專利名稱：小麥南大2419抗赤霉病侵染主效基因位點(diǎn)及其分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了小麥南大2419抗赤霉病侵染主效基因位點(diǎn)及其分子標(biāo)記，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，專用于小麥赤霉病抗病品種的選育與種質(zhì)資源的利用。
二、技術(shù)背景小麥?zhǔn)俏覈闹匾Z食作物。由赤霉菌引起的小麥赤霉病，不僅造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)，降低籽粒品質(zhì)，而且該病菌產(chǎn)生的毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇還影響人、畜健康，給小麥生產(chǎn)造成了極大損失。在我國，有超過四分之一的小麥產(chǎn)區(qū)遭受赤霉病的危害，且每隔3~5年就有一次大流行，僅2002年赤霉病發(fā)生面積即達(dá)3000萬畝次。因此，研究防治小麥赤霉病也就成了當(dāng)前小麥生產(chǎn)上的一個(gè)迫切任務(wù)。培育抗病品種是防治小麥赤霉病危害的最安全、有效而且節(jié)約成本的措施之一。但傳統(tǒng)育種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且由于赤霉病表型鑒定非常困難，使小麥抗赤霉病育種進(jìn)程異常緩慢。通過定位鑒定抗病主效基因位點(diǎn)來輔助育種可以有效解決這一問題。
遺傳研究表明，小麥赤霉病主要受少數(shù)幾個(gè)主效基因位點(diǎn)控制，不同的抗性材料其抗病主效基因位點(diǎn)在染色體上的位置不一致，而且分為抗侵染和抗擴(kuò)展兩種類型。但通過不同抗病主效基因位點(diǎn)的聚合或者引入新的抗源可以選育出抗性很好的品種。
目前在赤霉病抗性遺傳基礎(chǔ)的研究及抗病育種的利用上多集中在蘇麥3號(hào)及其衍生系。南大2419是意大利小麥品種Mentana的選系，具有較好的豐產(chǎn)性，農(nóng)藝性狀優(yōu)良，是我國小麥育種的骨干親本之一。而且Mentana與蘇三的親本“Funo”有著共同的祖先，所以南大2419中可能存在與蘇三相似的赤霉病抗性機(jī)制。
上述小麥南大2419抗赤霉病侵染主效基因位點(diǎn)，是通過以下方法獲得標(biāo)記定位的(1)小麥品種望水白(♀)與南大2419(♂)進(jìn)行雜交得到雜種F1，F(xiàn)1自交產(chǎn)生F2，然后采用單粒傳方法(SSD)獲得F6代的重組自交系；(2)用SDS法提取重組自交系群體各株系的DNA，采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記SSR對(duì)兩親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，PCR在PE9600擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物在8％(g/ml)聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離分析，根據(jù)分子標(biāo)記篩選結(jié)果，篩選出親本間有多態(tài)的引物，親本間有多態(tài)的引物在重組自交系群體中進(jìn)行分析，PCR擴(kuò)增程序同上，獲取群體基因型資料；(3)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構(gòu)建小麥的遺傳圖譜，所用軟件為Mapmaker 2.0，最小LOD值設(shè)為3，獲得連鎖圖譜；(4)揚(yáng)花期接種赤霉病病原菌，對(duì)重組自交系每個(gè)家系進(jìn)行赤霉病抗性鑒定，獲得重組自交系每個(gè)家系的病穗率；(5)利用Data desk v.5.0軟件對(duì)各個(gè)分子標(biāo)記的群體基因型資料與其對(duì)應(yīng)每個(gè)家系的赤霉病抗性鑒定的病穗率進(jìn)行連鎖分析，單向方差分析測(cè)得與赤霉病抗性不相關(guān)的概率P值，P＜0.05的分子標(biāo)記即表明與一個(gè)主效基因位點(diǎn)連鎖在南大2419中發(fā)現(xiàn)P＝0.0064的標(biāo)記Xgwm2和P＝0.0249的標(biāo)記Xgwm107與抗侵染主效基因位點(diǎn)緊密連鎖，即獲得南大2419抗侵染主效基因位點(diǎn)QFhs.nau-3a和QFhs.nau-4b的標(biāo)記定位。有益效果 本發(fā)明所提供的小麥南大2419抗赤霉病侵染主效基因位點(diǎn)及其分子標(biāo)記，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明在國際上首次獲得定位了小麥品種南大2419中的2個(gè)抗赤霉病侵染的主效基因位點(diǎn)，它們共同可解釋15.8％的赤霉病抗性。小麥基因組巨大，是水稻基因組大小的40倍，對(duì)小麥抗赤霉病主效基因位點(diǎn)的精確定位工作居于同領(lǐng)域前列；(2)主效基因位點(diǎn)位置明確，鑒定方便。通過檢測(cè)與這些抗侵染主效基因位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記，即可以預(yù)測(cè)小麥植株的赤霉病抗性，用于小麥品種或品系的基因型檢測(cè)，以判斷該品種或品系是否具有赤霉病抗性，進(jìn)而快速篩選抗病品種或品系用于小麥育種。主效基因位點(diǎn)的檢測(cè)方便快速，不受環(huán)境影響；(3)輔助育種選擇目標(biāo)明確，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)育種方法中，首先要收集具有抗病基因的親本與栽培品種進(jìn)行一系列雜交，而且要對(duì)赤霉病抗性進(jìn)行單株選擇。對(duì)小麥赤霉病進(jìn)行表型鑒定要等到揚(yáng)花期，受到較大的環(huán)境影響，表型鑒定的結(jié)果可靠性低。因此抗病育種不僅費(fèi)時(shí)，而且難度大，成本高。通過檢測(cè)抗赤霉病主效基因位點(diǎn)，可以在苗期就鑒定出高抗赤霉病的單株，淘汰其它植株，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高抗赤霉病小麥的選擇效率。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的詳細(xì)說明如下研究表明，小麥赤霉病抗性主要受少數(shù)主效基因位點(diǎn)控制。美國Anderson實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)四個(gè)主效基因位點(diǎn)與蘇麥3號(hào)/Stoa群體的赤霉病抗性呈顯著相關(guān)，分別位于2Al、3BS、4BS和6BS上(Anderson，1998；Waldron，1999；Anderson，2000，2001)。美國Bai等人獲得與RAPD標(biāo)記相關(guān)的兩個(gè)赤霉病抗性位點(diǎn)，2002年Zhou綜合運(yùn)用SSR、AFLP和非整倍體技術(shù)將該主效基因位點(diǎn)定位在缺失系3BS-8未端上一個(gè)長(zhǎng)度約為8cM的染色體區(qū)域。日本Ban推測(cè)蘇麥3的抗性主效基因位點(diǎn)可能位于5AL上。奧地利的Buerstmayr(2000，2001)發(fā)現(xiàn)有三個(gè)基因組區(qū)域與赤霉病抗擴(kuò)展性顯著相關(guān)，并定位于3BS、5A、1B上。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，小麥品種南大2419的3A和4B染色體中存在2個(gè)抗侵染主效基因位點(diǎn)，這些主效基因位點(diǎn)可用來指導(dǎo)抗赤霉病品種的選育工作，用與之連鎖的分子標(biāo)記對(duì)抗病品種進(jìn)行篩選，使不同抗病主效基因位點(diǎn)快速聚合在同一個(gè)植株中，從而大大提高育種效率。材料與方法(一)南大2419重組自交系的構(gòu)建與表型鑒定(1)對(duì)我國江蘇地方品種望水白(♀)與意大利小麥品種Mentana的選系南大2419(♂)進(jìn)行雜交獲得F1，F(xiàn)1自交產(chǎn)生F2，136個(gè)F2單株任選一粒種植，采用單粒傳的方法繁殖到F6代，獲得重組自交系，包括136個(gè)家系；(2)重組自交系種植在江蘇省農(nóng)科院，讓其自然發(fā)病。在開花后20天，測(cè)量病穗率等病情指標(biāo)。病穗率＝病穗數(shù)/總穗數(shù)×100％(二)重組自交系群體的分子標(biāo)記分析(1)用SDS法提取重組自交系群體各株系DNA；(2)首先用976對(duì)SSR引物對(duì)望水白和南大2419親本的DNA多態(tài)性進(jìn)行初步分析。PCR反應(yīng)體積為25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl21.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，Taq酶(5單位/微升)0.2微升，模板DNA 20納克，加水至25微升。SSR反應(yīng)體系為DNA 94℃預(yù)變性3min后，94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸展2min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。在PE 9600擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在8％非變性聚丙烯酰胺凝膠(100ml聚丙烯酰胺溶液中含7.6克丙烯酰胺和0.4克甲叉雙丙烯酰胺)上進(jìn)行電泳分離，然后在紫外透射儀上照相，記錄結(jié)果，親本間有多態(tài)的引物在重組自交系群體中進(jìn)行分析，PCR擴(kuò)增程序同上，獲取群體基因型資料；(3)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構(gòu)建小麥的遺傳圖譜，所用軟件為Mapmaker 2.0，最小LOD值設(shè)為3，獲得連鎖圖譜；(4)利用Data desk v.5.0軟件對(duì)各個(gè)分子標(biāo)記的群體基因型資料與其對(duì)應(yīng)每個(gè)家系的赤霉病抗性鑒定的病穗率進(jìn)行連鎖分析，定位主效基因位點(diǎn)。(三)結(jié)果與分析分子標(biāo)記篩選結(jié)果表明，有383對(duì)SSR引物在雙親間有差異。利用Datadesk v.5.0軟件對(duì)各個(gè)分子標(biāo)記的群體基因型資料與其對(duì)應(yīng)每個(gè)家系的赤霉病抗性鑒定的病穗率進(jìn)行連鎖分析，單向方差分析測(cè)得與赤霉病抗性不相關(guān)的概率P值和位點(diǎn)對(duì)赤霉病抗性的貢獻(xiàn)率R2(表2)，P＜0.05的分子標(biāo)記即與一個(gè)主效基因位點(diǎn)連鎖。所得分子標(biāo)記在群體中的基因型按親本望水白和南大2419的基因型分類，如果基因型與南大2419相同的株系表型為抗，則該標(biāo)記定位的抗病主效基因位點(diǎn)來自南大2419在南大2419中發(fā)現(xiàn)P＝0.0064的標(biāo)記Xgwm2和P＝0.0249的標(biāo)記Xgwm107與抗侵染主效基因位點(diǎn)緊密連鎖，即獲得南大2419抗侵染主效基因位點(diǎn)QFhs.nau-3a和QFhs.nau-4b的標(biāo)記定位。
通過鑒定上述主效基因位點(diǎn)來預(yù)測(cè)小麥植株抗性，預(yù)計(jì)可迅速提高我國小麥抗病品種的育種進(jìn)程。
表1.標(biāo)記引物的序列及擴(kuò)增片段大小片段大小標(biāo)記左端引物序列 右端引物序列(bp)Xgwm2 CTGCAAGCCTGTGATCAACT CATTCTCAAATGATCGAACA100Xgwm107 ATTAATACCTGAGGGAGGTGCGGTCTCAGGAGCAAGAACAC188表2.南大2419抗侵染主效基因位點(diǎn)的單向方差分析病穗率主效基因位點(diǎn) 標(biāo)記P R2(％)QFhs.nau-3aXgwm2 0.0064 9.9QFhs.nau-4bXgwm107 0.0249 7.9P表示與赤霉病抗性不相關(guān)的概率，P＜0.05表明該標(biāo)記與赤霉病抗性緊密連鎖R2位點(diǎn)對(duì)赤霉病抗性的貢獻(xiàn)率，值越大表明與赤霉病抗性越相關(guān)
權(quán)利要求
1.小麥南大2419抗赤霉病侵染主效基因位點(diǎn)，其特征在于主效基因位點(diǎn)QFhs.nau-3a，由標(biāo)記Xgwm2定位，左端引物序列 CTGCAAGCCTGTGATCAACT右端引物序列 CATTCTCAAATGATCGAACA擴(kuò)增片段100bp，該主效基因位點(diǎn)位于小麥南大2419的3A染色體，利用Data desk v.5.0軟件測(cè)得與赤霉病抗性不相關(guān)的概率P值為0.0064，對(duì)赤霉病抗性的貢獻(xiàn)率9.9％；主效基因位點(diǎn)QFhs.nau-4b，由標(biāo)記Xgwm107定位，左端引物序列 ATTAATACCTGAGGGAGGTGC右端引物序列 GGTCTCAGGAGCAAGAACAC擴(kuò)增片段188bp，該主效基因位點(diǎn)位于小麥南大2419的4B染色體，利用Data desk v.5.0軟件測(cè)得與赤霉病抗性不相關(guān)的概率P值為0.0249，對(duì)赤霉病抗性的貢獻(xiàn)率7.9％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥南大2419抗赤霉病侵染主效基因位點(diǎn)，其特征在于，這些主效基因位點(diǎn)是通過以下方法獲得標(biāo)記定位的(1)小麥品種望水自(♀)與南大2419(♂)進(jìn)行雜交得到雜種F1，F(xiàn)1自交產(chǎn)生F2，然后采用單粒傳方法(SSD)獲得F6代的重組自交系；(2)用SDS法提取重組自交系群體各株系的DNA，采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記SSR對(duì)兩親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，PCR在PE9600擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物在8％(g/ml)聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離分析，根據(jù)分子標(biāo)記篩選結(jié)果，篩選出親本間有多態(tài)的引物，親本間有多態(tài)的引物在重組自交系群體中進(jìn)行分析，PCR擴(kuò)增程序同上，獲取群體基因型資料；(3)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構(gòu)建小麥的遺傳圖譜，所用軟件為Mapmaker 2.0，最小LOD值設(shè)為3，獲得連鎖圖譜；(4)揚(yáng)花期接種赤霉病病原菌，對(duì)重組自交系每個(gè)家系進(jìn)行赤霉病抗性鑒定，獲得重組自交系每個(gè)家系的病穗率；(5)利用Data desk v.5.0軟件對(duì)各個(gè)分子標(biāo)記的群體基因型資料與其對(duì)應(yīng)每個(gè)家系的赤霉病抗性鑒定的病穗率進(jìn)行連鎖分析，單向方差分析測(cè)得與赤霉病抗性不相關(guān)的概率P值，P＜0.05的分子標(biāo)記即與一個(gè)主效基因位點(diǎn)連鎖，抗赤霉病侵染主效基因位點(diǎn)的位置由分子標(biāo)記的染色體位置確定在南大2419中發(fā)現(xiàn)P＝0.0064的標(biāo)記Xgwm2和P＝0.0249的標(biāo)記Xgwm107與抗侵染主效基因位點(diǎn)緊密連鎖，即獲得南大2419抗侵染主效基因位點(diǎn)QFhs.nau-3a和QFhs.nau-4b的標(biāo)記定位。
3.權(quán)利要求1或2所述小麥南大2419抗赤霉病侵染主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記，其特征在于南大2419中位于3A和4B上的抗赤霉病侵染主效基因位點(diǎn)QFhs.nau-3a、QFhs.nau-4b的分子標(biāo)記分別為Xgwm2和Xgwm107。
全文摘要
本發(fā)明提供了小麥南大2419抗赤霉病侵染主效基因位點(diǎn)及其分子標(biāo)記，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。對(duì)小麥品種望水白(♀)與南大2419(♂)雜交獲得的重組自交系的各家系的基因型和各家系的病穗率進(jìn)行遺傳連鎖分析，獲得南大2419抗赤霉病侵染主效基因位點(diǎn)QFhs.nau－3a和QFhs.nau－4b。通過檢測(cè)南大2419及其衍生品種(系)中是否含有該主效基因位點(diǎn)，可預(yù)測(cè)其赤霉病抗性水平，大大提高抗赤霉病小麥的選擇效率。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1462806SQ03131960
公開日2003年12月24日 申請(qǐng)日期2003年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月23日
發(fā)明者馬正強(qiáng), 孔忠新, 林峰 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)