專利名稱：一種基于dna芯片的基因分型方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因分析領域中一種基因分型方法及其應用，特別涉及一種基于DNA芯片的基因分型方法及其應用。
背景技術：
在不同個體之間進行組織器官移植時，受體和供體雙方的相互接受程度被稱為組織相容性(histocompatibility)。導致對移植器官產生排斥反應的抗原稱為移植抗原(transplantation antigen)或稱組織相容性抗原(histocompatibility antigen)。機體內與排斥反應有關的抗原系統(tǒng)多達20種以上，其中能引起強急性排斥反應的稱為主要組織相容性抗原(major histocompatibility antigen)，其編碼基因是一組緊密連鎖的基因群，稱為主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)?，F(xiàn)已證明，控制機體免疫應答能力與調節(jié)功能的基因(immune response gene，IR gene)也存在于MHC內。因此，MHC不僅與移植排斥反應有關，也廣泛參與免疫應答的誘導與調節(jié)。不同種屬的哺乳類動物其MHC及編碼的抗原系統(tǒng)有不同的命名，小鼠的主要組織相容性抗原系統(tǒng)稱為H-2系統(tǒng)，人類的主要組織相容性抗原系統(tǒng)命名為HLA，即人白細胞抗原(human leukocyte antigen)，是由HLA基因復合體(HLA genecomplex)編碼的。HLA基因復合體是人類主要組織相容性復合體(majorhistocompatability complex，MHC)的一部分，是一個與組織抗原和免疫應答相關的基因簇。HLA基因復合體位于人第6號染色體短臂上4000kb的DNA片段內，約占人體整個基因組的1/3000，是目前已知的人類最復雜的基因系統(tǒng)之一。HLA復合體已經發(fā)現(xiàn)基因座位有224個，傳統(tǒng)上按其產物的結構、表達方式、組織分布與功能可將這些基因座分為三類即HLA-I，HLA-II，HLA-III。而每一類基因座位中又有數(shù)百種等位基因(allele)。
目前，同種異體間的組織器官移植(allograft)已經成為醫(yī)學臨床上治療某些惡性疾病的有效手段。而異體移植物(如腎臟、心臟、皮膚等)能否在接收者體內存活并行使正常生理功能，是臨床醫(yī)學的重大研究課題，也是人們極為關心的問題。免疫學研究的發(fā)展闡明了移植物的排斥反應是機體免疫系統(tǒng)的正常功能——排斥異物所造成的。通過眾多免疫學家的深入研究，終于發(fā)現(xiàn)由組織相容性復合體(MHC)基因編碼的蛋白質——人白細胞抗原(HLA)是移植排斥產生的主要決定因素。進一步的研究表明，HLA在抗原遞呈和免疫應答調控方面還具有極為重要的功能，對研究自身免疫性疾病、病毒感染性疾病以及腫瘤的發(fā)病機理可提供有益的幫助(So-loskiMJ，Szperka ME，Davies A，Wooden SL.Host immune response to intracellular bac-teriaA role for MHC-linked class-Ib antigen-presenting molecules.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.2000；224231-9.)。由于HLA在群體中不同個體之間呈現(xiàn)高度多態(tài)性，不同個體對抗原的免疫應答程度和能力也存在差異，因而對疾病的易感性和抗性也有所不同，因此研究HLA對診斷和防治疾病具有積極的意義。另外，由于HLA具有單倍型遺傳和共顯性表達的特點，所以HLA還可作為法醫(yī)鑒定、親子鑒定及遺傳學研究的重要指標。但是，這些工作的開展都必須依賴于對HLA進行準確地分型。因此，HLA分型技術是現(xiàn)代醫(yī)學和免疫學研究的支撐性技術。
HLA分型指的是用血清學、細胞學、分子生物學的技術和方法或其它的技術和方法對人類的HLA抗原特異性進行準確鑒定的一種技術。目前常用的鑒定方法有三種，它們分別是60年代建立起來的并不斷完善的血清學分型法、細胞學分型法和80年代后期建立起來的并快速發(fā)展的DNA分型法。
1、血清學分型技術血清學分型法有白細胞凝集試驗、淋巴細胞毒試驗、抗體依賴細胞介導淋巴細胞毒試驗等。目前普遍采用的是Terasaki于1964年建立，后經幾度改良的微量淋巴細胞毒試驗(microlymphocytotoxicity test)或稱補體依賴的細胞毒試驗(complementdependent cytotoxicity test)?；驹硎强贵w(IgG或IgM)與活的淋巴細胞膜上相應的抗原結合，在補體存在的條件下破壞淋巴細胞膜，染料(曙紅或錐藍)進入細胞而染色?；罴毎蚣毎ねㄍ感詻]有改變，染料不能進入細胞而不能著色。通過顯微鏡觀察，估算出死亡細胞的數(shù)目，用計分方法反映細胞毒反應強度。一般必須通過兩個分型血清交叉進行。根據分型血清的特異性就可以檢出被檢細胞的抗原特異性。標準抗血清多取自多次經產婦或計劃免疫志愿者。標準血清學方法存在著諸多的不足，例如①隨著新的等位基因特異性被發(fā)現(xiàn)，血清學方法難以獲得相應的標準抗血清；②較多的交叉反應使亞型分辨困難；③標準血清的篩選技術復雜、難度大，至今C位點的血清學分型仍缺乏理想的試劑。
80年代末期，出現(xiàn)了單維等電聚焦(ID-IEF)法用于HLA抗原的分型，但其技術條件高、操作復雜，只能作為血清學的一種補充?；谘鍖W原理和分辨水平的單克隆抗體分型技術于1994年首先由美國萊姆德公司研制成功，克服了許多血清學的不足，分型時間縮短、特異性提高，已被很多臨床實驗室采納。雖然目前血清學分型仍是一種占有重要地位的分型技術，但是由于其具有一些在技術上無法克服的缺陷，近年來國際上已經把研究重點放到基因分型上。
2、細胞學分型技術細胞學分型是采用混合淋巴細胞培養(yǎng)(mixed lymphocyte culture，MLC)的方法。當同種異體淋巴細胞的HLA抗原不同時，將兩種淋巴細胞混合培養(yǎng)，將會刺激對方細胞發(fā)生增殖反應，通過檢測淋巴細胞的增殖程度就可了解兩者抗原的同源性程度。HLA-Dw特異性與HLA-DP特異性可分別通過純合分型細胞(homozygote typing cell，HTC)及預致敏淋巴細胞試驗(primed lymphocyte test，PLT)檢測。二種方法的基本原理均是判斷淋巴細胞在識別非己HLA抗原決定簇后發(fā)生的增殖反應。由于分型細胞來源困難以及操作手續(xù)繁瑣，細胞學分型技術已逐漸被淘汰。
3、HLA的DNA分型技術HLA的DNA分型技術始于80年代末，近年逐漸發(fā)展成熟。主要方法包括限制性酶切片段長度多態(tài)性分析(RFLP)、測序與單鏈構象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)、寡核苷酸探針雜交(PCR-SSOP)和順序特異引物聚合酶鏈反應(PCR-SSP)方法。盡管血清學對I類抗原分型有較高的準確性和實用性，但與DNA分型結果比較仍存在一定的誤差。在HLA-I類血清學誤差中，1/3是亞型誤差、50％是由于血清學空白位點經DNA證實存在第二個位點。由于HLA的基因分型法準確率高，操作相對簡單，近年來已被國內外大多數(shù)實驗室采用。
(1)限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)檢測技術這是于80年代后期首先建立的對多態(tài)性進行檢測的DNA分析技術(Oertel M，Berr F，Schroder S，Schwarz R，Tannapfel A，Wenzke M et al.Acute rejection of hepatic allogra-ftsfrom HLA-DR13(Allele DRB1(*)1301)-positive donors.Liver Transpl.2000；6728-33.)(Erlich U.S.Pat.No.4,582,788)。個體間抗原特異性來自氨基酸順序的差別，后者由編碼基因的堿基順序不同所決定。這種堿基順序的差別造成限制性內切酶識別位置及酶切位點數(shù)目的不同，從而產生數(shù)量和長度不一的DNA酶切片段。用特異性探針對整個基因組DNA酶切片段進行雜交，即可分析限制性長度片段多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)。一定的內切酶組合所得到的HLA-RFLP可以和傳統(tǒng)方法測定的HLA特異性型別相關。80年代末發(fā)展起來的PCR(polymerase chain reaction)技術已被用于RFLP分析，即用等位特異限制酶裂解PCR擴增的片段，然后再進行分析，從而大大提高了靈敏度。
其缺點是獲得一個完全的HLA-II樣品分型至少需要2周的時間，且探針的放射性標記使得該技術只能在少數(shù)實驗室中進行。
(2)PCR/SSO技術到1989～1991年，分子生物學已經建立起新的HLA-II類基因分型標準(MiddletonD，Williams F，Cullen C，Mallon E.Modification of an HLA-B PCR-SSOP typing systemleading to improved allele determination.Tissue Antigens 1995；45232-6.)。此法用人工合成的HLA型別特異的寡核苷酸序列作為探針，與待檢細胞經PCR擴增的HLA基因片段雜交，從而確定HLA型別，PCR技術可將HLA復合體上指定基因片段特異性地擴增5～6個數(shù)量級；而專門設計的序列特異的寡核苷酸(sequence specific oligonucleotide，SSO)探針又能探測出等位基因間1-2個核苷酸的差異，故PCR/SSO技術具有靈敏度高、特異性強、需樣本量少等優(yōu)點。
該方法的缺點是對每一種探針都要制備條件一致的膜，隨著探針數(shù)目的增加，膜的數(shù)目可能會很大。如果想使膜重復使用，則必須在雜交完成后將探針清除掉，而這種工作目前還不能實現(xiàn)自動化，可以想象該工作的復雜程度。
鑒于該方法的不足，現(xiàn)在世界上一些有實力的公司正在對其進行改進，如美國的Roche公司已經于最近開發(fā)出了一種反向雜交技術(Reverse line strip typingmethod)，其顯色方法是酶學方法，其操作程序非常復雜，要求極為嚴格，操作不當很容易得不到理想的結果。
3.3、PCR/SSP技術目前常規(guī)的HLA-DNA分型技術，包括上述的PCR/RFLP、PCR/SSO等，最終均需用標記的特性探針與擴增產物進行雜交，再分析結果。而PCR/SSP方法是設計出一整套等位基因組特異性引物(sequence specific primer，SSP)，借助PCR技術獲得HLA型別特異的擴增產物，可通過電泳直接分析帶型決定HLA型別，從而大大簡化了實驗步驟，使整個檢測過程縮短為2～3個小時(Mytilineos J，Lempert M，Scherer S，Schwarz V，Opelz G Comparison of serological and DNA PCR-SSP typing results for HLA-A andHLA-B in 421 Black individualsa Collaborative Transplant Study report.Hum.Immunol.1998；59512-7.)。
但該方法的缺點也是顯而易見的，對于一份未知樣品，需要用各種序列特異的引物去試，需要做大量的PCR實驗，還要做大量的瓊脂糖凝膠電泳，工作量是巨大的。但是該方法快速簡便，所以已經有數(shù)家國際大公司開發(fā)出了試劑盒和自動化分析儀器，使工作量大大降低，使其成為目前國際分型市場上的一種重要方法。但是，由于HLA序列的高度多態(tài)性和特異性，對同一種型號下的各種亞型的區(qū)分就比較困難，很難做到較高的分辨率。
由于傳統(tǒng)方法在II類抗原分型方面困難較大，故大部分的基因分析型方法目前主要用于II類基因座。此外，目前已建立的HLA基因分型技術還包括PCR單鏈構像多態(tài)性分析(PCR-single strand conformational polymorphism，PCR-SSCP)和PCR異源二聚體電泳多態(tài)即PCR指紋圖(PCR fingerprinting)分析。DNA分型技術的應用，使HLA型別分析達到了更精細的水平，并因此發(fā)現(xiàn)了更多的HLA多態(tài)性。HLA的DNA分型技術現(xiàn)已成為血清學方法的有力競爭者，并可能在不久的將來完全取而代之。
4、基于DNA芯片的HLA分型技術鑒于HLA分型的在醫(yī)學、免疫學、遺傳學等方面的重要性，HLA分型技術一直是一個倍受關注的研究熱點。除了已有的分型技術如血清學方法、細胞學方法、DNA分型方法得到進一步發(fā)展外，近年來又有一些新的方法和技術出現(xiàn)。例如，Roche公司的Sturniolo等根據人類白細胞抗原空間構像的特異性，利用噬菌體展示技術和蛋白質芯片技術相結合而發(fā)展了一種可用于HLA分型的新技術；Worrall等報道引物延伸技術和時間飛行質譜相結合有可能發(fā)展成為一種高通量的HLA分型技術，只是目前其成本還較高；近年來快速發(fā)展的毛細管電泳技術有可能成為另一種對HLA進行高分辨率分型的方法。另外，隨著生物芯片技術的迅速發(fā)展，基于生物芯片的HLA分型技術正日益受到人們的關注。
自從Fodor等1991年在著名雜志Science上提出DNA芯片的概念后，近年來以DNA芯片為代表的生物芯片(biochip)技術得到了迅猛發(fā)展，目前已有多種不同功用的芯片問世，而且，這些芯片中有的已經在生命科學研究中開始發(fā)揮重要作用。生物芯片采用了光刻加工等縮微技術，將生命科學中許多不連續(xù)的過程如樣品制備、化學反應和檢測等步驟移植到芯片中并使其連續(xù)化和微型化。這種基于微加工技術發(fā)展起來的生物芯片，可以把成千上萬乃至幾十萬個生命信息集成在一個很小的芯片上，對基因、抗原和活體細胞等進行測試分析。用這些生物芯片所制作的各種不同用途的生化分析儀和傳統(tǒng)儀器相比較具有體積小、重量輕、成本低，便于攜帶，防污染、分析過程自動化、分析速度快、所需樣品和試劑少等諸多優(yōu)點。因此，生物芯片技術必將在HLA分型領域發(fā)揮革命性的作用。雖然目前已經開發(fā)出了各種HLA分型用的試劑盒和方法(Kashiwase K.DNA typing methods of HLA.Rinsho Byori 1999；Suppl 11099-106.)，但由于HLA系統(tǒng)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為復雜的人類基因序列，而且每年都有5％左右的新序列被發(fā)現(xiàn)，所以HLA分型的難度將不斷增加。而生物芯片所具有的高通量、并行分析、易于操縱、所需試劑量少、檢測快速等特點使其成為HLA分型最為理想的工具，現(xiàn)在已經有一些研究者開展了這方面的積極探索(Cao K，Chopek M，F(xiàn)ernandez-VinaMA.High and intermediate resolution DNA typing systems for class I HLA-A，B，C genesby hybridization with sequence-specific oligonucleotide probes(SSOP).Rev.Immunogenet.1999；1177-208.；Guo Z，Hood L，Petersdorf EW.Oligonucleotide arrays for highresolution HLA typing.Rev.Immunogenet.1999；1220-30.)
發(fā)明創(chuàng)造內容本發(fā)明的目的是提供一種對目的基因進行分型的方法。
本發(fā)明所提供的對目的基因進行分型的方法包括a)從合適樣品中分離含有目的基因的靶細胞；b)目的核苷酸序列的制備，所述目的核苷酸序列至少是所述目的基因的一部分；與所述目的基因不相關的另一核苷酸序列的制備；c)提供一種芯片，所述芯片上固定了能和所述目的核苷酸序列雜交的寡核苷酸探針和至少一種以下對照探針陽性對照探針、陰性對照探針、雜交對照探針和固定化對照探針；d)使步驟b)中所述目的核苷酸序列和/或所述另一核苷酸序列和步驟c)中所提供的芯片雜交，根據所述目的核苷酸序列和/或所述另一核苷酸序列與所述芯片上的所述探針的雜交結果來對所述目的基因進行分型。
此方法適用于對靶細胞(如白細胞)的目的基因的進行分型。其它的靶細胞還包括動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、重組細胞、培養(yǎng)細胞等。
此方法可用于任何目的基因的分型，如人類白細胞抗原(HLA)基因，HLA-I類基因或II類基因。
任何合適的樣品，如含有人類核酸的血液、唾液、毛發(fā)、人體組織等都能用于此方法。血液樣品指血清、血漿或全血，可以是新鮮的或者冷藏的。
靶細胞能用任何合適的方法從樣品中被分離出來。例如，靶細胞能用磁珠從樣品中分離。這種磁珠直徑最好為5um到大約200um。
這種磁珠能用任何適當?shù)姆椒ㄖ苽?。例如，專利CN 01/109870.8、專利CN Pat.NO.01134861.5或WO02/075309中公布的方法。
任何適當?shù)拇判晕镔|都可用此方法制備磁性微球。這些磁性物質包括鐵磁物質，亞鐵磁物質，順磁物質以及超順磁物質等。構成磁珠的順磁物質可以是順磁金屬氧化物。順磁金屬氧化物優(yōu)選的是某種過渡元素或它們的合金的金屬氧化物，如鐵、銅、鈷、錳、鎳、鉭、鋅、鋯等任何合適的過渡元素或Fe3O4或Fe2O3。磁珠中的磁性物質可包含金屬成份。金屬成份可以是過渡元素或它們的合金，如鐵、銅、鈷、錳、鎳、鉭、鋅、鋯和鈷-鉭-鋯合金等。
磁珠可由可用的前體小珠制成，也可用原材料制備，或者由專利U.S.Patent No.5,834,121中公布的單體交聯(lián)形成的包被于金屬氧化物外形成的剛性聚合體制成?？勺鳛榭纱呕牧系暮线m物質包括磁鐵礦、鐵氧體、錳、鈷、鎳、赤鐵礦以及各種合金等鐵的氧化物。磁鐵是最適合的金屬氧化物。通常，金屬鹽被轉化為金屬氧化物，然后用聚合物包被，或被含有還原基團的熱塑樹脂小珠吸收。如果用金屬氧化物顆粒制備疏水的前體顆粒，必須用熱塑乙烯聚合體包被。最好用聚苯乙烯，它能與多孔基質結合。磁性顆粒能用以下幾種方法制備，參見磁學和磁性材料雜志，15-181117-18，1980；Matijevic，Acc.Chem.Res.，1422-29，1981以及U.S.Patent.No.5091206；4774265；4554088；and 4421660。前體小珠的制備方法見專利U.S.Patent.Nos.5395688；5318797；5283079；52327892；5091206；4965007；4774265；4654267；4490436；4336173；and 4421660，或者使用合適的商用產品。前體小珠最好是由聚乙烯包被的磁性小珠。這樣的磁珠可以從Dynal公司(Lake Success，N.Y.)，RhonePoulonc(France)公司和SINTEF(Trondheim，Norway)獲得。也可以使用有色小珠或磁珠，其表面先包被一層不穩(wěn)定的聚合物，其外層再包被一層穩(wěn)定的剛性聚合物。
所述目的核苷酸序列的制備可以包括擴增的步驟?？捎梅蛛x的靶細胞直接擴增，也可以先提取DNA再擴增。如可利用磁珠從全血中分離白細胞，用提取的核酸或直接用分離的白細胞作模板，擴增目的核酸序列，擴增得到的單鏈DNA或RNA可含有熒光或生物素標記的，標記的DNA或RNA可不經純化直接用于雜交。
可使用任何適當?shù)臄U增方法，如聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)，連接酶鏈反應(ligase chain reaction，LCR)，基于核酸序列的擴增(nucleicacid sequence-based amplification，NASBA)，鏈置換擴增(strand displacementamplification，SDA)、滾環(huán)復制(RCA)和轉錄介導的擴增(transcription medicatedamplification，TMA)等。TMA方法最好使用T7啟動子。
單鏈RNA也可以通過TMA方法得到。含有一個T7啟動子的引物使用RNA聚合酶用于擴增。用單鏈DNA或RNA雜交，避免了用雙鏈所帶來的PCR產物的純化和變性以及雜交信號弱或丟失的問題。
最好使用不對稱PCR進行樣品制備。不對稱PCR中兩條引物可以是任何適當?shù)谋壤热鐝?∶5到1∶200。不對稱PCR中兩條引物可以有相同的或者不同的Tm值，例如兩引物的Tm值的差異可以是1℃到20℃。不對稱PCR也可以使用三條引物，兩條有相同或相近的Tm，另一條相差范圍1℃到20℃。引物可以是直鏈或帶有發(fā)卡結構?？墒褂脝我换蚪M合的退火溫度。例如不同的退火溫度可以相差1℃到20℃。有較低的Tm值的引物可以用于雙鏈的擴增，另一條有較高的Tm值的引物可以在有一定雙鏈后擴增單鏈DNA。通過這種PCR過程產生的單鏈目的核苷酸可以不經過純化直接用于雜交。
所述制備目的核酸序列的方法可以用于核酸樣品的快速制備和對樣品進行主動式操作以便構建微全分析系統(tǒng)(或芯片實驗室)。
步驟b)制備的目的核苷酸序列可以是單鏈、雙鏈或三鏈。步驟b)制備的目的核苷酸序列最好是單鏈DNA或RNA。步驟b)制備的目的核苷酸序列可以是正義鏈或反義鏈。單鏈DNA或RNA最好是正義鏈或反義鏈。步驟b)也可以制備帶標記的目的核苷酸序列，最好使用熒光或生物素標記。
所述另一寡核苷酸序列最好與芯片上的陽性對照探針、陰性對照探針或雜交對照探針互補。
所述固定于芯片上的探針可以是正義鏈或反義鏈。這些芯片上的探針可以被修飾，修飾方法可以是5′-NH2修飾、5′-SH修飾、5′-polyT(or A，C or G)修飾、5′-biotin修飾、3′-NH2修飾、3′-SH修飾、3′-polyT(or A，C or G)修飾和3′-biotin修飾等。
芯片上可固定任何合適數(shù)目和類型的探針。例如芯片能有1-400種不同類型的探針。再比如芯片能含有多個探針陣列，每一個陣列可以含有1-400種不同類型的探針。
所有探針可在任何適當?shù)臏囟认鹿潭ㄓ谛酒稀Ｈ?7℃～100℃。芯片表面可以被修飾，典型的修飾包括醛基、氨基、聚賴氨酸、巰基、BSA、鏈親和素、瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺膠修飾。
可以對所述探針的序列、純度、末端標記情況等進行評估。最好是使用DHPLC。如通過DHPLC可測得探針的純度和末端修飾狀況。末端修飾是探針質量的一個重要的指標。DHPLC能夠分離末端修飾的探針和沒被修飾的探針，這樣可以用于探針的質量控制。一個用DHPLC來估測探針末端NH2修飾的例子如圖6A-圖6D所示，圖6A代表的是純度很高的探針；圖6B代表的是含少量雜質的探針；圖6C代表的是含較多雜質的探針；圖6D代表的是純度很差的探針。DHPLC也可以用來檢測探針中堿基的突變或者缺失。
芯片上每種探針可固定任何數(shù)目的拷貝，如1-10拷貝。
所述多拷貝或任何合適數(shù)目探針可以以任何適當?shù)慕M合形式固定于芯片。如所述多拷貝或任何合適數(shù)目探針可以是連續(xù)的或者分開的固定于芯片表面。最好每種陽性對照探針有多個拷貝、多種不同長度和序列。當固定于芯片上的探針與步驟b)制備的目的核苷酸序列或另一核苷酸序列雜交時，能產生不同量級的由強至弱或由弱至強的雜交信號。
本發(fā)明的方法可使用任何適當?shù)年栃詫φ仗结槨ｊ栃詫φ仗结樧詈媚芘c目的核苷酸序列、以目的核苷酸序列為模板擴增產生的核苷酸序列或人工合成的核苷酸序列的一部分互補。
本發(fā)明的方法可使用任何適當?shù)年幮詫φ仗结?。陰性對照探針最好能與陽性對照探針有1-3個堿基對的錯配。
本發(fā)明的方法可使用任何適當?shù)碾s交對照探針。雜交對照探針最好與人工合成的與目的基因無關的核苷酸序列互補，也可與一段人工合成的經標記的序列互補或與一段人工合成的經標記的序列有1-2堿基對的錯配。
本發(fā)明的方法可使用任何適當?shù)墓潭ɑ瘜φ仗结?。它是芯片表面化學修飾、點樣和固定化過程的內部對照。它不與任何核酸序列雜交。固定化對照探針可一端進行化學修飾，另一端帶有可檢測的標記。
本發(fā)明的方法所用到的芯片可包含任何一條、部分或全部陽性對照探針、陰性對照探針、雜交對照探針、固定化對照探針。例如一種芯片可包含陽性對照探針、陰性對照探針、雜交對照探針和固定化對照探針。這些對照探針可用任何排布方式固定于芯片上。例如它們可以被排布在芯片的四角、中心等進行有規(guī)律的排布或隨機排布。
所述步驟(d)中的雜交可以在任何雜交液中進行。如含有SSC和表面活性劑的雜交液。雜交液可以含有任何濃度的SSC(包括氯化鈉和檸檬酸鈉)，例如3×-10×的SSC。也可以使用任何適當?shù)谋砻婊钚詣?，如SDS，Triton100，SLS(十二烷基肌氨酸鈉)等。雜交液中也可以有任何濃度的表面活性劑，如0.05％-5％(w/w)。
所述步驟(d)中的雜交可在任何適當?shù)臏囟认逻M行，如42℃-70℃。
本發(fā)明的方法還包括雜交后的洗脫步驟。可使用任何適當?shù)南疵撘?。洗脫液可含?％-2％(w/w)的表面活性劑，洗脫可持續(xù)適當?shù)臅r間，如5-30分鐘。
可使用任何適當?shù)姆椒z測不同探針的固定效率。例如固定效率可通過分析固定化對照探針的信號來檢測。固定化對照探針可帶有可檢測的標記，如熒光分子。
總體雜交效率，包括與目的核苷酸序列互補的寡核苷酸探針和各種對照探針的雜交效率，可通過任何適當?shù)姆椒ㄟM行檢測。例如可通過分析雜交對照探針和人工合成的與目的基因無同源性的核苷酸序列的雜交信號的進行判斷。
總體雜交特異性，包括與目的核苷酸序列互補的寡核苷酸探針和各種對照探針的雜交特異性，可通過任何適當?shù)姆椒z測。例如總體雜交特異性可以通過分析陽性對照探針的雜交信號和陰性對照探針的雜交信號的比值，以及陽性雜交對照探針的雜交信號和陰性雜交對照探針的雜交信號的比值來檢測。比值提高意味著雜交特異性的提高。
陽性信號可以用任何適當?shù)臉藴蕘泶_定。例如，當一組緊密相關的探針進行雜交時，陽性信號可以以下的標準進行判定(a)雜交信號和背景噪音的比值大于3；(b)雜交信號相對一個相關的陽性對照探針雜交信號的比值在一個預先確定的范圍；(c)比較所有根據步驟b和c表現(xiàn)出陽性的探針的雜交信號；或者根據步驟b和c，僅一個探針表現(xiàn)出陽性的時候，比較表現(xiàn)出最強雜交信號的兩個探針的雜交信號來確定信號是陽性還是陰性，(d)在緊密相關的探針組里只有2個或少于2個陽性信號。
緊密相關的探針組可以根據任何適當標準確定。例如一組設計用來檢測特定位點的多態(tài)性的探針可被用作一組緊密相關的探針。這種多態(tài)性差異包括單堿基變化或者多堿基的變化。正常情況下，堿基對的變化位于探針的長度之內，例如20堿基對。
上述預先確定的范圍會根據探針的不同而不同。這個范圍可以通過經驗獲得。例如，這個范圍可以通過用已知的HLA標準序列做多次(例如成百次)雜交試驗來獲得。
本發(fā)明的方法適用于任何基因的分型分析。例如，可以用和目的HLA基因互補的寡核苷酸探針來進行HLA分型。寡核苷酸探針最好具有以下的序列(a)能在高嚴謹雜交條件下和目的HLA序列或其互補序列進行雜交的序列，如序列表中的序列；或(b)能夠和目的HLA序列或其互補序列至少有90％的匹配率。寡核苷酸探針最好包括序列表中列出的核酸序列或者其互補序列。芯片可以包括部分或全部序列表中列出的核酸序列或其互補序列。
序列表中，SEQ ID №1至SEQ ID №94為HLA-A的分型探針序列；SEQ ID №95至SEQ ID №170為HLA-B的分型探針序列；SEQ ID №171至SEQ ID №214為HLA-DRB1的分型探針序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種對HLA目的基因進行分型的寡核苷酸探針。
本發(fā)明所提供的對HLA目的基因進行分型的寡核苷酸探針包含如下序列a)能夠在高嚴謹性條件下與目的HLA基因核苷酸序列或其互補鏈進行雜交的序列；所述序列選自序列表中的序列1-214；b)對目的HLA核苷酸序列至少能夠達到90％分辨率的序列，所述目的HLA核苷酸序列是正義鏈或負義鏈；所述序列選自序列表中的序列1-214。
所述寡核苷酸探針可以是DNA、RNA、PNA或其衍生物。所述寡核苷酸探針最好包括序列表中的序列或其互補序列。探針可以是被標記的，其標記方式包括化學標記、酶標記、免疫標記、放射性標記、熒光標記、發(fā)光標記或熒光共振能量轉移(FRET)標記等。
所述寡核苷酸探針可以用任何方法進行合成。例如可以化學合成(見Ausubel編著的“分子生物學使用操作方法”中的2.11.寡核苷酸的合成和純化，John Wiley &Sons，公司，2000)、從天然物質中分離、由天然產物重組或綜合幾種方法合成。人工合成的寡核苷酸也能用Matteucci的方法制備(Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.，33185-3191，1981)。使用自動合成儀也是一種好方法，例如使用ABI公司的DNA合成儀。但是，使用化學方法制備的探針更為合適。
本發(fā)明中用于合成所述寡核苷酸探針的堿基是天然的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶，也可以選擇非天然形成的或合成的如8-氧-鳥嘌呤，6-巰基鳥嘌呤，4-乙酰基胞嘧啶，5-(羰基羥乙基)尿嘧啶，2’-氧-甲基胞嘧啶，5-羰基甲氨基-甲基-2-胸腺嘧啶，5-羰基甲氨基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，2-氧-甲基假尿嘧啶，β-D-半乳糖基鳥嘌呤，2’-氧-甲基鳥嘌呤，次黃嘌呤，N6-異戊烯基腺嘌呤，1-甲基腺嘌呤，1-甲基假尿嘧啶，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基次黃嘌呤，2，2-二甲基鳥嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫-尿嘧啶，β-D-甘露糖基鳥嘌呤，5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤，N-((9-β-D-脫氧呋喃基-2-甲硫基尿嘧啶-6-)氨基甲?；?蘇氨酸，N-((9-β-D-脫氧呋喃基-2-甲硫基尿嘧啶-6-)N-甲基氨基甲?；?蘇氨酸，尿嘧啶-5-氧-醋酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧-醋酸，假尿嘧啶，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，5-甲氧尿嘧啶，2’-氧-甲基-5-甲基尿嘧啶，2’-氧-甲基尿嘧啶，和3-(3-氨基-3-羰基異丙基)尿嘧啶等。
同樣的，寡核苷酸的化學類似物(如磷酸骨架經修飾的核苷)也可用于合成所述寡核苷酸探針?？刹扇〉姆乐菇到獾姆椒ㄓ小?′末端帽子法”，參見(Shaw等，Nucleic Acids Res.，19747，1991)。有許多新的化學途徑可用于將新的連接方式代替磷酸骨架。磷酸骨架的類似物包括磷酸化硫鹽，磷酸化二硫鹽，甲基磷酸鹽，氨基磷酸酯，硼酸磷酸酯，磷酸三酯，醋酸甲酯，3’-硫醋酸甲酯，5’-硫醋酸甲酯，5’-硫醚，碳酸酯，5’-N-氨基甲酸酯，硫酸酯，磺酸酯，氨基磺酸酯，磺胺藥，砜，亞硫酸酯，亞砜，硫醚，羥基胺，亞甲基(甲基亞氨基)(MMI)or亞甲基氧基(甲基亞氨基)(MOMI)連接等。所述寡核苷酸可以是肽核酸，如Milligan等已經描述的(J.Med.Chem.，361923，1993)。所述寡所述核苷酸探針必須含有一段能與目的DNA分子的一部分進行互補結合的序列。
所述寡核苷酸探針可以是任何長度，沒有最長或最短的限制。只要能完成探針的功能，與目的HLA基因雜交即可。所述寡核苷酸探針的長度可短至50，40，30，20，15或10個核苷酸或更短。同樣的，所述寡核苷酸探針也可以有20，40，50，60，75，100，200個核苷酸或更長，例如與整個HLA目的基因一樣長。通常，所述寡核苷酸探針至少有14nt，更好的是在18nt以上，最好是有20至30nt，與靶基因互補，沒有發(fā)卡結構。有的情況下，所述寡核苷酸探針可能最少有30nt或50nt。如果要完全配對，例如，如果靶基因與探針特異性結合，那么這個雜交雙鏈在平穩(wěn)的嚴謹性雜交條件下或探針短至10-30nt時能保持相對的穩(wěn)定性。如果所述寡核苷酸探針可能含有一定程度的錯配堿基，比如針對一個可變區(qū)域或一個特定屬中的所有種的一組序列，則所述寡核苷酸探針可以加大長度(例如15～40nt)來抵消錯配的不利影響。所述寡核苷酸探針不必跨越整個HLA基因。任何潛在的可用于特異性地區(qū)分HLA靶基因的區(qū)域都可以用于設計所述寡核苷酸探針。所以，所述寡核苷酸探針能與最少8nt的目的區(qū)域雜交。而且，所述寡核苷酸探針的片斷也可以用于HLA基因的分型，只要它們的特異性足夠。在低嚴謹?shù)臈l件下，所述寡核苷酸探針至少應有8nt與HLA靶基因雜交，雜交最好在中等嚴謹或高嚴謹條件下進行。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種對HLA目的基因進行分型的的陣列。
本發(fā)明所提供的對HLA目的基因進行分型的寡核苷酸探針陣列，包括可以固定大量寡核苷酸探針并適于雜交反應的固相載體，所述探針中至少一條探針具有如下序列a)能夠在高嚴謹雜交條件下與目的HLA核苷酸序列或其互補鏈進行雜交的序列，如序列表中的序列；b)能夠與目的HLA核苷酸序列或其互補序列至少有90％匹配的序列，所述序列為序列表中的序列。
所述探針可以是DNA、RNA、PNA或其衍生物。至少有一條或幾條所述探針含有序列表中的核苷酸序列或其互補序列，或至少有一段如序列表所示的序列或其互補序列。所述陣列包含序列表中所有序列或其互補序列的探針。
至少有一條或幾條或全部所述探針是經過標記的，標記方式包括化學標記、酶標記、免疫標記、放射性標記、熒光標記、發(fā)光標記，或熒光共振能量轉移(FRET)標記。任何適當?shù)闹С治锶绻杌?、塑料、玻璃、陶瓷、橡膠和高分子材料等都可以采用。
本發(fā)明的方法、探針和探針陣列可以在溶液中使用。更適用于以芯片形式使用，如將探針固定于固體支持物上。
探針可固定于任何適當?shù)奈镔|表面。特別是固體支持物如硅、塑料、玻璃、陶瓷、橡膠和高分子材料，還可以固定于三維多孔的瓊脂膠板上，如Packard公司的水溶膠芯片(Broude et al.，Nucleic Acids Res.，29(19)E92，2001)。對基于點陣的檢測，探針最好固定于固體支持物上構成“生物芯片”。固體支持物可以是生物的、非生物的、有機的、無機的或其任意的組合，存在形式可以是顆粒狀、鏈狀、沉淀物、膠狀、薄片、管狀、球形、毛細管狀、塊狀、片狀、膠片狀、板狀或玻片狀等。
含有探針組的微陣列生物芯片可由許多常規(guī)方法制備，如光介導法(VLSIPSTM在U.S.Patent Nos.5143854；5384261 or 5561071中所描述的)、磁珠法(U.S.PatentNo.5541061)、點樣法(U.S.Patent No.5288514；U.S.Patent No.5556752)等。
流體通道方法，如美國專利No 5677195和5384261所提及的，可以用來制備具有各種不同探針的微陣列芯片。當探針通過流體通道傳送到固體支持物時，底物的活性區(qū)域自動從其它區(qū)域分離出來。流體通道方法的詳細描述可以在美國專利NO.5556752中找到，包括用于提高液體通過已設計好的流動路徑的保護性遮蔽設備的使用。
點樣方法(Spotting methods)可被用于制備表面固定有各種探針的微陣列芯片。在這種方法中，相對小量的反應物被直接傳遞到支持物上被選擇的區(qū)域。在某些情況下，支持物表面可用一種特殊的溶液進行噴射或覆蓋。在特定情況下，一個噴頭從一個區(qū)域移到另一個區(qū)域的過程中會在每一個停頓時噴射必需量的探針或其它試劑。典型的自動裝置包括微升級吸量管、納升級吸量管、噴頭卡具和點樣針等都可以傳遞探針或其他溶液到支持物上，并由一套自動機械系統(tǒng)來控制點到支持物上的具體位置。另外，這個自動裝置還包括一系列的試管、多孔板、管線和一排傳遞裝置，這樣各種試劑能夠同時被傳遞到反應區(qū)域。點樣方法(Spotting methods)在美國專利Nos.5288514；5312233和6024138中有描述。在某些情況下，流體通道和在支持物上的預定區(qū)域進行點樣的技術結合起來也能用于制備固定有探針的微陣列芯片。
固定探針的固體支持物最好是扁平形的，但是它也會存在兩種不同的表面構造。例如，固體支持物存在凹凸不平的區(qū)域，探針在這些區(qū)域被合成或被點樣。在一些具體情況下，可以選擇具有合適的光吸收特性的固體支持物。例如，支持物可以是聚合的Langmuir Blodgett膠卷、玻璃或功能化玻璃、硅、鍺、砷化鈣、磷化鈣、二氧化硅、氮化硅、改良硅，或一些凝膠或聚合物如聚四氟乙烯、聚亞乙烯基二氟、聚苯乙烯、聚碳酸鹽或它們的組合物。
固體支持物表面可包含活性基團，如包括羧基、氨基、羥基、硫醇或類似基團，這些基團適合于和寡核苷酸或核酸上的活性基團連接。那些表面透明而且含有Si-OH功能基團的材料(如硅表面)更適合。
探針可以通過化學或物理的方法，如通過離子鍵、共價化合或其它已知的力吸附在支持物上。核酸和寡核苷酸的固定可以通過文獻，例如Dattagupta et al.，Analytical Biochemistry，11785-89，1989；Saiki et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，866230-6234，1989；and Gravitt et al.，J.Clin.Micro.，363020-3027，1998等所描述的一些方法來達到。
探針也可以通過“連接分子”固定到支持物上，例如美國專利No.5556752描述的方法，連接分子可以為探針形成雙鏈的部分提供一個自由的空間，這可能有助于雜交反應的進行。典型的連接分子包括6-50個原子，而且包括可固定于支持物表面上的部分。探針固定到支持物上可以通過C-C鍵實現(xiàn)，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷鍵(玻璃或二氧化硅作支持物時使用)。硅氧烷鍵鍵合可以通過支持物和連接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基團反應完成。氨基烷基硅烷、羥基烷基硅烷、2-羥乙基-氨丙基三乙氧基硅烷、羥乙基-氨丙基三乙氧基硅烷或羥丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基團。
連接分子還包括一個能被固定到固相載體表面的延伸部分或長鏈。例如，氨基、羥基、巰基、羧基等基團均適合于將連接分子的延伸部分固定到載體表面。連接分子的延伸部分可以是對聚合物合成反應后續(xù)條件保持惰性的多種分子中的一些。長鏈部分一般都是芳香基、乙炔、乙烯、乙二醇(包含2-14單體單元的)低聚物、二(元)胺、二酸、氨基酸、肽或其化合物。
在一些具體情況中，連接分子的延伸部分可以是一段多聚核苷酸或整個連接分子是一段多聚核苷酸。連接分子的延伸部分也可以包括聚乙烯乙二醇、聚核苷、亞羥基、聚乙醇、聚酯、聚氨、聚硫酸酯和其組合物。另外，為了在探針的合成中應用連接分子，連接分子在末梢或末端(相對于固體支持物表面)可以有一個保護基團連接到雙功能基團上(如羥基、氨基或羧酸基)。當去保護并連接后，該末端能被共價鍵合到寡聚物或探針上。
本發(fā)明的方法可用于一次用一條探針去分析一個樣品。本發(fā)明的方法在高通量的形式下進行更為有利。例如，多個樣品能用單一探針同時分析或單一樣品能用多個探針同時分析。更好的情況是，大量的樣品可以用多個探針同時分析。
雜交可以采用該領域所熟知的任何技術來進行。可以改變雜交條件來提高或降低雜交嚴謹度、雜交的特異性水平和非特異吸附造成的背景水平(例如，改變雜交或洗脫液的鹽濃度或溫度)。探針和靶核苷序列之間的雜交可以在任何適宜的嚴謹性(包括高、中、低)下進行。一般是在高嚴謹性條件下雜交。
探針和靶核酸之間的雜交可以是同源性的，例如分子信標技術中用的典型條件(Tyagi S.et al.，Nature Biotechnology，14303-308，1996；美國專利No.6150097)和雜交保護分析中用的方法(Gen-Probe公司；美國專利No.6004745).探針和靶核酸之間的雜交可以是非同原性的(參見那些基于不同類型的硝酸纖維素膜和磁珠所采用特定的條件)。
靶多聚核苷酸序列可以通過和寡核苷探針在從高到低的雜交和洗脫嚴謹性條件下形成穩(wěn)定的雜合體而被檢測到。通過依賴于探針的雜交反應來作為檢測的手段的好處是可以保證特異性。如果探針和靶序列之間是完全互補的(例如是99％，或更高)，則應該用高嚴謹性的條件進行雜交。如果它們之間存在一些錯配，例如當用探針去檢測一組不可能完全互補的呈多態(tài)性變化的靶序列的時候，雜交的嚴謹性就應降低。但是，應該優(yōu)化雜交條件使非特異性雜交達到最小或消除。
那些能夠影響雜交和用以消除非特異性雜交的條件在一些文章(MolecularCloning A Laboratory Manual，second edition，J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中已經提到過。通常，低鹽濃度和高溫可以促進雜交的嚴謹性。例如一般來說，高嚴謹性的雜交條件是指在含有大約0.1×SSC和0.1％SDS的溶液中在65℃進行雜交和洗脫；中等嚴謹?shù)碾s交條件是在含有大約1～2×SSC和0.1％SDS的溶液中于50℃～65℃進行雜交和洗脫；低嚴謹?shù)碾s交條件是在2×SSC溶液中于30℃～50℃進行雜交和洗脫。
一個可選擇的雜交和洗脫的方法是先采用低嚴謹條件進行雜交(5×SSPE，0.5％SDS)，再用含有濃度為3M的四甲基氯化銨(TMAC)的溶液來嚴格洗脫。TMAC的作用是消除A-T和G-C堿基對間結合力的不同，以便在給定的溫度下雜交的結果主要與多聚核苷的長度相對應。用TMAC可以改變洗脫的溫度以達到文獻(Wood et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.821585-1588，1985)中所期望的嚴謹性水平。
雜交液可以含有25％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt溶液、100μg/ml單鏈DNA、5％右旋糖苷硫酸鹽，或者其它一些已知的對雜交有利的溶液。
探針和靶HLA核酸之間的雜交可以采用任何已知的方法進行檢測，例如標記探針、二級探針、靶核酸或者其組合物。同時，在缺少可檢測的標記時，也可以用質譜學方法來檢測雜交結果(例如，美國專利No.6300076中所描述的)。
可檢測的標記是一種可直接或間接進行雜交結果檢測的方法?？蓹z測的標記有一種可被測量的物理特性(例如熒光或吸光性)或能參與酶反應。如果用直接標記，則靶核苷酸序列或探針是被標記的，那么通過檢測雜合體中的標記物就可以評估雜交的結果。如果用間接標記，則二級探針被標記，那么可以通過檢測二級探針和初始雜合體間形成的二級雜交物來實現(xiàn)對雜交結果的檢測。
適合的標記包括熒光標記、發(fā)色團、發(fā)光體、放射性同位素標記、電子密標記試劑、FRET(熒光共振能量遷移)、酶和有特殊結合配體的配基。有特殊用途的標記是酶活性基團，如酶(Wisdom，Clin.Chem.，2212431976)；酶的底物(英國專利No.1548741)；輔酶(美國專利No.4230797和4238565)和酶抑致劑(美國專利No.4134792)；熒光劑(Soini和Hemmila，Clin.Chem.，25353，1979)；發(fā)色團(包括藻膽蛋白)；發(fā)光體，如化學發(fā)光和生物發(fā)光(Gorus和Schram，Clin.Chem.，25512，1979和上述雜志的1531頁)；特殊捆綁配體，如蛋白捆綁配體；抗體；放射性同位素，如3H，35S，32P，125I和14C。這些標記根據他們各自的物理特性(如熒光性，發(fā)光性和放射性)或他們的反應活性或結合特性(如抗體，酶，底物，輔酶和抑致劑)等被檢測。配體標記對固相狀態(tài)下寡核苷酸探針的捕獲是有用的(例如捕獲探針)。相似的標記包括生物素(通過與親和素或鏈霉親和素結合而被檢測)和酶類，如山葵過氧化酶或堿性硫酸酶(通過添加酶的底物產生顏色反應而被檢測)。
放射性同位素標記的探針或靶核苷酸可以通過放射自顯影來檢測。熒光標記的探針和靶核苷酸可以用熒光儀來檢測。半抗原和配基(如維生素)標記的核酸可以通過向半抗原或結合了標記配體(如抗生素蛋白)的蛋白添加半抗原或抗體片段來鑒定。
作為另外一種選擇，探針或核酸可用通過其它的試劑來對雜交結果進行檢測的標記物進行標記。如果標記物是一種酶，被標記的核酸，如DNA最終被放置在一個合適的介質中來決定催化作用的程度。例如，用輔酶來標記的核酸可以通過添加一種酶來檢測，因為這個標記是這種酶的輔酶和底物。因而，如果這種酶是磷酸化酶，那介質中能夠包括磷酸硝基苯，這樣就能通過觀察顏色來監(jiān)控硝基苯酚的產生。如果這種酶是β-半乳糖苷酶，那介質中可以含有硝基苯基磷酸鹽，它能夠釋放硝基苯酚。典型的例子中包括但不限于β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、木瓜蛋白酶和過氧化物酶。通過原位雜交的研究，表明底物的最終產物是不溶于水的。其它的標記物，如染料等也是可以用作標記物。
標記物可以直接被連接到DNA的粘合性配合體上，如吖啶染料、菲啶、吩嗪、香豆素、吩噻嗪和喹啉可通過共價鍵等化學鍵直接聯(lián)接，或通過與聯(lián)接在粘合性配合體上的微囊體或脂質體結合而達到非直接聯(lián)接。標記物通過插入化合物連接到DNA的粘合性配合體上的方法是常用的。具有代表性的插入化合物包括單或二疊氮羰基甲基物質或乙基物質、單/二疊氮羰基乙基物質、氮羰基乙基物質聚合物(Mitchell et al.，J.Am.Chem.Soc.，1044256，1982)、4-疊氮羰基-7-氯喹啉、2-疊氮羰基芴、4-氨甲基-4、5-二甲基當歸根素、4-氨甲基-三氧鹽(4-氨甲基-4，5，8-三甲基補骨脂素)、3-羧基-5或8-氨基或羥基補骨脂素。一種特殊的核酸結合性疊氮羰基物質已經被Forster等(Nucleic Acid Res.，13745，1985)描述過。其它有用的具有光反應活性的插入物質是香豆素，它和嘧啶殘留物形成(2+2)環(huán)狀物。烷化劑，如二氯乙胺和環(huán)氧化物或吖啶類，如黃曲霉毒素、多輪烴的環(huán)氧化物、絲裂霉素和norphillinA，也能被用作DNA的粘合性配合基。特別有用的具有光反應活性的插入物質的是疊氮羰基類物質。它們的活性氮烯結構在長波長的紫外線或可見光下很容易產生，并且芳基疊氮化物的氮烯結構在它們的重排產物上更易于發(fā)生插入反應(White et al.，Meth.Enzymol.，46644，1977)。
探針也可以被修飾成特殊的形式，如添加10-100個T殘基用于反相點樣，或與BSA結合或固定到磁珠上。
當用間接的方法來檢測雜交時，可被檢測的帶標記的二級探針可以在探針與靶序列進行最初的雜交之后或雜交過程中加入。在加入二級探針后，雜交條件可以被改變。雜交之后，如果初級探針被固定于固體支持物上，通過洗脫，沒有雜交上的二級探針能夠和初級探針分離開來。對固體支持物上的特定區(qū)域的標記程度的檢測就可以顯示樣品中靶核酸序列和探針的雜交情況。
可被檢測的帶標記的二級探針是一種特殊的探針。相對來說，可檢測的標記探針可以是退化探針，如美國專利No.5348855中描述的全基因組DNA的混合物。近來的研究發(fā)現(xiàn)，如果二級探針含有雙股DNA，可以通過插入染料來標記。如上面提到的，首選的DNA結合配體就是插入化合物。
二級探針也可以是一個隨機核苷酸探針序列庫。二級探針的長度應視一級探針的長度和組成或固體支持物上由二級探針鑒定的靶核苷酸序列而定。這樣的探針庫的探針最好3′或5′末端的一端用光反應試劑標記，另一端用可檢測試劑如熒光劑、酶、染料、發(fā)光體或其它已知的可檢測物進行標記。
用作標記核酸的特殊序列是可變的。例如氨基取代的補骨質素能首先被核酸光化學偶聯(lián)，其產物帶有能結合標記物的氨基基團等，通過光化學反應，DNA結合配體標記到核酸上，即補骨質素首先和標記物如酶結合，然后和核酸結合。其好處在于，DNA結合配體首先和標記物結合，然后再和核酸探針結合。例如，由于生物素帶有羧基基團，它能和香豆素通過酰胺或酯的形式結合，而不影響香豆素的光反應活性或生物素的生物學活性。氨甲基當歸素、補骨質素和菲啶衍生物可同樣結合到標記物上，如菲啶氯化物和氨丙基甲基氯化物等衍生物(Hertzberg et al，J.Amer.Chem.Soc.，104313，1982)。另外，雙功能試劑如二硫代雙丁二酰胺基丙酸或1，4-丁二醇二環(huán)氧甘油醚可在適當?shù)娜軇?、反應物配比和反應條件下直接把DNA結合配體和有氨基殘基的標記物連接。某些雙功能試劑如戊二醛可能不合適，因為當它們發(fā)生耦合反應時可能對核酸發(fā)生修飾作用而影響分析結果。常規(guī)的預防措施能防止這樣的情況發(fā)生。
同樣有利的是，DNA結合配體也能夠通過連接分子與標記物相連，此連接分子的長度可多達40個原子，但2到20個原子的長度更合適。組成連接分子的原子包括但不限于碳、氧、氮、硫。此連接分子可以是多功能基團，例如肽、碳氫化合物、多元醇、多元醚、多胺、碳水化合物類如甘氨酸聚合物或其它寡肽、羰基肽、α-氨基-碳?；蝾愃频奈镔|。糖類、聚乙烯氧化基團、甘油基、季戊四醇基團等也可以作為連接分子。連接分子能直接連到核酸分子或/和標記物上。連接分子可包括雙功能基偶聯(lián)試劑，如二硫代雙丁二酰胺基丙酸或1，4-丁二醇二環(huán)氧甘油醚，二異氰酸酯、碳二酰亞胺、乙二醛、戊二醛之類。
不能直接進行檢測的二級探針因能量轉移而可被檢測，如Tyagi和Kramer描述的分子信標法(Nature Biotech.，14303-309，1996 or U.S.Patent No.5119801and 5312728)。上述任何熒光共振能量轉移(FRET)檢測系統(tǒng)都可以應用于本方法。例如可以使用AlphaScreenTM系統(tǒng)。AlphaScreen是一種近距離放大發(fā)光均相檢測(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)方法。用680nm激光照射時，供體小珠上的光敏劑能將周圍的氧變?yōu)檠鯁误w。激發(fā)態(tài)氧分子在衰變前發(fā)出250nm(接近小珠直徑)的光。如果受體小珠與供體小珠很接近，氧單體分子就能與受體上的化學發(fā)光基團作用，將能量很快轉移到同一小珠的熒光物質上。熒光物質將光波轉換為520-620nm。整個過程的半衰期是0.3秒。熒光共振能量轉移(FRET)供體/受體對可以是熒光素(供體)和四甲基羅丹明(受體)，其有效波長距離是55埃；IAEDANS(供體)和熒光素(受體)，其有效波長距離是46埃；熒光素(供體)和QSY-7染料(受體)，其有效波長距離是61埃。
本發(fā)明也可用于核酸的定量檢測。結合于微陣列點上的二級探針的數(shù)量能夠被檢測，并且與目的核酸分子的數(shù)量相關。根據含有已知數(shù)量的目的核酸的對照的數(shù)量可以對樣品進行稀釋。其精確程度與操作者的熟練程度有關。微陣列分析中，將探針陣列放在X光膠片或顯像儀旁邊可顯示出標記物，從而確定固定探針的位置。熒光能用光電倍增管CCD或激光掃描探測。
任何合適的樣品，包括來自于人類、動物、環(huán)境產物(如泥土或水)的樣品，都能用本發(fā)明的方法分析。測試樣品包括各種體液，如尿液、血液、精液、腦脊髓液、膿、羊水、眼淚或半固體或液體排出物如痰、唾液、呼吸產物、陰道尿道排出物；糞便或固體組織樣品，如活體組織或絨毛膜樣品。檢測樣品還包括皮膚、生殖器或咽喉刮取物。
可使用多種方法提取被檢樣品的核酸，如(Ausubel(Ed.)Current Protocols inMolecular Biology，2.Preparation and Analysis of DNA and 4.Preparation andAnalysis of RNA，John Wiley & Sons，Inc.(2000))。所得到的目的核酸可以是經擴增或純化的DNA或RNA。
上述方法得到的核酸可用色譜或其它儀器測量?？梢允褂酶鞣N擴增反應得到擴增產物，如PCR(Polymerase Chain Reaction，U.S.Patent Nos.4,683,195，4,683,202，4,800,159 and 4,965,188)，NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，U.S.Patent No.5,130,238)，TMA(Transcription Mediated Amplification)(Kwohet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，861173-1177(1989))，SDA(StrandDi splacement Amplification，described by Walker et al.，U.S.Patent No.5,270,184)，tSDA(thermophilic Strand Displacement Amplification(U.S.PatentNo.5,648,211 and Euro.Pat ent No.EP 0 684315)，SSSR(Self-Sustained SequenceReplication)(U.S.Patent No.6,156,508)。
本發(fā)明的探針可以包裝為試劑盒的形式，最好包括如何使用這些探針去檢測目的基因的說明書。試劑盒的各成分可以裝在一個共同的箱子里，試劑盒可選擇性包括本發(fā)明描述的檢測方法，如二級探針，和/或標記試劑和進行標記的操作方法(如放射性標記物、酶反應底物、抗體等這類物質)。
本發(fā)明的分型方法可用于建設人類骨髓干細胞庫和臍帶血干細胞庫、器官移植檢測、骨髓移植檢測、自身免疫疾病研究、病毒感染，以及癌癥研究、疾病易感性研究、法醫(yī)鑒定、親子鑒定和人類基因組研究等方面。


圖1為納米磁珠捕獲白細胞的照片圖2為幾種不同納米磁珠捕獲白細胞后直接進行不對稱PCR的檢測結果圖3為Fe3O4磁珠捕獲白細胞后直接進行不對稱PCR的檢測結果圖4為點有144條探針的芯片的雜交結果圖5A為DHPLC對PBH_0303019探針的檢測結果圖5B為DHPLC對PBH_0301119探針的檢測結果圖6A為純度很高的探針圖6B為含少量雜質的探針圖6C為含較多雜質的探針圖6D為純度很差的探針具體實施方式
定義除非特別指出，這里所有用到的技術和科學術語的含義與熟悉本領域知識的人所理解的一致。如果本專利申請書中所列出的某個定義與上述參考文獻中所提到的一個定義在意思上相反或者不一致，那么將以本說明書中的定義的為準。
“一個”，意味著“至少一個”或者“一個或更多”。
“引物”是一種寡核苷酸，它能夠與靶序列結合，它可在擴增反應中作為核酸擴增的引物。
“探針”是指一種能夠和靶序列或目的序列雜交的寡核苷酸。探針不像引物那樣在聚合酶的作用下去延伸、擴增靶序列。但是，對于熟知本領域的人都很清楚，在許多情況下探針和引物在結構上是相似的或完全相同。
“靶序列或目的序列”，是指能夠和探針特異性的結合一種核酸序列。
“陽性對照探針”是一種能夠與一組(或一類)靶序列上的保守序列雜交的探針。“陰性對照探針”是指和陽性探針相比，在序列上有一個或多個堿基改變的探針。與陽性對照探針只有一個堿基不同的陰性探針要更合適一些。再比如陰性對照探針可以是與原靶序列無同源性的序列的同源序列。舉一個特殊的例子，當兩種陽性對照探針如一種強陽、一種弱陽，及一種單堿基不同的陰性對照探針被一起使用時，強陽對照探針和陰性對照探針在雜交過程中用于評估雜交效率，弱陽性對照探針則用來評估待檢測探針的雜交信號，例如非對照的探針雜交信號將會以此來評估。待檢測探針的雜交信號和弱陽對照探針的雜交信號的比值在一定數(shù)值范圍內用于評估待檢測探針的雜交強度。
“雜交對照探針”是指用于評估待檢測探針和靶序列的雜交效率的探針。例如，如果靶序列是一種HLA序列，則雜交對照探針的序列最好是與任何HLA序列都不同源的序列。雜交對照探針可以被氨基修飾，然后被用于(或固定于)芯片表面，其點樣濃度和/或點樣過程與其它探針相同或相似，其中也包括待檢測探針。另一種標記探針，如HEX標記探針，它是一種標準的雜交對照探針，它被以一種濃度或比例添加到雜交液中，而這個濃度或比例與其它探針的濃度或比例相一致。這樣，整個的雜交過程可以被檢測到。雜交對照探針也被用于指導或決定探針在芯片上的位置。
“固定化質控探針”是指用于評估芯片固定化過程的探針，它不參與任何的雜交過程。固定化質控探針的一端被修飾，如氨基修飾，以利于其在芯片表面的固定，而它的另一端則被一種易被檢測的標記物標記，如Hex。
“Hex”指六氯熒光素，是一種常用的熒光標記物。
“互補”是指兩種核酸序列至少有50％的一致性，一般二者至少有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或100％的一致性。互補也指兩種核苷酸序列能夠在低、中和/或高三種嚴格程度的條件下雜交。
“充分匹配”是指兩種核苷酸序列有至少90％的統(tǒng)一性，即“充分匹配”是指兩種核苷酸序列可以在高嚴謹?shù)碾s交條件下雜交。
“兩種完全匹配的核酸序列”是指兩條核酸單鏈根據Watson-Crick堿基匹配原則而生成的核酸雙鏈，如在DNADNA中是A-T和C-G的相互配對，在DNARNA或RNARNA中則是A-U和C-G的相互配對，除此之外，不會有其他任何的堿基配對情況。
“雜交嚴格性”是指如下條件1)高嚴謹性0.1×SSPE，0.1％SDS，65℃；2)中嚴謹性0.2×SSPE，0.1％SDS，50℃(也被稱為溫和的嚴謹性)；3)低嚴謹性1.0×SSPE，0.1％SDS，50℃。
通過選擇緩沖液、鹽濃度和溫度來獲得相同的要求標準。(Ausubel(Ed.)CurrentProtocols in Molecular Biology，2.9A.Southern Blotting，2.9B.Dot and SlotBlotting of DNA and 2.10.Hybridization Analysis of DNA Blots，John Wiley &Sons，Inc.2000)。
“退火溫度”是指核酸雙鏈，如DNADNA，DNARNA和RNARNA，在變性過程中溫度變化范圍的中值時的溫度。這里指的探針的Tm指的是發(fā)生雜交反應的探針的Tm。
“評價”是指對探針和靶核酸序列之間形成的雜合體的定量和/或定性的檢測。例如檢測一個雜合體的數(shù)量或濃度的絕對值；檢測某一個指數(shù)，比值，百分數(shù)，圖表或其它的數(shù)值來顯示雜交的效果。評價可以是直接的或間接的，實際上化學類物質的檢測可以不必檢測雜交體本身，可以通過衍生化、還原化、或探針和/或靶核苷酸序列或其它的物質的減少或消失等來評價。
“磁性物質”是指那些具有磁鐵的特性、與磁鐵或磁性有關、能夠用磁力進行誘導或操縱的任何物質。
“可磁化的物質”是指當懸浮或自由放置在磁場內能被磁化和產生磁距的任何物質。這些磁化物質包括順磁物質，磁鐵和亞鐵磁物質，但不僅僅限于這些物質。
“順磁物質”指其單個原子、離子或分子具有永久的偶磁極的物質，在外加磁場的作用下，這些偶磁極隨機取向，而物質本身整體上不表現(xiàn)出定向的磁場。這種隨機取向是由物質內部熱運動引起的。外加磁場后，原子偶磁極都在磁作用下平行于外磁場，因為這種狀態(tài)下能量最低，這也增加了磁場的磁化系數(shù)。關于順磁物質和順磁性的詳細介紹，能在許多文獻中找到，例如由B.I Bleaney和B.Bleaney編著的“電學和磁學”第六章，P169～171，1975，牛津出版社出版。
“鐵磁性物質”指具有顯著正磁化系數(shù)的物質。磁系數(shù)由磁場強度決定。另外，鐵磁性物質能在外磁場消失后保持磁性，更多細節(jié)詳見B.I Bleaney和B.Bleaney編著的“電學和磁學”第六章，P171～174，1975，牛津出版社出版。
“亞鐵磁物質”指具有自發(fā)的永久磁性，與普通磁鐵特性相同的物質。但這些自發(fā)的磁性并不一定是由于該物質內部偶磁極平行排列而產生的。關于鐵磁物質和亞鐵磁物質更詳盡的資料可見于許多文獻中，如B.I Bleaney和B.Bleaney編著的“電學和磁學”第十六章，P519～524，1975，牛津出版社出版。
“金屬氧化物顆粒”指以顆粒形式存在的某種金屬的任何氧化形式。某些特殊的金屬氧化物顆粒具有順磁性或超順磁性。順磁顆粒指易被磁場磁化但自身不能維持一個磁性區(qū)域的顆粒。順磁顆粒是由順磁物質組成的顆粒。順磁顆粒包括金屬氧化物，如Fe3O4顆粒，和合金顆粒如CoTaZr合金顆粒等。
“樣品，如新鮮全血”是指從其天然來源處分離、獲得后12小時以內的樣品，當然也包括10、5、4、3、2、1小時，30、20、10、5、2或者1分鐘以內的樣品。
“低溫保存”指將樣品保存在0℃或更低的溫度。
實施例1、HLA基因分型(1)分離人全血中的白細胞及目的基因的擴增本實施例中白細胞用一種Fe3O4磁珠或Fe2O3磁珠、醛基包覆的Fe3O4磁珠、羧基包覆的Fe3O4磁珠、環(huán)氧基包覆的Fe3O4磁珠、羧基包覆的Fe2O3磁珠等種磁珠進行分離(例如圖2所用的三種磁珠分別是I Fe3O4裸珠，II醛基包覆的Fe3O4磁珠，III羧基包覆的Fe3O4磁珠)。
5μl用ACD(23mM檸檬酸，80mM葡萄糖，45mM檸檬酸鈉)抗凝的全血與20μl磁珠(懸于pH6.0的TE緩沖液制成15mg/ml懸液)在一支1.5ml的EP管中于振蕩器上輕微混勻10秒鐘，靜置3分鐘。然后用磁力架吸附住磁珠，棄掉上清。用PBS洗滌磁珠兩次。然后將磁珠重新混懸于100μlTE緩沖液中，取5μl這種混懸液作為PCR的模板。用25μl體系進行PCR擴增，PCR混合物組成是2.5μl 10×PCR緩沖液，0.5μl10mM dNTP，0.5μl 1mM Cy5-dCTP，0.5μl 100ng/μl模板DNA，0.5μl 1μM上游引物(5’-TCC CCA GAC GCC GAG GAT GGC C-3’)，2.5μl 10μM下游引物(5’-CCC GTGGCC CCT GGT ACC CG-3’)，0.5μl 5U/μl Taq酶，加無菌雙蒸水至25μl。PCR擴增程序是96℃變性3min；25個循環(huán)，96℃變性25秒，71℃退火45秒，72℃延伸30秒；9個循環(huán)，96℃變性25秒，68℃退火60秒，72℃延伸120秒；72℃延伸8分鐘。
PCR結束后用1.2％瓊脂糖凝膠檢測擴增結果，PCR產物的檢測結果如圖2和圖3所示，表明納米磁珠捕獲的白細胞可以直接作為模板進行不對稱PCR反應。圖二中顯示的是三種Fe3O4磁珠分別在三種不同模板量情況下的擴增結果。圖3顯示的是一種Fe2O3磁珠捕獲白細胞后直接擴增的結果，其中3、5、7指不同的模板量。圖2和圖3中，M表示DL-2000Marker，I、II、III代表不同的磁珠，3、5、7代表不同的模板量?？梢钥闯鰣D中的PCR產物有兩條帶，分別位于1000bp和500bp左右，這與理論數(shù)值一致。這些PCR產物可以不經純化直接用于下面的雜交步驟。
(2)雜交及HLA基因分型5μl PCR產物與3μl雜交液混合，98℃保溫5分鐘，然后使這些PCR產物和芯片上固定的144條探針(探針的種類詳見表3)在65℃雜交1小時。雜交結束后，用去離子水洗去未雜交的PCR產物，再用芯片洗滌液于45℃洗滌10分鐘，再用去離子水漂洗一次，干燥玻片。
用特殊的掃描儀(這里用的是Scanarray 4000共聚焦激光掃描儀，也可以用其它的激光掃描儀)掃描雜交后的芯片得到雜交圖結果如圖4所示，再用專用軟件(如Genepix3.0)處理圖像得到數(shù)據文件，分析得到的數(shù)據文件就可以得到目的基因的基因型。如圖4所示的分型結果是HLA-A*01/29的分型結果。
實施例2、探針質量的檢測PBH_0303019和PBH_0301119(由上海博亞生物工程公司合成)這兩條一端經氨基修飾的寡核苷酸探針溶于水配成10μM溶液，用WAVE核酸片段分析系統(tǒng)(Transgenomic，USA)進行分析。柱溫80℃，探針用梯度濃度的乙氰緩沖液洗滌。用紫外監(jiān)測器在260nm進行檢測。隨洗脫時間不同而呈現(xiàn)出的峰的數(shù)目和形狀就可以表明探針的質量。PBH_0303019和PBH_0301119的質量檢測結果如圖5A和圖5B所示，表明DHPLC不但可以有效地檢測芯片所用的探針的純度，同時可以準確檢測出探針所含雜質的具體含量。如圖5A和5B中所示探針的有效含量分別為93.35％和64.8％。
實施例3、HLA_A，B，DRB1三個基因座位的分型探針表1中PBH_0301xxx為HLA-A區(qū)的分型探針，PBH_0302xxx為HLA-B區(qū)的分型探針，PBH_0303xxx為HLA-DRB區(qū)的分型探針。
實施例4、克隆標準HLA等位基因(具體流程如下)以基因組DNA為模板通過PCR的方法擴增出目的片段↓瓊脂糖電泳檢測PCR擴增情況↓切膠回收純化樣品↓連接反應↓轉化反應↓菌落PCR鑒定(M13引物)↓陽性菌落接種LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)↓菌液PCR鑒定(HLA通用引物和特異性引物)↓陽性克隆測序、保種為了檢測HLA_A，B，DRB1三個基因座位的分型探針和控制芯片的質量而構建了一個HLA標準等位基因庫，其中HLA-A區(qū)共克隆成功43個等位基因，分布于19組，可以覆蓋我國HLA中分辯率分型95.0％的型別；HLA_B區(qū)共克隆成功47個等位基因，分布于29組，可以覆蓋中分辯率分型80％的型別；HLA_DR區(qū)共克隆成功22個等位基因，分布于14組，可以覆蓋中分辯率分型87.5％的型別。根據第十二屆國際組織相容性工作委員會(www.ihwg.org)提供的人類HLA等位基因序列來設計表1中的全部探針。然后把這些探針固定在經醛基化修飾的玻璃芯片表面從而構成芯片。
選擇能夠產生較強陽性信號和最小假陽性信號的雜交條件和洗脫條件。用較高的雜交溫度(如65℃)進行雜交，用合適的溫度(如45℃)和較強的離子強度(如0.2％SDS，0.1xSSC)進行洗滌，以便保證較好的陽性信號，并有效降低假陽性信號。
含有靶基因的樣品和芯片的雜交、用一種溶液洗滌玻片、信號掃描并通過靶核酸序列和固定在芯片上的探針之間的雜交結果來確定靶基因的類型。例如可以取含有靶基因的PCR產物5μl與5μl雜交緩沖液混合后與芯片在65℃雜交1小時，用含0.2％SDS和0.1xSSC的洗滌溶液在45℃洗滌10分鐘，再用1xSSC洗滌5分鐘，再用水漂洗1分鐘，用離心機將玻片甩干，用芯片掃描儀進行掃描，用分析軟件分析得到的圖譜，將得到的數(shù)據輸入特定的HLA分析軟件判斷分型的結果。
對這些克隆的標準HLA等位基因測序發(fā)現(xiàn)許多序列和第十二屆國際組織委員會提供的序列不匹配。
所設計的HLA_A，B，DRB1三個基因座位的分型探針如表1。
表1. HLA_A，B，DRB1三個基因座位的分型探針探針名稱 HLA_A probePBH_0301001 CCTGCGCTCTTGGACCGCPBH_0301001a CCTGCGCTCTTGGACCGCGPBH_0301001b CCTCCTGCGCTCTTGGACCGPBH_0301001c CCTGCGCTCTTGGACCPBH_0301001d CGTGTCCCGGCCCGGCPBH_0301001e ATGGAGCCGCGGGCGCPBH_0301001g CCT GCG CTC TTG GAC CGC GGPBH_0301001comp GCGGTCCAAGAGCGCAGGPBH_0301002a CCTGCGCTTTTGGACCGCPBH_0301002B CCT GCG CTG TTG GAC CGCPBH_0301003 GCAGGAGAGGCCTGAGTATTGG
PBH_0301004 C ACC ATC AGATAATGTATGGCTGCPBH_0301004 C ACC ATC CAG ATA ATG TAT GGC TGCPBH_0301101 TTCTACACCTCCGTGTCCCGPBH_0301103 CGCTTCATCGCAGTGGGCTPBH_0301105 CGAGCCAGAAGATGGAGCCPBH_0301106 CCGCGGGCACCGTGGATAPBH_0301107 GCAGGAGGGTCCGGAGTATTPBH_0301111 GACGTGGGGCCGGACGGGPBH_0301112 GACGGGCGCCTCCTCCGCPBH_0301114 CGGGTACCACCAGTACGCCTPBH_0301115 GGTACCGGCAGGACGCCTAPBH_0301116 CGCCCTGAACGAGGACCTGPBH_0301117 CGGACATGGCAGCTCAGATCPBH_0301119 CCACCAAGCACAAGTGGGAPBH_0301120 AAGTGGGAGACGGCCCATGPBH_0301121 AGGCGGCCCGTGTGGCGGPBH_0301122 AGGCGGTCCATGCGGCGGPBH_0301123 CGGCCCATGAGGCGGAGCPBH_0301125 TACCTGGATGGCACGTGCGPBH_0301127 CTGGAGGGCGAGTGCGTGGPBH_0301128 TGCGTGGACGGGCTCCGCPBH_0301129 GTATTTCTACACCTCCGTGTCCCGPBH_0301130 CGAGCGGTTTGACAGCGACPBH_0301131 CGTGCGGTTCGACAGCGACPBH_0301133 CGTGGGGCCGGACGGGPBH_0301136 AGGCGGTCCATGCGGCGPBH_0301137 CCCGGCCGCGGGGAGCCCPBH_0301138 CCGCGGGCGCCGTGGATAPBH_0301139 TGGGACGAGGAGACAGGGAPBH_0301140 TGGGACCAGGAGACACGGAPBH_0301141 TGGGGACCCTGCGCGGCTAPBH_0301142 GACGTGGGGTCGGACGGGPBH_0301143 GACGGGCGCTTCCTCCGCPBH_0301144 GCGGGTACCAGCAGGACGCPBH_0301145 CGCCCTGAAAGAGGACCTG
PBH_0301146 AGCTCAGATCACCAAGCGCAPBH_0301146a TCAGATCACCAAGCGCAAGAGPBH_0301147 AGCTCAGATCACCGAGCGCAPBH_0301148 GGCTCAGATCACCCAGCGCAPBH_0301148a TCAGATCACCCAGCGCAAGTGPBH_0301149 AGACGGCCCATGAGGCGPBH_0301149a AGACGGCCCATGAGGCGGPBH_0301150 GCGGAGCAGCGGAGAGTCTPBH_0301150a AGACGGCCCATGAGGCGGPBH_0301151 GCGGAGCAGTTGAGAGCCTPBH_0301151a GGCGGAGCAGTTGAGAGCCPBH_0301152 GCGGAGCAGTGGAGAGCCTPBH_0301153 TACCTGGAGGGCACGTGCGPBH_0301154 TGCGTGGAGTGGCTCCGCPBH_0301155 TCACCGAGTGGACCTGGGGPBH_0301155a CCGAGTGGACCTGGGGACCPBH_0301156 TGACCGAGAGAACCTGCGGPBH_0301156a CCGAGAGAACCTGCGGATCGPBH_0301157 GAAGGCCCACTCACAGACTGPBH_0301171 TATTTCTTCACATCCGTGTCCCGPBH_0301172 TCTACACTTCCGTTTCCCGGCPBH_0301173 CTACACCTCCATGTCCCGGCPBH_0301174 CCGGAACACACGGAAAGTGAAPBH_0301175 ATTGGGACGGGGAGACACGPBH_0301176 GACACGGAATATGAAGGCCCAPBH_0301177 GACACGGAATGTGAAGGCCCPBH_0301178 TCACAGACTCACCGAGTGGACCPBH_0301179 TCACAGATTGACCGAGTGGACCPBH_0301180 TCACAGACTGACCGAGTGGACCPBH_0301181 CGAGCGAACCTGGGGACCPBH_0301182 CCGAGAGAGCCTGCGGATCPBH_0301183 ACCGAGAGAACCTGGGGACCPBH_0301184 GTGGACCTGGCGACCCTGCPBH_0301185 CACCGTCCAGAGGATGTATGGCPBH_0301186 ACCAGCAGGACGCTTACGACG
PBH_0301187 TCGCCTTGAACGAGGACCTGPBH_0301188 CCTGCGCTCTTGGACCGCPBH_0301189 TCAGACCACCAAGCACAAGTGGPBH_0301190 GAGGCGGCCCATGTGGCPBH_0301191 GGCCCATGCGGCGGAGCPBH_0301192 GCGGCCCGTCGGGCGGAPBH_0301193 GCACGTGCGTGGAGTGGCPBH_0301194 GCCGGTGCGTGGACGGGCPBH_0301195 GGCGAGTGCGTGGAGTGGCPBH_0301196 GCACGTGCGTGGACGGGCPBH_0301197 GCCGGTGCGTGGAGTGGCPBH_0301198 GGCGAGTGCGTGGACGGGCPBH_0301199 AGACACGGAAAGTGAAGGCCC探針名稱 HLA_B probesPBH_0302001 TGGCCCTGACCGAGACCTGGGCPBH_0302001a CTACAACCAGAGCGAGGCCGPBH_0302002(negative)GCCCTGACCCAGACCTGGGPBH_0302003 CCCGAACCCTCCTCCTGCPBH_0302004 CCCGAACCGTCCTCCTGCPBH_0302005 TGCTCTCGGCGGCCCTGPBH_0302006 TGCTCTCGGGAGCCCTGGPBH_0302007 GGGGGGCAGTGGCCCTPBH_0302008 TGAGGTATTTCGACACCGCCAPBH_0302009 TGAGGTATTTCTACACCGCCATGPBH_0302010 TTTCCACACCTCCGTGTCCCPBH_0302011 TCTACACCGCCATGTCCCGPBH_0302012 TCTACACCTCCGTGTCCCGGPBH_0302013 CCGCTTCATCTCAGTGGGCTACPBH_0302014 CGCTTCATCACCGTGGGCTPBH_0302015 CGCTTCATCGCAGTGGGCTPBH_0302016 TACGTGGACGGCACCCAGTTPBH_0302017 CGTGGACGACACCCAGTTCGPBH_0302018 GGACGACACGCTGTTCGTGA
PBH_0302019 TGGACGACACGCAGTTCGTGPBH_0302020 GCGACGCCACGAGTCCGPBH_0302021 GCGACGCCGCGAGTCCPBH_0302022 GAGTCCGAGAGAGGAGCCGCPBH_0302023 CCGAGGAAGGAGCCGCGPBH_0302024 AGGATGGCGCCCCGGPBH_0302025 GGACGGAGCCCCGGGCPBH_0302026 CGGGCGCCGTGGATAGAGPBH_0302027 CGGGCGCCATGGATAGAGPBH_0302028 GGGGCCGGAATATTTGGGACPBH_0302029 GGGGCCGGAGTATTGGGACPBH_0302030 GGGACCGGGAGACACAGATCTPBH_0302031 TGGGACCGGAACACACAGATCPBH_0302032 ACACAGAAGTACAAGCGCCAGGPBH_0302033 ACACGGAACATGAAGGCCTCCPBH_0302034 CACACAGATCTTCAAGACCAACACPBH_0302035 ATCTGCAAGGCCAAGGCACAPBH_0302036 TACAAGGCCCAGGCACAGACTPBH_0302037 ACACAGACTGACCGAGAGPBH_0302038 CACACAGACTTACCGAGAGAGCCPBH_0302039 GCACCGCGCTCCGCTAPBH_0302040 CGGACCCTGCTCCGCTACTPBH_0302041 ACCTGCGGATCGCGCTCPBH_0302042 CGGAACCTGCGCGGCTPBH_0302043 CGGGTCTCACATCATCCAGAGGPBH_0302044 GGGTCTCACACCCTCCAGAGGPBH_0302045 TCACACTTGGCAGACGATGTATGPBH_0302046 ACACCCTCCAGAGGATGTACGGPBH_0302047 CGACCTGGGGCCCGACPBH_0302048 CGACGTGGGGCCGGACPBH_0302049 GGGTACCACCAGGACGCCTPBH_0302050 CGGGTATGACCAGGACGCCPBH_0302051 GGGCATGACCAGTCCGCCPBH_0302052 GCGGGTATAACCAGTTCGCCPBH_0302053 GAGGACCTGCGCTCCTGGA
PBH_0302054 GAGGACCTGAGCTCCTGGAPBH_0302055 GGACCGCCGCGGACACPBH_0302056 GGACCGCGGCGGACACPBH_0302057 CGGACACGGCGGCTCAGPBH_0302058 CGGACACCGCGGCTCAGPBH_0302059 GGCCCGTGAGGCGGAGPBH_0302060 GGCCCGTGTGGCGGAGPBH_0302061 GCGGAGCAGGACAGAGCCTAPBH_0302062 GCGGAGCAGTGGAGAGCCTAPBH_0302063 GCGGAGCAGCTGAGAGCCTAPBH_0302064 AGCAGCTGAGAACCTACCTGGAGPBH_0302065 AGCAGCTGAGAGCCTACCTGGAGPBH_0302066 GGAGGGCGAGTGCGTGGPBH_0302067 GGAGGGCACGTGCGTGGPBH_0302068 GGAGGGCCTGTGCGTGGPBH_0302069 CGTGGAGTCGCTCCGCAGPBH_0302070 CGTGGAGTGGCTCCGCAGPBH_0302071 CTCCGCAGACACCTGGAGAACPBH_0302072 GCTCCGCAGATACCTGGAGAAPBH_0302073 AGGACAAGCTGGAGCGCGPBH_0302074 GGACACGCTGGAGCGCGPBH_0302075 GGAGACGCTGCAGCGCG探針名稱 HLA_DRB1 probesPBH_0303001 CTTGTGGCAGCTTAAGTTTGAATGTPBH_0303002 TGGAGTACTCTACGTCTGAGTGTCAPBH_0303003 GGAGCAGGTTAAACATGAGTGTPBH_0303004 CCTGTGGCAGGGTAAGTATAAGTPBH_0303005 TTGGAGTACTCTACGGGTGAGTGPBH_0303006 CCTGTGGCAGCCTAAGAGGGPBH_0303007 CCTGGAGCAGGCGCGGPBH_0303008 CCTGGAAGACGAGCGGGCPBH_0303009 CCAGGAGGAGAACGTGCGCPBH_0303010 CCTGGAAGACAGGCGGGCPBH_0303011 CGGTTGCTGGAAAGATGCATC
PBH_0303012 CGGTTCCTGGACAGATACTTCTATCACPBH_0303013 TGCAGTTCCTGGAAAGACTCTTCTPBH_0303014 CGGTATCTGCACAGAGGCATCTPBH_0303015 TGCTGGAAAGACGCGTCCAPBH_0303016 CGGTTACTGGAGAGACACTTCCATAPBH_0303017 CGGCCTGATGAGGAGTACTGGPBH_0303018 CCTGTCGCCGAGTCCTGGAPBH_0303019 GGCCTGATGCCGAGTACTGGPBH_0303020 CAGGAGGAGCTCCTGCGCTTPBH_0303021 GAGCAGAAGCGGGGCCGGPBH_0303022 TCCTGGAGCGGAGGCGGPBH_0303023 GCGGGCCCTGGTGGACAPBH_0303024 GGGGGAGTTCCGGGCGGPBH_0303025 GGGGGAGTACCGGGCGGPBH_0303026 GGCCTGACGCTGAGTACTGGPBH_0303027 CAATGGGACGGAGCGGGTGCPBH_0303027a AATGGGACGGAGCGGGTGPBH0303027b GGGACGGAGCGGGTPBH_0303028 GGGGGAGTTCCGGGCGPBH_0303029 TGGGGGAGTACCGGGCGPBH_0303030 ACCAAGAGGAGTACGTGCGCTTPBH_0303031 GCCTGCTGCGGAGCACTGPBH_0303032 CCAGGAGGAGTTCGTGCGCPBH_0303033 CCTGGAAGACGAGCGGGCPBH_0303034 GCCTGCTGCGGAGCACTGPBH_0303035 GGCCTGATGCCGAGTACTGGPBH 0303036 CCAGGAGGAGAACGTGCGCPBH_0303037 CCTGGAAGACGAGCGGGCPBH_0303038 GACAGGCGCGCCGCGPBH_0303039 CTGGAGCAGAGGCGGGCPBH_0303040 AACCAAGAGGAGTACGTGCGCPBH_0303041 AATGGGACGCAGCGGGTGPBH_0303055 CATCCTGGAAGACGAGCGGGG
實施例4、探針陣列本實施例提供一種探針陣列。本陣列中有64種檢測探針，2種陽性探針，1種陰性探針，1種陰性雜交對照探針，1種陽性雜交對照探針，如表2所示，表中，斜體表示各種對照陽性探針，正體表示各種檢測探針。
表2探針陣列

表3 HLA分型微陣列中探針的種類和排布
序列表<160>214<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1cctgcgctcttggaccgc 18<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2cctgcgctcttggaccgcg 19<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3cctcctgcgctcttggaccg 20<210>4<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4cctgcgctcttggacc 16<210>5<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5cgtgtcccggcccggc 16<210>6<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6atggagccgcgggcgc16<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7cctgcgctcttggaccgcgg20<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8gcggtccaagagcgcagg 18<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9cctgcgcttttggaccgc 18<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>10cctgcgctgttggaccgc 18<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>11gcaggagaggcctgagtattgg 22<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>12caccatcagataatgtatggctgc 24<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>13caccatccagataatgtatggctgc 25<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>14ttctacacctccgtgtcccg 20<210>15<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
<400>15cgcttcatcgcagtgggct 19<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>16cgagccagaagatggagcc 19<210>17<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>17ccgcgggcaccgtggata 18<210>18
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>18gcaggagggtccggagtatt 20<210>19<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>19gacgtggggccggacggg 18<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>20gacgggcgcctcctccgc 18
<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>21cgggtaccaccagtacgcct 20<210>22<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>22ggtaccggcaggacgccta 19<210>23<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>23cgccctgaacgaggacctg 19
<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>24cggacatggcagctcagatc 20<210>25<211>
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>25ccaccaagcacaagtggga 19<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>26
aagtgggagacggcccatg 19<210>27<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>27aggcggcccgtgtggcgg 18<210>28<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>28aggcggtccatgcggcgg 18<210>29<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>29cggcccatgaggcggagc 18<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>30tacctggatggcacgtgcg 19<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>31ctggagggcgagtgcgtgg 19<210>32<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>32tgcgtggacgggctccgc 18<210>33<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>33gtatttctacacctccgtgtcccg 24<210>34<211>
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>34cgagcggtttgacagcgac 19<210>35<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>35cgtgcggttcgacagcgac 19<210>36<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>36cgtggggccggacggg 16<210>37<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>37aggcggtccatgcggcg 17<210>38<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>38cccggccgcggggagccc 18<210>39<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>39ccgcgggcgccgtggata 18<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>40tgggacgaggagacaggga 19<210>41<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>41tgggaccaggagacacgga 19<210>42<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>42tggggaccctgcgcggcta 19<210>43<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>43gacgtggggtcggacggg 18<210>44<211>18<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
<400>44gacgggcgcttcctccgc18<210>45<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>45gcgggtaccagcaggacgc19<210>46<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>46cgccctgaaagaggacctg 19<210>47<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>47agctcagatcaccaagcgca 20<210>48<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>48tcagatcaccaagcgcaagag 21<210>49<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>49agctcagatcaccgagcgca 20<210>50<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>50ggctcagatcacccagcgca 20<210>51<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>51tcagatcacccagcgcaagtg 21<210>52<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>52agacggcccatgaggcg 17<210>53
<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>53agacggcccatgaggcgg 18<210>54<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>54gcggagcagcggagagtct19<210>55<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>55agacggcccatgaggcgg 18
<210>56<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>56gcggagcagttgagagcct 19<210>57<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>57ggcggagcagttgagagcc 19<210>58<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>58gcggagcagtggagagcct 19
<210>59<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>59tacctggagggcacgtgcg 19<210>60<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>60tgcgtggagtggctccgc 18<210>61<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>61
tcaccgagtggacctgggg19<210>62<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>62ccgagtggacctggggacc19<210>63<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>63tgaccgagagaacctgcgg 19<210>64<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>64ccgagagaacctgcggatcg 20<210>65<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>65gaaggcccactcacagactg 20<210>66<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
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<223>
<400>67tctacacttccgtttcccggc 21<210>68<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>68ctacacctccatgt cccggc 20<210>69<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>69ccggaacacacggaaagtgaa 21<210>70<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>70attgggacggggagacacg 19<210>71<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>71gacacggaatatgaaggccca 21<210>72<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>72gacacggaatgtgaaggccc 20<210>73<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
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<223>
<400>74tcacagattgaccgagtggacc 22<210>75<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>75tcacagactgaccgagtggacc 22<210>76<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>76cgagcgaacctggggacc 18<210>77<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>77ccgagagagcctgcggatc 19<210>78<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>78accgagagaacctggggacc 20<210>79<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
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<223>
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<223>
<400>81accagcaggacgcttacgacg 21<210>82<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
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<400>214catcctggaagacgagcgggg 2權利要求
1.一種對目的基因進行分型的方法，包括a)從合適樣品中分離含有目的基因的靶細胞；b)目的核苷酸序列的制備，所述目的核苷酸序列至少是所述目的基因的一部分；與所述目的基因不相關的另一核苷酸序列的制備；c)提供一種芯片，所述芯片上固定了能和所述目的核苷酸序列雜交的寡核苷酸探針和至少一種以下對照探針陽性對照探針、陰性對照探針、雜交對照探針和固定化對照探針；d)使步驟b)中所述目的核苷酸序列和/或所述另一核苷酸序列和步驟c)中所提供的芯片雜交，根據所述目的核苷酸序列和/或所述另一核苷酸序列與所述芯片上的所述探針的雜交結果來對所述目的基因進行分型。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述靶細胞是白細胞。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因是人類白細胞抗原基因。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述合適樣品選自血液、唾液、毛發(fā)、含有核酸的人類組織和其它任何含有有核細胞的人類組織。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述血樣選自血清、血漿和全血。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述血樣是新鮮的或低溫保存的。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述靶細胞是用微型磁珠從合適樣品中分離出來的。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述微型磁珠的直徑為5-200μm。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述目的核酸序列的制備包括核酸擴增步驟。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述目的核酸序列是通過對所述分離的靶細胞直接進行核酸擴增得到的。
11.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述目的核苷酸序列是通過以所述分離的靶細胞的核酸為模板進行核酸擴增得到的。
12.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述核酸擴增步驟為聚合酶鏈式反應、連接酶鏈式反應、基于核酸序列的擴增、鏈置換擴增、滾環(huán)復制或轉錄介導的擴增。
13.根據權利要求12所述的方法，其特征在于所述轉錄介導的擴增是由T7啟動子啟動的。
14.根據權利要求12所述的方法，其特征在于所述聚合酶鏈式反應為不對稱PCR。
15.根據權利要求14所述的方法，其特征在于所述不對稱PCR的上下游引物比例為1∶5-1∶200。
16.根據權利要求14所述的方法，其特征在于所述不對稱PCR的上下游引物的Tm值相同或不同。
17.根據權利要求14所述的方法，其特征在于所述不對稱PCR的上下游引物Tm值相差1-20℃。
18.根據權利要求14所述的方法，其特征在于所述不對稱PCR有三條引物，其中兩條引物的Tm值相近，第三條的Tm值與所述兩條引物的Tm值相差1-20℃。
19.根據權利要求14所述的方法，其特征在于所述不對稱PCR的引物是直鏈引物或包含發(fā)卡結構的引物。
20.根據權利要求12所述的方法，其特征在于所述聚合酶鏈式反應的退火溫度為單個或多個。
21.根據權利要求20所述的方法，其特征在于所述退火溫度之間相差1-20℃。
22.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟b)中目的核酸序列為單鏈DNA或RNA。
23.根據權利要求22所述的方法，其特征在于所述單鏈DNA或RNA為正鏈，或負鏈。
24.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟b)中得到的目的核酸序列是被標記的。
25.根據權利要求24所述的方法，其特征在于所述標記為熒光素或生物素標記。
26.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述另一核苷酸序列是與固定在所述芯片上的陽性對照探針、陰性對照探針或雜交對照探針互補的基因序列。
27.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述固定于芯片上的探針為正鏈或負鏈探針。
28.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述固定于芯片上的探針是被修飾過的。
29.根據權利要求28所述的方法，其特征在于所述探針修飾選自5’-NH2修飾，5’-SH修飾，5’-polyT、5’-poly A、5’-poly C或5’-poly G修飾，5’-生物素修飾，3’-NH2修飾，3’-SH修飾，3’-polyT、3’-poly A、3’-poly C或3’-poly G修飾和3’-生物素修飾。
30.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述芯片含有1-400種不同類型的探針。
31.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述芯片上有復合探針陣列，每一個陣列包括1-400種不同類型的探針。
32.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述探針是被固定到芯片上的，固定化溫度為37-100℃。
33.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述芯片是經過修飾的。
34.根據權利要求33所述的方法，其特征在于所述芯片修飾為在芯片表面包被以下任意一種官能團醛基，氨基，聚賴氨酸，巰基，牛血清蛋白，鏈霉親和素，瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺膠。
35.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述探針的序列正確性、純度、末端修飾情況是經過檢驗的。
36.根據權利要求35所述的方法，其特征在于所述探針的序列正確性、純度、末端修飾情況的檢驗通過DHPLC完成。
37.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述芯片上固定有一種探針的多拷貝。
38.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述芯片上固定的一種探針的拷貝數(shù)為1-10。
39.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述一種探針的多個拷貝連續(xù)或分開固定于所述芯片上。
40.根據權利要求39所述的方法，其特征在于一種陽性對照探針的多個拷貝固定于所述芯片上；當所述固定的陽性對照探針與步驟b)所述目的核苷酸序列或另一核苷酸序列雜交時，所述固定的陽性對照探針序列和長度的變化，可產生從強到弱或從弱到強變化的信號。
41.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述陽性對照探針與目的核苷酸序列、以目的核苷酸序列為模板擴增產生的核苷酸序列或人工合成的核苷酸序列的一部分互補。
42.根據權利要求41所述的方法，其特征在于陰性對照探針與所述陽性對照探針有1-3個堿基對的錯配。
43.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述雜交對照探針與目的基因無同源性的人工合成的核苷酸序列互補。
44.根據權利要求43所述的方法，其特征在于所述雜交對照探針與人工合成的標記的核苷酸序列完全互補，或者與人工合成的標記的核苷酸序列有1-2個堿基對的錯配。
45.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述固定化對照探針不會與目的核苷酸序列發(fā)生反應而產生雜交信號。
46.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述固定化對照探針的一端進行了化學修飾，另一端有一種可被檢測的標記。
47.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述芯片上包含了一種陽性對照探針、一種陰性對照探針、一種雜交對照探針和一種固定化對照探針。
48.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述陽性對照探針、陰性對照探針、雜交對照探針和固定化對照探針固定在所述芯片的四個角上、中間或按其它合適的方式排列或隨機分布在探針陣列中。
49.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟d)中的雜交反應在含有氯化鈉和檸檬酸鈉和表面活性劑的緩沖液中進行。
50.根據權利要求49所述的方法，其特征在于所述緩沖液為3×～10×的SSC。
51.根據權利要求49所述的方法，其特征在于所述表面活性劑的質量濃度從0.05％到5％。
52.根據權利要求49所述的方法，其特征在于所述表面活性劑選自十二烷基磺酸鈉、Triton 100和十二烷基肌氨酸鈉。
53.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟d)中的雜交反應溫度范圍為42℃到70℃。
54.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括在雜交反應結束后進行清洗的步驟。
55.根據權利要求54所述的方法，其特征在于所述清洗用緩沖液含有質量濃度為0％到2％的表面活性劑。
56.根據權利要求54所述的方法，其特征在于所述清洗進行5分鐘到30分鐘。
57.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中固定化效率是通過固定化對照探針的信號值來評價的。
58.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中總體雜交效率是通過分析雜交對照探針和與目的基因無關的合成的帶標記的核苷酸序列的雜交信號來評價的。
59.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中雜交特異性通過分析陽性對照探針的雜交信號和陰性對照探針的雜交信號的比值以及陽性雜交對照探針的雜交信號和陰性雜交對照探針的雜交信號的比值來進行評價，比值越高則說明特異性越好。
60.根據權利要求1所述的方法，其特征在于在涉及一組緊密相關的探針雜交中，陽性雜交信號的判斷標準是a)雜交信號和背景噪音的比值大于3；b)雜交信號與相應陽性對照探針的雜交信號的比值在一個預先確定的范圍內；c)比較所有根據步驟b和c產生陽性雜交信號的所有探針的雜交信號，或者僅一個探針表現(xiàn)出陽性雜交信號時比較表現(xiàn)出最強雜交信號的兩個探針的雜交信號，來確定雜交信號是陰性還是陽性。d)在緊密相關的探針組里只有2個或少于2個陽性信號。
61.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述寡核苷酸探針和HLA目的基因互補。
62.根據權利要求61所述的方法，其特征在于所述寡核苷酸探針含有如下的序列a)能夠在高嚴謹性條件下與目的HLA核苷酸序列或其互補鏈進行雜交的序列；所述序列選自序列表中的序列1-214；b)能夠與所述目的HLA核苷酸序列至少有90％匹配率的序列，所述序列為正義鏈或負義鏈；所述序列為序列表中的序列。
63.根據權利要求61所述的方法，其特征在于所述寡核苷酸探針是序列表中的序列或其互補序列。
64.根據權利要求61所述的方法，其特征在于所述芯片上包括序列表中所有的寡核苷酸序列或其互補序列。
65.用于對HLA基因進行分型的寡核苷酸探針包含如下序列a)能夠在高嚴謹雜交條件下與目的HLA基因核苷酸序列或其互補鏈進行雜交的序列；所述序列選自序列表中的序列1-214；b)能夠與目的HLA核苷酸序列或其互補序列至少有90％匹配率的序列，所述序列選自序列表中的序列1-214。
66.根據權利要求65所述的方法，其特征在于所述寡核苷酸探針是DNA、RNA、PNA或其它衍生物。
67.根據權利要求65所述的方法，其特征在于所述寡核苷酸探針是序列表中的序列，或其互補序列。
68.根據權利要求65所述的方法，其特征在于所述寡核苷酸探針是被標記的。
69.根據權利要求68所述的方法，其特征在于所述標記選自化學標記，酶標記，免疫標記，放射性標記，熒光標記、化學發(fā)光標記和熒光共振能量轉移標記。
70.一種對HLA目的基因進行分型的寡核苷酸探針陣列，包括可以固定大量寡核苷酸探針并適于雜交反應的固相載體，所述探針中至少一條探針具有如下序列a)能夠在高嚴謹性條件下與目的HLA核苷酸序列或其互補鏈進行雜交的序列，所述序列為序列表中的序列；b)能夠與目的HLA核苷酸序列或其互補序列至少有90％匹配的序列，所述序列為序列表中的序列。
71.根據權利要求70所述的陣列，其特征在于所述寡核苷酸探針包括DNA、RNA、PNA或其衍生物。
72.根據權利要求70所述的陣列，其特征在于所述寡核苷酸探針中至少一條探針含有表1中的序列或其互補序列。
73.根據權利要求70所述的陣列，其特征在于所述陣列包含序列表中所有序列或其互補序列的探針。
74.根據權利要求73所述的陣列，其特征在于所述探針中至少一條是被標記的。
75.根據權利要求74所述的陣列，其特征在于所述標記選自化學標記，酶標記，免疫標記，放射性標記，熒光標記、化學發(fā)光標記和熒光共振能量轉移標記。
76.根據權利要求70所述的陣列，其特征在于所述陣列的載體表面為硅片、塑料、玻璃、陶瓷、橡膠合或聚合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于DNA芯片的基因分型方法及其應用。本發(fā)明所提供的基于DNA芯片的基因分型方法包括a)從合適樣品中分離含有目的基因的靶細胞；b)目的核苷酸序列的制備，所述目的核苷酸序列至少是所述目的基因的一部分；與所述目的基因不相關的另一核苷酸序列的制備；c)提供一種芯片，所述芯片上固定了能和所述目的核苷酸序列雜交的寡核苷酸探針和至少一種以下對照探針陽性對照探針、陰性對照探針、雜交對照探針和固定化對照探針；d)使步驟b)中所述目的核苷酸序列和/或所述另一核苷酸序列和步驟c)中所提供的芯片雜交，根據所述目的核苷酸序列和/或所述另一核苷酸序列與所述芯片上的所述探針的雜交結果來對所述目的基因進行分型。
文檔編號C12Q1/68GK1566366SQ03148529
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月30日 優(yōu)先權日2003年6月30日
發(fā)明者高華方, 馬雪梅, 張翅, 陳謙, 周一鳴, 王棟, 章軼哲, 田玉娥, 張蕊, 蘭更欣, 周玉祥, 程京 申請人:清華大學, 北京博奧生物芯片有限責任公司