專(zhuān)利名稱(chēng)：提高dna擴(kuò)增反應(yīng)效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高DNA擴(kuò)增反應(yīng)效率以及提高寡核苷酸和DNA模板雜交特異性的方法。
背景技術(shù)：
DNA擴(kuò)增在基因檢測(cè)方面尤為重要，在DNA擴(kuò)增領(lǐng)域內(nèi)，PCR方法可以使DNA序列中的目標(biāo)核苷酸序列得到大量擴(kuò)增，而且該方法不僅可以應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域，還可以應(yīng)用于很多其它領(lǐng)域。
然而，在設(shè)計(jì)特異的檢測(cè)引物時(shí)，引物必須包含一段特異于目標(biāo)序列的堿基序列。
不幸的是，包含這類(lèi)位點(diǎn)的序列往往不適于作引物。換言之，在某些情況下，比如富含AT的序列或者是正反向引物的解鏈溫度不相匹配，使擴(kuò)增效率急劇下降，致使此類(lèi)序列不適于作引物。在檢測(cè)極微量DNA時(shí)，該問(wèn)題就成為一個(gè)非常不利的因素。
而且為提高PCR的擴(kuò)增效率，需首先確定最適的反應(yīng)溫度，然而，要確定最適的反應(yīng)溫度需要進(jìn)行一系列復(fù)雜的預(yù)實(shí)驗(yàn)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使確定最適的反應(yīng)溫度的操作簡(jiǎn)單化并使得DNA擴(kuò)增反應(yīng)效率提高的方法。
另外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高寡核苷酸和DNA模板雜交特異性的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)令人意外的現(xiàn)象當(dāng)在一簡(jiǎn)并引物的5’末端加上一段人工合成的非特異序列后，PCR的擴(kuò)增效率會(huì)提高，當(dāng)把這段人工合成的非特異序列從引物的5’末端消除后，PCR的擴(kuò)增效率又會(huì)降低。
隨后，發(fā)明者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，非常出人意料的是，在引物的5’末端不論添加一段人工合成的非特異序列還是連接一個(gè)化合物，如LC-Red 705，PCR的擴(kuò)增效率都會(huì)提高，結(jié)果就使得DNA擴(kuò)增反應(yīng)效率得到提高，因此發(fā)明者完成了本發(fā)明。最適退火溫度范圍可以擴(kuò)大，這意味著研究退火溫度條件的預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚝?jiǎn)化，從而使整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程大大簡(jiǎn)化。
換言之，第一方面，本發(fā)明提供了一種提高DNA擴(kuò)增反應(yīng)效率的方法，其中，在5’末端添加一個(gè)來(lái)自下組的化合物L(fēng)C-Red 705，氨基，磷酸鹽基團(tuán)，生物素，DIG，DNP，TAMRA，Texas-Red，ROX，XRITC，若丹明，LC-Red 640，巰基，補(bǔ)骨脂(psoralen)，膽固醇，F(xiàn)ITC，6-FAM，TET，cy3，cy5，BODIPY 564/570，BODIPY 500/510，BODIPY 530/550，BODIPY 581/591(下文表述為“特定化合物組”)以及至少具有四個(gè)堿基且GC含量不低于25％的寡核苷酸(下文表述為“特定堿基序列”)的引物來(lái)作為引物。
第二方面，本發(fā)明提供了一種提高寡核苷酸和DNA樣品雜交特異性的方法，其中，在5’末端連接有選自上述特定化合物組中的某個(gè)化合物的寡核苷酸被用來(lái)與DNA雜交。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1.PCR循環(huán)數(shù)和60℃，0秒退火條件下的熒光強(qiáng)度關(guān)系圖。
圖2.PCR循環(huán)數(shù)和60℃，5秒退火條件下的熒光強(qiáng)度關(guān)系圖。
圖3.PCR循環(huán)數(shù)和60℃，10秒退火條件下的熒光強(qiáng)度關(guān)系圖。
圖4.PCR循環(huán)數(shù)和64℃，5秒退火條件下的熒光強(qiáng)度關(guān)系圖。
發(fā)明詳細(xì)描述在本發(fā)明的第一和第二方面，既沒(méi)有對(duì)連接或添加特定化合物組中的化合物和特定堿基序列的引物的特殊限制，也沒(méi)有對(duì)連接有特定化合物組中的化合物的寡核苷酸的限制，只要它們代表了通常應(yīng)用于DNA擴(kuò)增中的引物或寡核苷酸。此外，由于本發(fā)明能夠提高DNA擴(kuò)增的效率，所以一些在通常條件下不能被用于DNA擴(kuò)增的引物也可以被利用。
在本發(fā)明的第一和第二方面，特定化合物組中的化合物與通過(guò)DNA擴(kuò)增技術(shù)被擴(kuò)增的目標(biāo)序列之間沒(méi)有特定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。DIG是地高辛配基的縮寫(xiě)，DNP是二硝基苯基的縮寫(xiě)，TAMRA指的是四甲基羧基若丹明，Texas-Red是指1H，5H，11H，15H-Xantheno[2，3，4-ij5，6，7-i’j’]diquinolizin-18-ium，9-[2(或4)-[[[6-(2，5-dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-6-oxohexyl]amino]sulfonyl]-4(或2)sulfophenyl]-2，3，6，7，12，13，16，17-octahydro-，inner salt，ROX是若丹明X的縮寫(xiě)，XRITC指異硫氰酸根若丹明X，F(xiàn)ITC是異硫氰酸根熒光素的縮寫(xiě)，6-FAM指6-羧基熒光素，TET是四氯熒光素的縮寫(xiě)，BODIPY564/570是4，4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸，琥珀酰亞胺脂，BODIPY 530/550是4，4-二氟-5，7-二苯基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸，琥珀酰亞胺脂，BODIPY 581/591是4，4-二氟-5-(4-苯基-1，3-丁二烯基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸，琥珀酰亞胺脂。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，特定堿基序列可特異或非特異于要雜交的核苷酸序列。此處所應(yīng)用的“特異”不僅包括此附加到引物上的序列與模板的互補(bǔ)區(qū)段和引物與模板的雜交區(qū)段并不相鄰近的情況，還包括此附加到引物上的序列與模板的互補(bǔ)區(qū)段和引物與模板的雜交區(qū)段相毗鄰的情況(尤其是模板的3’區(qū)段要與引物的5’區(qū)段相一致)。后一種情況在現(xiàn)有技術(shù)中被用來(lái)調(diào)整引物的Tm值，然而，在本發(fā)明中則被用以提高擴(kuò)增的效率。
“非特異”包括一種引物和模板之間并不存在聯(lián)系的情況，即附加的序列含有一種不能通過(guò)GC和AT堿基配對(duì)而形成連續(xù)的雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸序列。即使在這種非特異的情況下，也可能通過(guò)本發(fā)明來(lái)提高某個(gè)引物的最高退火溫度。因此，在本發(fā)明的第一個(gè)方面，特定堿基序列對(duì)要雜交的核苷酸序列(模板DNA)來(lái)說(shuō)，可以是特異的或非特異的。然而，更優(yōu)選非特異的特定序列來(lái)提高擴(kuò)增的效率。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，可使用特定化合物組中的一個(gè)，兩個(gè)或多個(gè)化合物以及特定堿基序列。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面，可使用特定化合物組中的一個(gè)，兩個(gè)或多個(gè)化合物。
在本發(fā)明的第一和第二方面，寡核苷酸或引物也可以通過(guò)一個(gè)接頭與選自特定化合物組中的化合物相連接。適合的接頭包括2-16個(gè)碳原子的碳?xì)浠衔铩?br> 在本發(fā)明的第一個(gè)方面，附加到引物5’端的寡核苷酸(附加序列)最好含有高的GC含量。確切地說(shuō)，此寡核苷酸的GC含量必須至少是50％，并且優(yōu)選不少于四個(gè)堿基的附加序列。DNA擴(kuò)增反應(yīng)的效率隨著GC含量的增加而增大，GC含量達(dá)到60％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，甚至100％是最理想的。任何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠根據(jù)附加序列的長(zhǎng)度以及附加序列和被擴(kuò)增序列或引物間的非互補(bǔ)情況來(lái)確定GC含量。如果附加序列太長(zhǎng)就會(huì)使得DNA擴(kuò)增反應(yīng)的效率下降，典型的不超過(guò)40個(gè)堿基的附加序列是更適合的。此外，為了防止引物二聚體的形成，G或C的含量最好不低于50％，A或T的含量最好不低于50％。
下面列出了優(yōu)選的核苷酸序列的特別例子。此外，大于或等于9個(gè)堿基的序列能夠從以下2-8個(gè)堿基的核苷酸序列的恰當(dāng)?shù)慕M合產(chǎn)生。在以下序列中，S代表C或G，W代表A或T。G或C的含量最好不低于50％，A或T的含量最好不低于50％。
SS，SW，WS，SSS，SSW，SWS，WSS，SSSS，SSSW，SSWS，SWSS，WSSS，SSSSS，SSSSW，SSSWS，SSWSS，SWSSS，WSSSS，SSSSSS，SSSSSW，SSSSWS，SSSWSS，SSWSSS，SWSSSS，WSSSSS，SSSSSSS，SSSSSSW，SSSSSWS，SSSSWSS，SSSWSSS，SSWSSSS，SWSSSSS，WSSSSSS，SSSSSSSS，SSSSSSSW，SSSSSSWS，SSSSSWSS，SSSSWSSS，SSSWSSSS，SSWSSSSS，SWSSSSSS，WSSSSSSS，SSSSSSWW，SSSSSWSW，SSSSWSSW，SSSWSSSW，SSWSSSSW，SWSSSSSW，WSSSSSSW，SSSSSWWS，SSSSWSWS，SSSWSSWS，SSWSSSWS，SWSSSSWS，WSSSSSWS，SSSSWWSS，SSSWSWSS，SSWSSWSS，SWSSSWSS，WSSSWSS，SSSWWSSS，SSWSWSSS，SWSSWSSS，WSSSWSSS，SSWWSSSS，SWSWSSSS，WSSWSSSS，SWWSSSSS，WSWSSSSS，WWSSSSSS另外，寡核苷酸的特殊例子包括那些由AGTC，AAGT，GGAC或GGGC重復(fù)單元所構(gòu)成的多達(dá)20個(gè)堿基的寡核苷酸序列。
此外，附加序列最好不含有能形成阻礙擴(kuò)增反應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的核苷酸序列。顯然，在附加序列3’末端之間能形成配對(duì)的堿基越少越好，最好是沒(méi)有能形成配對(duì)的堿基。最低的優(yōu)選要求是不能有連續(xù)的堿基配對(duì)的情況發(fā)生。另外，具有附加序列的引物間能形成配對(duì)的堿基越少越好，最好是沒(méi)有配對(duì)的堿基形成。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，從前文提到的特定化合物組中的化合物或特定堿基序列能以標(biāo)準(zhǔn)的方法連接或添加到引物的5’末端。為了連接或添加兩個(gè)或多個(gè)不同的選自特定化合物組中的化合物或特定堿基序列，可采用先連接一個(gè)化合物，再合成一個(gè)包含特定堿基在內(nèi)的寡核苷酸序列，或者選擇先合成一個(gè)包含特定堿基在內(nèi)的寡核苷酸序列，再連接一個(gè)化合物的方法。一個(gè)具有兩個(gè)或多個(gè)選自特定化合物組中的化合物或添加了特定堿基序列的引物的例子是具有添加了雙倍重復(fù)序列的GGGC的FITC。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面，從前文提到的選自特定化合物組中的化合物能以標(biāo)準(zhǔn)的方法連接到一段寡核苷酸序列的5’末端。為了連接兩個(gè)或多個(gè)不同的從特定化合物組中選擇的化合物或特定堿基序列，可采用先連接一個(gè)化合物，再合成一個(gè)包含特定堿基在內(nèi)的寡核苷酸序列，或者選擇先合成一個(gè)包含特定堿基在內(nèi)的寡核苷酸序列，再連接一個(gè)化合物的方法。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，通過(guò)將選自特定化合物組中的化合物連接到一條引物上或者在一條引物上添加特定堿基序列，引物與擴(kuò)增產(chǎn)物的退火速度及退火穩(wěn)定性均能得以提高，意味著該引物非常適用于常規(guī)PCR。引物與擴(kuò)增產(chǎn)物的退火速度及退火穩(wěn)定性的提高在特定堿基序列與模板DNA不能完全配對(duì)時(shí)也能被觀(guān)察到(見(jiàn)表2所示結(jié)果)。
另外，本發(fā)明也能很好地應(yīng)用于不對(duì)稱(chēng)PCR。
不對(duì)稱(chēng)PCR指的是一種快速擴(kuò)增單鏈DNA的方法，比如在需要對(duì)目標(biāo)DNA片段直接進(jìn)行測(cè)序的情況下。換言之，盡管在常規(guī)PCR反應(yīng)中所使用的引物對(duì)的濃度相等，但在不對(duì)稱(chēng)PCR反應(yīng)中，引物對(duì)中的一條引物的濃度比另一條引物的濃度提高數(shù)倍或數(shù)十倍。通過(guò)這種操作，低濃度的引物首先被消耗掉，接下來(lái)的PCR反應(yīng)只是由剩下的高濃度引物來(lái)進(jìn)行，從而產(chǎn)生大量的與高濃度引物相對(duì)應(yīng)的單鏈DNA。此外，溫度不對(duì)稱(chēng)PCR，一種特殊類(lèi)型的不對(duì)稱(chēng)PCR，其所使用的引物對(duì)的Tm值相差至少10℃，且首輪PCR反應(yīng)是在具有較低Tm值的引物也發(fā)生退火的條件下進(jìn)行的，隨后的PCR反應(yīng)是只在具有較高Tm值的引物發(fā)生退火的條件下進(jìn)行的。
然而，不對(duì)稱(chēng)PCR受到下述各類(lèi)問(wèn)題的困擾。也就是說(shuō)，如果模板DNA與引物的濃度條件不是最優(yōu)化的，那么單鏈DNA的擴(kuò)增量會(huì)很低(Production of Single Stranded DNA by Asymmetric PCR，PCR Protocols，Aguide to Methods and Applications，Academic Press Inc.1990)。但是，此類(lèi)優(yōu)化選擇過(guò)程需要繁雜的預(yù)實(shí)驗(yàn)。
此外，在溫度不對(duì)稱(chēng)PCR中，必須準(zhǔn)備一套退火溫度差異至少有10℃的特異引物，而這未必是一項(xiàng)簡(jiǎn)單的工作。
另一種快速擴(kuò)增單鏈DNA的方法利用了引物對(duì)內(nèi)擴(kuò)增能力的不同。例如，可以利用DNA與RNA的混合引物。在延伸反應(yīng)中RNA引物所起的作用要弱于DNA引物，因此如果PCR反應(yīng)是以這種混合型引物進(jìn)行的，那么純DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物就多，就可以產(chǎn)生單鏈DNA。
然而，該方法中單鏈DNA的獲得是由于RNA引物的低擴(kuò)增能力所導(dǎo)致的，而非由于DNA引物擴(kuò)增能力的提高所引起的。
相反地，在本發(fā)明的第一個(gè)方面，只在引物對(duì)中的一條引物上連接從特定化合物組中選擇的化合物或添加特定堿基序列，兩引物間的擴(kuò)增效率就會(huì)有很大不同，這意味著使模板DNA與引物的濃度條件達(dá)到最優(yōu)化的復(fù)雜操作是不必要的。因此，將本發(fā)明的第一個(gè)方面應(yīng)用于不對(duì)稱(chēng)PCR，就可使單鏈DNA的擴(kuò)增效率得到顯著提高。此外，本發(fā)明的第一個(gè)方面也可使引物的最適退火溫度范圍擴(kuò)大，從而使本發(fā)明也可以應(yīng)用于溫度不對(duì)稱(chēng)PCR中。
通常地，不對(duì)稱(chēng)PCR通過(guò)抑制引物對(duì)中的一條引物的延伸進(jìn)行，更確切地說(shuō)，是通過(guò)有效降低整個(gè)PCR反應(yīng)的效率實(shí)現(xiàn)。相反地，本發(fā)明的第一個(gè)方面可以使不對(duì)稱(chēng)PCR在提高引物對(duì)中的一條引物的擴(kuò)增效率的條件下進(jìn)行。換言之，與常規(guī)PCR相比，應(yīng)用本發(fā)明的不對(duì)稱(chēng)PCR不會(huì)使擴(kuò)增反應(yīng)效率降低。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面在產(chǎn)生單鏈DNA并維持高水平的擴(kuò)增效率的情況下是尤為有效的，例如在檢測(cè)像病原體這樣含有極微量DNA的生物，并將它們快速而容易地分類(lèi)的情況下。
此外，本發(fā)明也能被很好地應(yīng)用于簡(jiǎn)并PCR。在簡(jiǎn)并PCR中，幾百和幾千條不同引物的混合物的使用，意味著混合物中每條引物最適的退火溫度是不同的，結(jié)果就使擴(kuò)增反應(yīng)溫度的設(shè)定變的相當(dāng)困難。然而，這類(lèi)問(wèn)題亦可由本發(fā)明解決。而且由于可設(shè)定一個(gè)相對(duì)高的退火溫度，非特異擴(kuò)增得到抑制，從而獲得更高的擴(kuò)增效率。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，連接有選自特定化合物組中的化合物的引物可被用來(lái)作為探針使用。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面，使用5’末端連接有選自特定化合物組中的化合物的寡核苷酸可以提高該寡核苷酸與DNA的雜交效率。換言之，與沒(méi)有結(jié)合特定化合物的寡核苷酸相比，結(jié)合有特定化合物的寡核苷酸既能提高與DNA雜交的速度，又能提高雜交的穩(wěn)定性。
實(shí)施例下文是基于一系列實(shí)施例上的對(duì)本發(fā)明的更加詳盡的描述。然而，本發(fā)明卻不會(huì)局限于下述實(shí)施例。
實(shí)施例1擴(kuò)增反應(yīng)中退火溫度上限的比較用5’末端連接有選自特定化合物組中的化合物的引物來(lái)檢測(cè)副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，采用的是Hybaid公司生產(chǎn)的，帶有梯度阻隔模塊的PCR反應(yīng)儀，擴(kuò)增反應(yīng)中退火溫度的上限是由下文所述條件下的受控PCR來(lái)測(cè)量的。
檢測(cè)副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)所利用的引物是以序列1所示的核苷酸序列作為正向引物，以序列2所示的核苷酸序列作為反向引物。
序列1aagaagacct agaagatgat序列2gttaccagta atagggca表1中所示的特定化合物組中的每一種化合物均被連接到正向與反向引物的5’末端。另外還需準(zhǔn)備的工作是，從副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的菌株(IFO12711T)中提取染色體DNA作為模板，PCR反應(yīng)采用rpoD基因的通用擴(kuò)增引物(參考日本未經(jīng)審查的專(zhuān)利申請(qǐng)，
發(fā)明者小泉雄史, 濱野葉子, 山本敏 申請(qǐng)人:株式會(huì)社日冷