專利名稱：一種快速篩選葫蘆科rip新基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物農(nóng)藥和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及核糖體失活蛋白(ribosome-inactivatingprotein，RIP)基因的篩選方法。
背景技術(shù)：
核糖體失活蛋白因具有抗腫瘤和抗病毒等醫(yī)用價值，以及抗植物病毒和病原真菌等農(nóng)用價值，受到醫(yī)藥科學(xué)家和農(nóng)藥研究者的共同青睞。迄今，至少有50個I型RIP和15個II型RIP的基因序列被測定。但是，人們對RIP的認(rèn)識還處在起步階段，尤其對其生理功能的認(rèn)識一直未能取得較大的進(jìn)展。RIP是一種具有多種酶學(xué)活性和多樣化生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，不同RIP具有各自獨(dú)特的功能，其潛在活性還在不斷發(fā)現(xiàn)之中[8]。對植物中RIP基因家族及其表達(dá)調(diào)控的研究，有助于了解其生理功能。另外，對不同RIP及其基因的認(rèn)識，也有助于更好地了解RIP的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系以及分子演化進(jìn)程。而構(gòu)建廣譜抗病毒抗真菌植物和基因工程單鏈免疫毒素也需要不斷有新型的RIP基因。因此，新型RIP及其基因的分離和表達(dá)，具有極其重要的意義。本發(fā)明以前的方法都是先分離RIP，后克隆其基因，這種方法往往是工作量大，而且往往是做大量分離工作后還無法篩選到新的RIP基因；因此，迄今并無一種行之有效并能夠快速篩選到RIP新基因的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種快速篩選葫蘆科RIP基因的方法，為新型RIP基因資源的快速篩選服務(wù)。
RIP基因快速篩選的方法根據(jù)已知的葫蘆科RIP蛋白氨基酸序列上、下游兩段高度保守的氨基酸序列及其密碼子偏好設(shè)計(jì)簡并引物對LY1/LY2，以總DNA為模板進(jìn)行Touchdown-PCR擴(kuò)增。對未報(bào)道過RIP基因的葫蘆科植物，直接將PCR產(chǎn)物克隆測序，即可獲得新的RIP基因；對已報(bào)道有RIP基因的葫蘆科植物，根據(jù)RIP基因LY1/LY2區(qū)段的限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，可快速區(qū)分已知的RIP基因和未知的RIP基因。
引物序列如下LY1，5’-GT[A/G]AC[G/C/A]AA[C/T]GT[C/T]TA[T/C]ITIATGGG-3’LY2，5’-[C/G/T]GCIA[A/T]I[A/T][G/A]IAT[T/C]TG[T/C]TTGGAIAG-3’
Touch-down PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃變性50s，64～48℃退火50s，每2個循環(huán)降2℃，48℃時17個循環(huán)，72℃延伸2min。
本發(fā)明所提供的方法快速、簡便。為快速獲得RIP新基因提供了新途徑，這與以往先分離RIP后克隆其基因的路線正好相反。該方法同樣適用于從其它科植物中快速獲得RIP新基因。
c、PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為超純水 12μL10×PCR緩沖液(含25mmol/L Mg2+) 2μLdNTPs(每份10mmol/L) 0.5μL
引物L(fēng)Y1(10pm/μL) 2μL引物L(fēng)Y2(10pm/μL) 2μL總DNA 1μLTaq DNA聚合酶(4U/M1)0.5μL總體積 20μL反應(yīng)程序?yàn)?4℃變性50s，64～48℃退火50s，每2個循環(huán)降2℃，48℃時17個循環(huán)，72℃延伸2min。
其余步驟，分別是d、瓊脂糖凝膠電泳及DNA片段的回收，e、連接載體，f、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的簡易制備，g、轉(zhuǎn)化，h、質(zhì)粒的提取，i、酶切鑒定，j、克隆子序列的測定及分析。為常規(guī)的分子生物學(xué)操作，按《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(北京科學(xué)出版社，1998)中的相關(guān)說明進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種RIP基因快速篩選的方法根據(jù)已知的葫蘆科RIP蛋白氨基酸序列上、下游兩段高度保守的氨基酸序列及其密碼子偏好設(shè)計(jì)簡并引物對LY1/LY2，以總DNA為模板進(jìn)行Touchdown-PCR擴(kuò)增。對未報(bào)道過RIP基因的葫蘆科植物，直接將PCR產(chǎn)物克隆測序，即可獲得新的RIP基因；對已報(bào)道有RIP基因的葫蘆科植物，根據(jù)RIP基因LY1/LY2區(qū)段的限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，可快速區(qū)分已知的RIP基因和未知的RIP基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種RIP基因快速篩選的方法，其特征是引物序列如下LY1，5’-GT[A/G]AC[G/C/A]AA[C/T]GT[C/T]TA[T/C]ITIATGGG-3’LY2，5’-[C/G/T]GCIA[A/T]I[A/T][G/A]IAT[T/C]TG[T/C]TTGGAIAG-3’
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種RIP基因快速篩選的方法，其特征是Touch-down PCR擴(kuò)增體系為超純水 12μL10倍PCR緩沖液(含25mm0l/L Mg2+) 2μLdNTPs(每份10mmol/L) 0.5μL引物L(fēng)Y1(10pm/μL)2μL引物L(fēng)Y2(10pm/μL)2μL總DNA1μLTaq DNA聚合酶(4U/M1) 0.5μL總體積 20μLTouch-down PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃變性50s，64～48℃退火50s，每2個循環(huán)降2℃，48℃時17個循環(huán)，72℃延伸2min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種RIP基因快速篩選的方法，其特征是總DNA的提取工藝為試劑配制試劑甲即CTAB抽提液含2％CTAB，100mM Tris-HCl pH8.0，1.4M NaCl，20mM EDTA pH8.0，1％β-巰基乙醇；試劑乙酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1；試劑丙氯仿∶異戊醇(24∶1)；試劑丁即CTAB沉淀液每L含5g CTAB，0.04M NaCl；試劑戊即TE緩沖液每mL含10μg RNase A，pH8.0；取0.3g葉片，冰凍研磨，加試劑甲，混勻，65℃保溫30min；冰浴1～2min；加1倍體積的試劑乙，0.5倍體積Tris飽和酚和0.5倍體積試劑丙，混勻后12,000rpm離心10min，取上清，加入等體積試劑丙，輕緩顛倒混勻，14,000rpm離心8min；取上清，加2倍體積試劑丁，室溫放置60min，12,000rpm離心10min，棄上清，加入350μL 1.2M NaCl溶解沉淀，加入等體積試劑丙，輕緩顛倒混勻，14,000rpm離心8min；取上清，加0.6倍體積異丙醇，12,000rpm離心10min，棄上清，加入500μL70％乙醇，洗2次，干燥；最后用50μL試劑戊溶解沉淀，得總DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速篩選葫蘆科RIP基因的方法，即根據(jù)已知的葫蘆科RIP氨基酸序列上、下游兩段高度保守的氨基酸序列及其密碼子偏好設(shè)計(jì)簡并引物對LY1/LY2，以總DNA為模板進(jìn)行Touchdown－PCR擴(kuò)增，對未報(bào)道過RIP基因的葫蘆科植物，直接將PCR產(chǎn)物克隆測序，即可獲得新的RIP基因；對已報(bào)道過RIP基因的葫蘆科植物，根據(jù)RIP基因LY1/LY2區(qū)段的限制性片段長度多態(tài)性，可快速區(qū)分已知和未知的RIP基因；可克服以前先分離RIP后克隆其基因方法的目的性差、費(fèi)工、費(fèi)時的不足，具有篩選快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于RIP基因的篩選。
文檔編號C12Q1/68GK1482259SQ0314402
公開日2004年3月17日 申請日期2003年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月26日
發(fā)明者林奇英, 林毅, 吳祖建, 謝聯(lián)輝 申請人:福建農(nóng)林大學(xué), 福州騰龍生物有限公司