專利名稱：水稻稻米糊化溫度主效控制基因alk及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種控制水稻稻米糊化溫度的主效基因，以及該基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及一種含有本發(fā)明的控制水稻稻米糊化溫度的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)載體和利用該表達(dá)載體培育植物的方法，該方法可使植物淀粉的主要儲藏器官的糊化溫度發(fā)生變化。
背景技術(shù)：
糊化溫度是農(nóng)作物，尤其是水稻稻米的重要蒸煮品質(zhì)。而糊化溫度又與淀粉粒中支鏈淀粉結(jié)構(gòu)直接有關(guān)。支鏈淀粉支鏈的非還原端指向顆粒表面呈放射狀排列，形成晶體層和無定形層交替排列的9nm的周期性半晶體結(jié)構(gòu)[1]。晶體層由同一分支簇內(nèi)相鄰的A鏈或B鏈間形成雙螺旋結(jié)構(gòu)緊密排列而成；無定形層主要包括松散分支點(diǎn)[2]。分支簇內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化會導(dǎo)致物種間、品種間和組織間淀粉理化特性的變化。而植物支鏈淀粉的生物合成是一個(gè)非常復(fù)雜的代謝過程，涉及到可溶性淀粉合酶、淀粉分支酶和淀粉脫支酶等。因此，糊化溫度可能與淀粉代謝途徑中的某些關(guān)鍵酶相關(guān)。對水稻不同糊化溫度品種(包括突變體)的研究便是揭示與該性狀相關(guān)的支鏈淀粉生物合成機(jī)理和相關(guān)基因的有效途徑。
首先，從表型上描述水稻稻米糊化溫度，早在20世紀(jì)60年代就用堿解反應(yīng)來間接測定。生物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)糊化特性與淀粉粒相對結(jié)晶度有關(guān)(γ＝+0.73)[3]，而淀粉粒結(jié)晶度又與支鏈淀粉結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，因此該性狀與支鏈淀粉的合成有關(guān)。分子標(biāo)記遺傳定位研究表明控制糊化溫度至少有三個(gè)等位基因，其中2號染色體1個(gè)，6號染色體2個(gè)[4，5]。日本科學(xué)家最近發(fā)現(xiàn)支鏈淀粉鏈長性狀的遺傳分離模式與淀粉粒的理化特性完全一致，控制該性狀的基因命名為ACL，而ALK和ACL二基因定位在染色體同一位點(diǎn)[6]。但至今未見克隆相關(guān)基因的報(bào)道。
由于糊化溫度是支鏈淀粉結(jié)構(gòu)特性的反映，因此參與支鏈淀粉生物合成的酶，如可溶性淀粉合酶、淀粉分支酶[7]和淀粉脫支酶[8]的表達(dá)或活性的改變都將引起糊化溫度不同程度的變化。
近年來對豌豆和衣藻突變體[9，10]的研究發(fā)現(xiàn)支鏈淀粉晶體構(gòu)建中SSSII是必需的。它負(fù)責(zé)合成支鏈淀粉分支簇的主要成分——中等長度的葡聚糖，在支鏈淀粉分支簇內(nèi)短鏈(A+B1鏈)延伸、B2和B3鏈合成中起明顯作用，從而影響淀粉粒的形態(tài)和淀粉的晶體模式。
水稻的糊化溫度作為評價(jià)和改善蒸煮和食味品質(zhì)的重要指標(biāo)，近年來多有報(bào)道，但僅限于表型、生化及遺傳定位等方面。本發(fā)明便是利用糊化溫度差異大的品種配制的群體和圖位克隆技術(shù)首先克隆了ALK基因，該基因編碼一種可溶性淀粉合酶SSSII，分子生物學(xué)和生物化學(xué)研究表明該基因控制水稻胚乳支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)。同時(shí)我們已通過基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)鑒定了該基因的功能。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述研究背景，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種控制水稻糊化溫度的主效基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種由本發(fā)明的控制水稻稻米糊化溫度的基因所編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種含有本發(fā)明的控制水稻稻米糊化溫度的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)載體。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種培育植物的方法，該方法可使植物淀粉的主要儲藏器官的糊化溫度發(fā)生變化。
本發(fā)明提供了一種控制水稻稻米糊化溫度的主效基因，該基因的核苷酸序列選自(1)編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)與(1)中的核苷酸序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并同時(shí)編碼具有控制水稻稻米糊化溫度的功能的核苷酸序列。
嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，7％SDS)中，65℃預(yù)雜交30min；棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，7％SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，65℃雜交12hr；棄雜交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。
本發(fā)明的控制水稻稻米糊化溫度的主效基因優(yōu)選具有如圖6和SEQ IDNO1所示的DNA序列。
本發(fā)明還提供了一種由上述核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)優(yōu)選具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明中的SEQ ID NO2和圖7所示的蛋白質(zhì)屬于可溶性淀粉合酶II家族。ALK與玉米SSIIa同源性為69.8％，該酶可能編碼一種可溶性淀粉合酶，直接參與支鏈淀粉生物合成。
1、本發(fā)明還提供了一種含有本發(fā)明的控制水稻稻米糊化溫度的主效基因的植物表達(dá)載體。這種表達(dá)載體可以是如圖4所示的(pCAMBIA1300-ALK和pCAMBIA-Ubi’Anti-Alk)，該載體可以表達(dá)由上述核酸序列編碼的多肽。
2、本發(fā)明還提供了一種培育植物的方法，該方法可使植物淀粉的主要儲藏器官的糊化溫度發(fā)生變化，包括用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株的步驟。


下面結(jié)合附圖對理解本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并非對本發(fā)明作限定。
圖1表示圖位克隆所用親本和F2群體中糊化溫度的表型鑒定。兩親本雙科早和C堡及F2代植株所結(jié)種子的堿消試驗(yàn)。隨機(jī)取20粒成熟種子去殼后置于6cm培養(yǎng)皿(20粒/皿)，加入2％(W/V)KOH(5ml/皿)，加蓋置于30℃恒溫培養(yǎng)36小時(shí)。雙科早和C堡分別作為正、負(fù)對照。
圖2示ALK在水稻第6染色體上的初步定位圖。
圖3表示ALK基因的精細(xì)定位及物理定位。
圖4示轉(zhuǎn)化所用載體圖譜。
圖5表示功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)T0代轉(zhuǎn)基因水稻所結(jié)種子的表型。T0-3，T0-5為轉(zhuǎn)正義ALK基因T0代植株所結(jié)種子；Anti-T0-1，Anti-T0-3為轉(zhuǎn)反義ALK基因T0代植株所結(jié)種子。
圖6示ALK基因的DNA序列(秈稻雙科早)。
圖7示ALK基因編碼的氨基酸序列(秈稻雙科早)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11、水稻材料水稻(Oryza sativa ssp.)高糊化溫度秈稻品種“雙科早”和低糊化溫度粳稻品種“C堡”。
2、分析和定位群體純合的秈稻品種“雙科早”和粳稻品種“C堡”進(jìn)行雜交，F(xiàn)1代自交后共得到7068個(gè)F2個(gè)體，并從中選出1,352個(gè)個(gè)體作為定位群體。在苗期每株取2克左右的嫩葉，用來提取DNA。
3、通過SSR，STS，和CAPS標(biāo)記定位ALK基因采用改進(jìn)的CTAB方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組DNA。取大約100mg水稻葉片，經(jīng)液氮冷凍，在直徑5cm的小研缽中磨成粉狀，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管里提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于100μl超純水中。每一個(gè)SSR、STS或CAPS反應(yīng)用1μl DNA樣品。
在ALK基因的初步定位階段，對由10個(gè)F2個(gè)體組成的混合池進(jìn)行SSR分析，發(fā)現(xiàn)ALK基因與第6號染色體RM50和RM527標(biāo)記連鎖，并定位于二標(biāo)記間。在此基礎(chǔ)上，我們設(shè)計(jì)了PCR引物分別以兩個(gè)親本的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將ALK初步定位在SSR標(biāo)記M4741和M4785之間。
為了將ALK定位在一個(gè)PAC克隆上，我們用已公布的水稻品種Nipponbare的PAC文庫(http//rgp.dna.affrc.go.jp)序列構(gòu)建了ALK位點(diǎn)附近的contig，設(shè)計(jì)PCR引物分別以兩個(gè)親本的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。兩個(gè)親本的PCR產(chǎn)物分別用100多種不同的限制酶消化，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙啶(EB)染色，檢測酶切產(chǎn)物的多態(tài)性。以此發(fā)展了CAPS標(biāo)記，并用于群體精細(xì)定位，最終將其定位在一個(gè)BAC克隆AP003509上。
4、ALK基因的精細(xì)定位根據(jù)公布的PAC克隆AP003509的序列(http//rgp.dna.affrc.go.jp)，發(fā)展了1個(gè)SSR標(biāo)記和1個(gè)CAPS標(biāo)記，最后通過連鎖分析將ALK定位在SSR標(biāo)記b與CAPS標(biāo)記d之間9.1kb的范圍之內(nèi)。
5、ALK部分cDNA序列的獲得與功能的預(yù)測首先對9.1kb的全長基因組序列用GENSCAN軟件(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)預(yù)測可能的編碼區(qū)(ORF)，發(fā)現(xiàn)其間只有一個(gè)不完整的開放閱讀框；擴(kuò)大序列范圍預(yù)測，并將基因產(chǎn)物用blastX軟件預(yù)測(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。用DNAStar軟件(Lasergene)MegAlign程序中的ClustalW方法進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比較和進(jìn)化樹分析。同時(shí)又設(shè)計(jì)一對引物AlkF(5’-GCACTCCTGCCTGTTTATCTGAAG-3’)(SEQ ID NO3)和AlkR(5’-CCTTGTACTTGCGGTACGTC-3’)(SEQ ID NO4)以秈稻“雙科早”總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)并測序，得到了ALK基因的部分cDNA序列。在上述研究的基礎(chǔ)上推測該基因可能編碼一種可溶性淀粉合酶II，與玉米SSSIIa極其相似。
6、不同品種間ALK基因序列的比較通過PCR技術(shù)擴(kuò)增包括親本“雙科早”和“C堡”、“明恢63”、“窄葉青”、“寧夏早粳”、“春江06”、“臺中本地1號”、“日本晴”、“楊稻6號”、“龍?zhí)馗Α?0個(gè)品種的ALK基因，通過比較不同水稻品種間ALK的DNA序列，并結(jié)合其糊化溫度的表型，表明堿基替換是造成糊化溫度改變的遺傳基礎(chǔ)。
實(shí)施例21、ALK全長基因序列的克隆根據(jù)秈稻雙科早ALK基因的序列設(shè)計(jì)引物，分三個(gè)區(qū)段進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增并測序，挑選序列完全正確的克隆、利用共有的AgeI位點(diǎn)和KpnI位點(diǎn)將它們連接成一個(gè)6.86kb片段，該片段包含起始密碼子ATG上游的1,766個(gè)堿基和終止密碼子TGA后的677個(gè)堿基的全長序列。
2、植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建ALK正義轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建。將克隆到的全長ALK基因插入到雙元載體pCAMBIA1300(澳大利亞CAMBIA公司)中，獲得了用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒pCAMBIA1300-Alk(圖4A)。
ALK反義轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建。用秈稻雙科早的總RNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增得到0.94kb片段，將其反向插入pCAMBIA-Ubi載體(澳大利亞CAMBIA公司)中，構(gòu)建反義基因轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA-Ubi’Anti-Alk(圖4B)。這兩個(gè)質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(AgroBacteriumtumefaciens)株系EHA105(澳大利亞CAMBIA公司)中，以用于后面的水稻轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例3水稻的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)及結(jié)果1、轉(zhuǎn)化受體材料粳稻C堡、春江06秈稻雙科早、明恢632、農(nóng)桿菌菌株及目的基因農(nóng)桿菌菌株EHA105目的基因Alk(正義基因)，Anti-Alk(反義基因)3、培養(yǎng)基水稻組織培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基4、水稻愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)將粳稻“C堡”和秈稻“雙科早”的幼胚脫殼滅菌，接種到誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)3周后，從盾片處生長出愈傷組織，挑選生長旺盛，顏色淺黃，比較松散的胚性愈傷組織，用作轉(zhuǎn)化的受體。
5、農(nóng)桿菌浸染和水稻轉(zhuǎn)化分別用正義基因表達(dá)載體pCAMBIA1300-Alk轉(zhuǎn)化C堡和春江06；反義基因轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA-Ubi’Anti-Alk轉(zhuǎn)化雙科早和明恢63。用含有上述雙元質(zhì)粒載體的EHA105菌株侵染水稻愈傷組織，在黑暗處25℃培養(yǎng)3天后，在含有50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織和轉(zhuǎn)基因植株。
6、轉(zhuǎn)基因植株鑒定將潮霉素抗性植株在陰涼處煉苗，幾天后移栽到水田，結(jié)實(shí)后取T0代種子進(jìn)行糊化溫度表型鑒定。轉(zhuǎn)正義ALK基因的T0代所結(jié)種子T0-3，T0-5不溶，說明由于正義ALK基因的導(dǎo)入與表達(dá)造成C堡和春江06稻米原本低的糊化溫度明顯升高；而轉(zhuǎn)反義ALK基因的T0代所結(jié)種子Anti-T0-1，Anti-T0-3溶解，說明由于反義ALK基因的導(dǎo)入與表達(dá)造成雙科早、明恢63稻米原本高的糊化溫度明顯降低。證明所克隆的ALK基因確為調(diào)控水稻稻米糊化溫度的主效基因。
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<221>CDS<222>(1)..(2412)<223>
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<212>DNA<213>人工序列<400>3gcactcctgc ctgtttatct gaag 24<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4ccttgtactt gcggtacgtc 20
權(quán)利要求
1.一種控制水稻稻米糊化溫度的主效基因，該基因的核苷酸序列選自(1)編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)與(1)中的核苷酸序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并同時(shí)編碼具有控制水稻稻米糊化溫度的功能的核苷酸序列。
2.按照權(quán)利要求1所述的基因，它具有SEQ ID NO1所示的DNA序列。
3.一種由權(quán)利要求1所述的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
4.按照權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
5.一種含有權(quán)利要求1或2所述的控制水稻稻米糊化溫度的基因的植物表達(dá)載體。
6.按照權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，該表達(dá)載體是pCAMBIA1300-ALK或pCAMBIA-Ubi’Anti-Alk。
7.一種培育淀粉的糊化溫度發(fā)生變化的植株的方法，包括用權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種控制水稻稻米糊化溫度的主效基因，該基因的核苷酸序列選自(1)編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)與(1)中的核苷酸序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并同時(shí)編碼具有控制水稻稻米糊化溫度的功能的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種控制水稻稻米糊化溫度的蛋白質(zhì)、含有本發(fā)明的基因的植物表達(dá)載體、和一種培育植物的方法，該方法可使植物淀粉的主要儲藏器官的糊化溫度發(fā)生變化，包括用含有本發(fā)明的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株的步驟。
文檔編號C12N15/29GK1570110SQ03132810
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月21日
發(fā)明者李家洋, 錢前, 高振宇, 周奕華 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所