專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)食品及動(dòng)植物產(chǎn)品中sars病毒的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本方法涉及一種從食品及動(dòng)植物產(chǎn)品中檢測(cè)病毒成分的方法，特別涉及一種從食品及動(dòng)植物產(chǎn)品中檢測(cè)SARS病毒的方法和該方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
非典型肺炎即嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，是由冠狀病毒的一個(gè)變種SARS病毒引起的。SARS病毒引起的呼吸性疾病具有很強(qiáng)的傳染性，并且致病快，導(dǎo)致肺功能衰竭，威脅人的生命。因此，從各類(lèi)樣品中快速檢測(cè)出SARS病毒是預(yù)防這一疾病，控制傳播途徑的一個(gè)重要技術(shù)。
目前，對(duì)SARS病毒的檢驗(yàn)方法主要有抗體檢測(cè)、分子生物學(xué)方法和細(xì)胞培養(yǎng)法等3種?？贵w檢測(cè)是通過(guò)酶聯(lián)免疫ELISA(IGM/IGA)或免疫熒光法檢測(cè)出現(xiàn)臨床癥狀20天后SARS病人血清中的病毒抗體，或病毒感染VERO細(xì)胞10天后產(chǎn)生的M免疫球蛋白。分子檢測(cè)方法是通過(guò)對(duì)SARS病毒特異片斷的引物設(shè)計(jì)，利用RT-PCR，巢式PCR方法檢測(cè)包括血液、糞便、呼吸道分泌物等樣品中的病毒(Identification of a Novel Coronavirus inPatients with Severe Acute Respiratory Syndrome C.Drosten and Others”Thenew England Journal of Medicine，Posted April 7，2003)，在采用巢式PCR時(shí)由于需要先后進(jìn)行兩次擴(kuò)增，因此所需時(shí)間較長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)方法是利用VERO細(xì)胞來(lái)檢測(cè)SARS病人的呼吸道分泌物和血液樣品，以確定SARS病人是否感染了冠狀病毒，但這些方法都是針對(duì)臨床標(biāo)本的。
在食品中檢測(cè)病毒的方法僅有包括甲型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎等腸道病毒的報(bào)道，而提取腸道病毒RNA的步驟一般為，先使用甘氨酸緩沖液溶解、然后用PEG或其它絮凝劑沉淀，接著用Tri-reagent-poly(dt)磁珠提取RNA。而該方法所采用的Tri-reagent-poly(dt)磁珠成本高，并且一般用于低脂肪產(chǎn)品及小樣本處理，如牡蠣產(chǎn)品中甲肝病毒RNA的提取。對(duì)于食品中SARS病毒的檢驗(yàn)，尤其是加工后或加工過(guò)程中受到污染的動(dòng)物源性食品，目前尚未看到相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從食品及動(dòng)植物產(chǎn)品中檢測(cè)SARS病毒的方法和相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。該方法適用于從各類(lèi)動(dòng)植物產(chǎn)品和食品樣本中檢測(cè)SARS病毒，并且檢測(cè)成本低，而且通過(guò)同時(shí)擴(kuò)增SARS病毒的2個(gè)保守區(qū)域基因使得檢測(cè)特異性更強(qiáng)，同時(shí)高效省時(shí)。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種從食品及動(dòng)植物產(chǎn)品中檢測(cè)SARS病毒的方法，具有如下檢測(cè)步驟A.首先在食品或動(dòng)植物樣品中加入含0.1～0.5M Na鹽的0.05～0.3M的甘氨酸緩沖液使樣品勻漿，在勻漿物質(zhì)經(jīng)離心后的上清液中加入含0.3～0.7M Na鹽的10～20％濃度PEG溶液，得到沉淀，離心后棄上清，再加入RNA提取試劑提取SARS病毒RNA；B.RT-PCR，合成RNA的互補(bǔ)脫氧核糖核酸；C.采用SARS病毒RNA聚合酶和N蛋白基因的特異性擴(kuò)增引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增RNA聚合酶和N蛋白基因片段；D.對(duì)步驟(C)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，根據(jù)電泳結(jié)果判斷SARS基因的存在與否。
步驟A中的PEG優(yōu)選PEG8000；RNA提取試劑優(yōu)選Trizol試劑；優(yōu)選RNA逆轉(zhuǎn)錄酶為SSII；優(yōu)選SARS病毒RNA聚合酶特異性擴(kuò)增引物為F15’-CCTCTCTTGTTCTTGCTCGCA-3’和R15’-TATAGTGAGCCGCCACACATG-3’；優(yōu)選SARS病毒N蛋白基因的特異性擴(kuò)增引物為F25’-TACACACCTCAGCGTTG-3’，和R25’-CACGAACGTGACGAAT-3’。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種從食品、動(dòng)植物及其產(chǎn)品中檢測(cè)SARS病毒的試劑盒，該試劑盒包括如下組份(a)SARS病毒RNA提取試劑包括溶液A含0.1～0.5M Na鹽的0.05～0.3M的甘氨酸緩沖液；溶液B含0.3～0.7M Na鹽的10～20％濃度PEG溶液；溶液CRNA提取試劑；和溶液DDEPC處理水；
(b)RT-PCR擴(kuò)增試劑引物OligdT，dNTP溶液，DTT，和RNA逆轉(zhuǎn)錄酶；(c)PCR擴(kuò)增SARS病毒基因的試劑包括SARS病毒RNA聚合酶和N蛋白基因的特異性擴(kuò)增引物，DNA聚合酶及PCR擴(kuò)增所需的試劑。
其中溶液B中的PEG優(yōu)選PEG8000；溶液C優(yōu)選Trizol試劑；優(yōu)選RNA逆轉(zhuǎn)錄酶為SSII；優(yōu)選SARS病毒RNA聚合酶特異性擴(kuò)增引物為F15’-CCTCTCTTGTTCTTGCTCGCA-3’和R15’-TATAGTGAGCCGCCACACATG-3’；優(yōu)選SARS病毒N蛋白基因的特異性擴(kuò)增引物為F25’-TACACACCTCAGCGTTG-3’，和R25’-CACGAACGTGACGAAT-3’；優(yōu)選DNA聚合酶為T(mén)aq酶。
“PCR擴(kuò)增所需的試劑”是指將模板中的極微量的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程所用的試劑，包括dNTP、10×酶緩沖液和雙蒸水等。
本發(fā)明的病毒RNA提取方法甘氨酸緩沖液-PEG沉淀-Trizol提取，能有效地從各類(lèi)樣品，包括脂類(lèi)的動(dòng)物源樣品中提取SARS病毒RNA，而且該方法成本低。本發(fā)明中通過(guò)同時(shí)使用處于SARS基因不同保守區(qū)域的兩對(duì)引物，擴(kuò)增2個(gè)SASR基因特異片段，使擴(kuò)增的特異性更強(qiáng)，同時(shí)高效省時(shí)，從而達(dá)到對(duì)SARS基因檢測(cè)的目的。


圖1A為雞肉組織中SARS病毒的檢測(cè)圖1B為雞肉組織中SARS病毒的檢測(cè)其中 泳道1為分子量標(biāo)記；泳道2為陽(yáng)性對(duì)照(添加了100TCID50/ml SARS病毒的雞肉樣品)；泳道3-7為同一份檢驗(yàn)樣品的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
圖2A為水產(chǎn)組織中SARS病毒的檢測(cè)圖2B為水產(chǎn)組織中SARS病毒的檢測(cè)其中 泳道1為分子量標(biāo)記；泳道2為陽(yáng)性對(duì)照(添加了10TCID50/mlSARS病毒的水產(chǎn)組織)；泳道3-7為同一份檢驗(yàn)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
圖3A為蔬菜中SARS病毒的檢測(cè)圖3B為蔬菜中SARS病毒的檢測(cè)其中 泳道1為分子量標(biāo)記；泳道2為陽(yáng)性對(duì)照(添加10TCID50/mlSARS病毒的蔬菜)；泳道3-7為同一份檢驗(yàn)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例中SARS病毒的RNA提取試劑的溶液C為T(mén)rizol試劑。實(shí)施例中RT-PCR擴(kuò)增試劑中的具體組分，以及PCR擴(kuò)增SARS病毒基因的試劑中的具體組分如下表所述。
RT-PCR擴(kuò)增試劑

PCR擴(kuò)增SARS病毒基因的試劑

實(shí)施例1步驟一、提取SARS病毒RNA稱(chēng)取25g雞肉樣本，加入175ml 1×溶液A(0.1M甘氨酸，0.3MNaCl，pH9.5)，于組織搗碎機(jī)中均質(zhì)5次，每次45s，使其充分勻漿。靜置5分鐘；取50ml帶螺旋蓋的PV離心管，加入30ml勻漿物質(zhì)，12000rpm，4℃離心15分鐘；將上清轉(zhuǎn)移到新的PV離心管中，加入等體積的溶液B(20％PEG8000，0.7M NaCl)，冰上放置1小時(shí)，9000rpm，4℃離心15分鐘；棄上清，每管加入5ml溶液C(Trizol)，吹打懸浮，室溫靜置5分鐘；加入1ml氯仿，反復(fù)震蕩搖勻，室溫靜置10分鐘；12000rpm 4℃離心15分鐘，小心吸取上層水相于不含RNA酶的1.5ml微量離心管中，加入0.5倍體積的異丙醇，室溫靜置10分鐘，12000rpm，4℃離心10分鐘；棄上清，用預(yù)冷500μl的75％乙醇洗2次，小心吸棄上清，晾干或90℃快速烘干，約需5-10分鐘；加入10μl DEPC處理水溶解RNA，輕輕混勻，立即用于cDNA合成或保存于-70℃。
步驟二、cDNA合成取10μl RNA到一個(gè)新的不含RNA酶的微量離心管中，加入2μl引物1(0.5μg/μl OligdT)，置于70℃水浴中，反應(yīng)10分鐘，立即置于冰浴2-5分鐘；加入7μl的反應(yīng)混合物1，輕輕混勻，短暫離心，室溫放置5分鐘；加入1μl的酶混合物1，42℃60分鐘，70℃15分鐘，立即置于冰浴2-5分鐘。
步驟三、PCR擴(kuò)增SARS基因取兩個(gè)PCR反應(yīng)的微量離心管，標(biāo)記，各加入10μl的操作步驟二中的反應(yīng)產(chǎn)物，再分別加入39μl的反應(yīng)混合物2.1和反應(yīng)混合物2.2，再各加入1μl的酶混合物2.2，再各加入1μl的酶混合物2(2u/μl Taq)，短暫離心，加入兩滴液體石蠟(用蓋加熱式的PCR儀可不加)，置于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)；PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置預(yù)變性95℃ 120秒 終延伸72℃ 300秒步驟四、電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物取2.0g瓊脂糖，于100ml電泳緩沖液加熱，充分溶解，加入溴化乙錠至終濃度1μg/ml，制膠。在電泳槽中加入適量電泳緩沖液，將10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別于適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣。9V/cm恒壓，電泳20-30min。紫外檢測(cè)儀下觀察結(jié)果并記錄結(jié)果(見(jiàn)圖1A和圖1B)。
其中泳道1為分子量Marker；泳道2為采用添加了100TCID50/ml SARS病毒的雞肉樣品經(jīng)上述相同步驟后的電泳，結(jié)果為陽(yáng)性，其中圖1A檢測(cè)到了SARS病毒RNA聚合酶基因(見(jiàn)圖1A中121bp箭頭所指處)，圖1B中檢測(cè)到了N蛋白基因(見(jiàn)圖1B中182bp箭頭所指處)；泳道3-7為本實(shí)施例同一份檢驗(yàn)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)，為陰性結(jié)果。
實(shí)施例2步驟一、提取SARS病毒RNA稱(chēng)取20g蟶蛤組織，加入150ml溶液A(0.3M甘氨酸，0.5MNaCl，pH8.5)，于組織搗碎機(jī)中均質(zhì)5次，每次45s，使其充分勻漿。靜置5分鐘；取50ml帶螺旋蓋的PV離心管，加入30ml勻漿物質(zhì)，12000rpm，4℃離心15分鐘；將上清轉(zhuǎn)移到新的PV離心管中，加入等體積的溶液B(14％PEG8000，0.4MNaCl)，冰上放置1小時(shí)，9000rpm，4℃離心10分鐘；棄上清，每管加入5ml溶液C，吹打懸浮，室溫靜置5分鐘；加入1ml氯仿，反復(fù)震蕩搖勻，室溫靜置10分鐘；12000rpm 4℃離心15分鐘，小心吸取上層水相于不含RNA酶的1.5ml微量離心管中，加入0.5倍體積的異丙醇，室溫靜置10分鐘，12000rpm，4℃離心10分鐘；棄上清，用預(yù)冷500μl的75％乙醇洗2次，小心吸棄上清，晾干或90℃快速烘干，約需5-10分鐘；加入10μl DEPC處理水溶解RNA，輕輕混勻，立即用于cDNA合成。
步驟二、cDNA合成取10μl RNA到一新的不含RNA酶的微量離心管中，加入2μl引物1，置于70℃水浴中，反應(yīng)10分鐘，立即置于冰浴2-5分鐘；加入7μl的反應(yīng)混合物1，輕輕混勻，短暫離心，室溫放置5分鐘；加入1μl的酶混合物1，42℃60分鐘，70℃15分鐘，立即置于冰浴2-5分鐘。
步驟三、PCR擴(kuò)增SARS基因取兩個(gè)PCR反應(yīng)的微量離心管，標(biāo)記，各加入10μl的操作步驟二中的反應(yīng)產(chǎn)物，再分別加入39μl的反應(yīng)混合物2.1和反應(yīng)混合物2.2，再各加入1μl的酶混合物2，短暫離心，加入兩滴液體石蠟(用蓋加熱式的PCR儀可不加)，置于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)；PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置預(yù)變性95℃ 120秒 終延伸72℃ 300秒步驟四、電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物取2.0g瓊脂糖。于100ml電泳緩沖液加熱，充分溶解，加入溴化乙錠至終濃度1μg/ml，制膠。在電泳槽中加入適量電泳緩沖液，將10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別于適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣。9V/cm恒壓，電泳20-30min。紫外檢測(cè)儀下觀察結(jié)果并記錄結(jié)果(見(jiàn)圖2A和圖2B)。其中泳道2為陽(yáng)性對(duì)照(樣品中添加了10TCID50/ml SARS病毒)經(jīng)上述相同步驟后的電泳，結(jié)果為陽(yáng)性。泳道3-7為本實(shí)施例同一份檢驗(yàn)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)，為陰性結(jié)果。
實(shí)施例3從蔬菜樣品中檢測(cè)SARS病毒步驟一、提取SARS病毒RNA稱(chēng)取25g蔬菜樣品，加入170ml溶液A(0.05M甘氨酸，0.1MNaCl，pH8.5)，于組織搗碎機(jī)中均質(zhì)5次，每次45s，使其充分勻漿。靜置5分鐘；取50ml帶螺旋蓋的PV離心管，加入30ml勻漿物質(zhì)，12000rpm，4℃離心15分鐘；將上清轉(zhuǎn)移到新的PV離心管中，加入等體積的溶液B(10％PEG8000，0.3M NaCl)，冰上放置1小時(shí)，9000rpm，4℃離心10分鐘；棄上清，每管加入5ml溶液C，吹打懸浮，室溫靜置5分鐘；加入1ml氯仿，反復(fù)震蕩搖勻，室溫靜置10分鐘；12000rpm4℃離心15分鐘，小心吸取上層水相于不含RNA酶的1.5ml微量離心管中，加入0.5倍體積的異丙醇，室溫靜置10分鐘，12000rpm，4℃離心10分鐘；棄上清，用預(yù)冷500μl的75％乙醇洗2次，小心吸棄上清，晾干或90℃快速烘干，約需5-10分鐘；加入10μl DEPC處理水溶解RNA，輕輕混勻，立即用于cDNA合成。
步驟二、cDNA合成取10μl RNA到一新的不含RNA酶的微量離心管中，加入2μl引物1，置于70℃水浴中，反應(yīng)10分鐘，立即置于冰浴2-5分鐘；加入7μl的反應(yīng)混合物1，輕輕混勻，短暫離心，室溫放置5分鐘；加入1μl的酶混合物1，42℃60分鐘，70℃15分鐘，立即置于冰浴2-5分鐘。
步驟三、PCR擴(kuò)增SARS基因取兩個(gè)PCR反應(yīng)的微量離心管，標(biāo)記，各加入10μl的操作步驟二中的反應(yīng)產(chǎn)物，再分別加入39μl的反應(yīng)混合物2.1和反應(yīng)混合物2.2，再各加入1μl的酶混合物2，短暫離心，加入兩滴液體石蠟(用蓋加熱式的PCR儀可不加)，置于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)；PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置預(yù)變性95℃ 120秒 終延伸72℃ 300秒步驟四、電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物取2.0g瓊脂糖。于100ml電泳緩沖液加熱，充分溶解，加入溴化乙錠至終濃度1μg/ml，制膠。在電泳槽中加入適量電泳緩沖液，將10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別于適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣。9V/cm恒壓，電泳20-30min。紫外檢測(cè)儀下觀察結(jié)果并記錄結(jié)果(見(jiàn)圖3A和圖3B)。其中泳道2為陽(yáng)性對(duì)照(添加了10TCID50/mlSARS病毒的蔬菜)經(jīng)上述相同步驟后的電泳，結(jié)果為陽(yáng)性。泳道3-7為本實(shí)施例同一份檢驗(yàn)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)，為陰性結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種從食品及動(dòng)植物產(chǎn)品中檢測(cè)SARS病毒的方法，具有如下檢測(cè)步驟A.首先在食品或動(dòng)植物樣品中加入含0.1～0.5M Na鹽的0.05～0.3M的甘氨酸緩沖液使樣品勻漿，在勻漿物質(zhì)經(jīng)離心后的上清液中加入含0.3～0.7M Na鹽的10～20％濃度PEG溶液，得到沉淀，離心后棄上清，再加入RNA提取試劑提取SARS病毒RNA；B.然后RT-PCR，用RNA逆轉(zhuǎn)錄酶合成RNA的互補(bǔ)脫氧核糖核酸；C.采用SARS病毒RNA聚合酶和N蛋白基因的特異性擴(kuò)增引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增RNA聚合酶和N蛋白基因；D.對(duì)步驟(C)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，根據(jù)電泳結(jié)果判斷SARS基因的存在與否。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟A中的PEG為PEG8000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟A中的RNA提取試劑為T(mén)rizol試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中的RNA逆轉(zhuǎn)錄酶為SSII。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟C中的SARS病毒RNA聚合酶特異性擴(kuò)增引物為F15’-CCTCTCTTGTTCTTGCTCGCA-3’和R15’-TATAGTGAGCCGCCA CACATG-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟C中的SARS病毒N蛋白基因的特異性擴(kuò)增引物為F25’-TACACACCTCAGCGTTG-3’，和R25’-CACGAACGTGACGAAT-3’。
7.一種從食品、動(dòng)植物及其產(chǎn)品中檢測(cè)SARS病毒的試劑盒，該試劑盒包括如下組份(a)SARS病毒RNA提取試劑包括溶液A含0.1～0.5M Na鹽的0.05～0.3M的甘氨酸緩沖液；溶液B含0.3～0.7M Na鹽的10～20％濃度的PEG溶液；溶液CRNA提取試劑；和溶液DDEPC處理水。(b)RT-PCR擴(kuò)增試劑引物OligdT，dNTP溶液，DTT，和RNA逆轉(zhuǎn)錄酶。(c)PCR擴(kuò)增SARS病毒基因的試劑包括SARS病毒RNA聚合酶和N蛋白基因的特異性擴(kuò)增引物，DNA聚合酶及PCR擴(kuò)增所需的試劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)SARS病毒的試劑盒，其特征在于，溶液B中的PEG為PEG8000。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)SARS病毒的試劑盒，其特征在于，溶液C中的RNA提取試劑為T(mén)rizol試劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)SARS病毒的試劑盒，其特征在于，組份(b)中的RNA逆轉(zhuǎn)錄酶為SSII。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從食品及動(dòng)植物產(chǎn)品中檢測(cè)SARS病毒的方法和相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括SARS病毒RNA提取試劑，RT－PCR擴(kuò)增試劑和PCR擴(kuò)增SARS病毒基因的試劑。本發(fā)明通過(guò)同時(shí)使用處于SARS基因不同保守區(qū)域的兩對(duì)引物，擴(kuò)增2個(gè)SASR基因特異片段，使擴(kuò)增的特異性更強(qiáng)，同時(shí)高效省時(shí)，從而有效地從食品及動(dòng)植物產(chǎn)品中檢測(cè)出SARS病毒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1566367SQ0314883
公開(kāi)日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月13日
發(fā)明者趙貴明, 王靜, 陳穎, 姚李四, 徐寶梁, 蘇寧, 李瑾, 于文蓮 申請(qǐng)人:中國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)技術(shù)研究所