專(zhuān)利名稱(chēng)：建立冠狀病毒體內(nèi)外模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒的體內(nèi)外模型的建立，特別是建立冠狀病毒體內(nèi)外模型的方法。
背景技術(shù)：
SARS冠狀病毒是世界性的高傳播的呼吸道傳染病，此次由2002年11月份到2003年5月份曾蔓延全球，對(duì)于人生命健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展影響甚大，目前SARS冠狀病毒的流行雖然初步得到控制，但在以后秋冬季節(jié)是否引起復(fù)燃和大的流行都是各國(guó)政府關(guān)注的問(wèn)題。因此尋找有效的防治方法，是全世界和我國(guó)疾病預(yù)防中的重點(diǎn)。但是系統(tǒng)的冠狀病毒體內(nèi)外模型-的建立與完善一直是實(shí)驗(yàn)研究的瓶頸。它的實(shí)驗(yàn)研究需要P3甚至P4級(jí)實(shí)驗(yàn)室和昂貴的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，給研究帶來(lái)很大的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是用致病力很低的，與SARS冠狀病毒有高度同源的、30年前分離的人冠狀病毒中華株(ZHZ)和近年分離的雞傳染性支氣管炎病毒GX-1-98株，建立起系列的體內(nèi)外冠狀病毒模型，為冠狀病毒藥物研究、預(yù)防措施、起源演化和致病機(jī)理，創(chuàng)立了必要的研究基礎(chǔ)。本方法具有較大的創(chuàng)新性，新穎性和應(yīng)用價(jià)值。本方法具有容易建立、重復(fù)性好、安全，試驗(yàn)周期短、價(jià)格便宜、不需要特殊實(shí)驗(yàn)室，而且不造成生物災(zāi)害等諸多優(yōu)點(diǎn)，適用于廣泛應(yīng)用與發(fā)展和評(píng)價(jià)冠狀病毒的防治藥物和免疫調(diào)節(jié)。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種建立冠狀病毒體內(nèi)外模型的方法包括人冠狀病毒中華株(ZHZ)體外模型和雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)體內(nèi)模型的建立，其中人冠狀病毒中華株(ZHZ)體外模型的建立為將基因序列與SARS冠狀病毒有高度同源性、致病力很低的冠狀病毒中華株接種于KMB17雙倍體細(xì)胞或MDCK細(xì)胞(狗腎細(xì)胞)，維持液為1～2％胎牛血清、0.5％水解乳蛋白與等量的DMEM培養(yǎng)液，在33～37℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)于3～5％CO2的溫箱內(nèi)的多孔凹板中4～6天，測(cè)定藥物毒性(TC50)與抑制病毒有效藥物濃度(ID50)，計(jì)算治療指數(shù)(TI)為判斷藥效標(biāo)準(zhǔn)。
雞傳染性支氣管病毒(IBV)體內(nèi)模型的建立為將雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)GX1～98株接種于雞胚尿囊腔，收取尿囊液于-70℃保存，作毒種；取1～2日齡30～40g雌雄不拘的雛雞，以麻醉藥輕度麻醉后進(jìn)行上呼吸道接種病毒，攻擊IBV，并置于15～18℃，80～90％濕度條件下飼養(yǎng)，連續(xù)飼養(yǎng)觀察8～10天，以生存保護(hù)率與熒光抗體染色肺切片作為藥物效果判斷標(biāo)準(zhǔn)。
所述的冠狀病毒中華株(ZHZ)可用于抗病毒活性及藥物毒性實(shí)驗(yàn)，也可用物感染機(jī)制的研究，對(duì)天然藥物和合成藥物甚至生物活性因子均可進(jìn)行檢測(cè)。
所述的冠狀病毒中華株(ZHZ)還可用于SARS病毒的起源演化、序列分析、免疫源性和致病機(jī)理研究分析。
本發(fā)明的原理是冠狀病毒中華株(ZHZ舊名為昆徐株)系由朱宇同的研究組于1971年12月在中國(guó)昆明市分離與鑒定的。該株病毒也是亞洲首先鑒定的人冠狀病毒。此病毒標(biāo)本采自一青年女性，在輕度感冒癥狀的鼻分泌物中，同時(shí)還有鼻病毒混合感染，經(jīng)分純后，與美國(guó)冠狀病毒229E株進(jìn)行抗原分析比較，發(fā)現(xiàn)抗原比為1/32，啟示兩者有顯著差異。在同一時(shí)間內(nèi)該患者之同房間或同單位之密切接觸者并未有嚴(yán)重呼吸道感染。1973-1974年期間，我們還以此冠狀病毒ZHZ株對(duì)昆明與貴陽(yáng)兩地193例居民進(jìn)行血清中和反應(yīng)，平均陽(yáng)性率達(dá)29％，其感染率隨年齡增長(zhǎng)而增高。此病毒于1973年5月經(jīng)真空冷凍干燥保存。三十年后，2003年5月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)病毒實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開(kāi)啟此熔封玻璃管，接種于KMB17二倍體細(xì)胞內(nèi)33℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，經(jīng)培養(yǎng)出現(xiàn)典型病變后，電鏡照片也看到冠狀病毒顆粒，乃提取總RNA，運(yùn)用229E引物對(duì)ZHZ和229E病毒，同時(shí)進(jìn)行RT-PCR，發(fā)現(xiàn)229E被成功擴(kuò)增，而ZHZ未擴(kuò)增出特異條帶，提示二者在基因序列上有明顯不同。同時(shí)與上海南方基因中心合作，在已測(cè)定之80％基因序列結(jié)果中發(fā)現(xiàn)與SAR-Co Tro株有98％以上的同源性，ELISA與熒光抗體染色法亦證明兩者有一定的交叉反應(yīng)，但其在VEROE 6細(xì)胞上未有病變存在。
雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的一種代表株，而且是動(dòng)物冠狀病毒中唯一能引起呼吸道感染的模型，可引起雞的一種急性、高度接觸性的傳染病，可引起雛雞呼吸道癥狀、蛋雞產(chǎn)蛋量和蛋的品質(zhì)急劇下降以及雞的腎臟病變等。其致病性較為接近于人冠狀病毒感染，其感染死亡率達(dá)60-90％，可在呼吸系統(tǒng)引起廣泛的病變。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，猴子被認(rèn)為是較為適合的動(dòng)物模型。目前國(guó)外已能在猴體上復(fù)制出與人類(lèi)相似的SARS癥狀，但是由于猴子價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)防護(hù)要求嚴(yán)格，不適于用作廣泛的藥物篩選模型，而我們選用的IBV模型與SARS核苷酸序列有57％的同源性，我國(guó)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)辛朝安教授等在國(guó)內(nèi)對(duì)IBV的病原學(xué)進(jìn)行了廣泛的調(diào)查，并對(duì)其病毒基因序列，免疫原性、致病力和影響因素作了深入的研究。經(jīng)過(guò)多年來(lái)在我國(guó)禽類(lèi)研究部門(mén)廣泛研究實(shí)踐表明，對(duì)工作人員及環(huán)境并無(wú)任何威脅，可以考慮作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷倪x擇，利用IBV模型進(jìn)行抗冠狀病毒藥物篩選及機(jī)理方面的研究，這在國(guó)內(nèi)外也具有創(chuàng)新性和較大的實(shí)用價(jià)值。
本發(fā)明的顯著進(jìn)步和優(yōu)良效果為本方法具有容易建立、重復(fù)性好、安全，試驗(yàn)周期短、價(jià)格便宜、不需要特殊實(shí)驗(yàn)室，而且不造成生物災(zāi)害等諸多優(yōu)點(diǎn)，適用于廣泛應(yīng)用與發(fā)展和評(píng)價(jià)冠狀病毒的防治藥物和免疫調(diào)節(jié)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1人冠狀病毒中華株分離鑒定與抗原分析患者徐某，女性，20歲，于1971年患普通感冒、鼻塞流涕、全身不適、但不發(fā)熱，病程歷時(shí)三天，同室有年青女性4名，密切接觸，但未傳染發(fā)病。同一大院共一百余人也未有嚴(yán)重呼吸道疾病流行。患病次日即由我研究組取鼻分泌物加青霉素、鏈霉素各500單位/ml處理離心后，種入原代人胚腎細(xì)胞內(nèi)，33℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，維持液為0.25％水解乳白蛋白水解物Hanks液，于第一代即可見(jiàn)腎細(xì)胞單層邊緣有輕度病變，經(jīng)送軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院電鏡檢查，除發(fā)現(xiàn)有鼻病毒顆粒外，且見(jiàn)有典型之冠狀病毒，由于本室從未保存過(guò)冠狀病毒，故可排除實(shí)驗(yàn)室污染之可能。經(jīng)用血清中和鼻病毒，分純冠狀病毒后(2)，測(cè)定其為RNA核酸型，不耐酸、不耐醚，符合冠狀病毒理化性質(zhì)。
對(duì)此分離之冠狀病毒與1971年以后由北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)防治研究所分贈(zèng)之229E冠狀病毒，以人胚腎細(xì)胞擴(kuò)增此冠狀病毒與229E株上清液，用腳掌及腹腔注射豚鼠，共8次。用前以56℃30分鐘滅活，將病毒稀釋為200TCID50/0.2ml，分別與等量不同稀釋度免疫血清滅活，在37℃水浴作用1小時(shí)，再種入昆明醫(yī)學(xué)生物研究所分贈(zèng)之KMB17雙倍體細(xì)胞內(nèi)，33℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，以25％細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變者為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，并設(shè)病毒對(duì)照、血清對(duì)照與正常細(xì)胞對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1冠狀病毒中華株及229E株交叉中和反映

為避免錯(cuò)誤，重復(fù)三次結(jié)果均是如此，由于此株與美國(guó)的229E株有較大區(qū)別，又首次由中國(guó)分出，故現(xiàn)定名為冠狀病毒中華株(Zhong Hua Zhu或ZHZ)，以示地理分布差異.(舊名為昆徐株)。
實(shí)施例2人冠狀病毒中華株體外模型的建立(一)病毒選用冠狀病毒中華株，由以朱宇同為首的研究組于1971年12月在國(guó)內(nèi)昆明首先由一普通感冒患者分離。
(二)細(xì)胞KMB17雙倍體細(xì)胞，MDCK細(xì)胞(狗腎細(xì)胞)。
(三)陽(yáng)性藥物干擾素或其誘生物。
(四)病毒毒力測(cè)定KMB17雙倍體細(xì)胞33℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，加入病毒10倍稀釋液，維持液為2％胎牛血清，0.5％水解乳白蛋白與等量DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)4-6天即可出現(xiàn)典型病變(CPE)(見(jiàn)照片1-2)即細(xì)胞疏開(kāi)，有繩索狀變性及顆粒出現(xiàn)。間雜有小圓細(xì)胞。測(cè)定各病毒半數(shù)致細(xì)胞病變計(jì)量(TCID50)。電鏡檢查也看到典型顆粒(照片3)。其攻擊濃度一般用100TCID50。或用MDCK細(xì)胞在37℃、5％CO2溫箱內(nèi)，96孔凹板中培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)液與維持液同上，接種病毒6天后以NDV或VSV病毒進(jìn)行干擾試驗(yàn)，計(jì)算TCID50。
(五)藥物毒性測(cè)定MDCK細(xì)胞或KMB17雙倍體細(xì)胞培養(yǎng)，加入5倍或10倍稀釋液5-7個(gè)濃度培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，計(jì)算藥物致細(xì)胞毒性，計(jì)算最大無(wú)毒濃度(TC0)和半數(shù)中毒濃度(TC50)。
(六)抗病毒實(shí)驗(yàn)細(xì)胞病變抑制法KMB17雙倍體細(xì)胞33℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，或者M(jìn)DCK細(xì)胞37℃、5％CO2溫箱旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，加入病毒10倍稀釋液，吸附1小時(shí)，吸去病毒，加入最大無(wú)毒濃度藥液2倍稀釋液7個(gè)濃度(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128)培養(yǎng)3天，觀察細(xì)胞病變，記錄病變程度。設(shè)病毒對(duì)照(不加藥液)，細(xì)胞對(duì)照(不加病毒)，藥物對(duì)照(細(xì)胞不加病毒，加不同濃度藥液)，與實(shí)驗(yàn)組同時(shí)觀察CPE或用干擾試驗(yàn)，以NDV或VSV攻擊，2-3天后觀察，一般觀察10天左右。計(jì)算50％抑制病毒病變濃度(IC50)及治療指數(shù)(TI)。
實(shí)施例3雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)體內(nèi)模型的建立雞傳染性支氣管炎實(shí)驗(yàn)(一)病毒雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)GX1-98株，接種雞胚尿囊腔，收取尿囊液-70℃保存，作毒種。
(二)雞882雛雞，30-40g，雌雄不拘。
(三)陽(yáng)性藥物干擾素或干擾素誘生劑(四)病毒毒力測(cè)定以戊巴比妥鈉輕度麻醉，再進(jìn)行上呼吸道接種病毒，攻擊IBV，以期發(fā)生吸入性支氣管炎或肺炎，置于15-18℃、80-90％濕度條件下飼養(yǎng)，加以適當(dāng)?shù)拿庖咭种拼胧们皩?shí)驗(yàn)所需飼料、墊料、實(shí)驗(yàn)籠具均進(jìn)行消毒，連續(xù)飼養(yǎng)觀察9天。記錄死亡％及計(jì)算LD50。
(五)藥物毒性測(cè)定在1-2日齡雛雞體內(nèi)，測(cè)定急性毒性和亞急性毒性，計(jì)算LD50及LD0。
(六)抗病毒實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前，每天皆給予四環(huán)素(1mg/ml)或氟哌酸(0.2mg/ml)(混在飲水中)，一直持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，以預(yù)防細(xì)菌性感染。實(shí)驗(yàn)時(shí)先以戊巴比妥鈉輕度麻醉，再進(jìn)行上呼吸道接種病毒，攻擊IBV，以期發(fā)生吸入性支氣管炎或肺炎，置于15-18℃、80-90％濕度清潔條件下飼養(yǎng)，用前實(shí)驗(yàn)所需飼料、墊料、實(shí)驗(yàn)籠具均進(jìn)行消毒，連續(xù)飼養(yǎng)觀察9天。其中病毒攻擊后的第2-3天，實(shí)驗(yàn)小雞開(kāi)始出現(xiàn)明顯的打噴嚏、流鼻涕、拉稀便等癥狀，并可聞及呼吸羅音、甚至出現(xiàn)呼吸困難等臨床癥狀，病毒感染后第5-6天，實(shí)驗(yàn)小雞開(kāi)始出現(xiàn)死亡高峰，病理切片均可發(fā)現(xiàn)大片典型滲出性炎癥病變，免疫熒光抗體可見(jiàn)雞冠狀病毒顆粒，可證明其系由IBV引起的肺炎，計(jì)錄死亡％并計(jì)算LD50。并作免疫熒光抗體實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行定量分析與評(píng)價(jià)。設(shè)病毒對(duì)照組、給生理鹽水；陽(yáng)性藥物組給干擾素或干擾素誘生劑。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
實(shí)施例4人冠狀病毒中華株與229E株提取之RNA初步比較根據(jù)229E全序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1(5‘-CCTTGGTGGATAAACGCACT-3‘，13640-13659)和P2(5’-AACGGTGGCATTTCTGGTAG-3‘，14241-14222)，分別提取229E和ZHZ細(xì)胞培養(yǎng)的總RNA，電泳證實(shí)有大片段RNA存在，然后運(yùn)用P1和P2同時(shí)對(duì)含229E和含ZHZ的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)。1.5％瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見(jiàn)(圖4)。從圖中可看出，229E株被成功擴(kuò)增，而ZHZ株沒(méi)有被擴(kuò)增，所以我們認(rèn)為，229E與ZHZ在基因序列上有明顯差別。二者應(yīng)為不同人冠狀病毒。
實(shí)施例5冠狀病毒中華株與229E株基因序列同源性之關(guān)聯(lián)冠狀病毒中華株在KMB17二倍體細(xì)胞與MDCK細(xì)胞培養(yǎng)提取總RNA，分五批，先后送交上海中國(guó)科學(xué)院南方人類(lèi)基因研究中心，經(jīng)過(guò)重復(fù)細(xì)致分析，目前已完成中華株測(cè)序1,6000個(gè)堿基，占整個(gè)基因組的60％。在測(cè)序的16000bp堿基中，有21個(gè)堿基變化(與加拿大TRO株比較)，總變化率為0.2％。其中9個(gè)堿基變化比較肯定；令人感興趣和驚異的是，在9個(gè)變化比較肯定的位點(diǎn)中，3個(gè)位點(diǎn)是在人類(lèi)SARS病毒中發(fā)現(xiàn)有變化的，其余6個(gè)位點(diǎn)的變化均未在人類(lèi)SARS病毒序列中發(fā)現(xiàn)。上述結(jié)果表明，已測(cè)定的中華株與SARS冠狀病毒加拿大株約三分之二的基因序列同源性為98％以上，其余的基因序列正在測(cè)定與整理中。
綜上所述，此病毒由于其分離患者僅為輕度感冒，同期接觸者并無(wú)類(lèi)似的目前SARS疾病發(fā)生，在VERO E6細(xì)胞上未能引起典型病變，其免疫血清進(jìn)行SARS冠狀病毒ELISA反映，也僅有輕度陽(yáng)性結(jié)果，故兩者之間是有所不同的。
權(quán)利要求
1.一種建立冠狀病毒體內(nèi)外模型的方法包括人冠狀病毒中華株(ZHZ)體外模型和雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)體內(nèi)模型的建立，其中人冠狀病毒中華株(ZHZ)體外模型的建立為將基因序列與SARS冠狀病毒有高度同源性、致病力很低的冠狀病毒中華株接種于KMB17雙倍體細(xì)胞或MDCK細(xì)胞(狗腎細(xì)胞)，維持液為1～2％胎牛血清、0.5％水解乳蛋白與等量的DMEM培養(yǎng)液，在33～37℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)于3～5％CO2的溫箱內(nèi)的多孔凹板中4～6天，測(cè)定藥物毒性(TC50)與抑制病毒有效藥物濃度(ID50)，計(jì)算治療指數(shù)(TI)為判斷藥效標(biāo)準(zhǔn)。
2.根據(jù)權(quán)利1所述的建立冠狀病毒體內(nèi)外模型的方法，其特征在于所述的冠狀病毒中華株(ZHZ)可用于抗病毒活性及藥物毒性實(shí)驗(yàn)，也可用物感染機(jī)制的研究，對(duì)天然藥物和合成藥物甚至生物活性因子均可進(jìn)行檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利1所述的建立冠狀病毒體內(nèi)外模型的方法，其特征在于所述的冠狀病毒中華株(ZHZ)還可用于SARS病毒的起源演化、序列分析、免疫源性和致病機(jī)理研究分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種建立冠狀病毒體內(nèi)外模型的方法其特征在于包括人冠狀病毒中華株(ZHZ)體外模型和雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)體內(nèi)模型的建立；本發(fā)明具有容易建立、重復(fù)性好、安全，試驗(yàn)周期短、價(jià)格便宜、不需要特殊實(shí)驗(yàn)室，而且不造成生物災(zāi)害等諸多優(yōu)點(diǎn)，適用于廣泛應(yīng)用與發(fā)展和評(píng)價(jià)冠狀病毒的防治藥物和免疫調(diào)節(jié)。
文檔編號(hào)C12N7/00GK1528886SQ0314695
公開(kāi)日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2003年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月26日
發(fā)明者朱宇同, 趙國(guó)屏, 陳鴻珊, 辛朝安, 王小寧, 王雙印, 宋懷東, 何金洋, 楊子峰, 劉妮, 朱關(guān)福, 李國(guó)橋 申請(qǐng)人:朱宇同, 廣州中醫(yī)藥大學(xué)