用PCR和限制性內(nèi)切酶酶切等方法鑒定陽性克隆。陽性克隆質(zhì)粒命名為pBI35S-AMF(見圖2)。
三親雜交將pBI35S-AMF導(dǎo)入農(nóng)桿菌從超低溫冰箱中取出LBA4404或EHA105菌株，劃于空白的固體LB培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)過夜，以活化處于休眠狀態(tài)的菌株；挑取LBA4404或EHA105單菌落劃于含Rif和Str各50mg/L的固體LB培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)過夜；挑取單菌落接種于含Rif和Str各50mg/L的液體LB培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)。
從超低溫冰箱中取出含幫助質(zhì)粒pRK2013的HB101大腸桿菌菌株，劃于空白的固體LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜，以活化處于休眠狀態(tài)的菌株；挑取單菌落劃于含Kan50mg/L的固體LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜；挑取單菌落接種于含Kan50mg/L的液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)。將含目的質(zhì)粒pBI35S-AMF的DH5α單菌落接種于含Kan50mg/L的液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)。
等上述三個菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD值約為0.6)，分別取0.5mL等體積混合于1.5mL離心管中，4℃下3500rpm離心10min，去上清，100μL液體LB懸浮沉淀的細(xì)菌，涂于固體LB平板上，28℃過夜，用少量的液體LB洗下菌落，經(jīng)適當(dāng)?shù)谋侗认♂尯螅坑诤?5mg/L Rif、100mg/L Str和100mg/L Kan的LB平板上，28℃培養(yǎng)48h，挑取單菌落接種在含有上述三種同樣抗生素同樣濃度的液體LB中，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。取1.5mL轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液，堿裂解法少量制備農(nóng)桿菌中的質(zhì)粒，隨后用所提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有Kan50mg/L的LB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)篩選，挑取單菌落接種于含有Kan50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜，再抽提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和限制性酶酶切鑒定。
通過組織培養(yǎng)獲得人工雄性不育植株(1)培養(yǎng)基組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以采用其他的激素配比的培養(yǎng)基，本試驗采用以下配比的培養(yǎng)基。
基本培養(yǎng)基1/2倍濃度NH4+的MS培養(yǎng)基的鹽類及維生素+2％蔗糖+0.8％瓊脂+60mL/L椰子汁+2mg/L BAP+0.45mg/L NAA+7.5mg/L AgNO3(pH值5.8)；預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基 同基本培養(yǎng)基；共培養(yǎng)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基+10mg/L Kan(pH值5.8，并在培養(yǎng)基表面鋪一張比培養(yǎng)皿口徑略大的滅菌濾紙)；分化培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基+10mg/L Kan+300mg/L Amp(pH值5.8)；生根培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基的鹽類及維生素+0.8％瓊脂+10mg/L Kan(pH值5.8)。
(2)遺傳轉(zhuǎn)化的具體操作將帶柄子葉外植體在預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3d后，用LBA4404/pBI35S-AM感染10～15min，在滅菌濾紙上吸干菌液，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d，隨后把外植體轉(zhuǎn)入含10mg/L Kan的選擇分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽，3個星期轉(zhuǎn)瓶一次，當(dāng)抗性幼苗長至2～3cm時，從愈傷組織處切下幼苗在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定根，20d左右后等不定根長成即可開瓶煉苗，繼而移栽至營養(yǎng)土中，正常管理至開花結(jié)果。
轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測及其育性觀察(1)轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測參照GUS基因內(nèi)部371bp的uidA片段兩端序列設(shè)計PCR引物(Ying et al.，1999)，引物的序列為P5 5’-ACG TCC TGTAGA AAC CCC AAC C-3’，P6 5’-TCC CGG CAA TAA CAT ACG GCG T-3’。在25μL的反應(yīng)體系中，含有1×的Pfu Buffer(10mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40，1.5mM MgCl2和0.001％BSA)，0.2μM的dNTPs，0.2μM的引物(每條)，1u的Taq酶。PCR擴(kuò)增條件為95℃，預(yù)變性3min；95℃，變性30s；59℃，退火1min；72℃，延長45s；35個循環(huán)；72℃，延長10min；4℃保存。循環(huán)反應(yīng)于PE公司和Biometra公司生產(chǎn)的熱循環(huán)儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，分別吸取10μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物點樣于1.2％的瓊脂糖凝膠(Gene Co.產(chǎn)品)進(jìn)行電泳。拍照。
(2)轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交檢測 以pBI35S-AMF質(zhì)粒為模板，按照PCR檢測的反應(yīng)體系擴(kuò)增得到GUS基因的uidA片段，瓊脂糖凝膠電泳后回收，作標(biāo)記探針的模板用。探針標(biāo)記的操作如下在1.5mL離心管中加入5μL回收的uidA片段DNA作為模板(10ng～1μg)，隨機(jī)引物2μL(濃度為1nmol/μL)和9μL滅菌的雙蒸水，混勻，95℃變性3min，迅速置于冰上5min；依次加入10×Buffer，dNTPs(缺dATP)各2.5μL，[α-32P]dATP 3μL；加入1μL Exo-free K1enow酶，37℃反應(yīng)15～20min，65℃加熱5min使Klenow酶失活(或加Na2EDTA30mM)；95℃變性3min后迅速放到冰上。小心將探針反應(yīng)液加入經(jīng)過預(yù)雜交的雜交管中雜交過夜。
經(jīng)PCR檢測為陽性的植株進(jìn)一步作Southern印跡雜交檢測。設(shè)非轉(zhuǎn)化植株為陰性對照，用Hind III和BamH I酶切。利用毛細(xì)管法進(jìn)行DNA的轉(zhuǎn)移，具體操作參照Sambrook J.et al.(1989)的方法。
(3)轉(zhuǎn)基因不育植株花粉萌發(fā)試驗取經(jīng)分子檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株及其對照株的花粉進(jìn)行花粉萌發(fā)試驗，并統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。以萌發(fā)率作為衡量花粉生活力強(qiáng)弱的指標(biāo)?；ǚ鄣呐囵B(yǎng)采用液體培養(yǎng)基為15％蔗糖+0.01％硼酸+1mg/L GA3。采集花朵的時間均為上午900左右，每株采10朵花藥剛裂開的花朵，采后先將花粉抖落到硫酸紙上，充分混勻，將其點涂在載玻片上的培養(yǎng)基中，不加蓋玻片，將載玻片置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于黑暗、恒溫條件下培養(yǎng)，白菜花粉的培養(yǎng)溫度為20℃～25℃，培養(yǎng)4h后在倒置顯微鏡下觀察萌發(fā)率，以花粉管長度超過花粉粒直徑1/2為萌發(fā)花粉，每株制作2張玻片，每張玻片觀察15個不同的視野。
(4)轉(zhuǎn)基因不育植株的Northern雜交檢測取Southern印跡雜交檢測為陽性的不育植株，進(jìn)一步作Northern印跡雜交檢測。設(shè)非轉(zhuǎn)化植株為陰性對照。利用毛細(xì)管法進(jìn)行RNA的轉(zhuǎn)移，具體操作參照Sambrook J.等(1989)的方法。
探針制備的操作同(2)。其中，用育性相關(guān)基因的反義片段為模板進(jìn)行探針的標(biāo)記。
按照上述的操作步驟，即可以獲得‘上海青’普通白菜和‘油青’菜心的人工雄性不育系。SEQ ID No.1的信息(i)序列特征(A)長度1667bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.1(xii)ATGCCTTTAA CAGAGTGAAT TTATAATCAT CTTTCTCTCT TCGATCTATC TCTTGCGTTG TTAGGTCTGTTTGTTTTTTG TTGTTTGCGT GAGAAGTTAA CCAATAAGCA CGGGCCAATG CTGTGGCCAG TGTTCGGCATTACCCTAGAG TTTTTCATTC ATAAAAATGA TGTCTATGCA TGGGTCACAA AGTCTTTAAA AAAATCCCGAAACACGTTTC TTTACCGCGG GTTCTGGCTT GATGGATCTC ATGGAGCCGT GACTTGTTCT CCTGCCAATGTTGAGTACAT GCTCAAGACC AACTTCAAGA ACTTCCCCAA AGGTACCTTC TTCAAAGACC GGTTCAAAGATCTCCTCGAG GAGGGTATCT TTAACGCTGA TGATGAGTCC TGGAAAGAGC AACGACGGGT CATCATAACCAAATGCATTC GAACTCGGTT CATGGAGCAT TCCTTTCAAA CAACACAACG TTTAGTAAGG AAGAAGCTGTTGAAGGTTAT GGAGAGTTTC GCTAGGTCAC AAGAAGCTTT TGATCTCCAA GACGTGCTCT TGCGCTTGACGTTTGACATC ATATGCATCG CGGGTCTTGG AGATGACCCG GAGACTCCAG CTCAAGATCT TCCTCAAGTTCCATTTGCTA AAGCTTTTGA TGAAGCAACG GAGTCTACGT TGTTTAGGTT CATGATCCCT CCATTTATATGGAAACCAAT GAGGTTCTTA GACATAGGGT ATGAGAAAGG TCTAAGAAAA GCTATTGACG TCGTGCATGGATTCGTGAAT AGATGATTAT GGATCGTATC TGCATGGTCA ATGATGATGA GACGTTAGAT AATAGATCTGATCCTTACAA GAATTATTCA GATAGAGAGT CATAAAAAAG GTAACGAGAT TGGTCCTTCA ACCATTAGGTTTTTTAGACA GTTTTGCACA AGTTTCATCT TAGCGGGACG TGACACAAGT TCTGTTGCAA TTTCATGGTTCTTCTGGGTG ATACAAAGAC ACCCACAAGT TGAAAACAAA ATCATCCAGG AGATCAGAGA AATCTTGAAACAGAGAGGAG ATCCTTCAGA CAGTAGTCTC TTCACGGTCA GAGAACTAAA CAACATGGTG TATCTACAAGCAGCAATTTC AGAAACTCTA AGACTTTACC CACCAATCCC TATGGAGATG AAACAAGCCA TTGAAGATGATATGTTTCCA GATGGGACAT TTATAAAAAA GGGTTCAAGG GTTTACTTCT CTATCTATGC CATGGGAAGGATGGAATCAG TATGGGGTAA AGACTGTGAA GACTTCGGAC CAGAGAGATG GATCCATGCA GGGAAGTTTGTTAGTGGCGA CCAATCCAAA TATGTTGTGT TCAATGCTGG GCCTAGGCTG TGTCTAGGGA AAACATTTGCTTACTTACAA ATGAAGATGA TAGCTGCTTC AGTCTTGTTA GGTATTCAAT CAAGGTTGCT CAAGATCATGTGGTTGTCCC GAGAGTTACT ACTAACTTGT AACATGAAGT ACGGTCTCAA GGTGACCATC ACGCCAAGGTCGCTGGAAGA GAAGATACTA GAGTCATTCC ACATGTAGAA AGCATTTTAA TTAGAATACA ATACTTTCTAGAGTTACTTA GTTTTTATGA TTAATACTAA ACCCACAATT TAAGCAAAA AAAAAAAASEQ ID No.2的信息(i)序列特征(D)長度438bp(E)類型核酸(F)鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.2(xii)ACCATTAGGT TTTTTAGACA GTTTTGCACA AGTTTCATCT TAGCGGGACG TGACACAAGT TCTGTTGCAATTTCATGGTT CTTCTGGGTG ATACAAAGAC ACCCACAAGT TGAAAACAAA ATCATCCAGG AGATCAGAGAAATCTTGAAA CAGAGAGGAG ATCCTTCAGA CAGTAGTCTC TTCACGGTCA GAGAACTAAA CAACATGGTGTATCTACAAG CAGCAATTTC AGAAACTCTA AGACTTTACC CACCAATCCC TATGGAGATG AAACAAGCCATTGAAGATGA TATGTTTCCA GATGGGACAT TTATAAAAAA GGGTTCAAGG GTTTACTTCT CTATCTATGCCATGGGAAGG ATGGAATCAG TATGGGGTAA AGACTGTGAA GACTTCGGAC CAGAGAGATG GATCCATGCAGGGAAGTTTG TTAGTGGC
權(quán)利要求
1.一種白菜育性相關(guān)基因，其特征在于該基因具有SEQ ID No.1的序列。
2.用白菜育性相關(guān)基因構(gòu)建白菜類作物的人工雄性不育系的方法，包括以下步驟(1)根據(jù)育性相關(guān)基因的全長序列，在育性相關(guān)基因的內(nèi)部第901個堿基至第1338個堿基之間設(shè)計引物，擴(kuò)增438bp序列作為反義基因片段；(2)根據(jù)植物雙元載體pBI121的多克隆酶切位點，分別設(shè)計兩條含有BamHI和Xba I限制性內(nèi)切酶位點以及三個保護(hù)堿基的PCR擴(kuò)增引物，其序列為P15’-GCT GGA TCC ACC ATT AGG TTT TTT AGA CA-3’；P2 5’-GAT TCT AGA GCCACT AAC AAA CTT CCC TG-3’，回收PCR產(chǎn)物，并連接在T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽性克隆經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定后，提取質(zhì)粒備用；(3)將陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行BamH I和Xba I雙酶切，酶切片段電泳分離后回收，取該回收片段和經(jīng)BamH I和Xba I雙酶切的pBI121載體用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽性克隆經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，陽性克隆質(zhì)粒命名為pBI35S-AMF；(4)按常規(guī)方法進(jìn)行三親雜交，將步驟3)構(gòu)建的pBI35S-AMF質(zhì)粒引入含Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌中；(5)將上述三親雜交的克隆轉(zhuǎn)化白菜蔬菜作物的外植體，用組織培養(yǎng)的方法從轉(zhuǎn)化的外植體中再生出植株，并通過PCR和Southern雜交等分子檢測手段對育性相關(guān)基因反義片段是否整合在受體植物染色體中進(jìn)行驗證；(6)在轉(zhuǎn)基因植株中觀察其花粉的育性，并進(jìn)行花粉萌發(fā)試驗和剝蕾授粉試驗，即可獲得雄性不育植株。
3.按權(quán)利要求2所述的構(gòu)建白菜類蔬菜作物的人工雄性不育系的方法，其特征在于擴(kuò)增的438bp反義基因片段來自育性相關(guān)基因，該反義基因片段具有SEQ ID No.2的序列。
4.按權(quán)利要求2所述的構(gòu)建白菜類蔬菜作物的人工雄性不育系的方法，其特征在于所說的農(nóng)桿菌菌株為LBA4404或EHA105。
5.按權(quán)利要求2所述的構(gòu)建白菜類蔬菜作物的人工雄性不育系的方法，其特征在于所說的外植體為帶柄子葉。
6.按權(quán)利要求2所述的構(gòu)建白菜類蔬菜作物的人工雄性不育系的方法，其特征在于步驟5)所說的組織培養(yǎng)基中的基本培養(yǎng)基為1/2倍濃度NH4+的MS培養(yǎng)基的鹽類及維生素+2％蔗糖+0.8％瓊脂+60mL/L椰子汁+2mg/L BAP+0.45mg/L NAA+7.5mg/L AgNO3(pH值5.8)；
7.按權(quán)利要求2所述的構(gòu)建白菜類蔬菜作物的人工雄性不育系的方法，其特征在于步驟6)所說的花粉萌發(fā)試驗液體培養(yǎng)基為15％蔗糖+0.01％硼酸+1mg/L GA3。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白菜育性相關(guān)基因及用該基因構(gòu)建白菜類作物的人工雄性不育系的方法。本發(fā)明利用植物基因工程將育性相關(guān)基因的內(nèi)部第901個堿基至第1338個堿基之間設(shè)計引物，擴(kuò)增438bp序列作為反義基因片段同時引入植物染色體中，獲得再生植株，并獲得人工雄性不育的普通白菜和菜心。該方法適用于蕓薹屬植物，能快速構(gòu)建各種白菜類蔬菜作物的雄性不育系，克服了從自然界尋找不育源所受的限制，同時也為植物基因工程技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用開辟了一條新的途徑。
文檔編號C12N15/74GK1453359SQ03128960
公開日2003年11月5日 申請日期2003年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月27日
發(fā)明者曹家樹, 余小林, 葉紈芝 申請人:浙江大學(xué)