專利名稱：重組的sars病毒n蛋白羧基端肽段與gst的融合蛋白及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類醫(yī)學(xué)衛(wèi)生領(lǐng)域，尤其涉及一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白及方法。
背景技術(shù)：
2002年底在世界各地爆發(fā)了一種急性呼吸道傳染病，世界衛(wèi)生組織(WTO)稱其為重癥急性呼吸綜合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，中文俗稱“非典型性肺炎”，簡稱非典。該病起病急、傳播快，病死率高達(dá)5-10％。目前涉及到世界近30個國家和地區(qū)，全球患者已達(dá)8000多例，并造成多人死亡，發(fā)病人數(shù)仍有不斷增加的趨勢。
2003年4月16日，世界衛(wèi)生組織宣布，經(jīng)過全球10個國家和地區(qū)13個實(shí)驗(yàn)室的通力合作，確認(rèn)在全球多個國家快速傳染的非典型肺炎(英文名稱為SARS，下文簡稱“非典”)的病原體是一種冠狀病毒，以前從未在人體中發(fā)現(xiàn)過。非典型肺炎病原，即SARS病毒的分離和確證，對于該病的臨床診斷、治療及預(yù)防至關(guān)重要，這也是本發(fā)明所要解決的問題。
為篩選具有抗原性的冠狀病毒特異的蛋白或多肽片斷，我們用“非典”病人血清篩選了病毒蛋白的多肽庫，發(fā)現(xiàn)有些片段呈明顯的陽性反應(yīng)，其中冠狀病毒N蛋白(nucleocapsid protein)的羧基端，簡稱C末端，集中了二個陽性較強(qiáng)的肽段。為進(jìn)一步調(diào)查該片段的抗原性，我們克隆了覆蓋該片段的編碼序列，并用酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了體外表達(dá)，獲得了融合蛋白。用來自病人的血清作Western檢測，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白呈陽性反應(yīng)，進(jìn)一步用ELISA檢測，融合蛋白與正常人血清呈陰性反應(yīng)，而與“非典”病人血清呈陽性反應(yīng)。表明該蛋白可以作為檢測SARS病毒的抗原蛋白，用于SARS病人的檢測，也可以是作為抗SARS病毒的疫苗的候選蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白及方法。
重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白具有Seq.No.1的序列的多肽。
其方法具體步驟為
1)PCR擴(kuò)增獲得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆；2)轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞；3)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)；4)回收純化與GST融合的重組蛋白。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是通過基因重組的方法，利用酵母細(xì)胞表達(dá)了SARS病毒N蛋白C端的融合蛋白，該融合蛋白能與非典病人的血清呈陽性反應(yīng)，而與正常人血清呈陰性反應(yīng)。這表明該融合蛋白可作為SARS病毒檢測的抗原體，并能作為疫苗的候選蛋白，同時，我們還建立了表達(dá)純化該融合蛋白的實(shí)驗(yàn)體系。


圖1是PCR擴(kuò)增冠狀病毒N蛋白的C末端編碼區(qū)示意圖，圖中，箭頭所示為500bp大小的擴(kuò)增產(chǎn)物；圖2是用EcoRI酶切鑒別重組克隆示意圖，圖中，pEGH為沒有重組的質(zhì)粒，pEGH-NC為含有SARS病毒N蛋白C端的重組質(zhì)粒；圖3是用Anti-Histag抗體檢測重組蛋白的表達(dá)示意圖；圖4是用GST樹脂純化重組蛋白示意圖；圖5是用SARS病人血清檢測重組蛋白的抗原性示意圖，圖中，A，B分別為兩個病人的檢測結(jié)果，箭頭所示為重組的融合蛋白；圖6是用ELISA檢測不同的抗血清與重組蛋白的反應(yīng)示意圖，圖中，1、2、3、4位確診SARS病人的檢測結(jié)果，5、6、7、8位正常人對照。
具體實(shí)施例方式
一、PCR擴(kuò)增獲得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆提取病毒RNA，以此為模板反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA后，通過PCR擴(kuò)增獲得含N蛋白C端編碼區(qū)的產(chǎn)物，克隆到pGEM-T載體(Promega公司)中。以含該片段的質(zhì)粒DNA為模板，利用含酵母表達(dá)載體序列的一對引物將目標(biāo)片段再次用PCR擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物用1％的瓊脂糖電泳檢測，所獲得的片段符合預(yù)計(jì)的長度。A.擴(kuò)增N蛋白C末端所用的引物序列5’-AAAGGACAAAAAGAAAAAGACTG -3’5’- AATTTTACACATTAGGGCTCTTC-3’B.含酵母表達(dá)載體序列的引物5′-GGCAGATCGTCAGTCAGTCACGATGAAAATTTTACACATTAGGGCTCTTC-3′5′-GCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGTAAGGACAAAAAGAAAAAGACTG-3′C.擴(kuò)增的片段序列如發(fā)明內(nèi)容的Seq.No.1所述的多肽片斷。
二、轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞1.表達(dá)載體DNA的線性化本實(shí)驗(yàn)所用的酵母表達(dá)載體為pEGH(參見Zhu Heng等，Naturegenetics，2000)，將pEGH質(zhì)粒DNA用HindIII和XbaI酶切后備用。
2.轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞混合線性化的pEGH質(zhì)粒DNA和PCR產(chǎn)物，用PEG法轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂于SC-Ura-固體平板培養(yǎng)基，30度培養(yǎng)2天后，肉眼可見再生菌落。
酵母培養(yǎng)基SC-Ura-固體培養(yǎng)基、SC-Ura-/葡萄糖液體培養(yǎng)基、SC-Ura-/棉子糖液體培養(yǎng)基配制按《酵母遺傳實(shí)驗(yàn)方法》(清華大學(xué)出版社2002年第一版)3.重組菌落的鑒別用苯酚法提取酵母的質(zhì)粒DNA后，用電激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取再生菌落接種到LB液體培養(yǎng)基(含Ampicillin 60ug/ml)，37度培養(yǎng)過夜后，提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒別重組克隆，含有目標(biāo)片段的質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的一條片段大于對照質(zhì)粒DNA，見圖2。對目標(biāo)菌落測序，證明所獲得的重組克隆含有來源于SARS病毒的N蛋白C末端。
4.將目標(biāo)克隆轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞將測序確認(rèn)后的質(zhì)粒DNA用PEG法轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂于SC-Ura-固體平板培養(yǎng)基，30度培養(yǎng)2-3天后獲得再生菌落。
三、融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測接種再生菌落到5ml SC-Ura/葡萄糖液體培養(yǎng)基中，30度振蕩培養(yǎng)過夜，取0.2ml過夜菌接種到50ml SC-Ura-/棉子糖培養(yǎng)基中，至OD600＝0.6-0.8后加入D-半乳糖(終濃度為2％)繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4-5小時。離心收集培養(yǎng)物，無菌水洗2次。
四、回收純化與GST融合的重組蛋白用裂解液重新懸浮酵母細(xì)胞，加入酸洗過的玻璃珠(Sigma，G-8772)，劇烈振蕩3-5分鐘，離心后回收上清，再加入裂解液懸浮，振蕩，回收上清，合并兩次上清，高速離心去掉不溶物，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入GST樹脂(Glutathione-uniflow resin，購自Clontech公司)，旋轉(zhuǎn)混合1小時，離心回收GST樹脂，用裂解液洗3次，再加入還原型谷胱苷肽(20mM)，旋轉(zhuǎn)混合1小時，離心回收上清，即為純化的重組蛋白，將獲得的融合蛋白用SDS-PAGE分離后，考馬斯亮蘭染色，脫色后可見純化的蛋白條帶，考染的結(jié)果表明，獲得的蛋白純度較高，沒有可見的雜蛋白污染，見圖4。
五、Western檢測融合蛋白本實(shí)驗(yàn)所用的酵母表達(dá)載體產(chǎn)生的是“GST-His-目標(biāo)蛋白”的融合產(chǎn)物，為了檢測表達(dá)產(chǎn)物，將酵母的細(xì)胞裂解液加入點(diǎn)樣緩沖液，100度加熱5分鐘，用10％的SDS-PAGE分離，然后將蛋白樣品轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用脫脂牛奶封閉1小時，“一抗”用anti-His tag抗體保溫2小時，漂洗后加入“二抗”(anti-rabbitIgG，購自北京中山公司)，保溫1小時后，用一步法檢測試劑盒檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。表達(dá)目標(biāo)蛋白的泳道的條帶顯然大于對照泳道中表達(dá)GST的條帶，表明該系統(tǒng)產(chǎn)生了融合蛋白，從條帶的大小及測序結(jié)果可以認(rèn)定，該融合蛋白中含有SARS病毒N蛋白的C末端產(chǎn)物。
六、用Western鑒定融合蛋白的抗原性為了檢測該融合蛋白的抗原性，我們將純化后的融合蛋白經(jīng)SDS分離后，Western轉(zhuǎn)到PVDF膜上，分別用兩份“非典”病人的血清作為“一抗”進(jìn)行檢測，Western檢測試劑盒為Promega公司生產(chǎn)的NBT和BCIP。從圖5可見，兩份病人血清都可以檢測到融合蛋白，由此證明了我們體外表達(dá)的N蛋白C末端具有SARS病毒的抗原性。
七、用ELISA檢測融合蛋白的抗原性為進(jìn)一步確認(rèn)該融合蛋白的抗原性，并開發(fā)其實(shí)用價值，我們將融合蛋白包被在Elisa用的96孔板上，ELISA實(shí)驗(yàn)程序1、設(shè)空白對照、陽性對照1孔、陰性對照2孔。其余檢測孔加入樣品稀釋液，每孔100μl，再加入待測樣品10μl。充分混勻，貼上封口膠，置37□溫育30分鐘；2、將50倍濃縮洗板液用雙蒸水50倍稀釋后用于洗滌板孔。
3、棄去各孔中樣品，每孔加滿洗液，靜置數(shù)秒后棄去，重復(fù)5次，拍干；4、除空白孔外，每孔加入酶標(biāo)抗人IgG工作液100μl，貼上封口膠，置37□溫育20分鐘；5、棄去各孔中液體，用洗板液反復(fù)洗滌5次，拍干；6、每孔加入底物液A 50μl，再加入底物液B 50μl，輕拍混勻，置37□避光溫育10分鐘；7、顯色完畢后，每孔加入終止液50μl，輕拍混勻，以空白孔調(diào)零，置酶標(biāo)儀450nm波長下測定OD值(參考波長630nm)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6，表明，非典病人的血清呈陽性反應(yīng)，而正常血清呈陰性反應(yīng)。氨基酸序列表<110>杭州華大基因研發(fā)中心<120>用酵母表達(dá)SARS病毒N蛋白的C末端肽段<160>52<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>13<212>PRT<213>SARS-associated coronavirus(SARS-CoV)<400>1Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro Gln Arg1 5 10 15Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Met Asp20 25 30Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser Ala Asp35 40 45Ser Thr Gln Ala50
權(quán)利要求
1.一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端(C端)肽段與GST的融合蛋白，其特征在于具有Seq.No.1的序列的多肽。
2.一種SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白的重組方法，其步驟為1)PCR擴(kuò)增獲得SARS病毒N蛋白的C端片段克?。?)轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞；3)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)；4)回收純化與GST融合的重組蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白的方法，其特征在于所說的PCR擴(kuò)增獲得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆，其步驟為1)分離純化體外培養(yǎng)的病毒顆粒，提取病毒RNA，以此為模板反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA后，通過PCR擴(kuò)增獲得含N蛋白C端編碼區(qū)的產(chǎn)物。擴(kuò)增N蛋白C末端所用的引物序列5’-AAAGGACAAAAAGAAAAAGACTG-3’5’-AATTTTACACATTAGGGCTCTTC-3’2)PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。3)以含該片段的質(zhì)粒DNA為模板，利用含酵母表達(dá)載體序列的一對引物將目標(biāo)片段再次用PCR擴(kuò)增。含酵母表達(dá)載體序列的引物5’-GGCAGATCGTCAGTCAGTCACGATGAAAATTTTACACATTAGGGCTCTTC-3’5’-GCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGTAAGGACAAAAAGAAAAAGACTG-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白的方法，其特征在于所說的轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，其步驟為1)分離，純化酵母表達(dá)載體pEGH，用限制性核酸內(nèi)切酶HindIII和XbaI酶切后備用。2)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。混合pEGH質(zhì)粒DNA和PCR產(chǎn)物，用PEG法轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂于SC-Ura-固體平板培養(yǎng)基，30度培養(yǎng)2天后，肉眼可見再生菌落。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白的方法，其特征在于所說的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)是接種再生菌落到5ml SC-Ura/葡萄糖液體培養(yǎng)基中，30度振蕩培養(yǎng)過夜，取0.2ml過夜菌接種到50ml SC-Ura-/棉子糖培養(yǎng)基中，至OD600＝0.6-0.8后加入D-半乳糖(終濃度為2％)繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4-5小時。離心收集培養(yǎng)物，無菌水洗2次。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白的方法，其特征在于所說的回收純化與GST融合的重組蛋白是用裂解液重新懸浮酵母細(xì)胞，加入酸洗過的玻璃珠，劇烈振蕩3-5分鐘，離心后回收上清，再加入裂解液懸浮，振蕩，回收上清，合并兩次上清，高速離心去掉不溶物，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入GST樹脂，旋轉(zhuǎn)混合1小時，離心回收樹脂，用裂解液洗3次，再加入還原型谷胱苷肽(20mM)，旋轉(zhuǎn)混合1小時，離心回收上清，即為純化的重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白及方法。融合蛋白具有Seq.No.1的序列的多肽。其方法步驟為1)PCR擴(kuò)增獲得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆；2)轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞；3)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)；4)回收純化與GST融合的重組蛋白。該融合蛋白與非典病人的血清呈陽性反應(yīng)，而與正常人血清呈陰性反應(yīng)。
文檔編號C12N15/81GK1468865SQ0312915
公開日2004年1月21日 申請日期2003年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月4日
發(fā)明者劉國振, 胡少暉, 胡詠武, 陳鵬, 殷劍寧, 方健秋, 文潔, 朱衡, 劉斯奇, 于軍, 汪建, 楊煥明 申請人:杭州華大基因研發(fā)中心