專利名稱：水稻根系磷饑餓誘導(dǎo)特異表達啟動子及其培養(yǎng)植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地講，本發(fā)明涉及一種水稻根系磷饑餓誘導(dǎo)特異表達啟動子及其培養(yǎng)植物的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及水稻OsIPS1的啟動子序列，該序列含兩個磷元件，為水稻根系中受磷饑餓誘導(dǎo)特異表達啟動子。本發(fā)明還涉及由啟動子中的磷元件及其旁鄰序列的應(yīng)用，以及由此得到的包含上述啟動子和磷元件的GUS融合轉(zhuǎn)基因植物。
背景技術(shù)：
磷是植物生長大量必須營養(yǎng)元素三要素之一(氮、磷、鉀)。由于磷素(PO43-，HPO42-，H2PO4-)在酸性與堿性土壤中的強烈固定作用，植物利用磷肥及土壤磷素的效率極低(作物當(dāng)季利用率僅5％左右)。我國及世界大部分耕地為酸性與堿性土壤，大量土壤已成磷庫。因此提高作物自身磷利用能力，開發(fā)巨大的土壤磷庫是具有重大經(jīng)濟價值的育種工程。植物自身已進化形成適應(yīng)磷脅迫的機制，包括根系發(fā)生與構(gòu)型適應(yīng)，生理代謝適應(yīng)。如何通過分子育種加強這種適應(yīng)性是提高植物磷利用能量的關(guān)鍵。因此根系特異性磷饑餓誘導(dǎo)表達基因的啟動子開發(fā)具有重要應(yīng)用前景。
從水稻中克隆的OsIPS1基因?qū)儆谥参颩t4/TPSI1基因家族。Mt4/TPSI1家族已經(jīng)有4個成員，包括TPSI1(番茄)，Mt4(苜蓿)，At4(擬南芥)，AtIPS1(擬南芥)(Liu et al.，1997；Burleigh et al.，1999；Martín et al.，2000)。它們具有如下特征皆受磷饑餓的高度特異誘導(dǎo)表達；屬于轉(zhuǎn)錄體長度為0.5～0.7kb的單拷貝基因；均不具有明顯的編碼閱讀框；在轉(zhuǎn)錄體中部存在有22bp(GGGCAACTTSKATCCTTTGGCA)的高度保守序列；基因啟動子中均具有“GNATATNC”(P1BS)的磷饑餓調(diào)控元件。Mt4/TPSI1家族基因可能以短肽或非編碼RNA的形式發(fā)揮作用，但功能到目前為止還沒有被揭示。在本發(fā)明之前，還沒有在單子葉植物中發(fā)現(xiàn)該類型基因。OsIPS1在水稻磷饑餓庫中被篩選并克隆。該基因為根系特異表達基因，受磷饑餓特異性誘導(dǎo)。該啟動子可在磷誘導(dǎo)調(diào)控表達基因工程及磷高效分子育種中具有極大的應(yīng)用潛力。
Burleigh S.H.and Harrison M.J.(1999)The Down-Regulation of Mt4-LikeGenes by Phosphate Fertilization Occurs Systemically and Involves PhosphateTranslocation to the Shoots.Plant Physiol.119241-248。
Liu CM，Muchhal U.S.andRaghothama K.G.(1997)Differential expression ofTPS11，a phosphate starvation-induced gene in Tomato.Plant Molecular Biology 33867-874。
Martín A.C，Pozo J.C del，Iglesias J.(2000)Influence of cytokinins on theexpression of phosphate starvation responsive genes in Arabidopsis The PlantJournal，24，5559。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水稻根系磷饑餓誘導(dǎo)特異表達啟動子及其培養(yǎng)植物的方法。
包含SEQ ID NO1的OsIPS1基因啟動子共2100位堿基的核酸，該核酸編碼一個水稻根系磷饑餓特異誘導(dǎo)表達的啟動子，中部含有兩拷貝的高度保守序列。
方法步驟如下1)將包括SEQ ID NO1或其功能性部分并與結(jié)構(gòu)基因連接在一起的分離的DNA構(gòu)建到載體上，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化進入作物或植物細胞中；2)從該細胞中再生出植物，結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物或組織培養(yǎng)物；3)在轉(zhuǎn)基因植物處于磷饑餓或低磷條件下，誘導(dǎo)該結(jié)構(gòu)基因的特異表達。
本發(fā)明利用啟動子或及其磷元件可以構(gòu)建提高植物或其細胞的耐磷饑餓能力的融合基因。例如，利用過表達轉(zhuǎn)基因技術(shù)將該啟動子與側(cè)根發(fā)生相關(guān)基因融合轉(zhuǎn)化作物如水稻、小麥等，通過提高在磷饑餓脅迫下誘導(dǎo)側(cè)根發(fā)生，從而提高作物磷吸收能力，可達到在不影響產(chǎn)量的前提情況下減少磷肥的施加，從而降低糧食生產(chǎn)成本。


圖1是OsIPS1在水稻根中受磷饑餓4天特異誘導(dǎo)表達RT-PCR分析圖；圖2是OsIPS1Pr∷GUS在水稻愈傷中受磷饑餓誘導(dǎo)表達圖，圖中-P為無磷培養(yǎng)，+P為正常磷培養(yǎng)；圖3OsIPS1Pr∷GUS在水稻根中受磷饑餓4天誘導(dǎo)表達圖；圖4是OsIPS啟動子中磷元件串聯(lián)載體與GUS的融合基因在水稻愈傷中受磷饑餓誘導(dǎo)表達圖，圖中-P為無磷培養(yǎng)。
具體實施例方式
闡述了一種新的水稻磷饑餓誘導(dǎo)表達基因OsIPS1的啟動子。OsIPS1基因?qū)儆贛t4/TPSI1家族成員，是從水稻日本晴(Nipponbare)磷饑餓4天cDNA扣除文庫中篩選得到的。經(jīng)5’RACE與3’RACE克隆出全長基因。該基因位于水稻第三條染色體分子標(biāo)記C725上，屬于單拷貝基因，中部含有22堿基的高度保守序列，與該家族其他成員一致。OsIPS1基因啟動子上具有兩個拷貝的磷饑餓調(diào)控元件“GNATATNC”(P1BS)。通過RNA Blotting、RT-PCR以及構(gòu)建啟動子GUS融合表達表明，OsIPS1基因在禾本科模式植物水稻中受磷饑餓的高度誘導(dǎo)，而且在根部特異表達。
在構(gòu)建了水稻品種Kasalath磷饑餓4天的抑制性差異扣除雜交cDNA文庫后，通過利用扣除探針進行篩選，獲得一個在水稻根系磷饑餓誘導(dǎo)增強表達的克隆，根據(jù)該克隆的序列設(shè)計上游引物進行基因組DNA擴增，獲得2100個堿基序列(SEQ ID No1)，我們命名為OsIPS1P。該啟動子與GUS基因，及該啟動子中第-567bp位的元件(GGATATCC)，第-432bp位的元件(GCATATCC)與GUS構(gòu)建的融基因轉(zhuǎn)基因研究表明，帶有上述兩個元件的啟動子受磷饑餓誘導(dǎo)在水稻根中特異表達(圖1，2)。
由這些結(jié)果表明，我們克隆的水稻OsIPS1P啟動子具有很高的應(yīng)用價值。我們可以通過利用該啟動子與根系發(fā)生發(fā)育基因構(gòu)建融合基因?qū)Σ荒偷土椎淖魑锲贩N進行轉(zhuǎn)基因改造，通過該啟動利用提高根系發(fā)生發(fā)育關(guān)鍵基因?qū)α尊囸I反應(yīng)的加強，促進根系磷饑餓誘導(dǎo)發(fā)生發(fā)育來提高作物耐低磷脅迫能力，從而減少對農(nóng)作物磷肥的施加量。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
實施例1，水稻抑制性扣除雜交文庫的構(gòu)建水稻Kasalath品種于37℃浸種催芽后播種到黃沙缽中，7天后移栽到溶液培養(yǎng)(溶液培養(yǎng)配方為國際水稻所標(biāo)準(zhǔn)配方)。等苗培養(yǎng)到三葉期后開始分組處理，一組正常培養(yǎng)，一組磷饑餓培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后取材，分別取根系材料用Gibco公司的Trizol提取總RNA。用Qiagen公司的Oligotex mRNA Mini Kit提取250μg總RNA中的mRNA，兩份材料的mRNA各取1μg用于cDNA合成，cDNA合成采用Clontech公司的SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit。取正常培養(yǎng)根組織的cDNA作為Driver，饑餓處理材料的cDNA作為Tester。采用Clontech公司的PCR-Select cDNA Subtraction Kit進行扣除雜交，最終產(chǎn)物用該公司的PCRCloning Kit進行克隆，并轉(zhuǎn)化TOP 10F’大腸桿菌菌株。挑選轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)保菌。
實施例2，水稻OsIPS1Pr的cDNA序列的克隆和測定用構(gòu)建抑制性扣除雜交文庫的cDNA材料，采用PCR-Select DifferentialScreening試劑盒篩選抑制性扣除雜交文庫，獲得受磷饑餓強烈誘導(dǎo)基因片段克隆。對該克隆測序獲得該基因為植物Mt4/TPSI1基因家族。該基因家族成員為磷誘導(dǎo)特異表達。設(shè)計引物用于擴增該基因的啟動子OsIPS1Pr。引物1GAGGAGAGAAGTTTTTCGGTGGAG用于3‘端擴增，引物2AGTTCTAGATGGGTGCTTTTATTTGGAAGTATTG用于5‘?dāng)U增。PCR產(chǎn)物采用Clontech公司的PCR Cloning Kit克隆于pT-Adv載體，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒進行測序，獲得2100bp序列。詳細序列見SEQ ID No.1.
實施例3，OsIPS1的RT-PCR分析與OsIPS1Pr與GUS融合基因的轉(zhuǎn)基因表達正常培養(yǎng)到三葉期的水稻日本晴(Nipponbare)品種開始磷饑餓脅迫，處理方式與構(gòu)建抑制性扣除雜交文庫過程一致。脅迫4天后，分別取正常苗的根、葉及饑餓處理的苗的根、葉材料。用Gibco公司的Trizol試劑分別提取總RNA。用OsIPS1克隆做探針對Northern印跡分析(圖1)。
利用上述引物以日本晴基因組DNA為模板，TAQ酶58℃擴增OsIPS1啟動子，長度為2100bp。經(jīng)T4聚合酶末段平滑化，與SmaI酶切過的Cambia1391z相連接，構(gòu)建OsIPS1Pr∷GUS融合基因，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。
挑選飽滿光潔無菌斑的種子，加入20％(v/v)NaClO溶液(有效氯約1～1.2％)消毒30min。用無菌水清洗5遍，置于無菌濾紙上吸干。轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃，光照培養(yǎng)3-4周。將自然分裂的胚性愈傷轉(zhuǎn)到新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，28℃，光照培養(yǎng)7天。7天后將愈傷置于22℃，暗培養(yǎng)3-30天。挑取單菌落(EHA105帶有OsIPS1Pr∷GUS質(zhì)粒)于2mlYEP培養(yǎng)液(含50mg/L Kan和50mg/L Str)中，28℃，220rpm振蕩培養(yǎng)24-28h，至OD600＝1.0-1.5。將培養(yǎng)完畢的農(nóng)桿菌液離心(4000rpm，4℃，15min)，棄上清，用適量的AAM培養(yǎng)液(含200μM As)重懸，稀釋成OD600＝0.01-0.05的菌懸液。與愈傷組織共培養(yǎng)。將愈傷轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基上，22℃，暗培養(yǎng)3天后，再轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基(含50mg/L潮霉素，500mg/L頭孢拉定或羧芐青霉素)，28℃光培養(yǎng)4-5周。每兩周換一次選擇培養(yǎng)基。挑取抗性愈傷置于分化培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)。當(dāng)分化綠芽長至1cm左右，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，28℃光照培養(yǎng)(14h光照，光強為60umolm-2s-1)。10-15天后開蓋煉苗，轉(zhuǎn)入水培或土培中繼續(xù)培養(yǎng)。
將得到的轉(zhuǎn)基因陽性苗在無磷培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天后GUS染色10小時，同時染供磷培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天后的轉(zhuǎn)基因愈傷作對照(圖2)。OsIPS1Pr與GUS融合基因的轉(zhuǎn)基因根系特異表達也得到確證(圖3)。實施例4，SEQ ID NO2磷饑餓調(diào)控元件“GNATATNC”(P1BS)的啟動子磷元件串聯(lián)啟動子構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因試驗分別克隆OsIPS1啟動子上的兩個磷饑餓調(diào)控元件“GNATATNC”(P1BS)，構(gòu)建串聯(lián)人工啟動子，與GUS基因融合轉(zhuǎn)化植物。
人工分別合成下列寡核苷酸序列(5’磷酸化)P1 5′GGGGTACCTCAGCTCggatatccTCAAGATGCCGC 3′P2 5′CCCGCGGCATCTTGAggatatccGAGCTGAGGTAC 3′P3 5′GGGCTAATGCTCGCCgcatatccTTTGGTAGATAC 3′P4 5′CCCGTATCTACCAAAggatatgcGGCGAGCATTAG 3’其中GGG和CCC表示接頭。將合成的每對互補寡核苷酸等量混合于PCR管中，通過兩步PCR(95℃，2min；降1℃/min至25℃)，便可退火形成雙鏈，由于接頭的作用，短的雙鏈之間可通過T4連接酶進行串連，并隨機形成2～多個拷貝，純化后連到pBSSK(smaI酶切)載體中，測序，分別得到DS1(6copy)和DS2(7copy)兩個正向的多拷貝和DS3(2copy)和DS4(4copy)的低拷貝克隆。將連有目的片段的pBSSK用BamHI和XbaI酶切后，把mini35S(-46 CaMV35S啟動子)+GUS連入。mini35S+GUS是通過BamHI和XbaI酶切pWS31得到的。再將連有mini35S+GUS和目的片段的pBSSK用HindIII和XbaI酶切，回收純化含有目的片段+mini35S+GUS的條帶，連到p1300(HindIII和XbaI酶切)載體中。將構(gòu)建好的載體通過電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。利用基因槍法用DS1(6copy)和DS2(7copy)兩個片段轉(zhuǎn)化水稻愈傷，GUS染色10小時，分別得到瞬時表達(轟完基因槍后48小時)(圖4)。
序列表浙江大學(xué)水稻根系磷饑餓誘導(dǎo)特異表達起動子OsIPS1PLength1862SequenceNameOsIPS1P<212>TypeDNA<213>水稻(Oryza sativa)OsIPS1基因啟動子(共2.1kb)caagattgtgttttcgaggagagaagtttttcggtggagctttggaaaattccacatgccacatatttcgtccgtttgagtttattttttacatggttggttcctgtgagttcctaagtgtgaaaaaaatatcaaaaaaataaaataaaaataaaaaagttgcacatctctctcctctgcactagttcggagagaggagaggagaggaaaaattctatatgtcacatattacgtccatttgagttcaatttttctatggttgattcttgtgtgtccctaagcgtgaaaaaaatatcaaacaaataaaacaaaataaaaaatttcggggggagggcgccagccactggggggcgccagtcactctggcgcactccccctagccacctcagcatcgccccgccacgtcggcagggggacggcgccaaagaggctggcgcggcagccactctggcgcctcaaaaaggaccatttttgggataaatttttctaggggtctatttgcgaaataagttttttaaaaggaccaaaatgtgaaaaatccagtacttgtctccgtgtacatcgcgtagctctagcacctccctgttcccaccaagtccgacggcgcgacgctgcgaaggttgacgtgcgggtgtgtgccggtggacgcgtatcgcctcctaccgaggcgacgcagcgaagattggtgaagcgcgtggaggacagcttcaaacaaaactcacacaagcaaactaaaatgaagctcacacaagctcaggggtatattttgttcaaaataaaaaaatgaaatgcaccagccgggaatcgaacccgggtctgtaccgtggcagggtactattctaccactagaccactggtgcttgcttgttgaaatttttctaagaatttatatatcagcagcatcgttcatcaatcaaggcactactcataaaattcagtatcacttcaaaatcaatcatgggttcagatatcactaggctcaagttctgagttacccctaaaccagcccagttctaccctgtaatggtctatatatggggggcatacgactatgctatacacactaccaaggctaccaagtacccagctagtatttctaaatgataaaggtaagcaatatgcactgacacatgtcgacaacctaactgcaaaaacacaaatttgctgatacacatgctccattcatagcaagtggagtacaccttgactaccccaaaaggaagcacatagtatatcagaaagcactcaagccaaactgtagttccacactgaccccccatgacactgaaagtctgaaccatattagttttagagcctagactgacaccaccaccatctcacaagtgatctcacggatcatatttgtcacaccttggcgagcaaagagcaggaggaggttgacgatgacaacacaaagctgctgcccccttctcccccttgtgatcgagttgtggttgtgacattgaagagacgagcacccaaaagaggagcaagaaattgaagttcgcactagtcgcggagtacctcagctcGGATATCCtcaagatgccgctggggaaagagcctagctcatgtggacgccgagggaaagtgcaacaaaagagagaaagccacgccaaagttggtggcatcaccagcctcgaaactcgaaagcgctaatgctcgccGCATATCCtttggtagataccgttccctcttctcctgcacatctccctgaagattgcgtagttgctccctgaactacaccataattgcagagataagcaaagcttaattgcgtcttcaagtatttgctttgctctaactgatgatctgtgcacttggtttatgctaatgttactctgcaaacaggctcagagctgcttctttcagctcaactattttttgctctgttctactggtatgcactctgtactacatacaagtaatacgtgtgcaagaattattacagacatggctcatgagggtgaattcactgaattgtaatcattgagagtattgtggagcaggtttcagttaatggaaagctaatgtctgttgatgCAAAATTgcactgatttaggTACAAAAggcacttttaactaaagaaatgatttcct-567bpGGATATCC-432bpGCATATCC (以最后一個堿基t為-1)為兩個低磷脅迫響應(yīng)元件PIBS(PHR1-binding site)-56bpCAAAATT為預(yù)測的CAAT-BOX。
-36bpTACAAAA為預(yù)測的TATA-BOX。
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，包含SEQ ID NO1的OsIPS1基因啟動子共2100位堿基的核酸，該核酸編碼一個水稻根系磷饑餓特異誘導(dǎo)表達的啟動子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離出的DNA分子，其特征在于所說的OsIPS1基因啟動子包含有兩個拷貝的SEQ ID NO2磷饑餓調(diào)控元件“GNATATNC”(P1BS)的啟動子
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離出的DNA分子，其特征在于所說的“GNATATNC”(P1BS)為-567bpGGATATCC，-432bpGCATATCC，及其旁鄰序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離出的DNA分子，其特征在于所說的OsIPS1基因啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基因是OsIPS1基因，屬于植物Mt4/TPSI1基因家族。
5.一種利用OsIPS1基因啟動子轉(zhuǎn)化植物的方法，其步驟如下1)將包括SEQ ID NO1或其功能性部分并與結(jié)構(gòu)基因連接在一起的分離的DNA構(gòu)建到載體上，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化進入作物或植物細胞中；2)從該細胞中再生出植物，結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物或組織培養(yǎng)物；3)在轉(zhuǎn)基因植物處于磷饑餓或低磷條件下，誘導(dǎo)該結(jié)構(gòu)基因的特異表達。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種利用OsIPS1基因啟動子培養(yǎng)植物的方法，其特征在于所說的結(jié)構(gòu)基因為側(cè)根發(fā)生相關(guān)基因，根毛發(fā)生相關(guān)基因和磷高效利用相關(guān)基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種利用OsIPS1基因啟動子培養(yǎng)植物的方法，其特征在于所說的轉(zhuǎn)基因植物細胞，包含權(quán)利要求1的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種利用OsIPS1基因啟動子培養(yǎng)植物的方法，其特征在于所說的作物為水稻，小麥，玉米。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻根系磷饑餓誘導(dǎo)特異表達啟動子及其培養(yǎng)植物的方法。它包含SEQ ID NO1的OsIPSl基因啟動子共2100位堿基的核酸，該核酸編碼一個水稻根系磷饑餓特異誘導(dǎo)表達的啟動子。方法步驟如下1)將包括SEQID NO1或其功能性部分并與結(jié)構(gòu)基因連接在一起的分離的DNA構(gòu)建到載體上，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化進入作物或植物細胞中；2)從該細胞中再生出植物，結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物或組織培養(yǎng)物；3)在轉(zhuǎn)基因植物處于磷饑餓或低磷條件下，誘導(dǎo)該結(jié)構(gòu)基因的特異表達。本發(fā)明利用啟動子或及其磷元件可以構(gòu)建提高植物或其細胞的耐磷饑餓能力的融合基因。通過提高在磷饑餓脅迫下誘導(dǎo)側(cè)根發(fā)生，從而提高作物磷吸收能力，可達到在不影響產(chǎn)量的前提情況下減少磷肥的施加，從而降低糧食生產(chǎn)成本。
文檔編號C12N15/09GK1487084SQ0314228
公開日2004年4月7日 申請日期2003年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者吳平, 侯興亮, 焦芳蟬, 吳運榮, 劉非燕, 吳 平 申請人:浙江大學(xué)