專利名稱：高活性雞蛋清溶菌酶的簡(jiǎn)易提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高活性雞蛋清溶菌酶的簡(jiǎn)易純化、濃縮與干燥方法。
背景技術(shù)：
溶菌酶具有專一水解微生物細(xì)胞壁的作用，故能殺菌和破壁，因而廣泛用于食品工業(yè)的低度酒、香腸、糕點(diǎn)、面條、飲料、乳制品等的防腐；醫(yī)療保健方面的消炎藥、漱口液、牙膏；基因工程方面的質(zhì)粒、包含體、細(xì)胞的破壁作用；工業(yè)上酵母膏增產(chǎn)的酵母破壁等。溶菌酶的生產(chǎn)一般以雞蛋清為原料，提取的方法早有報(bào)道，主要有樹脂吸附、鹽析與結(jié)晶及超濾法。結(jié)晶純化法太費(fèi)時(shí)，且生產(chǎn)率較低。超濾純化濃縮法需要特殊設(shè)備，蛋清必需用磷酸鹽緩沖液(I＝0.2)稀釋10倍，蛋清蛋白質(zhì)難于回收利用。純化液常用冷凍干燥法，冷凍設(shè)備昂貴、耗電多。以上種種原因使高活性的溶菌酶生產(chǎn)成本高、而產(chǎn)品在國(guó)際上定價(jià)低、限制了溶菌酶的規(guī)模化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是研發(fā)一種提取高活性雞蛋清溶菌酶的簡(jiǎn)易方法。
蛋清溶菌酶粗制品或者鹽析物經(jīng)透析后的稀釋液調(diào)節(jié)pH值、加少量磷酸鹽再調(diào)節(jié)pH值、通過離心去除雜質(zhì)，純化液在40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮液于室溫下真空干燥。詳細(xì)操作程序見


。
該方法涉及的設(shè)備有離心機(jī)、攪拌器、pH試紙、透析袋、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、真空泵和724樹脂。試劑有硫酸銨、磷酸鹽緩沖液、鹽酸、氫氧化鈉。
利用本方法提取的高活性雞蛋清溶菌酶，其方法簡(jiǎn)便易行，產(chǎn)品質(zhì)量高，用途廣泛。

圖1高活性雞蛋清溶菌酶簡(jiǎn)易提取方法流程1中的1是新鮮雞蛋洗凈，取出蛋清(嚴(yán)防蛋黃混入)、冷藏；2是處理724樹脂先后分別用2mol/L鹽酸、氫氧化鈉浸泡樹脂2小時(shí)，分別用去離子水洗至近中性，再用0.15mol/L、pH6.5的磷酸鹽緩沖液浸泡過夜，濾后備用；3是冷藏的蛋清加入處理好的724樹脂(按每公斤蛋清加處理之前的樹脂160克)，大力攪拌(冰浴中)吸附6小時(shí)，4℃靜置待分層；4是離心(3000rpm，15min)，收集樹脂，回收蛋清供食用；5是洗去雜蛋白樹脂先用蒸餾水洗至洗液無渾濁，再用等體積的0.15mol/L、pH6.5的磷酸鹽緩沖液攪拌洗滌20min(冰浴下)，再重復(fù)兩次；6是洗脫溶菌酶樹脂用等體積10％的硫酸銨浸泡10min，攪拌30min，洗脫液經(jīng)尼龍布過濾，準(zhǔn)確量取體積。樹脂再重復(fù)洗脫兩次，合并洗脫液；7是鹽析每83ml洗脫液在攪拌下緩慢加入32克固體硫酸銨，待硫酸銨完全溶解后、4℃放置過夜，離心(3000rpm，15min)收集沉淀；8是透析將鹽析沉淀裝入透析袋，用去離子水透析24h，其間換兩次去離子水；9是去雜質(zhì)取出透析液，用2mol/L鹽酸調(diào)整pH值4-5，離心，收集上清液。其沉淀加少量蒸餾水，再重復(fù)處理兩次。上清液合并、調(diào)pH＝5.5，再加入1mol/L磷酸氫二鈉～磷酸二氫鉀緩沖液(pH＝5.5)達(dá)終濃度為10mmol/L，靜置10min、離心、棄沉淀，收集上清純化液；10是濃縮與干燥純化液在(40±2)℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，變濁時(shí)倒出、冷凍。25℃以下真空干燥，獲得淡黃色產(chǎn)品。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例蛋清1178克，按比例加處理好的724樹脂、攪拌(冰浴中)吸附6小時(shí)。離心、收集樹脂，用水和磷酸鹽緩沖液分別洗去雜蛋白，再用等體積10％的硫酸銨浸泡、攪拌洗脫。三次洗脫液的總體積約820ml。每83ml洗脫液加32克研細(xì)的硫酸銨攪拌至完全溶解，靜置分層后，離心，收集鹽析沉淀。沉淀對(duì)水透析，透析后調(diào)整pH4-5、離心、棄褐色沉淀。其上請(qǐng)液(約40ml)調(diào)整pH＝5.5、再加1mol/L磷酸氫二鈉～磷酸二氫鉀緩沖液(pH＝5.5)達(dá)終濃度為10mmol/L(約0.4ml)，靜置10分鐘，離心、棄沉淀。其純化液在(40±2)℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，變濁時(shí)倒出，冷凍后25℃以下真空干燥。獲產(chǎn)品為淡黃色大顆粒結(jié)晶0.7248克，其產(chǎn)品活性范圍13539U/mg～15741U/mg?；厥盏牡扒蹇芍苯邮秤茫姿猁}、硫酸銨及蛋白質(zhì)廢水液可回收作肥料。724樹脂經(jīng)酸、堿處理，可反復(fù)利用。這樣除可大大降低成本，實(shí)現(xiàn)蛋清的綜合應(yīng)用之外，主要是使溶菌酶的生產(chǎn)效率較傳統(tǒng)方法可提高近20倍，效益顯著。
權(quán)利要求
1.一種高活性雞蛋清溶菌酶簡(jiǎn)易提取方法，其特征在于在生產(chǎn)程序中對(duì)取出的透析液用鹽酸調(diào)整的pH值為4-5，上清液合并后再調(diào)pH值為5.5，再在45℃左右下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，在室溫下真空干燥獲得淡黃色產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及雞蛋清溶菌酶高活性的簡(jiǎn)易純化、濃縮與干燥方法。蛋清溶菌酶被樹脂吸附、洗脫、硫酸銨鹽析、透析，再用創(chuàng)新技術(shù)調(diào)整透析液pH值、離心，收集上清液。其沉淀加少量蒸餾水、重復(fù)處理兩次后棄褐色不容物，合并上清液、調(diào)pH＝5.5，加入1mol/L、pH＝5.5的磷酸鹽緩沖液、達(dá)終濃度為10mmol/L，靜置片刻、離心，收集純化液，于40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮液冰凍后室溫真空干燥。產(chǎn)品呈淡黃色、活性范圍13539U/mg～15741U/mg，與超濾濃縮、冷凍干燥產(chǎn)品(14610U/mg)基本一致。其產(chǎn)率(0.7248g/kg蛋清)比文獻(xiàn)報(bào)道的工藝(樹脂吸附→洗脫→硫酸銨鹽析→透析→結(jié)晶純化→丙酮濃縮蒸發(fā)干燥)產(chǎn)率(0.0367g/kg蛋清)高19.75倍。生產(chǎn)成本低，效果顯著。
文檔編號(hào)C12N9/36GK1492041SQ0313904
公開日2004年4月28日 申請(qǐng)日期2003年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月12日
發(fā)明者楊景芝, 孫衍華, 張杰道, 白吉?jiǎng)? 楊國(guó)棟, 李菡 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)