專(zhuān)利名稱(chēng)：馬立克氏病毒疫苗毒cv1988株vp22基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中的基因工程生產(chǎn)藥物的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
過(guò)去無(wú)論是核酸疫苗還是蛋白質(zhì)免疫一個(gè)明顯的缺陷是不能像病毒性載體疫苗那樣在體內(nèi)擴(kuò)增和擴(kuò)散，人們很難將基因引入細(xì)胞，更難將它們定向地導(dǎo)入特定類(lèi)型的細(xì)胞。即便被導(dǎo)入，它們也很難長(zhǎng)久滯留和受控表達(dá)，且會(huì)產(chǎn)生毒副作用。Green M等(1988)和Frankel A等(1988)在分別研究人I型獲得性免疫缺陷癥(HIV-1)的TAT蛋白時(shí)，驚喜地發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入TAT以后，該蛋白可迅速進(jìn)入細(xì)胞，并定位于核內(nèi)，且無(wú)任何毒副作用。隨后，一些天然和人工合成的蛋白質(zhì)或多肽相繼被發(fā)現(xiàn)具有傳導(dǎo)作用，并迅速應(yīng)用于人類(lèi)疾病的基礎(chǔ)研究和治療領(lǐng)域，尤其在惡性腫瘤治療方面，大量抑癌蛋白已被成功傳導(dǎo)，在誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡中卓有成效。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)三種高效的PTDs，分別來(lái)自果蠅的同源異型轉(zhuǎn)錄因子Antp、單純皰疹病毒(HSV-1)的被膜蛋白VP22和HIV-1轉(zhuǎn)錄激活因子TAT。由于它們能夠引導(dǎo)其所承載的物質(zhì)通過(guò)漿膜，并在細(xì)胞內(nèi)積累，所以將它們統(tǒng)稱(chēng)為蛋白質(zhì)傳導(dǎo)域(PTDs)。
由于通過(guò)PTDs帶入細(xì)胞的分子基本上保留了它們各自原有的性質(zhì)，從而使PTDs的研究?jī)r(jià)值更為廣泛。如在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究和應(yīng)用中，通過(guò)將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子引入細(xì)胞，觀察它們對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)過(guò)程的作用，有助于了解信號(hào)傳遞的機(jī)制；而將癌基因抑制蛋白引入腫瘤細(xì)胞，能夠進(jìn)一步了解細(xì)胞癌變的分子機(jī)理，以找到在分子水平治療腫瘤的方法。同樣，將基因調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等引入細(xì)胞，可以更深入地揭示細(xì)胞分子機(jī)理。
馬立克氏病(Marek’s disease virus，MDV)是一種導(dǎo)致雞免疫抑制、神經(jīng)麻痹、T細(xì)胞腫瘤為特征的皰疹病毒，在基因組結(jié)構(gòu)、核酸序列的分類(lèi)上屬于α皰疹病毒。MDV的基因序列分析結(jié)果表明，MDV存在與組成α皰疹病毒代表株HSV-1被膜蛋白的主要基因UL46～UL49相應(yīng)的同源序列。MDV血清I型(MDV-1)GA病毒的UL49h基因編碼249個(gè)氨基酸殘基的病毒被膜蛋白(tegument viral protein 22，VP22)，分子量約27.6kD，為MDV-1增殖所必需。最早由Yanagida N等(1993)從MDV-1GA株的一段長(zhǎng)為8.4kb的BamHI-EcoRI片段DNA中得到。Fabien D等(2000)指出，MDV-1 VP22存在PTD，大致范圍在N’端38-188aa處。VP22介導(dǎo)的傳導(dǎo)過(guò)程不會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗鼈冊(cè)谧屓诤系鞍状┰降耐瑫r(shí)并沒(méi)有促進(jìn)同時(shí)存在于培養(yǎng)液中的其他非VP22融合分子穿越。且在VP22介導(dǎo)治療性分子穿越細(xì)胞膜時(shí)，也避免不讓其他無(wú)關(guān)分子進(jìn)入或離開(kāi)細(xì)胞。目前，利用VP22傳導(dǎo)的蛋白有p53、p27、GFP、YFP、EGFP、流感病毒的NA、BH3、EBV的EBNV-1和胸苷激酶(Tk)、胞嘧啶脫氨基酶(CD)等?，F(xiàn)已有利用MDV-1的VP22來(lái)傳導(dǎo)目的分子的報(bào)道，且被證實(shí)可增強(qiáng)DNA疫苗的細(xì)胞免疫反應(yīng)。如Hung CF等(2002)發(fā)現(xiàn)將人16型乳頭瘤病毒E7抗原與VP22融合表達(dá)的DNA疫苗免疫，可增強(qiáng)E7特異性的CD8+T細(xì)胞活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于研究獲得一種能在人或動(dòng)物體內(nèi)擴(kuò)增、擴(kuò)散，并令其定向地導(dǎo)入特定類(lèi)型細(xì)胞的蛋白質(zhì)傳導(dǎo)域基因，以及與目的基因融合表達(dá)。
本發(fā)明用PCR法從CVI988/Rispens弱毒疫苗株感染的鴨胚或雞胚成纖維細(xì)胞(DEF)基因組DNA擴(kuò)增UL49h基因片段，獲得VP22基因，大小為732bp。
馬立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因的核苷酸序列是ATGGGGGATTCTGAAAGGCGGAAATCGGAACGGCGTCGTTCCCTTGGATATCCCTCTGCATATGATGACGTCTCGATTCCTGCTCGCAGACCATCAACACGTACTCAGCGAAATTTAAACCAGGATGATTTGTCAAAACATGGACCATTTACCGACCATCCAACACAAAAATACAAATCGGCGAAAGCCGTATCGGAAGACGTTTCGTCTACCACCCGGGGTGGCTTTACAAACAAACCCCGTGCCAAGCCCGGGGTCAGAGCTGTACAAAGTAATAAATTCGCTTTCAGTACGGCTCCTTCATCAGCATCTAGCACTTGGAGATCAAATACAGTGGCATTTAATCAGCGTATGTTTTGCGGAGCGGTTGCAACTGTGGCTCAATATCACGCATACCAAGGCGCGCTCGCCCTTTGGCGTCAAGATCCTCCGCGAACAAATGAAGAATTAGATGCATTTCTTTCCAGAGCTGTCATTAAAATTACCATTCAAGAGGGTCCAAATTTGATGGGGGAAGCCGAAACCTGTGCCCGCAAACTATTGGAAGAGTCTGGATTAT
CCCAGGGGAACGAGAACGTAAAGTCCAAATCTGAACGTACAAGACGCGGCGGTGAAATTGAAATCAAATCGCCAGATCCGGGATCTCATCGTACACATAACCCTCGCACTCCCGCAACTTCGCGTCGCCATCATTCATCCGCCCGCGGATATCGTGGCAGTGATAGCGAATAA將上述VP22基因測(cè)序分析，與經(jīng)典MDV強(qiáng)毒GA株比較，確定弱毒株CVI988的UL49h存在3個(gè)定點(diǎn)突變(第172、244和733位bp)和一個(gè)缺失性突變，缺失的氨基酸為200TTKSER205，該位點(diǎn)親水性強(qiáng)，用Jarmeson-Wolf法分析，該位點(diǎn)位于VP22主要的抗原決定簇區(qū)，有利于CVI988 VP22基因的開(kāi)發(fā)與利用。利用CVI988 VP22基因或部分基因序列開(kāi)發(fā)傳導(dǎo)人或動(dòng)物病原體主要保護(hù)性抗原、傳導(dǎo)人或動(dòng)物治療性藥物、提高目的蛋白的免疫保護(hù)效果或增強(qiáng)藥物的療效。
本發(fā)明還在于所述核苷酸序列的馬立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因與目的基因融合表達(dá)、基因的蛋白傳導(dǎo)域傳導(dǎo)人或動(dòng)物病原體主要保護(hù)性抗原的應(yīng)用、基因的蛋白傳導(dǎo)域傳導(dǎo)人或動(dòng)物治療性藥物的應(yīng)用、基因提高目的蛋白的免疫保護(hù)效果的應(yīng)用以及基因增強(qiáng)藥物的療效的應(yīng)用。
發(fā)明實(shí)施例1.MDV VP22基因的克隆1.1提取基因組DNA用潔凈鴨胚制備的DEF擴(kuò)增MDV GA株、Md5、Md11、RB1B、CVI988、FC126、Z4、648A，待細(xì)胞90％以上皆出現(xiàn)CPE時(shí)，0.25％胰酶消化，0.01MPBS(pH7.2)洗滌一次，將其懸浮于500μl消化液(100mM NaCl，25mM EDTA，10mM Tris～Cl pH8.0，0.5％SDS，0.1mg/ml proteinase K)中，37℃消化4hr或過(guò)夜。消化結(jié)束后，用等量的TE飽和苯酚/氯仿-異戊醇混勻，充分振蕩，離心抽提2次，并再次經(jīng)氯仿抽提1次。抽提完后，用2倍體積的無(wú)水乙醇-20℃沉淀30min或過(guò)夜，以12000rpm離心20min，將沉淀以70％乙醇洗滌，空氣中自然干燥后，懸浮于50μl雙蒸H2O中，-20℃凍存。
1.2 VP22(ULA9基因的擴(kuò)增)針對(duì)MDV homologue of UL49 of HSV-1(VP22)的基因序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)上游和下游引物上游引物VP22F(P1)5’-GCC GGA TCC ATG GGG GAT TCT G-3’；下游引物VP22RI(P2)5’-GCC GAA TTC GCT ATC ACT GCT A-3’。
常規(guī)PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)組成5μl 10 PCR buffer，25mM dNTP 1μl，25mM MgCl210μl，Taq DNA聚合酶(4U)1μl，50pM primers 1μl 2，模板DNA(0.1ng)1μl，加水至50μl，滴加一滴礦物油(液體石蠟)防蒸發(fā)。
反應(yīng)條件95℃變性5min，以下步驟30個(gè)循環(huán)(94℃變性1min，55℃退火2min，72℃延伸3min)，隨后經(jīng)72℃延長(zhǎng)10min，產(chǎn)物置4℃或-20℃。取5μl PCR產(chǎn)物，1.0％瓊脂糖凝膠電泳(55V，1.5hr)，Marker是1kbλDNA Ladder。
權(quán)利要求
1.馬立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因，其特征在于核苷酸序列為ATGGGGGATTCTGAAAGGCGGAAATCGGAACGGCGTCGTTCCCTTGGATATCCCTCTGCATATGATGACGTCTCGATTCCTGCTCGCAGACCATCAACACGTACTCAGCGAAATTTAAACCAGGATGATTTGTCAAAACATGGACCATTTACCGACCATCCAACACAAAAATACAAATCGGCGAAAGCCGTATCGGAAGACGTTTCGTCTACCACCCGGGGTGGCTTTACAAACAAACCCCGTGCCAAGCCCGGGGTCAGAGCTGTACAAAGTAATAAATTCGCTTTCAGTACGGCTCCTTCATCAGCATCTAGCACTTGGAGATCAAATACAGTGGCATTTAATCAGCGTATGTTTTGCGGAGCGGTTGCAACTGTGGCTCAATATCACGCATACCAAGGCGCGCTCGCCCTTTGGCGTCAAGATCCTCCGCGAACAAATGAAGAATTAGATGCATTTCTTTCCAGAGCTGTCATTAAAATTACCATTCAAGAGGGTCCAAATTTGATGGGGGAAGCCGAAACCTGTGCCCGCAAACTATTGGAAGAGTCTGGATTATCCCAGGGGAACGAGAACGTAAAGTCCAAATCTGAACGTACAAGACGCGGCGGTGAAATTGAAATCAAATCGCCAGATCCGGGATCTCATCGTACACATAACCCTCGCACTCCCGCAACTTCGCGTCGCCATCATTCATCCGCCCGCGGATATCGTGGCAGTGATAGCGAATAA
2.如權(quán)利要求1所述核苷酸序列的馬立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因的制取方法，其特征在于包括以下步驟1)用PCR法從CVI988/Rispens弱毒疫苗株感染的鴨胚或雞胚成纖維細(xì)胞(DEF或CEF)中提取基因組DNA；2)將提取的基因組DNA擴(kuò)增UL49h基因片段。
3.如權(quán)利要求1所述核苷酸序列的馬立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因與目的基因融合表達(dá)。
4.如權(quán)利要求1所述核苷酸序列的馬立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因的蛋自傳導(dǎo)域傳導(dǎo)人或動(dòng)物病原體主要保護(hù)性抗原的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求1所述核苷酸序列的馬立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因的蛋白傳導(dǎo)域傳導(dǎo)人或動(dòng)物治療性藥物的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求1所述核苷酸序列的馬立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因提高目的蛋白的免疫保護(hù)效果的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求1所述核苷酸序列的馬立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因增強(qiáng)藥物的療效的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中的基因工程生產(chǎn)藥物的技術(shù)領(lǐng)域，用PCR法從CVI988/Rispens弱毒疫苗株感染的鴨胚或雞胚成纖維細(xì)胞(DEF)基因組DNA擴(kuò)增UL49h基因片段，獲得大小為732bp的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物克隆并測(cè)序分析，與經(jīng)典MDV強(qiáng)毒GA株比較，確定弱毒株CVI988的UL49h存在3個(gè)定點(diǎn)突變(第172、244和733位bp)和一個(gè)缺失性突變，缺失的氨基酸為
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1513996SQ0313192
公開(kāi)日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2003年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月16日
發(fā)明者秦愛(ài)建, 陳鴻軍, 金文杰, 劉岳龍 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)