專利名稱：基因芯片電位掃描無標記熒光檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及利用一種基因芯片進行生物分子檢測的方法。
背景技術(shù)：
人類基因組計劃和其他基因測序計劃的完成，蛋白質(zhì)組計劃的實施，為與生命、醫(yī)學(xué)相關(guān)的研究，如基因工程、疾病的診斷和治療、新藥的開發(fā)，奠定了基礎(chǔ)。為了這些后續(xù)的工作，同時需要發(fā)展新的生物技術(shù)，基因芯片就是其中的一個例子。
基因芯片的目的是高通量地從大量的DNA或DNA片段中識別出特定的DNA序列和分子。基因芯片的一種類型是將已知的一定序列的DNA片段(以下稱作探針)固化在表面上，通過DNA雜交實驗，使被測樣品中與探針完全匹配的生物分子(以下稱作標靶)與探針結(jié)合，同時與探針不完全匹配的生物分子(以下簡稱錯靶)不能與探針結(jié)合，從而實現(xiàn)對不同生物分子的特異性識別，標靶和錯靶統(tǒng)稱為樣品。在基因芯片檢測中，如何將只是一個堿基有差別的兩個寡聚核酸序列(即所謂單堿基多態(tài)性，SNP)區(qū)別開，是一個技術(shù)難題[J.Wang，Nucleic Acids Research 283011(2000).；F.W.Scheller，et al.，Current Opinionin Biotechnology 1235(2001)；J.Fritz，et al.，Science 288316(2000)]。
利用溫度、pH、鹽濃度等來控制或優(yōu)化DNA雜交是經(jīng)典的方法。最近，有人發(fā)明了溫度控制的基因芯片，探針為線性DNA分子[T.Kajiyama，et al.，Genome Research 13467(2003)，USPTO6，428，749]。但是，線性SNP序列隨溫度變化的差別較小，信號的區(qū)別度仍然不能令人滿意。利用電位調(diào)節(jié)、控制生物分子的分析、分離過程，也是經(jīng)典的方法，大量商品化的分析、分離儀器(如電泳儀)是建立在電位控制上的。以上的電位控制方法都已經(jīng)被標準化，并被寫入有關(guān)的教科書。例如盧圣棟主編《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)》(中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，1999年版)。
近年來有人提出利用一定電位下產(chǎn)生的電流實現(xiàn)生物分子的導(dǎo)向和雙鏈DNA的解聚和SNP識別[C.F.Edman，et al.，Nucleic Acids Res 254907(1997)；R.G..Sosnowski，et al.，P Natl Acad Sci USA 941119(1997)；USPTO524477，USPTO5849486，USPTO6030781，USPTO6048690，USPTO6197508]，以及在固定電位下識別完全匹配與有兩個堿基錯配的序列[R.J.Heaton，et al.，P NatlAcad Sci USA 983701(2001)；WO 02/055993]。但是，他們使用的探針都是線性DNA分子，并且都是利用信號強度隨時間變化的性質(zhì)來觀測DNA雜交結(jié)果。
另一方面，無標記熒光檢測方法已經(jīng)是文獻中的方法。這一方法利用一類稱為嵌入式熒光染料的分子可以與DNA雙螺旋結(jié)合發(fā)出熒光的性質(zhì)，顯示DNA雜交后雙螺旋的存在。例如PicoGreen分子就是人們熟知的該類分子[J.A.Susan，Nucleic Acids Research 242623(1996)；USPTO 6350578]。
中國專利申請“發(fā)卡形探針基因芯片及其制備方法和檢測方法”(申請?zhí)?2116202.2，申請日2002年3月22日)公開了一種發(fā)卡形探針基因芯片。
將發(fā)卡結(jié)構(gòu)的探針和無標記熒光檢測的方法結(jié)合，利用電位掃描，通過熒光強度隨電位變化的曲線特征實現(xiàn)SNP識別的技術(shù)和方法還沒有文章或?qū)＠麍蟮馈?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種通過電位掃描、進行無標記熒光檢測的、實現(xiàn)SNP識別的基因芯片檢測方法。
本發(fā)明的方法采用發(fā)卡形探針基因芯片，其步驟包括1、制作該基因芯片與標靶的電位掃描解鏈熒光標準曲線1)用已知是完全匹配的樣品(標靶)配制溶液(以下稱標準溶液)，標準溶液的濃度在1×10-9M和1×10-6M之間，推薦值為5×10-8M。將標準溶液裝入熒光法測量芯片雜交的裝置，與探針雜交；2)按照生產(chǎn)商提供的使用方法，在待測標準溶液中加入嵌入式熒光染料；3)對芯片基底施加電位和進行電位掃描，最大掃描范圍從+0.5V到-1.5V。記錄電位掃描下的探針與標準溶液雜交的熒光信號隨表面電位變化的曲線，即為該芯片的電位掃描解鏈熒光標準曲線。
2、制作該基因芯片與待測樣品的電位掃描解鏈熒光曲線1)將與標準溶液濃度接近的待測樣品DNA溶液裝入熒光法測量芯片雜交的裝置，與探針雜交，并按照生產(chǎn)商提供的使用方法加入嵌入式熒光染料；2)以與獲得標準曲線相同的掃描速度對芯片基底施加電位和進行電位掃描，最大掃描范圍是從+0.5V到-1.5V。記錄電位掃描下的探針與待測樣品雜交的熒光信號隨表面電位變化的曲線，即待測樣品的電位掃描解鏈熒光曲線。
3、將待測樣品曲線與標準曲線進行比較，給出識別結(jié)果1)計算待測樣品曲線與標準曲線的的解鏈半高電位之差ΔE1/2值；2)當(dāng)ΔE1/2＜0.2伏時，確認待測樣品為標靶；當(dāng)ΔE1/2＞0.2伏時，確認待測樣品為錯靶。
本發(fā)明識別錯靶判據(jù)的理論依據(jù)如下由于標靶與發(fā)卡形探針形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，熒光信號在較大的電位范圍內(nèi)保持不變，稱為高平臺區(qū)，高平臺區(qū)的熒光信號強度記為I1，然后在很小的電位區(qū)間內(nèi)熒光信號降低到低平臺區(qū)，其熒光信號強度記為I2。與之對比，由于錯靶與發(fā)卡形探針形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，熒光信號比標靶提前從高平臺區(qū)降低到低平臺區(qū)。分別將標靶和錯靶的信號降低到I1/2＝(I1-I2)/2+I2時的電位稱為標靶和錯靶的解鏈半高電位，E1/2。根據(jù)電化學(xué)理論，電荷處于電位E下的標準摩爾自由能(G)為G＝G0+δFE(1)其中G0為沒有電位時的標準摩爾自由能，δ為分子的有效電荷，F(xiàn)為法拉第常數(shù)。而DNA雙鏈的解鏈平衡常數(shù)為[P][PS]=exp(-ΔGRT+ln[S]co)---(2)]]>其中，[P]為表面上未結(jié)合樣品的發(fā)卡形探針的濃度，[PS]為表面上與樣品結(jié)合的發(fā)卡形探針的濃度，[S]為溶液中樣品的濃度，c0為濃度單位。由以上兩式推導(dǎo)可得熒光信號隨電位變化的關(guān)系為I=I0exp(-δFRT(E-E1/2))1+exp(-δFRT(E-E1/2))---(3)]]>上式便是識別時熒光隨電位的關(guān)系式，由它擬合實驗曲線便可得到解鏈半高電位。而由(1)、(2)得知，標靶與錯靶的解鏈半高電位之差，ΔE1/2＝|E1/2(標靶)-E1/2(錯靶)|，為ΔE1/2=ΔG0δF]]>其中ΔG0為單個堿基對結(jié)合的標準摩爾自由能。一般地，A-T對的ΔG0在8-15kJ/mol之間，C-G對的ΔG0在12-20kJ/mol之間，對于單堿基突變的錯靶由此計算得到ΔE1/2的范圍為0.3V＜ΔE1/2＜0.9V完全匹配的標靶從原理上講不會有解鏈半高電位的移動。實驗表明，確定ΔE1/2的誤差一般小于±0.1V?？紤]到標靶和錯靶測量的各自可能的最大誤差，因此給出前面的判斷標準。
本發(fā)明在實施方案中采用的嵌入式熒光染料為PicoGreen。它的最佳激發(fā)波長為488nm，由于實驗條件所限，本發(fā)明在實施方案中采用514nm激光激發(fā)，其結(jié)果可能是熒光信號的強度和信噪比劣于最佳波長下的結(jié)果，但是不會有本質(zhì)的區(qū)別。
本發(fā)明利用電位掃描中的解鏈半高電位之差獲得探針對于標靶和錯靶的確定無疑的識別。由于DNA是帶電分子，探針與標靶或者探針與錯靶在芯片表面的結(jié)合能力受芯片基底電位的影響。存在著一定的表面電位范圍，使得探針在與標靶有結(jié)合的時候卻不能與錯靶結(jié)合，反映在熒光信號中，標靶和錯靶的熒光信號隨電位的變化有明顯不同的曲線關(guān)系。
圖1顯示完全匹配的標靶和單點錯配的錯靶與發(fā)卡形DNA探針雜交時，熒光信號隨電位掃描的變化。由圖看出，標靶和錯靶的熒光隨電位變化曲線完全不同。
圖1中，ΔE1/2＝0.82V，標靶和錯靶被確定無疑地識別開。圖1還顯示在沒有外加電位(電位接近零)時，標靶和錯靶與發(fā)卡形探針形成雙螺旋的熒光信號接近。如果僅僅采用發(fā)卡形結(jié)構(gòu)的探針，而沒有適當(dāng)?shù)碾娢豢刂坪蛼呙?，無法確定無疑地獲得SNP識別。
圖2顯示上述標靶和錯靶與線性DNA探針雜交時，熒光信號隨電位掃描的變化。由圖看出，SNP不同的標靶和錯靶的熒光隨電位變化曲線相近，無法確切區(qū)分哪一個是標靶，哪一個是錯靶。說明僅僅是線性探針的電位掃描同樣不能提供SNP識別的準確信息。
識別標靶和錯靶的傳統(tǒng)方法是比較某種檢測信號的強度差別。由于實驗測量誤差的起伏，該標準常常會產(chǎn)生假陽性和假陰性的結(jié)果。本發(fā)明以解鏈半高電位之差作為判斷標準，該性質(zhì)受實驗誤差的影響小，更加穩(wěn)定和可重復(fù)。所以判斷更加確切和可靠。
本發(fā)明利用無標記熒光檢測方法，探針和樣品都無需進行特殊的標記，大大降低了技術(shù)成本。同時又具有通常熒光檢測的方便和靈敏的優(yōu)點，可以同現(xiàn)有的芯片技術(shù)結(jié)合，特別是可以利用高度平行化的成像技術(shù)檢測，滿足基因芯片高通量檢測的需要。


圖1 同一個接有無標記發(fā)卡形DNA探針的生物芯片在電位掃描時對完全匹配的標靶和單點錯配的錯靶的熒光響應(yīng)曲線11--芯片對標靶的信號響應(yīng)曲線12--芯片對錯靶的信號響應(yīng)曲線圖2 同一個接有無標記線性DNA探針的生物芯片在電位掃描時對與圖1中相同的標靶和錯靶的熒光響應(yīng)曲線兩種樣品的結(jié)果在實驗誤差范圍內(nèi)難于區(qū)分，說明如果沒有發(fā)卡形結(jié)構(gòu)，僅僅施加電位控制或電位掃描，不能達到SNP識別的目的。
21--芯片對標靶的信號響應(yīng)曲線22--芯片對錯靶的信號響應(yīng)曲線圖3 獲得圖1和圖2實驗數(shù)據(jù)的實驗裝置示意3-1該裝置的正視3-2該裝置的上視圖該裝置為兩電極體系的現(xiàn)場熒光-電池。測量時，將檢測溶液加入電池，用激光激發(fā)，記錄探針與樣品DNA雜交產(chǎn)生的熒光信號。
31--接有無標記發(fā)卡形DNA探針的生物芯片，用做工作電極。
32--螺旋狀鉑絲，用作對電極。
33--波長為514nm的激光實施方案按照“發(fā)卡形探針基因芯片及其制備方法和檢測方法”(申請?zhí)?2116202.2，申請日2002年3月22日)專利申請和文獻報道的方法[見物理化學(xué)學(xué)報17931(2001)“硅表面上構(gòu)筑具有化學(xué)特性的圖形的新方法”，吳瑞閣等]制備得到以羧基終止的單層有機膜覆蓋的p-硅表面作為生物芯片的基底。選擇人體脂蛋白脂肪酶基因LPL的天然序列片斷為被測樣品。研究表明，在LPL中有多個位點都可能因發(fā)生單點突變而引發(fā)高脂血癥。這里選擇的被檢測的一段正?；蛐蛄袨?記為Ser 447)3’-AAT AAG AAG T A GGC TGA AAC-5’，單點突變的序列為3’-AAT AAG AAG T A GGC TGA AAC-5’，其中黑體并斜體帶陰影下劃線的堿基為發(fā)生突變位置的堿基。設(shè)計的無標記發(fā)卡形探針的堿基序列為5′-CCCCCGTT TCA GCC TGA CTT CTT ATTGGGGG-3′(一號探針)，其中下劃線的堿基為莖桿區(qū)，探測區(qū)的堿基序列與正?；蛐蛄型耆ヅ?。而作為對比用的線性探針(二號探針)除了沒有莖桿區(qū)外，其余部分與一號探針相同。利用無標記探針的-OH基團與有機膜的羧基之間的縮合反應(yīng)形成的脂鍵分別將兩個探針固化到硅表面有機膜上[10mM EDAC/1mM NHS(MES buffer，pH＝6.5)活化，固定反應(yīng)4℃ 24小時]，分別制得接有無標記線性和發(fā)卡形探針的芯片。
在電位掃描下觀察雙鏈解開過程。利用恒電位儀(商品，ZF-3，上海)和電位掃描儀(商品，ZF-4，上海)進行電位掃描。檢測溶液為含有PicoGreen(商品，Molecular Probes，美國)的1×TE緩沖溶液。測量時，用514nm的激光激發(fā)探針修飾的電極，測量PicoGreen與雙鏈結(jié)合后產(chǎn)生的熒光隨電位的變化。在本實施例中，圖1顯示，發(fā)卡形的一號探針對SNP差別的標靶和錯靶的熒光-電位掃描曲線有明顯差異。存在最佳電位區(qū)間，在此區(qū)間內(nèi)，探針對標靶的熒光信號很強，而對錯靶的熒光信號很弱。通過讀取和比較解鏈半高電位，可以實現(xiàn)完全匹配與單點錯配的確定無疑的識別。圖2顯示對照實驗的結(jié)果線性的二號探針對完全匹配與單點錯配的兩個不同序列的響應(yīng)幾乎完全相同，因此不能做到SNP識別。
權(quán)利要求
1.一種基因芯片電位掃描無標記熒光檢測方法，采用發(fā)卡形探針基因芯片，其步驟包括1)制作該基因芯片與標靶的電位掃描解鏈熒光標準曲線1-1)用已知是完全匹配的樣品配制標準溶液；1-2)將標準溶液裝入熒光法測量芯片雜交的裝置，與探針雜交；1-3)在待測標準溶液中加入嵌入式熒光染料；1-4)對芯片基底施加電位和進行電位掃描；1-5)記錄電位掃描下的探針與標準溶液雜交的熒光信號隨表面電位變化的曲線，即為該芯片的電位掃描解鏈熒光標準曲線；2)制作該基因芯片與待測樣品的電位掃描解鏈熒光曲線2-1)將與標準溶液濃度接近的待測樣品DNA溶液裝入熒光法測量芯片雜交的裝置，與探針雜交，并在溶液中加入嵌入式熒光染料；2-2)以與獲得標準曲線相同的掃描速度對芯片基底施加電位和進行電位掃描；2-3)記錄電位掃描下的探針與待測樣品雜交的熒光信號隨表面電位變化的曲線，即待測樣品的電位掃描解鏈熒光曲線；3)將待測樣品曲線與標準曲線進行比較，給出識別結(jié)果3-1)計算待測樣品曲線與標準曲線的的解鏈半高電位之差ΔE1/2值；3-2)當(dāng)ΔE1/2＜0.2伏時，確認待測樣品為標靶；當(dāng)ΔE1/2＞0.2伏時，確認待測樣品為錯靶。
2.如權(quán)利要求1所述的基因芯片電位掃描無標記熒光檢測方法，其特征在于所述標準溶液的濃度在1×10-9M和1×10-6M之間，掃描范圍從+0.5V到-1.5V。
3.如權(quán)利要求2所述的基因芯片電位掃描無標記熒光檢測方法，其特征在于所述標準溶液的濃度為5×10-8M。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的基因芯片電位掃描無標記熒光檢測方法，其特征在于所述嵌入式熒光染料為PicoGreen。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因芯片電位掃描無標記熒光檢測方法，采用發(fā)卡形探針基因芯片，首先用標靶配制標準溶液，將標準溶液與探針雜交，并加入嵌入式熒光染料，對芯片基底施加電位和進行電位掃描，記錄掃描下的探針與標準溶液雜交的熒光信號標準曲線；然后將待測樣品DNA溶液裝入熒光法測量芯片雜交的裝置，與探針雜交，并加入嵌入式熒光染料；同樣對芯片基底施加電位和進行電位掃描，記錄掃描下的探針與待測樣品雜交的熒光信號變化的曲線；將該曲線與標準曲線進行比較，給出識別結(jié)果。本發(fā)明可確切和可靠地實現(xiàn)SNP識別，探針和樣品都無需進行特殊的標記，大大降低了成本?？蓮V泛應(yīng)用于生物芯片技術(shù)領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/68GK1477210SQ0314261
公開日2004年2月25日 申請日期2003年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月3日
發(fā)明者趙新生, 魏芳 申請人:北京大學(xué)