專利名稱：非典型肺炎冠狀病毒的基因檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及非典型肺炎冠狀病毒的基因檢測(cè)方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
2003年我國(guó)和世界上許多國(guó)家遭到了一次大規(guī)模的非典型肺炎(Atypicalpneumonias)的侵襲，由非典型肺炎引起的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe AcuteRespiratory Sydrome，SARS)已經(jīng)在22個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生。世界衛(wèi)生組織(WorldHealth Organization，WHO)在疫情發(fā)生后迅速建立起由全球10個(gè)國(guó)家的13個(gè)實(shí)驗(yàn)室組成的協(xié)作研究和監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)。4月16日，WHO正式確認(rèn)SARS的病原體是一種新型冠狀病毒，這是一種單鏈RNA病毒。
全球已有8000多例非典型肺炎患者，在某些發(fā)病區(qū)其死亡率達(dá)到15％，給人民群眾帶來了極大的恐慌。及時(shí)開展SARS冠狀病毒的病原學(xué)以及預(yù)防、診斷和治療的研究，加強(qiáng)控制和治療措施、對(duì)患者和疑似病例做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離和早治療，是控制疫情繼續(xù)發(fā)生和傳播的關(guān)鍵。
人體感染SARS病毒后，經(jīng)過一定時(shí)間后能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，可以通過抗原-抗體反應(yīng)來檢測(cè)血清中的抗體。用免疫熒光試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法可以檢測(cè)針對(duì)SARS病毒的特異性抗體。但是這種抗體出現(xiàn)較晚，一般要到感染后20天左右，不利于病毒感染的早期診斷。
診斷SARS最直接的方法是檢測(cè)病人體內(nèi)的病原體，可以利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)來檢測(cè)病毒的遺傳物質(zhì)。逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)首先將標(biāo)本中少量的SARS病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，再通過基因擴(kuò)增將核酸放大幾百萬(wàn)倍，可通過電泳或熒光定量檢測(cè)，應(yīng)用于在感染早期(10天內(nèi))檢測(cè)人體呼吸道分泌物、血液、血清、尿液、糞便或死亡患者尸體解剖樣品中SARS病毒的核酸，具有簡(jiǎn)便快速、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。
然而，由于在獲取的生物樣品中，SARS病毒的含量非常少，而且血液、糞便、呼吸分泌物等待測(cè)樣品還含有大量其他的核酸物質(zhì)。因此，這給有效擴(kuò)增SARS特異性產(chǎn)物帶來了極大的困難，在實(shí)驗(yàn)中往往造成假陰性的結(jié)果。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)SARS病毒的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)SARS病毒的新方法和相關(guān)試劑盒。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種標(biāo)本中SARS病毒的濃縮方法，更佳地用PEG進(jìn)行濃縮。例如用分子量為5000-25000道爾頓，如6000、8000、20000的PEG進(jìn)行濃縮，尤其是分子量為20000的PEG進(jìn)行濃縮。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種非典型肺炎冠狀病毒特異性擴(kuò)增的方法，它包括如下步驟(a)抽提樣品中的病毒RNA；(b)用SEQ ID NO1和2所示的特異性引物和步驟(a)中的核酸，在特異性擴(kuò)增條件下進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種對(duì)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的方法，它包括如下步驟(c)對(duì)步驟(b)的產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量檢測(cè)；(d)對(duì)部分熒光定量檢測(cè)結(jié)果為陰性的步驟(b)的擴(kuò)增產(chǎn)物，用SEQ IDNO3和4所示的特異性引物，在特定擴(kuò)增條件下進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增；(e)對(duì)步驟(d)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，顯示有特異性條帶就表示樣品中存在非典型肺炎冠狀病毒。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種檢測(cè)非典型肺炎冠狀病毒的試劑盒，它含有濃縮標(biāo)本的試劑、SEQ ID NO1和2所示核苷酸序列的引物、SEQID NO5所示核苷酸序列的Taqman探針。所述的試劑盒還含有制備模板所需的試劑、進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有SEQ ID NO3和4所示的核苷酸序列的巢式PCR引物。


圖1顯示了實(shí)施例3中各標(biāo)本的熒光定量PCR曲線。
圖2顯示了電泳檢測(cè)圖。其中泳道1為陰性對(duì)照；泳道2為陽(yáng)性對(duì)照；泳道3、4均為第5號(hào)標(biāo)本；泳道5為分子量標(biāo)準(zhǔn)物。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，首先利用PEG沉淀法濃縮標(biāo)本中的病毒，設(shè)計(jì)合成了SARS特異性引物，通過熒光定量RT-PCR，結(jié)合巢式PCR，實(shí)現(xiàn)了SARS病毒的快速、準(zhǔn)確的早期檢測(cè)，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
具體地，本發(fā)明人根據(jù)香港、廣州、北京、多倫多等不同地區(qū)所分離的冠狀病毒株的基因組序列，選擇了CUHK-W1株P(guān)基因(編碼病毒的聚合酶蛋白)18138bp-18294bp的157個(gè)堿基作為靶核苷酸，其序列如下所示atgaattacc aagtcaatgg ttaccctaat atgtttatca cccgcgaaga agctattcgt60cacgttcgtg cgtggattgg ctttgatgta gagggctgtc atgcaactag agatgctgtg120ggtactaacc tacctctcca gctaggattt tctacag 157(SEQ ID NO6)對(duì)以上157個(gè)堿基在Genebank中Blast的結(jié)果可知，該靶序列保守性很高，除廣州株有一個(gè)堿基的差異外，其它序列均為同源。
根據(jù)SEQID NO6所示的序列，本發(fā)明設(shè)計(jì)和合成了以下RT-PCR的引物SARS-Fs5′-ATG AAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC-3′(SEQ ID NO1)SARS-Fas5′-CTG TAG AAA ATC CTA GCT GGA G-3′(SEQ ID NO2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)，它利用了Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個(gè)熒光標(biāo)記探針，可對(duì)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。一種優(yōu)選的TaqMan探針的序列如下5′-FAM-TCG TGC GTG GAT TGG CTT TGA TGT-TAMRA-3′(SEQ ID NO5)其中，熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)可采用本領(lǐng)域常用的種類，例如熒光發(fā)射基團(tuán)可采用6-羧基熒光素(FAM)，而熒光淬滅基團(tuán)可采用6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)。
對(duì)于熒光定量檢測(cè)結(jié)果為陰性的可疑樣品，可以將熒光RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二次擴(kuò)增。在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，它可以有效提高檢測(cè)的靈敏度。
在本發(fā)明中，非典型肺炎冠狀病毒特異性巢式引物的序列對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO6所示的核苷酸序列，且長(zhǎng)度為18-30bp(較佳地19-25bp)。一種優(yōu)選的巢式PCR的引物如下SARS-ins5-GAA GCT ATT CGT CAC GTT CG-3(SEQ ID NO3)SARS-Fas5-CTG TAG AAA ATC CTA GCT GGA G-3(SEQ ID NO4)當(dāng)使用SEQ ID NO3和4所示的巢式引物時(shí)，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在109bp處有特異性條帶的標(biāo)本可判為陽(yáng)性結(jié)果，否則判為陰性結(jié)果。采用上述方法有利于非典型肺炎SARS冠狀病毒的早期診斷。檢測(cè)快速，一般4小時(shí)可得結(jié)果。
在本發(fā)明方法中，對(duì)PCR擴(kuò)增條件并沒有特別的限制，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的特異性PCR擴(kuò)增條件。
在本發(fā)明方法中，RNA的提取是非常重要的。由于某些樣品中所含病毒數(shù)量較少，在PCR檢測(cè)中容易引起假陰性。一種優(yōu)選的方法是用PEG沉淀RNA的方法來富集樣品中的冠狀病毒。樣品沉淀物經(jīng)RNA抽提后，在特異性引物、SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA Taq酶、熒光標(biāo)記探針等的作用下進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增。
本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)非典型肺炎冠狀病毒的試劑盒，它含有濃縮標(biāo)本的試劑、SEQ ID NO1和2所示核苷酸序列的引物、SEQ ID NO5所示核苷酸序列的Taqman探針。所述的試劑盒還含有制備模板所需的試劑、進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑。
如本文所用，“制備模板所需的試劑”指將檢測(cè)樣本中的RNA提取純化過程所用的試劑。例如Qiagen公司病毒RNA抽提試劑。
如本文所用，“進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑”指將模板中的極微量非典型肺炎冠狀病毒基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)過程所用的試劑，其中包括例如dNTP、耐高溫DNA多聚酶、Mg2+、特異性引物、和緩沖液等。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行PEG濃縮處理，增加了標(biāo)本中病毒的數(shù)量。
(b)產(chǎn)物檢測(cè)采用熒光定量法，并與巢式PCR結(jié)合，提高了檢測(cè)靈敏度。
熒光定量靈敏度103拷貝/ml；巢式PCR靈敏度102拷貝/ml。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1樣本的濃縮取20％PEG溶液170ul加入1.5ml的離心管內(nèi)，加入樣本500ul，再加入10.2ul濃度為20％的硫酸，振蕩混勻5s；4℃放置過夜，4℃離心17860g，20min；棄去上清液，4℃離心17860g，1min。用可調(diào)移液器小心吸去多余的上清液，沉淀用于樣本抽提。
實(shí)施例2樣本抽提采用Qiagen公司病毒RNA抽提試劑盒，按制造商提供的說明書操作。
實(shí)施例3熒光RT-PCR擴(kuò)增引物采用SARS-Fs5-ATG，AAT，TAC，CAA，GTC，AAT，GGT，TAC-3(SEQ ID NO1)SARS-Fas5-CTG，TAG，AAA，ATC，CTA，GCT，GGA，G-3(SEQ ID NO2)TaqMan探針采用5′-FAM-TCG，TGC，GTG，GAT，TGG，CTT，TGA，TGT-TAMRA-3′(SEQ ID NO5)RT-PCR擴(kuò)增試劑RT-PCR主反應(yīng)液(含引物、dNTP/dUTP、探針、Mg2+等)RT-PCR酶混合液(含Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶和RNA酶抑制劑的溶液)尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)操作將33.8ul RT-PCR主反應(yīng)液融化、混勻后簡(jiǎn)短離心，與0.8ulRT-PCR酶混合液、0.4ul UNG充分混合，在反應(yīng)管中分別加入已處理好的樣品濾液和工作標(biāo)準(zhǔn)品，蓋上蓋子，離心數(shù)秒后放入iCycler(Roche公司)中進(jìn)行擴(kuò)增。
結(jié)果獲取選擇熒光基團(tuán)FAM-490，獲取熒光結(jié)果，如圖1和表1所示。
表1熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

Ct值循環(huán)閾值N/A未檢測(cè)到信號(hào)+判斷結(jié)果為陽(yáng)性-判斷結(jié)果為陰性標(biāo)本設(shè)置1為RNA陽(yáng)性參考品；2為正常人的陰性血清；3、4為上海2例臨床確證的SARS患者的血清。標(biāo)本號(hào)5為某SARS可疑病人的血清。
該結(jié)果表明，3、4號(hào)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，5號(hào)標(biāo)本熒光定量檢測(cè)結(jié)果雖然為N/A，但是結(jié)合其熒光定量檢測(cè)曲線，結(jié)果可疑。
實(shí)施例4巢式PCR對(duì)于實(shí)施例3中熒光定量檢測(cè)結(jié)果為陰性的可疑樣品，可以將熒光PCR產(chǎn)物進(jìn)行巢式PCR，巢式PCR的引物采用SARS-ins5-GAA GCT ATT CGT CAC GTT CG-3(SEQ ID NO3)SARS-Fas5-CTG TAG AAA ATC CTA GCT GGA G-3(SEQ ID NO4)PCR擴(kuò)增試劑2ndPCR Taq聚合酶2ndPCR反應(yīng)液(含引物、dNTP/dUTP、Mg2+等)UNG操作將27.4ul 2ndPCR反應(yīng)液融化，混勻后簡(jiǎn)短離心，與0.3ul 2ndPCR Taq聚合酶、0.3ul UNG充分混合，在反應(yīng)管中加入可疑的熒光PCR產(chǎn)物2ul，放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。
結(jié)果如圖2所示，5號(hào)標(biāo)本在109bp處有特異性條帶，為SARS陽(yáng)性。
實(shí)施例5非典型肺炎冠狀病毒檢測(cè)試劑盒為方便上述PCR檢測(cè)，特制成一種非典型肺炎冠狀病毒的基因檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含下列試劑(1)樣品病毒富集試劑20％PEG溶液(溶于0.9％NaCl溶液)(2)病毒RNA抽提試劑盒(Qiagen公司)(3)RT-PCR試劑RT-PCR主反應(yīng)液1×緩沖液2.5mM MgCl20.2uM引物SARS-Fs(SEQ ID NO1)0.2uM引物SARS-Fas(SEQ ID NO2)0.2mM dNTP0.2mM dUTP0.1uM探針RT-PCR酶混合液2U/ul Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶0.05U/ul Taq DNA聚合酶0.01U/ul UNG(4)巢式PCR試劑反應(yīng)液1×緩沖液2.5mM MgCl20.2uM引物SARS-ins(SEQ ID NO3)0.2uM引物SARS-Fas(SEQ ID NO4)0.2mM dNTP
0.2mM dUTP0.05U/ul 2ndPCR Taq聚合酶0.01U/ul UNG(5)電泳試劑50×電泳緩沖液溴酚藍(lán)緩沖液2％凝膠溴乙錠陽(yáng)性參照物。
實(shí)施例6濃縮對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響用不同分子量的PEG，按照實(shí)施例1的方法對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行濃縮。并按實(shí)施例2-4的方法進(jìn)行RNA抽提、熒光RT-PCR擴(kuò)增。與未經(jīng)過濃縮處理，但同樣進(jìn)行抽提、熒光RT-PCR擴(kuò)增的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。
結(jié)果如下表所示

其中，標(biāo)準(zhǔn)品1、標(biāo)準(zhǔn)品2、標(biāo)準(zhǔn)品3用于確定標(biāo)準(zhǔn)曲線。未經(jīng)濃縮處理的樣品原液的測(cè)定值為4.27×102拷貝/ml，而用PEG20000、PEG8000和PEG6000濃縮處理后，測(cè)定值提高到2.07×105、4.81×104、和5.80×104拷貝/ml，其中尤其以PEG20000的濃縮效果最佳。
應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海復(fù)旦悅達(dá)生物技術(shù)有限公司<120>非典型肺炎冠狀病毒的基因檢測(cè)方法及試劑盒<130>033384<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>引物<400>1atgaattacc aagtcaatgg ttac 24<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>引物<400>2ctgtagaaaa tcctagctgg ag 22<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)
<223>引物<400>3gaagctattc gtcacgttcg 20<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(23)<223>引物<400>4ctgtagaaaa tcctagctgg ag 22<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>探針<400>5tcgtgcgtgg attggctttg atgt 24<210>6<211>157<212>DNA<213>非典型肺炎病毒(SARS virus)<400>6atgaattacc aagtcaatgg ttaccctaat atgtttatca cccgcgaaga agctattcgt 60cacgttcgtg cgtggattgg ctttgatgta gagggctgtc atgcaactag agatgctgtg 120ggtactaacc tacctctcca gctaggattt tctacag 15權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)樣品中是否存在非典型肺炎冠狀病毒的方法，其特征在于，包括步驟(a)應(yīng)用PEG沉淀法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行濃縮；(b)抽提樣品中的病毒RNA，用特異性引物在特定的擴(kuò)增條件下進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增；(c)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，對(duì)部分熒光定量檢測(cè)結(jié)果為陰性的可疑標(biāo)本，用特異性巢式引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增；(d)對(duì)步驟(c)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，存在特異性擴(kuò)增產(chǎn)物就表示樣品中存在非典型肺炎冠狀病毒。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光RT-PCR的引物具有SEQID NO1和2所示的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的巢式引物具有SEQ ID NO3和4所示的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，PEG沉淀法中使用分子量為5000-25000的PEG。
5.一種檢測(cè)非典型肺炎冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，它含有SEQ ID NO1和2所示核苷酸序列的引物。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，還含有SEQ ID NO3和4所示核苷酸序列的巢式引物。
7.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，還含有制備模板所需的試劑、進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑。
8.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，還含有SEQ ID NO5所示核苷酸序列的Taqman探針。
9.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，還含有濃縮標(biāo)本病毒的PEG試劑。
10.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述PEG的分子量為5000-25000。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于非典型肺炎冠狀病毒基因檢測(cè)的標(biāo)本濃縮、RT－PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測(cè)的方法及試劑盒。該方法包括(a)應(yīng)用PEG沉淀法濃縮標(biāo)本；(b)抽提樣品中的病毒RNA，用特異性引物進(jìn)行熒光RT－PCR擴(kuò)增；(c)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，部分熒光定量檢測(cè)結(jié)果為陰性的可疑標(biāo)本，用特異性巢式引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增；(d)對(duì)步驟(c)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，存在特異性擴(kuò)增產(chǎn)物就表示樣品中存在SARS冠狀病毒。本發(fā)明方法和試劑盒可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)SARS病毒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1570139SQ03141839
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月25日
發(fā)明者袁正宏, 胡蕓文 申請(qǐng)人:上海復(fù)旦悅達(dá)生物技術(shù)有限公司, 復(fù)旦大學(xué)