專利名稱：精神分裂癥易感基因檢測方法及易感基因和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及精神分裂癥易感基因檢測方法，體外檢測試驗(yàn)者精神分裂癥易感性的方法以及精神分裂癥易感基因和用途，具體的說，本發(fā)明涉及精神分裂癥易感基因NRG1基因多態(tài)性位點(diǎn)的檢測方法，體外檢測試驗(yàn)者精神分裂癥易感性的方法以及精神分裂癥易感基因NRG1基因和用途。
背景技術(shù)：
據(jù)1999年底，我國衛(wèi)生部的統(tǒng)計(jì)資料顯示按傷殘所調(diào)整的生命年限指標(biāo)，評價(jià)各類疾病在我國疾病社會(huì)負(fù)擔(dān)中所占的比例，精神疾患約占疾病總負(fù)擔(dān)的1/5，已超過心血管、呼吸系統(tǒng)及惡性腫瘤等疾患，排名居首位。精神分裂癥發(fā)病率僅次于抑郁癥，占整個(gè)精神疾患的第二位。精神分裂癥的癥狀包括思維紊亂、狂想以及情緒與行動(dòng)改變等。
一個(gè)世紀(jì)以來，人們對精神疾病的生理、生化、影像、藥物治療以及社會(huì)家庭、環(huán)境等方面的觀察，對精神疾病的發(fā)病機(jī)理作出了各種假說和推斷。隨著科技的進(jìn)步，人們越來越認(rèn)識(shí)到基因缺陷是許多嚴(yán)重精神疾病產(chǎn)生的重要原因，人在遇到心理和社會(huì)環(huán)境壓力時(shí)，那些攜帶疾病易感基因的人比不攜帶疾病易感基因的人更可能罹患精神衛(wèi)生疾患。遺傳因素還基本上得到家系、雙生子及寄養(yǎng)子的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果的支持，80年代后期，對精神疾病遺傳流行病學(xué)的大規(guī)模調(diào)查，更充分顯示了精神疾病的遺傳基礎(chǔ)。在科技日益發(fā)展的今天如何對精神疾患，尤其是精神分裂癥，如何從遺傳角度檢測易感基因以及個(gè)體的疾病易感性，以至于進(jìn)行進(jìn)一步風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測和診斷治療，成為廣大科技人員和醫(yī)療衛(wèi)生人員面臨的嚴(yán)峻問題。盡管國內(nèi)外疾病易感基因研究開展多年，但尚未取得突破性進(jìn)展，鮮有價(jià)值的研究結(jié)果。對于怎樣鑒定遺傳易感基因以及鑒定試驗(yàn)者的遺傳易感性，本領(lǐng)域一直缺乏全面、系統(tǒng)、有效的識(shí)別方法，對于精神分裂癥易感性的研究成果更少。
最近基因組掃描結(jié)果提示，8p22-21是精神分裂癥的易感區(qū)域之一。neu基因調(diào)節(jié)劑1基因(Neuregulin 1，NRG1)，基因定位于8p21，genbank登記號(hào)GI22048149，全長216361bp，已知在神經(jīng)發(fā)育、分化、營養(yǎng)和突觸可塑性調(diào)節(jié)及學(xué)習(xí)記憶中占有重要的作用，為一種多功能因子。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明提供一種檢測精神分裂癥易感基因的方法，從而，滿足了本領(lǐng)域?qū)τ谡_識(shí)別精神分裂癥易感基因的需求，為精神分裂癥的深入研究和防治，甚至診斷治療提供了新的思路。
本發(fā)明同時(shí)提供了一種體外檢測試驗(yàn)者精神分裂癥易感性的方法。
本發(fā)明還提供了按照本發(fā)明的方法制備而成的試劑盒。
另一方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種精神分裂癥易感基因。
本發(fā)明提供的體外檢測精神分裂癥易感基因的方法還可以用于精神分裂癥的預(yù)防、診斷和治療。
本發(fā)明提供的體外檢測試驗(yàn)者精神分裂癥易感性的方法可以用于精神分裂癥的患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測、診斷和治療。
本發(fā)明提供的本發(fā)明的精神分裂癥易感基因可以用于精神分裂癥的預(yù)防、診斷和治療。
本發(fā)明通過大樣本的統(tǒng)計(jì)分析，研究了NRG1基因序列第二個(gè)外顯子第12位的rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和第五個(gè)內(nèi)含子的rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)在精神分裂癥核心家系的等位基因頻率，并根據(jù)父母基因型在患病子女中的傳遞情況，進(jìn)行傳遞不平衡檢驗(yàn)(TDT)和單體型分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全部樣本的基因型分布和等位基因頻率均符合Hardy-Weinburg平衡；經(jīng)過Bonferroni法矯正后，兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的TDT分析仍然有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；單個(gè)單體型的分析也顯示在患者中AG單體型傳遞過多，差異有顯著型；從而以試驗(yàn)證明了NRG1基因序列的rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和/或rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)影響精神分裂癥的易感性，其中NRG1基因序列中rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和/或rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)為精神分裂癥易感基因。
因此，本發(fā)明提供了一種檢測精神分裂癥易感基因的方法，該方法為通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-直接測序法和/或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性分析方法體外檢測NRG1基因序列，其中有位于NRG1基因第二個(gè)外顯子第12位的rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和/或位于第五個(gè)內(nèi)含子的rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)。
所謂“基因多態(tài)性”指的是在人群中，各個(gè)體基因的核苷酸序列存在的差異。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，本發(fā)明所述的多態(tài)性位點(diǎn)為單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，即基因組序列中單個(gè)核苷酸發(fā)生改變；核苷酸序列的差異可以體現(xiàn)在DNA水平上或者RNA水平上，所以，可以通過檢測DNA、RNA檢測多態(tài)性，優(yōu)選DNA，更優(yōu)選基因組DNA。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以用多種技術(shù)在DNA水平上體外檢測NRG1基因序列的多態(tài)性位點(diǎn)?？梢越?jīng)與用放射性標(biāo)記的反義RNA或DNA探針與擴(kuò)增后的DNA序列雜交，以鑒別點(diǎn)多態(tài)性。也可以基于已知的核苷酸順序的改變，合成正常的和多態(tài)性的PCR引物，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR反應(yīng))的底物中加入熒光標(biāo)記的核苷酸，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物中有無熒光出現(xiàn)，確定在擴(kuò)增所用的引物中有無堿基變化，從而檢測多態(tài)性。通過DNA直接測序可以直接揭示對照基因和攜帶多態(tài)性基因之間的序列差異。當(dāng)與PCR結(jié)合使用時(shí)，這種方法的靈敏性大大提高。例如，將測序引物和雙鏈PCR產(chǎn)物或者不對稱擴(kuò)增法產(chǎn)生的單鏈模板分子一起使用。各種DNA及DNA片段的核苷酸序列的測定也可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger等人，PNAS，1977，745463-5467)。此外，核苷酸序列測定也可用商業(yè)測序試劑盒或自動(dòng)測序儀等。常規(guī)的自動(dòng)測序法用放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記來確定核酸序列。
由于基因多態(tài)性，導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)改變、消失或產(chǎn)生新的位點(diǎn)，若用某種限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，則酶切后產(chǎn)生與正常基因組不同長度的DNA片段，經(jīng)用適當(dāng)?shù)奶结橂s交檢測，就可檢測這些條帶的位置和大小。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)方法的原理為在設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)時(shí)，引物位于基因多態(tài)性部位的兩側(cè)，現(xiàn)將目的基因擴(kuò)增，使其易于檢測，由于多態(tài)性引起已有的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)改變，則可先用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，根據(jù)產(chǎn)物片斷大小或數(shù)量與正常對照作出判斷。本發(fā)明優(yōu)選采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-直接測序法，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性分析方法。更優(yōu)選聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性分析方法。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制生片斷長度多態(tài)性分析方法檢測精神分裂癥易感基因的方法，所述多態(tài)性分析方法包括A提取DNA，在rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和/或rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)；B針對上述多態(tài)性位點(diǎn)，利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；C凝膠電泳分離與鑒定酶切結(jié)果；其中，rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和/或rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)為精神分裂癥易感性等位基因。
本發(fā)明所述的檢測精神分裂癥易感基因的方法，可以進(jìn)一步包括在多態(tài)性分析之后，利用傳遞不平衡檢驗(yàn)分析NRG1基因的等位基因的傳遞頻率和單體型傳遞頻率，具有顯著性差異為精神分裂癥易感基因。如實(shí)施例1所述，本發(fā)明對246個(gè)家系(每例都含有血緣關(guān)系的父母雙親和1個(gè)患病子/女)中的2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了單體型頻率分析。結(jié)果得出，經(jīng)過Bonferroni法矯正后，兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的TDT分析仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(rs3924999X2＝9.0905，P＝0.005168；rs2954041X2＝22.0458，P＝0.0006206)；單個(gè)單體型的分析也顯示在患者中AG單體型傳遞過多，差異有顯著性(X2＝26.114，自由度＝1，p＜0.00001)。
本發(fā)明同時(shí)提供了一種體外檢測試驗(yàn)者精神分裂癥遺傳易感性的方法，該方法為檢測試驗(yàn)者NRG1基因序列rs3924999和/或rs2954041多態(tài)性，其中rs3924999位點(diǎn)核苷酸傳遞G，和/或rs2954041位點(diǎn)核苷酸傳遞T的試驗(yàn)者，為精神分裂癥易感性高者。
這里所說的“遺傳易感性”是指由遺傳決定的易于罹患某種(某類)疾病的傾向性(susceptibility)，即過去人們常謂的“素質(zhì)”(diathesis)。遺傳易感基因的存在，是遺傳易感性的基礎(chǔ)。人在遇到心理和社會(huì)環(huán)境壓力時(shí)，那些攜帶精神分裂癥易感基因的人比不攜帶易感基因的人更可能罹患精神分裂癥疾患。
含有待測NRG1基因序列的樣品可以從來自試驗(yàn)者的細(xì)胞獲得，如來自血液、尿、唾液、胃液、頭發(fā)，活組織檢查和尸體解剖材料的細(xì)胞。優(yōu)選來自血液。
通過本發(fā)明大樣本的統(tǒng)計(jì)分析，可以單獨(dú)使用本發(fā)明的方法，即檢測試驗(yàn)者NRG1基因序列rs3924999和/或rs2954041多態(tài)性來檢測相關(guān)精神分裂癥遺傳易感性，同時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，精神分裂癥的發(fā)生、發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果，遺傳易感性也有其自身的復(fù)雜性，所以本發(fā)明也可以與其它方法聯(lián)合使用，以達(dá)到檢測精神分裂癥易感性的目的。
本發(fā)明提供的體外檢測試驗(yàn)者精神分裂癥遺傳易感性的方法，檢測NRG1基因序列rs3924999和/或rs2954041多態(tài)性的方法可以采用上述檢測基因序列的多態(tài)性位點(diǎn)的方法，例如直接測序法，限制性片斷長度多態(tài)性分析方法。優(yōu)選聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-直接測序法，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性分析方法，更優(yōu)選聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性分析方法。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性分析方法檢測試驗(yàn)者精神分裂癥易感性，其中所述多態(tài)性分析方法包括A提取試驗(yàn)者DNA，在rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和/或rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)；B針對上述多態(tài)性位點(diǎn)，利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；C凝膠電泳分離與鑒定酶切結(jié)果。
本發(fā)明還提供一種用于檢測精神分裂癥易感性的試劑盒。所述試劑盒內(nèi)裝有一個(gè)或多個(gè)容器，容器內(nèi)裝有用以檢測NRG1基因序列rs3924999和/或rs2954041多態(tài)性的一種或多種組分。按照具體檢測方法及檢測多態(tài)性位點(diǎn)的不同，試劑盒可含有不同組分。與之同時(shí)提供的可以是經(jīng)政府藥物管理機(jī)構(gòu)審核的、有關(guān)藥品或生物制品制造、使用及銷售的信息。優(yōu)選含有利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性分析方法，檢測NRG1基因序列rs3924999和rs2954041多態(tài)性的組分1)擴(kuò)增rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和/或rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)的引物；2)PCR擴(kuò)增酶，酶切多態(tài)性位點(diǎn)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，及相應(yīng)緩沖液；3)dNTP；4)所述多態(tài)性位點(diǎn)酶切圖譜。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，上述擴(kuò)增引物，可以依據(jù)已知的核苷酸序列設(shè)計(jì)，通常為15-30個(gè)堿基，GC含量為45％-50％左右，在適當(dāng)?shù)臏囟认屡c模板特異性結(jié)合，其可以利用專門的計(jì)算機(jī)程序設(shè)計(jì)，例如(OLIGO 4.06引物分析軟件)；如本發(fā)明實(shí)施例1所示，
擴(kuò)增rs3924999多態(tài)性的引物可以分別為AACTGGTTTCACACCGAAGGAC；(SEQ ID No 3)CCAAGATGAGATCCATTTTCGC；(SEQ ID No 4)擴(kuò)增rs2954041多態(tài)性的引物可以分別為TGACATTATTCATTGTTTGTTGCTGA；(SEQ ID No 5)GGATGCCATGGATATACTATGCAGA；(SEQ ID No 6)所述的TagDNA聚合酶可以是Klenow片段，Tth DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶等能夠用于PCR擴(kuò)增的酶。酶切多態(tài)性位點(diǎn)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也可以按照已知技術(shù)設(shè)計(jì)，例如，按照實(shí)施例1中所述的可以分別為限制性內(nèi)切酶MunI和Tru1I，限制性內(nèi)切酶確定后，與之相對的內(nèi)切圖譜也相應(yīng)確定。
本發(fā)明同時(shí)提出一種精神分裂癥易感基因，其為NRG1基因序列，并且有一位于NRG1基因第二個(gè)外顯子第12位的rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)，和/或位于第五個(gè)內(nèi)含子的rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)。本發(fā)明NRG1基因的多態(tài)性可以表現(xiàn)在DNA水平或RNA水平。優(yōu)選DNA，更優(yōu)選基因組DNA。
本發(fā)明提供的體外檢測精神分裂癥易感性的方法可以用于精神分裂癥的預(yù)防、診斷和治療。
本發(fā)明提供的體外檢測試驗(yàn)者精神分裂癥易感基因的方法可以用于精神分裂癥患病的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測、診斷和治療。
本發(fā)明提供的精神分裂癥易感基因可以用于精神分裂癥的預(yù)防、診斷和治療。


圖1顯示NRG1基因的基因示意圖，其中黑色條形框代表外顯子，白色條形框代表內(nèi)含子，箭頭所指為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)所在位置。
圖2顯示利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性分析方法檢測試驗(yàn)者精神分裂癥易感性的流程圖。
圖3顯示多態(tài)性位點(diǎn)rs3924999位點(diǎn)的酶切圖，其中，1為100bp分子量標(biāo)準(zhǔn)(marker)，2為246/65/181雜合子，3為246純合子，4為65/181純合子。
圖4顯示多態(tài)性位點(diǎn)rs2954041位點(diǎn)的酶切圖，其中，1為25bp分子量標(biāo)準(zhǔn)(marker)，2為60/127純合子，3為30/31/60/126/127雜合子，4為30/31/126純合子。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.研究對象此階段的研究對象均為2001年-2002年在北京大學(xué)精神衛(wèi)生研究所門診和住院部進(jìn)行診治的患者，和前一階段的樣本合并后共有精神分裂癥核心家系246例(每例都含有血緣關(guān)系的父母雙親和1個(gè)患病子/女)，均為漢族。所有患者都符合國際疾病分類手冊第10版(ICD-10)中精神分裂癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并接受了結(jié)構(gòu)式臨床訪談。在患者中，男性為138例(56％)，女性108例(44％)，平均年齡為29歲。平均病程為5年。
所有研究對象都簽署了知情同意書。該研究得到北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
2.方法用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-based RFLP)分析方法檢測所有研究對象2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs3924999、rs2954041的基因型。流程參見附圖2。
2.1血液標(biāo)本的采集及處理所有患者都抽取了外周靜脈血5-10ml，置于抗凝管中，于4℃冰箱保存，1周內(nèi)提取基因組DNA。
2.2基因組DNA的提取及鑒定2.2.1基因組DNA的提取在前一階段基因組DNA的提取中，需要5ml血液，未能留下部分血液凍存。為了減少血液用量，此階段的提取用基因組DNA抽提純化試劑盒(上海華舜生物工程有限公司，血液基因組DNA抽提純化試劑盒)完成。方法如下在5ml離心管中加入1ml含抗凝劑的新鮮全血，再加入3ml預(yù)冷的1*BP(紅細(xì)胞裂解液)液，來回顛倒離心管以徹底混勻。冰浴10分鐘后，4500g離心2分鐘，將上層液體徹底吸出，在離心管中加入1ml預(yù)冷的1*BP(紅細(xì)胞裂解液)液。徹底混勻后，4500g離心2分鐘，將上層液體徹底吸出。在沉淀中加入200μl DT(懸浮液)液，徹底振蕩懸浮。加入400μl DL(裂解液)液和25μl蛋白酶K，迅速振蕩混勻，置65℃溫浴15-30分鐘，期間來回顛倒離心管多次。加入400μl異丙醇，劇烈顛倒離心管使溶液混勻后，移取600μl至吸附柱中，離心30秒，棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中，將剩余的全部移至吸附柱中，離心30秒。棄掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。加入500μl W1(洗滌液)液，靜置1分鐘后，離心30秒。將吸附柱移入另一個(gè)干凈的收集管中，加入500μl W1液，離心15秒。棄掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中，離心1分鐘。將吸附柱移入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入100μl T1(洗脫液)液，65℃靜置5分鐘后，離心1分鐘。加入60μl T1液，離心1分鐘。將1.5ml離心管(DNA)放于-20℃保存。
2.3目的片段的擴(kuò)增2.3.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)25-μl的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，1.5mM氯化鎂，200μM每種dNTP，0.4μM引物，1.0U Taq DNA聚合酶，30-50ng基因組DNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘，94℃變性30秒，55℃-62℃退火40秒，72℃延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)，最后72℃后延伸7分鐘。
2.3.2引物通過生物信息學(xué)的檢索，分別選取了NRG1基因上的2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs3924999和rs2954041，具體資料見表1。
表1 2個(gè)SNPs引物的序列及相關(guān)信息

2.3.3PCR產(chǎn)物的全序列rs3924999參見(SEQ ID No 1)rs2954041參見(SEQ ID No 2)2.4多態(tài)性位點(diǎn)在基因上的位置rs3924999位于NRG1基因的第二外顯子第12位(G38A)，rs2954041位于第五內(nèi)含子，具體位置見圖1。
2.5限制性片段長度多態(tài)性分析2.5.1限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)取15μl PCR產(chǎn)物置于5μl內(nèi)切酶及酶切緩沖液體系中，于37℃溫箱過夜反應(yīng)。
2.5.2瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定取6-8μl酶切產(chǎn)物，用3％瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，經(jīng)凝膠成相系統(tǒng)掃描后讀取基因型。
結(jié)論如圖3所示，為3％瓊脂糖凝膠電泳后，多態(tài)性位點(diǎn)rs3924999位點(diǎn)的酶切圖，其中，1為100bp分子量標(biāo)準(zhǔn)(marker)，2為246/65/181雜合子，3為246純合子，4為65/181純合子。
如圖4所示，為3％瓊脂糖凝膠電泳后，多態(tài)性位點(diǎn)rs2954041的酶切圖，其中1為25bp marker，2為60/127純合子，3為30/31/60/126/127雜合子，4為30/31/126純合子。
2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析遺傳統(tǒng)計(jì)數(shù)理分析用傳遞不平衡檢驗(yàn)(the transmission disequilibrium test，TDT)分析所有精神分裂癥核心家系中等位基因與疾病的關(guān)系，分析過程與第一階段研究相同。在以連鎖不平衡為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)研究中，由于單體型比單個(gè)的SNP位點(diǎn)更精確，而且具有更高的統(tǒng)計(jì)效力，因此本發(fā)明用2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了單體型頻率的分析。單體型頻率采用TRANSMIT軟件(2.5.2)進(jìn)行分析。在多次統(tǒng)計(jì)分析后，用Bonferroni法進(jìn)行矯正。
結(jié)果1.三個(gè)SNPs基因型分布和等位基因頻率表2 NRG1基因2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布和等位基因頻率

2.三個(gè)SNPs的TDT檢驗(yàn)根據(jù)父母基因型在患病子女中的傳遞情況，在246個(gè)家系中進(jìn)行傳遞不平衡檢驗(yàn)(TDT)。如表3所示，經(jīng)過Bonferroni法矯正后，兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的TDT分析仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(rs3924999X2＝9.0905，P＝0.005168；rs2954041X2＝22.0458，P＝0.0006206)。
表3 NRG1基因的等位基因的傳遞不平衡檢驗(yàn)

3.NRG1基因的單體型分析單體型傳遞的總體檢驗(yàn)顯示NRG1基因與精神分裂癥有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)(X2＝33.651，自由度＝3，p＜0.000001)。單個(gè)單體型的分析也顯示在患者中AG單體型傳遞過多，差異有顯著性(X2＝26.114，自由度＝1，p＜0.00001)(見表4)。
表4 NRG1基因的單體型傳遞頻率分析

注GT為rs3924999的G+rs2954041的T；GG為rs3924999 G+rs2954041的G；AT為rs3924999的A+rs2954041的T；AG為rs3924999的A+rs2954041的G。
結(jié)論上述試驗(yàn)證明了NRG1基因序列的rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和/或rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)影響精神分裂癥的易感性，其中NRG1基因序列中rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和/或rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)為精神分裂癥易感基因。
實(shí)施例2檢測試驗(yàn)者精神分裂癥易感性的方法方法用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-based RFLP)分析方法檢測試驗(yàn)者2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs3924999、rs2954041的基因型。
主要方法如下1.血液標(biāo)本的采集及處理2.基因組DNA的提取及鑒定3.目的片段的擴(kuò)增4.限制性片段長度多態(tài)性分析具體方法參見實(shí)施例1的2.1-2.5。
其中rs3924999位點(diǎn)核苷酸為G，和/或rs2954041位點(diǎn)核苷酸為T的試驗(yàn)者，為精神分裂癥易感性高者。
實(shí)施例3體外檢測精神分裂癥易感基因的試劑盒1)引物擴(kuò)增rs3924999多態(tài)性的引物可以分別為AACTGGTTTCACACCGAAGGAC；(SEQ ID No 3)CCAAGATGAGATCCATTTTCGC；(SEQ ID No 4)擴(kuò)增rs2954041多態(tài)性的引物可以分別為TGACATTATTCATTGTTTGTTGCTGA；(SEQ ID No 5)GGATGCCATGGATATACTATGCAGA；(SEQ ID No 6)2)PCR擴(kuò)增酶，限制性內(nèi)切酶MunI和Tru1I，以及相應(yīng)緩沖液
3)dNTP4)所述多態(tài)性位點(diǎn)酶切圖譜

并說明使用方法如下包括1.血液標(biāo)本的采集及處理2.基因組DNA的提取及鑒定3.目的片段的擴(kuò)增4.限制性片段長度多態(tài)性分析具體方法參見實(shí)施例1方法2.1-2.5。
應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，但改動(dòng)或修改的等價(jià)形式同樣落在本申請權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)。
序列表<110>張岱北京大學(xué)精神衛(wèi)生研究所<120>精神分裂癥易感基因檢測方法及易感基因和用途<130>D0305022F<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>246<212>DNA<213>Homo sapiens(智人)<400>1ccaagatgag atccattttc gctcatccat tttgaaattg tttttctctc tgttaataaa60acctttggaa tggtgccttg atcaggctaa ctccagatta aatgtttctc tttgaaagat 120tgcctggtga tcagagttgt ttttcattct cttttcttct tttagccttg cctccccgat 180tgaaagagat gaaaagccag gaatcggctg caggttccaa actagtcctt cggtgtgaaa 240ccagtt 246<210>2<211>187<212>DNA<213>Homo sapiens(智人)<400>2tgacattatt cattgtttgt tgctgatgaa tgaaacctct tttcgagtgt gtgttccctt60taataggcac tggtaattta tgtactaaga tttatttctg tatggaaatt acaagtgaaa 120tttcatattg aatttatatt tagcctgttc tagtacatag tctctgcata gtatatccat 180ggcatcc 187<210>3<211>22<212>DNA<213>artificial(人工序列)
<220>
<223>引物<400>3aactggtttc acaccgaagg ac 22<210>4<211>22<212>DNA<213>artificial(人工序列)<220>
<223>引物<400>4ccaagatgag atccattttc gc 22<210>5<211>26<212>DNA<213>artificial(人工序列)<220>
<223>引物<400>5tgacattatt cattgtttgt tgctga 26<210>6<211>25<212>DNA<213>artificial(人工序列)<220>
<223>引物<400>6ggatgccatg gatatactat gcaga2權(quán)利要求
1.一種檢測精神分裂癥易感基因的方法，該方法為通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-直接測序法和/或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性分析方法體外檢測NRG1基因序列，其中有位于NRG1基因第二個(gè)外顯子第12位的rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和/或位于第五個(gè)內(nèi)含子的rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其為通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性分析方法，所述多態(tài)性分析方法包括A提取DNA，在rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和/或rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)；B針對上述多態(tài)性位點(diǎn)，利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；C凝膠電泳分離與鑒定酶切結(jié)果；其中，rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和/或rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)為精神分裂癥易感性等位基因。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測精神分裂癥易感基因的方法，所述方法進(jìn)一步包括在多態(tài)性分析之后，利用傳遞不平衡檢驗(yàn)分析NRG1基因的等位基因的傳遞頻率和單體型傳遞頻率，具有顯著性差異為精神分裂癥易感基因。
4.一種體外檢測試驗(yàn)者精神分裂癥遺傳易感性的方法，該方法包括檢測試驗(yàn)者NRG1基因序列rs3924999和/或rs2954041多態(tài)性，其中rs3924999位點(diǎn)傳遞G，和/或rs2954041位點(diǎn)傳遞T的試驗(yàn)者，為精神分裂癥易感性高者。
5.如權(quán)利要求4所述的體外檢測試驗(yàn)者精神分裂癥遺傳易感性的方法，其中檢測NRG1基因序列rs3924999和/或rs2954041多態(tài)性的方法為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-直接測序法和/或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性分析方法。
6.如權(quán)利要求5所述的體外檢測試驗(yàn)者精神分裂癥遺傳易感性的方法，其中檢測rs3924999和rs2954041多態(tài)性的方法，為通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性分析方法，所述多態(tài)性分析方法包括A提取DNA，在rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和/或rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)；B針對上述多態(tài)性位點(diǎn)，利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；C凝膠電泳分離與鑒定酶切結(jié)果。
7.一種用于檢測精神分裂癥易感性的試劑盒，其包括1)擴(kuò)增NRG1基因rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和/或rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)的引物；2)PCR擴(kuò)增酶，酶切多態(tài)性位點(diǎn)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，及相應(yīng)緩沖液；3)dNTP；4)所述多態(tài)性位點(diǎn)酶切圖譜。
8.如權(quán)利要求7所述的檢測精神分裂癥易感性的試劑盒，其包括1)引物擴(kuò)增rs3924999多態(tài)性的引物可以分別為AACTGGTTTCACACCGAAGGAC；(SEQ ID No 3)CCAAGATGAGATCCATTTTCGC；(SEQ ID No 4)；擴(kuò)增rs2954041多態(tài)性的引物可以分別為TGACATTATTCATTGTTTGTTGCTGA；(SEQ ID No 5)GGATGCCATGGATATACTATGCAGA；(SEQ ID No 6)；2)PCR擴(kuò)增酶和限制性內(nèi)切酶MunI和Tru1I，以及相應(yīng)緩沖液；3)dNTP；4)所述多態(tài)性位點(diǎn)酶切圖譜。
9.一種精神分裂癥易感基因，其為NRG1基因序列，并且有位于第二個(gè)外顯子第12位的rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)，和/或位于第五個(gè)內(nèi)含子的rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)。
10.如權(quán)利要求9所述的精神分裂癥易感基因，其為基因組DNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了精神分裂癥易感基因NRG1基因的檢測方法，體外檢測試驗(yàn)者精神分裂癥易感性的方法以及精神分裂癥易感基因NRG1基因和用途。本發(fā)明提供的檢測精神分裂癥易感基因的方法為通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－直接測序法和/或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－限制性片斷長度多態(tài)性分析方法體外檢測NRG1基因序列，其中有位于第二個(gè)外顯子第12位的rs3924999多態(tài)性位點(diǎn)和/或位于第五個(gè)內(nèi)含子的rs2954041多態(tài)性位點(diǎn)。本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域?qū)τ谡_識(shí)別精神分裂癥易感基因的需求，為精神分裂癥的深入研究和防治，甚至診斷治療提供了新的思路。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1548552SQ0313609
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月20日
發(fā)明者張岱, 楊建中, 張 岱 申請人:張岱, 北京大學(xué)精神衛(wèi)生研究所, 張 岱