專利名稱：一種克服滯后污染的pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，特別是涉及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種快捷、高效的擴增特定DNA的方法。根據(jù)PCR的基本原理經(jīng)過25-30循環(huán)擴增目標(biāo)基因片段將增加800萬至2億5千萬倍。由于擴增產(chǎn)物和樣品中的目標(biāo)基因均可作為擴增模板，痕跡量乃至幾個拷貝擴增產(chǎn)物DNA片段的滯后污染，即會造成比交叉污染嚴(yán)重得多的麻煩。為了減少滯后污染的機會通常需采取嚴(yán)格的物理防范措施(J.L.Hartley等，PCR Method andapplications，1993，3，S10-S14)，例如將PCR反應(yīng)液制備區(qū)與PCR產(chǎn)物檢測區(qū)分開甚至分二個房間，應(yīng)用專門的PCR操作箱和專用的移液管，應(yīng)用帶氣霧阻擋物的PCR專用移液頭，用特制的能破壞DNA的試劑清潔操作臺表面及各種器具等等。為了減少氣流振蕩造成微量反應(yīng)液擴散，有人甚至主張在PCR反應(yīng)完成后，先將試管冷凍至液體結(jié)成冰，然后再打開管蓋。各種物理措施盡管必要，但滯后污染仍防不勝防，為此發(fā)展了各種化學(xué)和生物化學(xué)方法，如光敏DNA交聯(lián)劑、核酸酶和脫氧尿嘧啶糖苷酶(UDG)方法等。至今，在試劑盒中被采用的是UDG方法，該方法(M.C.Longo等，Gene，1990，125-128)用特殊核苷酸dUTP取代4種核苷酸底物中的dTTP，使擴增產(chǎn)物帶有尿嘧啶。PCR反應(yīng)前用脫氧尿嘧啶糖苷酶分解可能存在于反應(yīng)液中的滯后污染擴增產(chǎn)物。該方法的嚴(yán)重缺點是由于擴增產(chǎn)物帶有大量非天然的堿基，PCR產(chǎn)物不適宜用于克隆等目的。90年代初有科學(xué)家提出用核酸酶和能切割擴增產(chǎn)物順序的一種或幾種限制性內(nèi)切酶處理反應(yīng)液，能有效去除可能存的滯后污染擴增產(chǎn)物(F.M.deFlilippes，BioTechniques，1991，1026-29和B.Furrer等，Nature，1990，346324)，但必須在酶處理之后再向反應(yīng)液加樣品DNA，否則目標(biāo)基因DNA也會被酶切割而導(dǎo)致擴增失敗。由于樣品本身也可能帶有滯后污染擴增產(chǎn)物，這種方法形同虛設(shè)，實際上難以實施。本發(fā)明提出了一種有效而可實際操作的用限制性內(nèi)切酶減少和消除滯后污染的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明提供一種克服滯后污染的PCR方法，以填補目前通過引物設(shè)計和常規(guī)限制性內(nèi)切酶處理的方法解決滯后污染問題的空白，解決現(xiàn)有技術(shù)中克服滯后污染需專用試劑和酶、操作復(fù)雜、產(chǎn)物無法進行克隆的缺陷。
發(fā)明構(gòu)思本發(fā)明的原理鑒于在引物的適當(dāng)位置中引進一個或若干個錯配堿基，引物仍能在較高的退火溫度下專一地完成擴增，同時，擴增產(chǎn)物又帶有一個目標(biāo)基因所不含有的限制性內(nèi)切酶識別順序。在每一次PCR反應(yīng)前用特定的限制性內(nèi)切酶處理反應(yīng)液，就可分解可能存在的滯后污染擴增產(chǎn)物，但又不傷及樣品DNA中的目標(biāo)基因。被限制性內(nèi)切酶分解的擴增產(chǎn)物，因為在它的正、反鏈的5’端各失去了一個約十個堿基的片段，在設(shè)定的PCR退火溫度下不再能與引物結(jié)合，失去了作為模板的功能。
技術(shù)方案本發(fā)明提供一種能克服滯后污染的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其步驟依次包括(1)用限制性內(nèi)切酶處理PCR反應(yīng)液；(2)DNA模板變性解鏈；(3)引物與模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環(huán)進行合成反應(yīng)；特別地，在設(shè)計正引物或者反引物時引進錯配堿基，使擴增產(chǎn)物含有目標(biāo)基因所沒有的限制性內(nèi)切酶識別順序。優(yōu)選正、反引物同時引進錯配堿基。
上述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的一個技術(shù)方案為，在引物中引進的錯配堿基數(shù)為1-8個，優(yōu)選1-3個。
上述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的另一個技術(shù)方案為，在引物中引進的錯配堿基位于引物3’或5’端起5-25堿基，優(yōu)選位于引物3’或5’端起10-15堿基。
上述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的另一個技術(shù)方案為，引進錯配堿基的引物具有1-6個限制性內(nèi)切酶切點，優(yōu)選具有2-4個限制性內(nèi)切酶切點，這些內(nèi)切酶的識別順序堿基數(shù)為4-8個，優(yōu)選的識別順序堿基數(shù)為6個。
上述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的另一個技術(shù)方案為，所說的限制性內(nèi)切酶為產(chǎn)生平末端、3’粘性末端或者5’粘性末端的酶。
上述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的另一個技術(shù)方案為，引進的錯配堿基在限制性內(nèi)切酶的識別順序中近5’端的位置。
下面通過一些計算和測試分析結(jié)果來說明本發(fā)明的原理和普遍可用性。
首先以全長1800多堿基的人肌動球蛋白基因為例進行分析，說明在引物的中間位置有一個堿基突變對引物功能的影響，和從該位置開始去除5’端片段堿基對引物功能的影響。測試時每間隔100個堿基取一段30堿基寡核苷酸作為正引物，然后分析在3’端數(shù)起的第12個堿基發(fā)生A與T，或C與G的堿基置換后，引物與模板的結(jié)合強度及解鏈溫度變化，并與去除第12位以后的5’端堿基的數(shù)據(jù)進行比較。用引物軟件Oligo6測算結(jié)合強度和解鏈溫度。表1列出每一個項目17個數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果。
表1.錯配堿基和去除一段堿基對引物特性的影響

*最鄰近堿基計算法**在引物軟件設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)液條件下的解鏈溫度表1說明30堿基長引物與模板的平均結(jié)合強度超過570，如果在引物的3’端第12位引進一個堿基突變，則平均結(jié)合強度仍達450，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過一個高嚴(yán)謹(jǐn)性引物對該項指標(biāo)的要求。反之，如果模板在該位置以后的5’端被切除，則引物與模板的結(jié)合強度下跌至308。另一方面，30堿基長引物的平均解鏈溫度為86℃，最高允許退火溫度超過72℃。引物引進一個突變后解鏈溫度下降約4℃，仍能在接近或高于72℃的高溫下退火。但是當(dāng)模板的5’端順序被切割后，引物與模板的最高允許退火溫度平均下降至45℃(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下的Tm計算)。所以，在30堿基長引物的第12位引進一個突變，使之形成一個限制性內(nèi)切酶識別順序。如用該限制性內(nèi)切酶處理PCR反應(yīng)液，酶對目標(biāo)基因不切割。引物與原始目標(biāo)基因模板雖有一個錯配，但仍能在高溫下與之退火完成擴增。滯后污染擴增產(chǎn)物的5’端會被限制性內(nèi)切酶分解，形成5’端缺失十幾個堿基的不完整模板，在同樣的溫度下引物不能與之退火，滯后污染擴增產(chǎn)物就喪失了模板的作用。
為了理解該方法的普遍應(yīng)用性，分析在人肌動球蛋白基因中引入一個堿基錯配后，能產(chǎn)生多少新增加的限制性內(nèi)切酶識別順序。以最常用的識別順序為六個堿基的六種限制性內(nèi)切酶BamHI，EcoRI，HindIII，PstI，SalI和XhoI為例進行分析。限制性內(nèi)切圖譜表明這六個酶在該基因中均無切割位點。但是只要改變一個堿基就能產(chǎn)生許多新的被酶切割的位點。分析結(jié)果示于表2，粗黑體表示該鹼基被取代后能產(chǎn)生一個酶識別順序。
表2.改變一個堿基后新增的限制性內(nèi)切酶的識別位點


表2說明在長1880多堿基的基因中，對指定的六種識別順序為6個堿基的限制性內(nèi)切酶，只要改變一個堿基就能產(chǎn)生36個新增的識別順序，平均每個酶能找到6個位點。常用的限制性內(nèi)切酶有幾十種，能找到的總位點數(shù)將數(shù)以百計。如果將錯配堿基數(shù)放寬到2或3個，新增的限制性內(nèi)切酶識別位點數(shù)將大大增加。
有益效果本發(fā)明提供的通過引物設(shè)計和常規(guī)限制性內(nèi)切酶處理克服滯后污染的PCR方法，填補了目前解決滯后污染問題上的空白，其有益效果除其他方法也能達到的完全分解污染片段外，其獨特之處還在于；1，本發(fā)明的方法是在下一輪PCR反應(yīng)之前而不是PCR反應(yīng)結(jié)束時采取防范措施，PCR擴增產(chǎn)物可用于分子雜交等，與標(biāo)準(zhǔn)PCR產(chǎn)物完全一樣。
2，用本發(fā)明的PCR反應(yīng)溶液不含有任何非天然核苷酸底物，或含非天然核苷酸的引物，PCR反應(yīng)的各項特性與標(biāo)準(zhǔn)PCR保持一致。
3，PCR擴增產(chǎn)物也不含有非天然核苷酸，產(chǎn)物可用于克隆和其他目的。產(chǎn)物的用途與標(biāo)準(zhǔn)PCR產(chǎn)物完全一致。
4，限制性內(nèi)切酶除了分解滯后污染的擴增產(chǎn)物外，還會分解基因組DNA的非目標(biāo)基因，將基因組DNA切割成比原來小片段，有利于減少空間位阻現(xiàn)象和降低非專一擴增機會。
具體實施例方式
實施例1.
實施例1用一對引物擴增GPT結(jié)合蛋白RhoA基因(基因庫編號L25080)的一個片段，再將PCR擴增產(chǎn)物稀釋作為下一輪PCR反應(yīng)的擴增模板。新一輪PCR反應(yīng)前用對該片段順序有切割位點的一個限制性內(nèi)切酶或二個限制性內(nèi)切酶分解，并以加熱方法預(yù)先被完全滅活的酶作為對照。根據(jù)新擴增產(chǎn)物條帶首次出現(xiàn)的循環(huán)數(shù)，來估測限制性內(nèi)切酶對底物DNA的破壞程度。正反引物的順序見表3。
表3.實施例1引物順序

擴增產(chǎn)物長度為590bp，限制性內(nèi)切酶EcoRV和PvuII對擴增產(chǎn)物片段各有一個切點。先以商品人組織總RNA為原始模板，用Clontech公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒以O(shè)ligo(dT)作反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA。再用該公司的Advantage-2-PCR試劑盒進行擴增。每管反應(yīng)體積25微升，加cDNA2.5微升，引物濃度0.4uM。PCR程序為首次變性95℃1分鐘，循環(huán)變性95℃10秒鐘，退火和延伸68℃1分半鐘，共30循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后用電泳和染色方法檢測擴增產(chǎn)物，然后將擴增產(chǎn)物稀釋100倍，作為下一輪PCR的模板。
第二輪PCR反應(yīng)，每管反應(yīng)體積5微升，每100微升反應(yīng)液加經(jīng)稀釋的擴增產(chǎn)物2微升，并加0.5微克商品Iamda噬菌體DNA代替人基因組DNA作為“背景”DNA。PCR程序與第一輪相同，但PCR反應(yīng)開始前先37℃保溫1小時，首次變性為95℃3分鐘。對照組加預(yù)先熱滅活的EcoRV和PvuII2.5微升/50微升反應(yīng)液，試驗組1加EcoRV2.5微升/50微升反應(yīng)液，試驗組2加EcoRV和PvuII各2.5微升/50微升反應(yīng)液。從PCR第12循環(huán)起每隔3個循環(huán)取一管進行分析，直至第36循環(huán)。試驗結(jié)果示于表4。
表4.實施例1試驗結(jié)果

表4說明用一個限制性內(nèi)切酶破壞模板，擴增產(chǎn)物出現(xiàn)比對照組遲6個循環(huán)；用二個限制內(nèi)切酶同時作用時，擴增產(chǎn)物出現(xiàn)比對照組遲12個循環(huán)，假定每一循環(huán)擴增產(chǎn)物增加達到倍增，則用2個限制性內(nèi)切酶作用時99.9％以上的底物DNA被分解。
實施例2.
實施例2以人beta-2-腎上腺素受體基因(基因庫編號M15169)和人甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因(基因庫編號XM_006959)為例進行類似的分析。引物順序見表5。
表5.實施例2引物順序


腎上腺素受體基因擴增產(chǎn)物長252堿基，同時用二種限制性內(nèi)切酶PstI和HaeII作用；甘油醛磷酸脫氫酶基因擴增產(chǎn)物長388堿基，同時用二種限制性內(nèi)切酶XhaI和HaeII作用。cDNA制備，第一輪和第二輪PCR擴增程序，限制性內(nèi)切酶的加量等均與實施例1相同，但將25微升第一輪擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，切割其條帶溶于500微升水，在37℃洗脫過夜作為第二輪PCR的模板。試驗結(jié)果示于表6。
表6.實施例2試驗結(jié)果


結(jié)果表明用酶處理的試驗組擴增產(chǎn)物條帶的出現(xiàn)都比對照組遲9個循環(huán)。說明99％以上的底物DNA被酶破壞。
實施例3.
實施例3以人肌動球蛋白基因為目標(biāo)基因(基因庫編號BC016045)設(shè)計一對引物，正反引物與目標(biāo)基因順序匹配，但分別引進一個錯配堿基，正引物造成一個EcoRI切割位點，而反引物造成一個HindIII切割位點。實施例3所用引物順序和特性示于表7和8。
表7.實施例3引物順序

引物“A正”和“A反”順序中的斜寫字體堿基為引進的錯配堿基，含下劃線部分分別為引進錯配堿基后形成的EcoRI和HindIII識別順序。引物“A1正”與引物“A正”的3’端相同；引物“A1反”與引物“A反”的3’端相同。
表8.實施例3引物特性

用Oligo(dT)合成cDNA，用引物“A”擴增cDNA的試劑和方法與實施例1相同，退火步驟為68℃1分15秒。用凝膠電泳檢查PCR擴增產(chǎn)物，然后將PCR反應(yīng)液稀釋500倍作為下一輪PCR反應(yīng)的模板。第二輪PCR方法與實施例1相同，退火步驟為68C°1分15秒。對照組加預(yù)先熱滅活的EcoRI和HindIII各2.5微升/50微升反應(yīng)液；試驗組1加EcoRI和HindIII各2.5微升/50微升反應(yīng)液；試驗組2與試驗組1相同但不加Iamda噬菌體DNA；試驗組3與試驗組1相同但PCR退火溫度為48℃。試驗結(jié)果示于表9。
表9實施例3試驗結(jié)果


試驗組1出現(xiàn)擴增產(chǎn)物比對照組遲9個循環(huán)，這是由于在正反引物中各引進了一個錯配堿基后，擴增產(chǎn)物的二個末端各形成了一個限制性內(nèi)切酶識別順序，PCR反應(yīng)前用酶處理使99％以上的滯后污染擴增產(chǎn)物破壞。試驗組2結(jié)果說明如果減少“背景”DNA則滯后污染擴增產(chǎn)物破壞更徹底，出現(xiàn)擴增產(chǎn)物比對照組遲12個循環(huán)。試驗組3結(jié)果說明在低退火溫度下，被限制性內(nèi)切酶分解的模板仍能作為擴增模板，說明限制性內(nèi)切酶作用非常專一，酶只在預(yù)期的擴增產(chǎn)物末端的引物部位對擴增產(chǎn)物切割。引物“A1”與基因組DNA模板的結(jié)合強度，相當(dāng)于引物“A”與被酶分解后的擴增模板之間的結(jié)合強度。試驗表明引物“A1”在48℃退火時能以cDNA為模板擴增目標(biāo)基因，但68℃退火時得不到目標(biāo)擴增產(chǎn)物，從另一角度說明了擴增產(chǎn)物被酶解后不再能作為擴增模板，是因為擴增產(chǎn)物的末端順序被切割。
實施例4實施例4仍以人肌動球蛋白基因為目標(biāo)基因，引物與實施例3引物”A“相同。cDNA的制備、PCR試劑和PCR程序等均與實施例3相同。試驗組1以不同稀釋度的cDNA為擴增模板，每100微升PCR反應(yīng)液加2微升不同稀釋度的cDNA。試驗組2也以不同稀釋度的cDNA為擴增模板，方法與試驗組1相同，但反應(yīng)前用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII處理，方法與實施例3相同。試驗組3以不同稀釋度的提純的擴增產(chǎn)物作為擴增模板，每100微升PCR反應(yīng)液加2微升不同稀釋度的擴增產(chǎn)物，PCR反應(yīng)前用酶處理，方法與試驗組2相同。試驗組4也以不同稀釋度的提純的擴增產(chǎn)物作為擴增模板，方法與試驗組3相同，但EcoRI和HindIII預(yù)先被加熱滅活。試驗組5和6分別與試驗組1和2相同，但以基因組DNA為模板，正反引物跨越2個內(nèi)涵子以基因組DNA為模板時擴增產(chǎn)物長度為727鹼基，基因組DNA的擴增片段內(nèi)也無EcoRI和HindIII的識別順序。試驗組1-4結(jié)果示于表10。
表10.實施例4試驗結(jié)果


試驗組1結(jié)果表明加常規(guī)量的cDNA時，需30循環(huán)反應(yīng)出現(xiàn)擴增產(chǎn)物條帶，cDNA加量降低10倍后需35循環(huán)才出現(xiàn)擴增產(chǎn)物條帶，模板加量繼續(xù)降低后需要更多的循環(huán)才能出現(xiàn)擴增產(chǎn)物條帶，或因靈敏度不夠而得不到擴增產(chǎn)物。試驗組2的結(jié)果和試驗組1相同，說明限制性內(nèi)切酶不切割RNA/DNA嵌合物。試驗組5和6的擴增結(jié)果也相同，說明限制性內(nèi)切酶處理不影響正常的擴增反應(yīng)。試驗組4結(jié)果說明痕跡量滯后污染會造成嚴(yán)重的假陽性，本例將25微升PCR反應(yīng)液用凝膠電泳分離，切割條帶后再用DNA分離試劑盒回收，并恢復(fù)至原來的體積。假定純化步驟的得率為50％，則試驗組4結(jié)果表明，20萬分之一體積的PCR反應(yīng)液的滯后污染就導(dǎo)致假陽性結(jié)果。試驗組3結(jié)果表明用本發(fā)明方法能完全克服痕跡量滯后污染導(dǎo)致的假陽性，也能有效降低較嚴(yán)重滯后污染導(dǎo)致的假陽性。
權(quán)利要求
1.一種能克服滯后污染的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其步驟依次包括(1)用限制性內(nèi)切酶處理PCR反應(yīng)液；(2)DNA模板變性解鏈；(3)引物與模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環(huán)進行合成反應(yīng)；在設(shè)計正引物或者反引物時引進錯配堿基，使擴增產(chǎn)物含有目標(biāo)基因所沒有的限制性內(nèi)切酶識別順序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其特征在于正、反引物同時引進錯配堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其特征在于在引物中引進的錯配堿基數(shù)為1-8個。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其特征在于在引物中引進的錯配堿基數(shù)為1-3個。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其特征在于引進的錯配堿基位于引物3’或5’端起5-25堿基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其特征在于引進的錯配堿基位于引物3’或5’端起10-15堿基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其特征在于引進錯配堿基的引物具有1-6個限制性內(nèi)切酶切點，這些內(nèi)切酶的識別順序堿基數(shù)為4-8個。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其特征在于引進錯配堿基的引物具有2-4個限制性內(nèi)切酶切點，這些內(nèi)切酶的識別順序堿基數(shù)為6個。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其特征在于所說的限制性內(nèi)切酶為產(chǎn)生平末端、3’粘性末端或者5’粘性末端的酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其特征在于引進的錯配堿基在限制性內(nèi)切酶的識別順序中近5’端的位置。
全文摘要
本發(fā)明提供一種克服滯后污染的PCR方法，就是針對滯后污染嚴(yán)重影響PCR在臨床診斷中應(yīng)用，而尚無一種理想的克服方法的現(xiàn)狀，提供一種比現(xiàn)有方法更簡單、有效的克服滯后污染的方法，PCR反應(yīng)過程和擴增產(chǎn)物均切合原來的狀態(tài)。
文檔編號C12P19/34GK1584042SQ03150448
公開日2005年2月23日 申請日期2003年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月19日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 謝文凱, 徐文慧 申請人:徐定邦, 徐文慧