專(zhuān)利名稱(chēng)：鰻弧菌的pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)動(dòng)物疾病的診斷技術(shù)，具體地說(shuō)是一種對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物鰻弧菌的PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
弧菌是海洋水環(huán)境微生態(tài)系的成員，在海水和海洋生物中廣泛存在。病原性弧菌能引起養(yǎng)殖生物流行病的爆發(fā)，導(dǎo)致死亡。鰻弧菌是其中一種非常重要的弧菌性病原，能夠引起養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的皮膚潰爛、肌體出血和死亡，危害十分巨大。對(duì)于病原性鰻弧菌的檢測(cè)方法，目前主要有生理生化鑒定技術(shù)、熒光抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和16srRNA基因探針雜交技術(shù)。但這些方法存在一些缺點(diǎn)和不足。生理生化檢測(cè)技術(shù)十分耗時(shí)耗力，并且結(jié)果不穩(wěn)定；熒光抗體技術(shù)需要較昂貴的儀器設(shè)備；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)敏感性不高，還易受干擾因素的影響；16srRNA基因在生物物種中非常保守，因此16srRNA基因探針雜交技術(shù)特異性不強(qiáng)。PCR是一種具有敏感性高、特異性強(qiáng)的靶DNA快速檢測(cè)方法，樣品中含有少量的細(xì)菌就能檢出。然而，采用PCR對(duì)鰻弧菌的檢測(cè)目前未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鰻弧菌的PCR檢測(cè)方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)鰻弧菌的準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)，為健康養(yǎng)殖提供科學(xué)的依據(jù)。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下包括下列步驟1)樣品處理取0.5～1克或0.1～0.5ml樣品，用200～400μl試劑A懸浮樣品，并將樣品充分混勻；10000～12000g離心2～5分鐘；2)DNA提取棄上清，用100～200μl試劑A再次懸浮沉淀，再加入20～100μl試劑B混勻；或取上清，再加入20～100μl試劑B混勻，室溫放置2～10分鐘，再在55～65℃浴中保溫10～15分鐘，10000～12000g離心8～10分鐘，取上清并加入上清體積2倍的無(wú)水乙醇沉淀DNA；室溫放置5～10分鐘，10000-12000g離心5～10分鐘；去上清，70～75％乙醇洗滌1～2次，讓乙醇徹底揮發(fā)，將其沉淀溶于10～50μl滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，2～8℃保存?zhèn)溆茫?)一次PCR在PCR試劑管中加入0.5～1μl所述的DNA提取液，每管加入2.5單位/ml的Taq酶0.5～1.0μl，3000～5000g離心2～5秒鐘混勻，置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增；通過(guò)94～96℃解鏈2～5分鐘；然后94～96℃變性40秒～1分鐘，55～60℃復(fù)性30秒～1分鐘，72℃延伸40s～1分鐘，如此進(jìn)行循環(huán)25～35次，最后72℃延伸6～10分鐘，得擴(kuò)增樣品；4)一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析取5～10μl擴(kuò)增后的樣品，與2～6μl 0.25％(w/v)溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，在含0.5～1.0μg/ml溴化乙錠的0.8～1％(w/v)瓊脂糖中進(jìn)行電泳和顯色，在透射紫外燈下觀察，樣品孔有一條593bp核酸條為有鰻弧菌感染或污染的陽(yáng)性樣品；對(duì)一次PCR未出現(xiàn)帶的樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行二次PCR處理，具體為取未出現(xiàn)帶的樣品的一次PCR產(chǎn)物0.5～1μl加入PCR試劑管，以所述步驟3)和4)方式進(jìn)行PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物分析，測(cè)得樣品孔有一條593bp的核酸條為鰻弧菌感染或污染陽(yáng)性樣品；所述試劑A含有氯化鈉、三羥基甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸和曲拉通X-100，它們的濃度分別為0.1～0.5M、10～50mM、1～10mM、5～10％(v/v)；三羥基甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸的pH均為8.0；所述試劑B含有溶菌酶和三羥基甲基氨基甲烷，濃度分別為5～10w/v、10～50mM；三羥基甲基氨基甲烷的pH為8.0。
所述PCR試劑管成分為2.5～5.0μl 10×buffer，2.0～4.0μl dNTP(為dTTP、dATP、dCTP、dCTP四種核苷酸的混合物，每種濃度2.5mM)，2.0～4.0μl 25mM MgCl2，0.5～1.0μl 20μM引物1，0.5～1.0μl 20μM引物2，16.5～33μl滅菌去離子水；PCR反應(yīng)試劑成分的最佳組成為5.0μl 10×buffer，1μl 2.5單位/μl Taq酶，4.0μl dNTP，4.0μl 25mM MgCl2，1μl 20μm引物1，1μl 20μm引物2，33μl滅菌去離子水；其中dNTP中每種核苷酸濃度為2.5mM；所述的引物1和引物2分別是由DNA合成儀按堿基序列為5’GATCGAGGTACGCGAGTG3’和5’TAATGCGGTTGGTATCCACA 3’合成的DNA片段。
本發(fā)明原理為試劑A和B將樣品中的細(xì)菌進(jìn)行裂解，釋放出細(xì)菌DNA，PCR反應(yīng)試劑管含多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑，通過(guò)試劑管中所含的鰻弧菌特異DNA片段引物和Tag酶等成分，對(duì)樣品釋放出的DNA進(jìn)行特異性的擴(kuò)增。由于本發(fā)明的引物為鰻弧菌所特有，因此，如果樣品中含有鰻弧菌，那么它的DNA的特異片段在經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后，濃度將達(dá)到108mol(克分子)以上，在電泳和溴乙錠染色后，紫外光檢測(cè)就可以探測(cè)到一定分子量的目的條帶。如果沒(méi)有鰻弧菌，則不能擴(kuò)增到同樣分子量的目的條帶。
本發(fā)明設(shè)計(jì)特異引物并成功建立鰻弧菌PCR檢測(cè)技術(shù)，與其它的弧菌病原檢測(cè)技術(shù)和其它的病原檢測(cè)技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果1.采用本發(fā)明方法檢測(cè)十分快速，4～8小時(shí)即可得知檢測(cè)結(jié)果，而其它方法則至少需要1天或一個(gè)星期以上。
2.采用本發(fā)明在一次PCR的基礎(chǔ)上進(jìn)行二次PCR，可以進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度，檢測(cè)下限低至1～10個(gè)左右的細(xì)菌，而現(xiàn)有技術(shù)的其它方法必須經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的純培養(yǎng)增殖達(dá)到105后才能進(jìn)行檢測(cè)。
3.本發(fā)明可以應(yīng)用于多種樣品的檢測(cè)，可以檢測(cè)養(yǎng)殖動(dòng)物遭受鰻弧菌感染的情況，也可以監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖水體環(huán)境中鰻弧菌，還可以檢測(cè)養(yǎng)殖飼料和鮮活餌料是否遭受鰻弧菌污染，應(yīng)用廣泛。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，不當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1按以下配方法制備檢測(cè)鰻弧菌的試劑(1)試劑A0.5M NaCl，50mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)，10％(ml/ml)TritonX-100；(2)試劑B10mg/ml溶菌酶、50mM Tris(pH8.0)；(3)PCR試劑管成分5.0μl 10×buffer，4.0μl dNTP(dTTP、dATP、dCTP、dCTP四種核苷酸的混合物，每種濃度2.5mM)，4.0μl MgCl2(25mM)，1μl引物1(20μM)，1μl引物2(20μM)，33μl滅菌去離子水。
(4)2.5單位/μl Taq酶；(5)含0.5μg/ml溴化乙錠的0.8％(g/ml)的瓊脂糖；(6)0.25％(g/ml)溴酚蘭上樣緩沖液；按照以下程序進(jìn)行檢測(cè)(1)樣品處理取魚(yú)組織1克，用400μl試劑A懸浮樣品，勻漿器勻漿，12000g離心5分鐘；(2)DNA提取棄上清，用200μl重新懸浮沉淀試劑A，再加入100μl試劑B，室溫放置5分鐘，65℃浴中保溫15分鐘，冷卻至室溫，12000g離心10分鐘，取上清并加入600μl的無(wú)水乙醇沉淀DNA；室溫放置5分鐘，12000g離心5分鐘；去上清，75％乙醇洗滌2次，讓乙醇徹底揮發(fā)，將其沉淀溶于20μl滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，8℃保存?zhèn)溆茫?3)一次PCR在PCR試劑管中加入1μl的DNA提取液，每管加入2.5單位/μl Taq酶1.0μl，5000g離心2秒鐘混勻，置PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)96℃解鏈5分鐘；然后96℃變性1分鐘，60℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸40秒分鐘，如此進(jìn)行循環(huán)30次，最后72℃延伸6分鐘，得擴(kuò)增樣品。
(4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析取5μl擴(kuò)增后的樣品，與2μl 0.25％溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，在含0.5μg/ml溴化乙錠的0.8％(g/ml)的瓊脂糖中進(jìn)行電泳和顯色，在透射紫外燈下觀察，如果所有樣品孔均出現(xiàn)一條593bp核酸條帶，說(shuō)明樣品有鰻弧菌感染或污染。
其中電泳液組成、電泳方法及染色方法參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)，p307，p309-313，p314。
實(shí)施例2按以下方法配制作檢測(cè)鰻弧菌的試劑(1)試劑A0.1M NaCl，10mM Tris(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)，5％tritonX-100；(2)試劑B5mg/ml溶菌酶、10mM Tris(pH8.0)；(3)PCR試劑管5.0μl 10×buffer，4.0μl dNTP(dTTP、dATP、dCTP、dCTP四種核苷酸的混合物，每種濃度2.5mM)，4.0μl MgCl2(25mM)，1μl引物1(20μM)，1μl引物2(20μM)，33μl滅菌去離子水。
(4)2.5U/μl Taq酶；(5)含0.75μg/ml溴化乙錠的0.9％(g/ml)的瓊脂糖；(6)0.25％(g/ml)溴酚蘭上樣緩沖液。
按照以下程序進(jìn)行檢測(cè)(1)樣品處理取餌料0.5克，用200μl試劑A懸浮樣品，充分溶解，12000g離心3分鐘；(2)DNA提取棄上清，用300μl重新懸浮沉淀試劑A，再加入70μl試劑B，室溫放置8分鐘，60℃浴中保溫12分鐘，冷卻至室溫，12000g離心9分鐘，取上清并加入740μl的無(wú)水乙醇，沉淀DNA；室溫放置8分鐘，12000g離心8分鐘；去上清，75％乙醇洗滌2次，讓乙醇徹底揮發(fā)，將其沉淀溶于30μl滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，4℃保存?zhèn)溆茫?3)一次PCR在PCR試劑管中加入1μl的DNA提取液，每管加入2.5單位/μl Taq酶1.0μl，4000g離心3秒鐘混勻，置PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)96℃解鏈5分鐘；然后96℃變性1分鐘，60℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸40秒分鐘，如此進(jìn)行循環(huán)30次，最后72℃延伸6分鐘，得擴(kuò)增樣品。
(4)一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析取8μl擴(kuò)增后的樣品，與4μl 0.25％溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，在含0.75μg/ml溴化乙錠的0.9％(g/ml)的瓊脂糖中進(jìn)行電泳和顯色，在透射紫外燈下觀察，如果樣品孔有一條593bp核酸條帶，說(shuō)明樣品有鰻弧菌感染或污染。對(duì)未出現(xiàn)帶的樣品的PCR產(chǎn)物用于進(jìn)行二次PCR。
(5)二次PCR及擴(kuò)增產(chǎn)物分析取未出現(xiàn)帶的樣品的PCR產(chǎn)物1μl加入PCR試劑管，以上述的步驟(3)和(4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物分析，如果樣品孔有一條593bp的核酸條帶，則判此樣品為鰻弧菌感染或污染陽(yáng)性，反之則沒(méi)有。
其中電泳液組成、電泳方法及染色方法參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)，p307，p309-313，p314。
實(shí)施例3按以下方法配制檢測(cè)鰻弧菌的試劑(1)試劑A0.25M NaCl，25mM Tris(pH8.0)，5mM EDTA(pH8.0)，7.5％tritonX-100(2)試劑B7.5mg/ml溶菌酶、25mM Tris.Cl(pH8.0)(3)PCR試劑管2.5μl 10×buffer，2.0μl dNTP(dTTP、dATP、dCTP、dCTP四種核苷酸的混合物，每種濃度2.5mM)，2.0μl MgCl2(25mM)，0.5μl引物1(20μM)，0.5μl引物2(20μM)，16μl滅菌去離子水。
(4)2.5U/μl Taq酶；(5)含1μg/ml溴化乙錠的1％(g/ml)的瓊脂糖；(6)0.25％(g/ml)溴酚蘭上樣緩沖液。
按照以下程序進(jìn)行檢測(cè)(1)樣品處理水樣0.1ml，加入200μl試劑A，混勻，10000g離心2分鐘；(2)DNA提取取上清，加入50μl試劑B，混勻，室溫放置10分鐘，55℃浴中保溫10分鐘，冷卻至室溫，12000g離心8分鐘，取上清并加入500μl的無(wú)水乙醇沉淀DNA，室溫放置10分鐘，12000g離心8分鐘；去上清，75％乙醇洗滌2次，讓乙醇徹底揮發(fā)，將沉淀溶于50μl滅菌雙蒸水中，即DNA提取液，2℃保存?zhèn)溆茫?3)一次PCR在PCR試劑管中加入1μl的DNA提取液，每管加入2.5單位/μl Taq酶1.0μl，3000g離心5秒鐘混勻，置PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)96℃解鏈5分鐘；然后96℃變性1分鐘，60℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸1分鐘，如此進(jìn)行循環(huán)30次，最后72℃延伸6分鐘，得擴(kuò)增樣品。
(4)一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析取10μl擴(kuò)增后的樣品，與5μl 0.25％溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，在含1μg/ml溴化乙錠的1％(g/ml)的瓊脂糖中進(jìn)行電泳和顯色，在透射紫外燈下觀察，如果樣品孔有一條593bp核酸條帶，說(shuō)明樣品有鰻弧菌感染或污染。對(duì)未出現(xiàn)帶的樣品的PCR產(chǎn)物用于進(jìn)行二次PCR。
(5)二次PCR及擴(kuò)增產(chǎn)物分析取未出現(xiàn)帶的樣品的PCR產(chǎn)物1μl加入PCR試劑管，以上述的步驟(3)和(4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物分析，如果樣品孔有一條593bp的核酸條帶，則判此樣品為鰻弧菌感染或污染陽(yáng)性，反之則沒(méi)有。
其中電泳液組成、電泳方法及染色方法參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)，p307，p309-313，p314。
權(quán)利要求
1.一種所述檢測(cè)鰻弧菌的PCR方法，其特征在于包括下列步驟1)樣品處理取0.5～1克或0.1～0.5ml樣品，用200～400μl試劑A懸浮樣品，并將樣品充分混勻；10000～12000g離心2～5分鐘；2)DNA提取棄上清，用100～200μl試劑A再次懸浮沉淀，再加入20～100μl試劑B混勻；或取上清，再加入20～100μl試劑B混勻，室溫放置2～10分鐘，再在55～65℃浴中保溫10～15分鐘，10000～12000g離心8～10分鐘，取上清并加入上清體積2倍的無(wú)水乙醇沉淀DNA；室溫放置5～10分鐘，10000-12000g離心5～10分鐘；去上清，70～75％乙醇洗滌1～2次，讓乙醇徹底揮發(fā)，將其沉淀溶于10～50μl滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，2～8℃保存?zhèn)溆茫?)一次PCR在PCR試劑管中加入0.5～1μl所述的DNA提取液，每管加入2.5單位/ml的Taq酶0.5～1.0μl，3000～5000g離心2～5秒鐘混勻，置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增；通過(guò)94～96℃解鏈2～5分鐘；然后94～96℃變性40秒～1分鐘，55～60℃復(fù)性30秒～1分鐘，72℃延伸40s～1分鐘，如此進(jìn)行循環(huán)25～35次，最后72℃延伸6～10分鐘，得擴(kuò)增樣品；4)一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析取5～10μl擴(kuò)增后的樣品，與2～6μl 0.25％(w/v)溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，在含0.5～1.0μg/ml溴化乙錠的0.8～1％(w/v)瓊脂糖中進(jìn)行電泳和顯色，在透射紫外燈下觀察，樣品孔有一條593bp核酸條為有鰻弧菌感染或污染的陽(yáng)性樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)鰻弧菌的PCR方法，其特征在于對(duì)一次PCR未出現(xiàn)帶的樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行二次PCR處理，具體為取未出現(xiàn)帶的樣品的一次PCR產(chǎn)物0.5～1μl加入PCR試劑管，以所述步驟3)和4)方式進(jìn)行PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物分析，測(cè)得樣品孔有一條593bp的核酸條為鰻弧菌感染或污染陽(yáng)性樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)鰻弧菌的PCR方法，其特征在于所述試劑A含有氯化鈉、三羥基甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸和曲拉通X-100，它們的濃度分別為0.1～0.5M、10～50mM、1～10mM、5～10％(v/v)；三羥基甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸的pH均為8.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)鰻弧菌的PCR方法，其特征在于所述試劑B含有溶菌酶和三羥基甲基氨基甲烷，濃度分別為5～10w/v、10～50mM；三羥基甲基氨基甲烷的pH為8.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)鰻弧菌的PCR方法，其特征在于所述PCR試劑管成分為2.5～5.0μl 10×buffer，2.0～4.0μl dNTP(為dTTP、dATP、dCTP、dCTP四種核苷酸的混合物，每種濃度2.5mM)，2.0～4.0μl 25mMMgCl2，0.5～1.0μl 20μM引物1，0.5～1.0μl 20μM引物2，16.5～33μl滅菌去離子水。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測(cè)鰻弧菌的PCR方法，其特征在于PCR反應(yīng)試劑成分的最佳組成為5.0μl 10×buffer，1μl 2.5單位/μl Taq酶，4.0μldNTP，4.0μl 25mM MgCl2，1μl 20μm引物1，1μl 20μm引物2，33μl滅菌去離子水；其中dNTP中每種核苷酸濃度為2.5mM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)鰻弧菌的PCR方法，其特征是所述的引物1和引物2分別是由DNA合成儀按堿基序列為5’GATCGAGGTACGCGAGTG3’和5’TAATGCGGTTGGTATCCACA 3’合成的DNA片段。
全文摘要
本發(fā)明屬于水產(chǎn)動(dòng)物疾病的診斷技術(shù)，具體地說(shuō)是一種對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物鰻弧菌的PCR檢測(cè)方法。包括由樣品處理試劑A和B、PCR試劑管、Taq酶、普通瓊脂糖、溴化乙錠溶液、溴酚藍(lán)上樣緩沖溶液組成的PCR檢測(cè)試劑的配制以及一次PCR、一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析等一套檢測(cè)操作程序，增加了二次PCR處理程序。本發(fā)明能在一次PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上，建立二次PCR反應(yīng)方法，可快速、準(zhǔn)確、敏感地檢測(cè)出樣品中的鰻弧菌，為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的疾病診斷提供簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確的方法，也可應(yīng)用于對(duì)養(yǎng)殖水體和飼料的質(zhì)量監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK1594592SQ03133940
公開(kāi)日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2003年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月10日
發(fā)明者莫照蘭, 張培軍, 陳師勇, 鄒玉霞, 張振冬, 王春玲, 肖鵬, 徐永立 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所