專利名稱：一種快速測定糖化酶活力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)分析方法，具體地說是關(guān)于快速測定糖化酶活力的方法。
背景技術(shù)：
糖化酶廣泛應(yīng)用于發(fā)酵酒類、酶法生產(chǎn)葡萄糖、果萄糖漿、谷氨酸、檸檬酸、抗生素等行業(yè)。在糖化酶的生產(chǎn)和應(yīng)用過程中都需要測定糖化酶的活力，對糖化酶活力的快速測定，可以真正了解糖化酶生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)及糖化酶應(yīng)用過程中酶活力的變化情況，及時(shí)指導(dǎo)生產(chǎn)。目前，國內(nèi)外糖化酶活力的測定方法有多種，我國國家標(biāo)準(zhǔn)測定糖化酶活力[1]和萃取化學(xué)公司法[2]相仿，是采用硫代硫酸鹽滴定法，測定的是還原糖而不是葡萄糖，測定一個樣品約一個小時(shí)。諾沃法[3]采用溶液酶法，需要消耗試劑酶，測定的是葡萄糖，需要將酶和底物在25℃下精確地保溫30分鐘。YSI公司[4]采用酶電極法測定糖化酶活力。他們的方法是用已知濃度的葡萄糖溶液作標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)酶反應(yīng)在單位時(shí)間產(chǎn)生的葡萄糖量來計(jì)算酶活單位，測定時(shí)間約4分鐘，結(jié)果的讀出很麻煩，需要目測比較二個顯示數(shù)的差值，然后通過計(jì)算得到糖化酶的活力單位。嚴(yán)格地說，它僅僅是利用葡萄糖分析儀的功能來測定糖化酶，不是一種專用的糖化酶分析儀。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是根據(jù)這一反應(yīng)過程，在葡萄糖氧化酶活力不變，并且糊精過量的條件下，一定時(shí)間內(nèi)H2O2的生成量與糖化酶的活力成正比，利用這一原理，由過氧化氫電極檢測相應(yīng)的信號，經(jīng)系統(tǒng)處理后，在屏幕上以數(shù)字直接顯示糖化酶活力，并自動打印測定結(jié)果。
本發(fā)明快速測定糖化酶活力的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的測定系統(tǒng)反應(yīng)池腔的側(cè)面裝有過氧化氫電極，電極表面為固定化的葡萄糖氧化酶膜圈，反應(yīng)池還設(shè)有攪拌子和電磁攪拌器，底物和糖化酶通過進(jìn)樣口加入，由光控進(jìn)樣傳感器檢測加樣動作，控制測定程序的運(yùn)行，系統(tǒng)清洗時(shí)緩沖液通過緩沖液泵進(jìn)入反應(yīng)池腔，多余液體通過錐形溢流帽流入廢液腔并經(jīng)廢液泵排出(附圖1)；測定系統(tǒng)的二次儀表(附圖2)是用單片機(jī)作中央控制器，控制采樣、信號放大、A/D轉(zhuǎn)換、清洗、攪拌、數(shù)據(jù)貯存和結(jié)果打印等功能。通過測定已知活力的葡萄糖糖化酶標(biāo)樣，獲得每個酶活力單位相對應(yīng)的H2O2電極電流，并以此作標(biāo)定參數(shù)，以稀釋一倍的標(biāo)樣對酶反應(yīng)的米氏響應(yīng)曲線作線性校正，在測定過程中通過運(yùn)算，在顯示屏上直接顯示糖化酶的活力單位。
程序的工作流程如附圖3所示。


圖1、快速測定糖化酶活力的一次儀表2、快速測定糖化酶活力的二次儀表組成示意3、快速測定糖化酶活力程序4、PH對糖化酶活力測定的影響圖5、酶反應(yīng)動力學(xué)過程中1.進(jìn)樣口 2.光控進(jìn)樣傳感器 3.廢液腔 4.反應(yīng)池腔5.葡萄糖酶膜 6.過氧化氫電極 7.電極緊固帽 8.有機(jī)玻璃反應(yīng)池體9.反應(yīng)池?cái)嚢枳? 10.磁力攪拌器 11.緩沖液泵 12.廢液泵13.廢液出口 14.緩沖液入口 15.錐形溢流帽
具體實(shí)施例方式測定方法儀器開機(jī)后，調(diào)整儀器進(jìn)入正常工作狀態(tài)，將定量的葡萄糖糖化酶樣品和底物糊精注入反應(yīng)池，系統(tǒng)將按設(shè)定的程序自動記錄反應(yīng)起點(diǎn)到反應(yīng)終點(diǎn)的酶反應(yīng)產(chǎn)生的電極電流的變化量并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，顯示出測定樣品的酶活力單位，打印測定結(jié)果，反應(yīng)的起點(diǎn)和終點(diǎn)可根據(jù)需要設(shè)定。測定時(shí)首先用已知活性單位的糖化酶溶液對系統(tǒng)進(jìn)行定標(biāo)和線性校正，然后將待測樣品稀釋后測定，系統(tǒng)顯示數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)即為被測定樣品中的糖化酶活性單位。
試劑材料葡萄糖氧化酶膜圈采用美國Sigma公司的葡萄糖氧化酶，經(jīng)生物技術(shù)加工成固定化制成[5]。一個酶膜圈可以工作1000次以上，或連續(xù)使用一個多月不用更換；糊精浙江菱糊淀粉廠出品；葡萄糖糖化酶江陰星達(dá)生物工程有限公司出品的液體酶；緩沖溶液100mM磷酸緩沖液，pH6.0；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，山東省科學(xué)院生物研究所出品。其它藥品均為分析純。
最適pH實(shí)驗(yàn)不同pH的測定環(huán)境對葡萄糖糖化酶的活性測定的影響見附圖4，本實(shí)驗(yàn)選用0.2mM的磷酸鹽緩沖液。結(jié)果表明pH5.5時(shí)的測定值最高。但是考慮到葡萄氧化酶膜的穩(wěn)定性和使用壽命，本測定系統(tǒng)選用pH6.0的緩沖液。
酶反應(yīng)的動力學(xué)過程及測定參數(shù)的選擇將不同活性單位的糖化酶樣品分別注入反應(yīng)池，記錄酶反應(yīng)過程中的數(shù)字增加量，反應(yīng)時(shí)間180秒，每20秒讀數(shù)、記錄，計(jì)算出每20秒的增加數(shù)值結(jié)果如圖5，圖中測定1-6的糖化酶活性依次分別為500、400、300、200、100、50u./mL從圖5可以看出不同活性單位的糖化酶樣品，在一定的時(shí)間內(nèi)的變化量不同。酶活性越高，變化速度越快，20秒內(nèi)顯示值增加越大，但是在20秒到140秒之間不同活性單位的糖化酶的反應(yīng)速度基本是穩(wěn)定的，因此，從進(jìn)樣20秒開始到140秒之間采樣比較合適。
樣品和底物中的游離葡萄糖對糖化酶活性單位測定的影響預(yù)加20uL500umL的糖化酶，再加5uL5％的糊精，以此測定結(jié)果定標(biāo)為500，進(jìn)行下述測定測定1預(yù)加20uL 500u/mL的糖化酶和10uL濃度為100mg/mL的葡萄糖后，再加5uL5％的糊精；測定2預(yù)加20uL 500u/mL的糖化酶和20uL濃度為100mg/mL的葡萄糖后，再加5uL5％的糊精測定3預(yù)加5uL 5％的糊精后，再加20uL 500u/mL的糖化酶和10uL濃度為100mg/mL的葡萄糖；測定4預(yù)加5uL5％的糊精后，再加20uL 500u/mL的糖化酶和20uL濃度為100mg/mL的葡萄糖，結(jié)果如表1所示。
表1、葡萄糖對測定結(jié)果的影響時(shí)間 20304050 60 70 80 100120140對照 285586112163218268318415500測定1305685112163218268314423501測定2305280122170214262316411499測定3255378106162215265311412501測定4255585108165213268318410500從上述結(jié)果看出采用本測定系統(tǒng)設(shè)計(jì)的測定程序測定糖化酶的活性單位時(shí)，樣品和底物中所含的葡萄糖對糖化酶活性的測定結(jié)果不會產(chǎn)生干擾。
穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)連續(xù)10次將100u/mL的糖化酶樣品注入反應(yīng)池，結(jié)果如表2所示表2連續(xù)進(jìn)樣10次的測定結(jié)果樣品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10結(jié)果 10010110199100100101 101 100 100對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理N＝10， X＝100.3S＝0.675CV＝0.67％結(jié)果證明，本測定系統(tǒng)對同一樣品具有良好的穩(wěn)定性。
線性實(shí)驗(yàn)依次取不同活性單位的糖化酶樣品測定，結(jié)果如表3表3線性實(shí)驗(yàn)進(jìn)樣量(u/mL) 100120150200300375500線性標(biāo)準(zhǔn)誤差結(jié)果1(u/mL)1031201512013013735001.344％結(jié)果2(u/mL)1161411682213203875024.645％測定結(jié)果1是先將儀器定標(biāo)為500后，將測定系統(tǒng)進(jìn)行了米氏校正后得到的測定結(jié)果2是定標(biāo)為500后，測定系統(tǒng)沒執(zhí)行米氏校正得到的。
結(jié)果表明用本系統(tǒng)測定糖化酶時(shí)，先進(jìn)行米氏校正后，進(jìn)樣量在100-500u/mL之間的不同酶量表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，計(jì)算得到線性標(biāo)準(zhǔn)誤差為1.344％；而不進(jìn)行米氏校正測得的結(jié)果的線性標(biāo)準(zhǔn)誤差為4.645％。
回收實(shí)驗(yàn)將樣品中加入一定量的已知活力糖化酶，作回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。
表4回收率實(shí)驗(yàn)樣品酶量加入酶量 測得酶量回收率樣品(u/mL) (u/mL)(u/mL) (u/mL)1 100 50.3 151.0 101.42 100 99.7 201.0 101.33 100 149.8 248.5 99.14 100 199.4 299.0 99.85 100 251.8 345.0 97.36 100 149.8 246.2 97.67 100199.4 295.0 97.88 100 251.8 351.5 99.9結(jié)果表明，回收率在97.6％～101.4％之間，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.68％。
測定有關(guān)糖化酶的樣品，并同碘量法進(jìn)行比較對結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果如下t＝1.652 t0.05(11)＝2.201t＜t0.05(11) p＞0.01傳統(tǒng)的糖化酶測定方法中是根據(jù)還原糖測定的原理來計(jì)算糖化酶反應(yīng)產(chǎn)生的葡萄糖，在實(shí)際分析中可能會有一定的誤差，不能真實(shí)反映糖化酶的活性單位和糖化酶的質(zhì)量，而且該方法測定時(shí)間過長，操作比較繁瑣，人為誤差大。本發(fā)明建立的方法快速、準(zhǔn)確，操作簡單，直接測定葡萄糖的產(chǎn)生量來表示糖化酶活性單位，專一性好，結(jié)果可靠。
參考文獻(xiàn)[1]天津輕工學(xué)院等主編工業(yè)發(fā)酵分析，輕工業(yè)出版社，1991，北京。
Betriebsinterne Mitteilung der Fa.Amano，Nagya[3]Betriebsinterne Mitteilung der Fa.Novo，Kpenhagen，Danemark[4]Yellow Spring Instrument Co.，Inc.U.S.A.Application NoteNo.114[5]馮德榮等，山東科學(xué)1990，3(3)1-權(quán)利要求
1.一種快速測定糖化酶活力的方法，其特征在于根據(jù) 這一反應(yīng)過程，在葡萄糖氧化酶活力不變，并且糊精過量的條件下，一定時(shí)間內(nèi)H2O2的生成量與糖化酶的活力成正比，利用這一原理，設(shè)定的測定系統(tǒng)中反應(yīng)池腔(4)側(cè)面裝有過氧化氫電極(6)，電極表面為固定化的葡萄糖氧化酶膜圈(5)，反應(yīng)池腔(4)中有攪拌子(9)通過磁力攪拌器(10)使參與反應(yīng)的糊精和糖化酶充分混勻，糊精底物和糖化酶通過進(jìn)樣口(1)加入到反應(yīng)池內(nèi)，光控進(jìn)樣傳感器(2)檢測到底物和糖化酶的加入，控制測定程序運(yùn)行，反應(yīng)結(jié)束后儀器自動完成清洗，緩沖液從緩沖液入口(14)通過連接管道，經(jīng)緩沖液泵(11)進(jìn)入反應(yīng)池腔(4)，多余液體從錐形溢流帽(15)排出進(jìn)入廢液腔(3)，最后通過廢液泵(12)經(jīng)廢液出口(13)排出；測定系統(tǒng)的二次儀表是用單片機(jī)作中央控制器，控制采樣、信號放大、A/D轉(zhuǎn)換、清洗、攪拌、數(shù)據(jù)貯存和結(jié)果打印等功能；系統(tǒng)通過測定H2O2電極對已知活力的葡萄糖糖化酶的響應(yīng)電流進(jìn)行定標(biāo)和線性校正，在測定糖化酶樣品時(shí)通過校正運(yùn)算，直接得到樣品的糖化酶活力單位。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速測定糖化酶活力的方法，該方法根據(jù)酶促反應(yīng)生成過氧化氫量與糖化酶作用于糊精產(chǎn)生的葡萄糖量成正比這一原理，設(shè)計(jì)的測定系統(tǒng)的反應(yīng)池腔側(cè)面裝有過氧化氫電極，電極表面為固定化的葡萄糖氧化酶膜，反應(yīng)池腔設(shè)有電磁攪拌器，底物和樣品通過進(jìn)樣口加入，光控進(jìn)樣傳感器檢測加樣動作，緩沖液通過緩沖液泵進(jìn)入反應(yīng)池腔，通過錐形溢流帽流入廢液腔并經(jīng)廢液泵排出；測定系統(tǒng)的二次儀表具有信號采集與放大、A/D轉(zhuǎn)換、清洗、攪拌、數(shù)據(jù)貯存和結(jié)果打印等功能，通過定標(biāo)和線性校正操作，儀器可直接得到糖化酶的活力單位。本發(fā)明建立的方法專一性好、結(jié)果可靠、操作簡單，在3分鐘之內(nèi)即可完成測定，用于生產(chǎn)過程的監(jiān)控十分有效。
文檔編號C12Q1/25GK1524965SQ03139048
公開日2004年9月1日 申請日期2003年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月16日
發(fā)明者馮德榮, 朱思榮, 周萬里, 馮東 申請人:山東省科學(xué)院生物研究所