專利名稱：一種制作微囊化細(xì)胞的裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種制備微囊的裝置，該裝置制備的微囊可用于包被細(xì)胞，如胰島細(xì)胞、肝細(xì)胞等進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞移植。
背景技術(shù)：
微囊具有選擇通透性，它能阻止免疫細(xì)胞、免疫球蛋白與包被的細(xì)胞接觸，從而阻止受體免疫系統(tǒng)對移植物的排斥。但微囊允許細(xì)胞代謝所需營養(yǎng)物質(zhì)及細(xì)胞代謝的產(chǎn)物通過，使移植細(xì)胞在微囊內(nèi)能長期存活并發(fā)揮功能。良好的微囊除必須具有一定的通透性及免疫隔離作用外，良好的生物相容性也是其必須具有的特性。以往人們已發(fā)明了一些技術(shù)制作微囊，例如美國專利4352883中使用的諧振器以及美國專利4391909使用的氣流液滴發(fā)生器。但以上兩種方法制作的微囊存在兩個(gè)缺點(diǎn)1.體積大，700-1000μm；2.形狀不均勻。目前常用的移植位點(diǎn)有心血管、腹膜腔和腎被膜下。將微囊注射到心血管中，微囊能直接與血液接觸，因此對血液內(nèi)物質(zhì)變化反應(yīng)速度快。但大體積微囊不能直接注射到心血管中。腹膜腔雖然能夠移植大量的微囊，但由于微囊在腹膜腔內(nèi)與血液沒有直接接觸，因此對血液中物質(zhì)變化反應(yīng)遲鈍，并且由于微囊的體積大，使得微囊內(nèi)細(xì)胞分泌的物質(zhì)不能快速擴(kuò)散到微囊外。相比之下，小微囊內(nèi)的細(xì)胞對外界變化反應(yīng)速度快。并且由于移植位點(diǎn)的總?cè)莘e有限，微囊體積越小所能移植的細(xì)胞數(shù)量也就越多。微囊的形狀不均勻，可導(dǎo)致組織與微囊之間的摩擦力增加，從而引起炎癥的發(fā)生，使微囊的組織相容性下降。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為解決現(xiàn)有裝置存在的問題而在設(shè)計(jì)的一個(gè)改進(jìn)的裝置。該裝置能制作出形狀均勻、體積更小的微囊。
圖1是本發(fā)明裝置的全貌，參考圖1說明此裝置的組成注射器4由不導(dǎo)電的絕緣材料制成。注射器4通過推桿2與注射泵1相連。注射泵的推進(jìn)速度為0.1-100ml/h，可連接20、50、100ml的注射器。注射泵1通過推桿2推動活塞3，活塞3推進(jìn)注射器中含有細(xì)胞的液體材料。注射針5連接于注射器上，注射針的規(guī)格為18-22G。液體通過注射針5到達(dá)注射針的末端，形成液滴7。導(dǎo)線6一端連接于注射針5上，另一端連接于高壓脈沖靜電發(fā)生器的正極，因此注射針帶有正電。液滴7落入一個(gè)盛有金屬鹽溶液(CaCl2)的容器8中，容器8的底部與導(dǎo)線9相連，導(dǎo)線9連接于高壓脈沖靜電發(fā)生器的負(fù)極。注射泵1通過夾子12、容器8通過夾子7連接于鐵架臺13上，鐵架臺的底部10起平衡整個(gè)裝置的作用。
圖2是高壓脈沖靜電液滴發(fā)生器的電路，參考圖2說明高壓靜電脈沖發(fā)生器的電路脈沖發(fā)生器14產(chǎn)生高頻脈沖信號，調(diào)制脈沖發(fā)生器23產(chǎn)生低頻脈沖信號。兩種脈沖信號傳送至調(diào)制器15。放大器16接受15輸出的脈沖信號，經(jīng)過高壓和功率放大輸出10KV高壓。功率放大器由大功率晶體管、驅(qū)動電路、高壓脈沖變壓器和電流釋放電路組成，保證放大器可靠工作。高壓發(fā)生器17接受16的脈沖信號輸出0-100KV連續(xù)可調(diào)的高壓。高壓通過導(dǎo)線18(正極)、19(負(fù)極)分別連接圖1的6和9。電源分別設(shè)置了主電源20和控制電源21。通過對主電源20輸出電壓值的調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)高壓發(fā)生器17輸出0-100KV電壓的連續(xù)調(diào)節(jié)。打火保護(hù)裝置22起保護(hù)作用。此高壓脈沖靜電發(fā)生器的參數(shù)如下電壓0-100KV連續(xù)可調(diào)；脈沖頻率10-100Hz；脈沖長度1-6ms。
圖3是高壓靜電發(fā)生器的脈沖波形，參考圖3說明電脈沖的波形工作電壓Vs0-100KV 基礎(chǔ)電壓Vb220VAC代表一個(gè)脈沖周期10-100ms，即頻率是10-100Hz。
AB代表一個(gè)周期內(nèi)工作脈沖作用時(shí)間；1-6ms。此時(shí)有電場力產(chǎn)生。
BC代表基礎(chǔ)電壓作用時(shí)間4-99ms。此段時(shí)間無電場力。
利用本發(fā)明提供的高壓脈沖靜電液滴發(fā)生器可制作直徑50-450μm的液滴，此液滴落入帶有相反電荷的溶液中形成固體的膠珠。高壓脈沖靜電發(fā)生器可以產(chǎn)生不同強(qiáng)度、頻率、脈沖長度的靜電。電壓決定了液滴在電場中所受到電場力的大小。頻率決定單位時(shí)間內(nèi)多少個(gè)脈沖作用于液滴。脈沖長度決定一個(gè)脈沖內(nèi)電場力發(fā)揮作用的時(shí)間。當(dāng)液滴超過一定的大小即超過其電壓臨界值時(shí)就會落下。
圖4是高壓脈沖靜電液滴發(fā)生器的實(shí)物圖。
應(yīng)用本裝置通過以下方法制成微囊首先將混有活細(xì)胞的可膠化材料溶液裝入注射器中。這種可膠化材料是多聚糖類物質(zhì)。常用的多聚糖是海藻酸鈉。海藻酸鈉由兩種成分組成，分別是古洛糖醛酸(G)和甘露糖醛酸(M)。由于古洛糖醛酸的生物相容性優(yōu)于甘露糖醛酸，因此本發(fā)明使用古洛糖醛酸含量高的海藻酸鈉，粘度50-1400CPS。打開注射泵和靜電發(fā)生器，注射器的針尖上形成液滴，液滴在靜電場力的作用下落入二價(jià)金屬鹽溶液中。海藻酸鈉與金屬鹽中的金屬離子發(fā)生膠化作用，形成膠珠。常用的金屬鹽是CaCl2，也可以用BaCl2。CaCl2的濃度是1.5-2.0％。
接著將膠珠放入一種多聚氨基酸溶液中，由于多聚氨基酸帶有負(fù)電荷而海藻酸鈉帶有正電荷，因此G、M與多聚氨基酸發(fā)生離子交聯(lián)作用形成具有選擇通透性的半透膜。海藻酸鈉的分子量、多聚氨基酸的分子量，以及二者的接觸時(shí)間都會影響半透膜的厚度和通透性。一般隨著分子量的上升、接觸時(shí)間的延長，膜的通透性下降，膜的厚度上升，堅(jiān)固性也上升。反之，膜的通透性上升，厚度下降，堅(jiān)固性也下降。常用的多聚氨基酸是多聚賴氨酸(PLL)及多聚鳥氨酸。一般多聚賴氨酸的分子量控制在1-30KDa，最好用17KDa。分子量大于80KDa的物質(zhì)不能通過。由于聚賴氨酸帶正電荷，而機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，二者易結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。因此PLL在體內(nèi)易引起炎癥反應(yīng)。因此需要在PLL膜上覆蓋一層具有生物相容性的材料。我們選用的是海藻酸鈉，與開始用的海藻酸鈉相同但是濃度低。
接下來將帶有半透膜的膠珠放入低濃度的海藻酸鈉溶液中。這樣就形成了具有優(yōu)良生物相容性的APA微囊。
最后將微囊放入金屬螯合劑中如Ca離子的螯合劑檸檬酸鈉、EDTA。螯合劑與微囊中間的鈣—海藻酸鈉膠珠發(fā)生反應(yīng)，鈣離子與螯合劑結(jié)合，海藻酸鈉恢復(fù)為液態(tài)。有人認(rèn)為液化的微囊通透性好，有利于物質(zhì)的傳遞與滲透，有利于細(xì)胞的存活。
本發(fā)明裝置可根據(jù)需要制備直徑從50μm到450μm的微囊，這些微囊體積小、形狀均勻、大小一致，可應(yīng)用于包被活細(xì)胞，例如胰島、肝細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、生殖細(xì)胞、干細(xì)胞等。本裝置制作的微囊可以直接用注射的方法進(jìn)行移植而不需要手術(shù)。微囊具有良好的通透性和生物相容性，有利于細(xì)胞的存活，有利于包被的細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1制作平均直徑400μm的膠珠將2％的海藻酸鈉溶液(粘度250CPS)放入20-100毫升的注射器中。將注射器放入注射泵中，注射器連有一個(gè)22G針頭，其直徑0.37μm，枕頭斜度17°。高壓靜電發(fā)生器的正極連接于針尖上，負(fù)極連接于盛有2％CaCl2溶液的容器的底部。液面與針尖的距離20mm，電壓10KV，頻率100Hz，脈沖長度3ms，注射泵速度2ml/s。打開注射泵和高壓脈沖靜電發(fā)生器。液滴在針尖上形成，并滴入CaCl2溶液中形成膠珠。10分鐘后收集膠珠，在帶有測微尺的顯微鏡下觀察直徑。膠珠完整光滑。
實(shí)施例2制作平均直徑200μm的膠珠針頭內(nèi)徑0.24μm，針長100mm枕頭斜度0°。其它條件同實(shí)施例1。可制作出平均直徑212±14μm的膠珠。
實(shí)施例3制作含有胰島的微囊將4×103個(gè)直徑小于300μm的胰島懸浮于4毫升粘度250CPS的2％海藻酸鈉溶液中。使用實(shí)施例1中的各種參數(shù)，制作的液滴滴入2％CaCl2溶液中。10分鐘后吸去CaCl2溶液。膠珠用PH 7.2的生理鹽水清洗，60目篩網(wǎng)過濾，放入分子量17KDa的0.05％PLL中，培養(yǎng)至少6分鐘，棄去PLL溶液，用PH 7.0的生理鹽水清洗，棄去溶液，放入0.05％的海藻酸鈉溶液中浸泡9分鐘，然后用PH 7.4的生理鹽水清洗。用此方法制作出的微囊光滑完整，平均直徑400μm。


圖1裝置的全貌圖2高壓脈沖靜電液滴發(fā)生器的電路圖3高壓靜電發(fā)生器的脈沖波形圖4高壓脈沖靜電液滴發(fā)生器的實(shí)物圖
權(quán)利要求
1本發(fā)明是一種制作微囊化細(xì)胞的裝置。該裝置是高壓脈沖靜電液滴發(fā)生器，由注射系統(tǒng)、靜電發(fā)生系統(tǒng)、輔助系統(tǒng)三部分組成。其特征是能夠制備50-1000微米的微囊。
2權(quán)利要求1中所說的注射系統(tǒng)，其特征是由自動注射泵、注射器、針頭組成。
3權(quán)利要求1中所說的靜電發(fā)生系統(tǒng)，其特征是由高壓脈沖靜電發(fā)生器、導(dǎo)線組成。
4權(quán)利要求1中所說的輔助系統(tǒng)由鐵架臺、夾子、絕緣容器組成。
5權(quán)利要求1中所說的液滴，其特征是由可膠化的材料組成?？赡z化材料可以是多聚糖類物質(zhì)。多聚糖類物質(zhì)可以是海藻酸鈉。
6權(quán)利要求5中所說的海藻酸鈉形成一定大小的液滴后，與一種含二價(jià)金屬離子的鹽溶液反應(yīng)發(fā)生膠化作用，形成膠珠。所說的二價(jià)金屬離子可以是Ca2+和Ba2+。鹽溶液可以是CaCl2和BaCl2溶液。
7權(quán)利要求6中形成的膠珠與一種帶相反電荷的多聚氨基酸發(fā)生離子交聯(lián)反應(yīng)，在表面形成半透膜。所說的多聚氨基酸是多聚賴氨酸。
8權(quán)利要求7中帶有半透膜的膠珠與生物相容性優(yōu)良的多聚糖材料發(fā)生離子反應(yīng)，目的是覆蓋多聚賴氨酸。
9權(quán)利要求8中所說的多聚糖材料，其特征是可以是海藻酸鈉。
10權(quán)利要求1中所說的細(xì)胞，其特征是可以是體細(xì)胞，也可以是生殖細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明是一種制作微囊化細(xì)胞的裝置，屬于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域。該裝置是由注射系統(tǒng)、高壓脈沖發(fā)生器和輔助系統(tǒng)組成。通過調(diào)節(jié)電壓、頻率和占空比制作50～1000微米不同直徑的微囊。制作的微囊可以用于細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞移植。
文檔編號C12N11/02GK1566339SQ0314855
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月3日
發(fā)明者王常勇, 孫志杰, 郭希民, 段翠密 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所