專利名稱：一種單分子dsDNA微陣列芯片制備方法
技術領域：
本發(fā)明提出一種新的在固相支持物(solid sustracts)上制備單分子雙鏈脫氧核糖核酸微陣列(unimolecular dsDNA microarray)的技術方法，所制備的單分子dsDNA微陣列芯片，在基礎分子生物學及生物醫(yī)學領域中具有重要的應用價值。在基礎分子生物學研究中，本發(fā)明制備的單分子dsDNA微陣列芯片可以作為高通量(high throughput)鑒定DNA結合蛋白(DNA-binding proteins)的DNA結合靶點、篩選及檢測DNA結合蛋白、分析DNA結合蛋白與其DNA結合靶點相互作用等的技術平臺；在生物醫(yī)學研究中，本發(fā)明制備的單分子dsDNA微陣列芯片可以作為DNA結合蛋白相關疾病輔助診斷、藥物作用機理研究、藥物有效成分篩選等的技術平臺。
背景技術：
DNA/蛋白質的相互作用在基因組染色體結構維護等細胞結構和功能活動中擔負重要作用，特別是序列特異性DNA/蛋白質相互作用(Sequence-specific DNA/protein interaction)在基因表達調控(gene expression regulation)和DNA重組(recombination)、限制(restriction)及復制(replication)等細胞功能中發(fā)揮極其重要的作用，因此DNA/蛋白質的相互作用是生物化學、分子生物學和生物物理學研究的重要內容，序列特異性DNA結合蛋白也是目前功能基因組(functional genome)和蛋白質組(proteome)研究的重要內容。因此，研究DNA/蛋白質相互作用的方法一直受到重視，并逐漸發(fā)展了多種研究技術，包括硝酸纖維素結合分析(Nitrocellulose-binding Assays)、凝膠遷移實驗(Gel Mobility-shift Analysis)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、Southwestern印記(Southwestern blotting)、報告構體(Reporter Construct)，染色體免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)，噬菌體展示(Phage Display)，結合位點簽名(Binding-site Signatures)，體外選擇(in-vitro selection)，紫外交聯(lián)(UVCrosslinking)，甲基化干擾分析(Methylization Interfering Assay)，X-射線晶體衍射(X-rayCrystallography)，原子力顯微鏡(Atomic Force microscopy，AFM)，表面激元共振(SurfacePlasmon Resonance，SPR)，毛細管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)，掃描力顯微鏡(ScanningForce Microscopy，SFM)，脫氧核糖核酸酶足跡法(DNasel footprinting)，熒光足跡法(Fluorescence Footprinting)，熒光各向異性(Fluorescence Anisotropy)，熒光共振能量傳遞(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)等，這些技術方法能夠非常有效地反應DNA/蛋白質相互作用的某一方面的特征，至今在實驗研究中發(fā)揮重要作用；但這些方法都存在對實驗樣品消耗多、實驗耗時長、分析效率低或存在放射性標記對實驗人員及環(huán)境的危害等缺點，而且難以高通量獲取DNA/蛋白質相互作用的生物信息。因此建立一種高通量的DNA/蛋白質相互作用的研究方法非常必要。
生物芯片技術是近幾年迅速崛起的一項極其重要的生物技術，它以微型化、平行化及自動化等技術特點，成為目前最有效地高通量獲取生物信息的前沿技術。特別是生物分子、細胞或組織構成的微陣列芯片，在檢測生物信號領域得到迅速地應用，尤其以基因芯片應用最數深入廣泛。微陣列芯片高通量獲取生物信息的特點為建立高通量DNA/蛋白質相互作用研究的新方法提供了新的技術思路。但由于分子生物學中發(fā)揮許多重要生物學作用的序列特異性DNA蛋白質相互作用都發(fā)生在基因組雙鏈DNA與蛋白質分子之間，因此用于DNA多態(tài)性、DNA測序和基因表達研究的常規(guī)單鏈DNA微陣列芯片，都不能直接用于序列特異性DNA/蛋白質相互作用的研究。于是如何在固相載體表面制備雙鏈DNA微陣列就成為科學家關注的焦點。在這一背景下，雙鏈DNA(dsDNA)微陣列芯片應運而生，由于dsDNA微陣列芯片表面的分子探針為雙鏈DNA，在分子結構上滿足了細胞自然狀況下DNA/蛋白質相互作用分子結構特征，因此dsDNA微陣列芯片成為目前高通量獲取DNA/蛋白質相互作用生物信息的重要技術平臺。
Lockhart最早(1996)提出在固相基質表面制備由大量不同的單分子(unimolecular)dsDNA構成的核酸陣列(“l(fā)ibrary comprising a plurality of different members of unimolecular，double-stranded oligonucleotides on a solid support”)，使之用于篩選生物樣品中肽、蛋白質等分子與陣列上的dsDNA相互作用的新思想和新方法(US.Pat.5556752)。該方法在固相基質表面原位合成或點樣制備較長的單鏈寡核苷酸(ssDNAs)，這些單鏈寡核苷酸包含兩段反向互補序列，通過鏈內退火形成“莖—環(huán)”(Stem-loop)結構，其中“莖”部dsDNA可用于檢測DNA結合蛋白。Lockhart技術的重要貢獻是最早將DNA微陣列技術引入到高通量檢測DNA/蛋白質相互作用的研究領域，但他提出的dsDNA陣列制備方法在應用中卻存在嚴重的技術和經濟問題，其dsDNA陣列制備技術若借助光導向原位DNA微陣列合成技術，則不僅合成的全長dsDNA數量極少，使大部分合成寡核苷酸為殘缺(truncated molecules)分子，嚴重干擾檢測反應，而且生產成本非常高昂；若借助基因芯片點樣法完成，則生產成本更加高昂。Mirzabekov等(1999，2001)提出運用雜交復性的方法制備dsDNA微陣列，他們首先制備ssDNA微陣列，再用互補單鏈寡核苷酸DNA與芯片雜交復性，使ssDNA微陣列芯片成為dsDNA微陣列芯片；這一方法最根本的缺點是不能用來制備堿基序列非常相似的dsDNA微陣列芯片，如單堿基多態(tài)性的dsDNA微陣列芯片，而且這一方法的實際生產成本也是難以接受的。Bulyk等在1999年提出了用核酸聚合酶引物延伸的辦法將ssDNA微陣列轉變?yōu)閐sDNA微陣列方法，并申報了美國專利(US.Pat.6326489)。這一方法首先在玻片上通過Affymetrix光導向原位合成專利技術制備ssDNA微陣列，使ssDNA微陣列的每條寡核苷酸靠近玻片的3′端含有長16個堿基的通用(constant)引物退火序列，ssDNA微陣列與通用引物退火后，進行聚合酶引物延伸反應，合成第二鏈核酸，從而形成dsDNA微陣列。這一方法的優(yōu)點是能利用DNA微陣列原位合成技術制備高密度dsDNA微陣列；但這一方法同樣存在嚴重的經濟和技術問題，在技術上它依賴于光刻掩膜原位DNA微陣列合成專利技術，但固相基質表面的單鏈寡核苷酸合成的效率不高，每個核苷酸的合成效率在92～96％，這樣合成一個40堿基長的寡核苷酸，則只有4～20％的寡核苷酸達到要求的40堿基長度，因此，以光刻掩膜原位合成技術制備的ssDNA及dsDNA微陣列嚴重地受到殘缺截短分子(truncated molecules)的污染。眾多競爭性殘缺截短分子將可能強烈抑制和誤導蛋白質結合實驗；并且沒有理由相信光刻掩膜原位合成的單鏈寡核苷酸微陣列上的每個寡核苷酸都可以被引物寡核苷酸結合，這樣就會使一部分40堿基全長寡核苷酸不能被轉換雙鏈核酸，這不但進一步降低了芯片上理想雙鏈核酸探針的數量，而且那些未被轉換為雙鏈的單鏈寡核苷酸同樣會干擾蛋白質結合實驗。另外，這一方法制備的dsDNA微陣列是雙分子(bimolecular)dsDNA微陣列，存在探針穩(wěn)定性問題，即雙分子dsDNA受到結合、洗片等實驗環(huán)節(jié)的影響，會發(fā)生雙鏈解鏈而喪失探針功能，使只能使用一次，因此其使用效率低、使用成本高。由于這一方法制備的dsDNA微陣列依賴目前非常昂貴的光刻掩膜原位DNA微陣列合成專利技術，加之這一方法本身的專利保護，使其不僅商業(yè)化應用成本非常昂貴。
dsDNA微陣列芯片是進行高通量DNA/蛋白質相互作用研究的重要技術，這種芯片已經證明能夠非常有效地用于序列特異性DNA/蛋白質相互作用的研究，可高效分析生物分子結合相互作用(binding interaction)。我們在2000年就認識到dsDNA微陣列芯片研究的重要價值，并開始著手研發(fā)能夠性能穩(wěn)定、成本較低的高通量檢測序列特異性DNA/蛋白質相互作用的單分子dsDNA微陣列芯片。在中國博士后科學基金(2001)和國家自然科學基金(60201005)的資助下，建立了兩種高效制備高性能dsDNA微陣列芯片的專利技術(中國專利申請?zhí)?2112780.8；02137945.9)。我們的研究成果已經受到國內外學者的關注，有關論文發(fā)表在國際刊物Nanotechnology、Molecules、Analytical Biochemistry、Journal of Biochemicaland Biophysical Methods以及專著″The frontiers of biochip technologies″of Iternational Forumof Biochip Technology 2002(published by Kluwer Academic Publishers)上；研究成果在2002年參加三次國際學術會議，并在清華大學、北京生物芯片技術國家工程研究中心、科技部、教育部和國家自然科學基金委員會主辦的“2002年國際生物芯片論壇”會議上獲得唯一的Poster獎勵。我們的研究表明運用我們的兩項專利技術，不僅可以高效地制備性能良好的單分子(unimolecular)dsDNA微陣列芯片，而且我們制備的可檢測多種疾病相關轉錄因子NF-κB(Nuclear Factor κB)的“點突變單分子dsDNA微陣列芯片”(中國專利申請?zhí)?3132206.9)，可以靈敏地定量檢測細胞核抽提物中NF-κB蛋白的數量、測定DNA/NF-κB相互作用的序列特異性和親合性、確定DNA/NF-κB相互作用中堿基和氨基酸的鍵合(base-amino acidcontacting)。我們設計的單分子dsDNA微陣列芯片制備方法與國內外基因芯片點樣制備技術完全兼容，而且在應用中與基因表達芯片的反應、檢測設備完全兼容，提高了芯片使用的簡便性。我們的方法尤其適宜制備最具應用價值的“點突變單分子dsDNA微陣列芯片”，這種芯片在研究DNA/蛋白質相互作用中堿基和氨基酸的接觸規(guī)律、預測基因組中蛋白質結合位點和構建基因表達調控網絡非常有效。目前我們已經著手研究“單分子dsDNA微陣列芯片”在篩選組合化學分子和天然藥物分子的應用，這一研究在生物醫(yī)學上具有重要應用價值。
“單分子dsDNA微陣列芯片”的諸多重要應用價值，使我們必須研究如何大幅度降低其生產成本和應用成本、提高其檢測的信息量、特異性和靈敏性，為了實現這一目的，我們對已有技術中造成較高成本的環(huán)節(jié)進行了深入思考，提出了本發(fā)明設計的新方法，旨在大幅度降低其生產成本和應用成本，為商業(yè)化生產奠定基礎。因此，本發(fā)明技術在基礎生物學和生物醫(yī)學的研究中具有重要意義。

發(fā)明內容
(1)發(fā)明目的本發(fā)明在我們已有單分子dsDNA微陣列芯片專利制備技術(中國專利申請?zhí)?2112780.8；02137945.9)的基礎上，提出一種在固相支持物上制備單分子雙鏈脫氧核糖核酸微陣列(unimolecular dsDNA microarray)的新方法，旨在大幅度降低單分子dsDNA微陣列芯片的生產成本和應用成本，為單分子dsDNA微陣列芯片的商業(yè)化生產奠定基礎。
本發(fā)明技術所制備的單分子dsDNA微陣列芯片，為基礎分子生物學及生物醫(yī)學領域中DNA/蛋白質相互作用相關研究提供高通量的技術平臺。在基礎分子生物學研究中，本發(fā)明制備的單分子dsDNA微陣列芯片可以作為高通量(high throughput)鑒定DNA結合蛋白(DNA-binding proteins)的DNA結合靶點、篩選及檢測DNA結合蛋白、分析DNA結合蛋白與其DNA結合靶點相互作用等的技術平臺；在生物醫(yī)學研究中，本發(fā)明制備的單分子dsDNA微陣列芯片可以作為DNA結合蛋白相關疾病輔助診斷、藥物作用機理研究、藥物有效成分篩選等的技術平臺。
(2)技術方案本發(fā)明提出的單分子雙鏈DNA微陣列制備新方法，該方法通過如下技術方案完成單分子雙鏈DNA微陣列的制備①、固相化學合成兩種單鏈寡核苷酸片段，一種為靶寡核苷酸，其5′端為兩段反向堿基互補序列，3′端為通用寡核苷酸互補序列；另一種為通用寡核苷酸，其3′端為羥基，5′端為化學修飾基團；②、在液相反應體系中將該通用寡核苷酸與靶寡核苷酸復性；③、兩寡核苷酸復性產物點樣固定到固相支持物表面，形成寡核苷酸微陣列；④、寡核苷酸微陣列在片核酸聚合酶延伸，形成雙分子dsDNA微陣列；⑤、雙鏈DNA微陣列芯片變性處理，使其成為單鏈DNA(ssDNA)微陣列芯片；⑥、ssDNA微陣列復性，單鏈3′端形成發(fā)卡結構；⑦、復性后ssDNA微陣列在片核酸聚合酶延伸，形成單分子dsDNA微陣列。
該技術方案流程示意見附圖1。
該方案技術流程可做適當調整，作為輔助方案，見附圖2。
本發(fā)明制備的單分子dsDNA微陣列芯片結構示意圖見附圖3。
由于本發(fā)明是依靠目前DNA微陣列制備的最普及的技術，即點樣法制備單分子雙鏈DNA微陣列的技術，制備芯片所使用的寡核苷酸須由商業(yè)化的核酸固相合成技術提供，因此合成制備芯片所使用的寡核苷酸是制備芯片的主要成本所在，為了使制備成本最小化，本發(fā)明設計了如下兩種技術方案擴增商業(yè)化固相化學合成的靶寡核苷酸，低成本生產大量點樣用寡核苷酸，使固相化學合成的靶寡核苷酸持續(xù)利用，極大地芯片制備的成本降低。
方案1包括如下步驟①、固相化學合成靶寡核苷酸和通用寡核苷酸，另合成一寡核苷酸，使其序列與靶寡核苷酸5′端反向堿基互補序列完全互補；②、三種寡核苷酸在PCR反應體系中混合并進行PCR擴增反應；③、PCR擴增反應產物點樣固定到固相支持物表面，形成雙分子dsDNA微陣列；④、雙分子dsDNA微陣列芯片變性處理，使其成為ssDNA微陣列芯片；⑤、ssDNA微陣列復性，單鏈3′端形成發(fā)卡結構；⑥、復性后ssDNA微陣列在片核酸聚合酶延伸，形成單分子dsDNA微陣列。
方案1技術流程見附圖4。
方案2包括如下步驟①、固相化學合成靶寡核苷酸和通用寡核苷酸，在靶寡核苷酸5′端反向堿基互補序列外增加合成其它序列，該序列和反向堿基互補序列間存在特定限制性內切酶識別位點；另合成一寡核苷酸，使其序列與靶寡核苷酸5′端反向堿基互補序列外增設序列完全互補；②、三種寡核苷酸在PCR反應體系中混合并進行PCR擴增反應；③、PCR擴增反應產物點樣固定到固相支持物表面，形成雙分子dsDNA微陣列；④、雙分子dsDNA微陣列進行限制性內切酶徹底酶切；⑤、酶切后雙分子dsDNA微陣列芯片變性處理，使其成為ssDNA微陣列芯片；⑥、ssDNA微陣列復性，單鏈3′端形成發(fā)卡結構；⑦、復性后ssDNA微陣列在片核酸聚合酶延伸，形成單分子dsDNA微陣列。
方案2技術流程見附圖5。
上述方案中，為了實現通用寡核苷酸在固相支持物上的固定而進行的5′末端化學修飾，其修飾基團應與固相支持物表面修飾的化學基團發(fā)生共價化學反應，以便將DNA穩(wěn)定牢固地連接在固相支持物表面，如通用寡核苷酸5′端修飾氨基，固相支持物玻片表面修飾醛基，則可以形成Schiffbase，DNA穩(wěn)定牢固地連接在固相支持物表面。
上述方案中，用于進行DNA聚合反應的核酸聚合酶包括一切可以完成DNA聚合功能的酶，如核糖核酸聚合酶、脫氧核糖核酸聚合酶及反轉錄酶等；用于進行核苷酸聚合反應的核苷酸包括所有核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、稀有核苷酸及化學修飾核苷酸；用于固定單鏈寡核苷酸的固相支持物包括可用于表面化學研究的擁有剛性和半剛性表面的材料。
(3)技術效果為了驗證本發(fā)明技術方案的可靠性，設計合成下列兩條寡核苷酸作為靶寡核苷酸和通用寡核苷酸進行芯片制備實驗
其中靶寡核苷酸序列中的矩形方框內序列為示例DNA結合蛋白NF-κB的結合位點(我們用點突變芯片篩選出的突變型高特異性和親合性結合位點)、箭頭指示序列為反向互補序列、底化線指示序列為限制性內切酶HaeIII酶切位點。
運用該該靶寡核苷酸實驗可以證明技術方案中在片DNA聚合酶能夠成功地延伸發(fā)卡引物，并能將延伸反應進行到緊接玻片的兩個腺嘌呤AA處。實驗中第一次在片DNA聚合酶延伸反應分兩組進行，一組的反應體系含有正常的四種dNTP，另一組反應體系含有正常的dATP、dGTP、dCTP及Cy3-dUTP；結果第一次在片DNA聚合酶延伸反應后，第一組芯片掃描無熒光信號，第二組芯片掃描出現熒光信號，說明第一次在片DNA聚合酶延伸反應在中成功進行。實驗中第二次在片DNA聚合酶延伸反應也分兩組進行，將第一次在片DNA聚合酶延伸反應中含有正常的四種dNTP的芯片，經熱變性再復性后，分為兩組進行實驗，一組的DNA聚合酶延伸反應體系仍含有正常的四種dNTP，另一組反應體系仍含有正常的dATP、dGTP、dCTP及Cy3-dUTP；結果第二次在片DNA聚合酶延伸反應后，第一組芯片掃描無熒光信號，第二組芯片掃描出現熒光信號，說明第二次在片DNA聚合酶延伸反應成功進行，并能將延伸反應進行到緊接玻片的兩個腺嘌呤AA處。因為該靶寡核苷酸中只有5′端的這兩個A才有機會使Cy3-dUTP進入聚合反應，因此第二次在片DNA聚合酶延伸反應結束后，對清洗干凈的芯片進行Cy3通道的熒光掃描時，若DNA聚合酶延伸反應體系中含有正常的dATP、dGTP、dCTP及Cy3-dUTP的一組芯片出現熒光信號，則證明在片DNA聚合酶延伸反應成功地將單鏈寡核苷酸微陣列轉變?yōu)閱畏肿觗sDNA微陣列。
為了進一步考察本發(fā)明技術方案的可靠性和所制備的芯片用于檢測DNA/蛋白質相互作用的可行性，將第二次在片DNA聚合酶延伸反應體系中含有正常的四種dNTP，延伸反應后掃描無熒光信號的芯片進行蛋白結合實驗將NF-κB蛋白p50與芯片反應，結合后用Cy3標記的NF-κB單克隆抗體再與芯片反應，反應后芯片進行Cy3通道的熒光掃描時，出現熒光信號；芯片再用HaeIII酶切過夜酶切，酶切后芯片再進行Cy3通道的熒光掃描時，熒光信號降低甚至除去。證明所制備的芯片能夠與轉錄因子DNA結合蛋白(NF-κB)發(fā)生結合反應，也可以與酶蛋白(HaeIII)發(fā)生酶切反應。
上述實驗的技術方案流程示意及實驗結果見附圖6。
本發(fā)明提出的單分子dsDNA陣列芯片制備方法，在核酸材料的最初制備上使用技術是核酸固相化學合成技術，在芯片制備中使用陣列芯片微點樣制備技術，這兩相相關技術都已經成為商業(yè)化的一般生物技術，因此本項目提出的單分子dsDNA微陣列芯片制備方法非常有利于商業(yè)化應用。本項目提出的單分子dsDNA陣列芯片制備方法是發(fā)明人對自己原有單分子雙鏈核酸微陣列芯片制備方法的重要技術創(chuàng)新。本發(fā)明技術方案的優(yōu)點體現在以下幾個方面。
一是本發(fā)明技術方案極大地降低了單分子dsDNA陣列芯片的制備成本，體現在以下幾個方面①使用通用寡核苷酸解決寡核苷酸在固相基質上的固定問題，避免在每條不同的探針寡核苷酸上修飾氨基等化學基團；②運用PCR擴增商業(yè)化提供的原始寡核苷酸，生產大量點樣用寡核苷酸，避免再次合成，做到持續(xù)利用合成材料；③芯片制備中只需要一個在片核酸聚合反應，核酸聚合酶不僅價格低廉，而且反應效率高，無需其他分子生物學試劑消耗；④其他材料(如雜交液、洗片液等)價格非常廉價且消耗極少。
二是本發(fā)明技術方案極大地簡化了生產工藝、維護單分子dsDNA陣列芯片可以反復利用(見附圖7)的優(yōu)良特性，進一步顯著降低了芯片使用成本。本發(fā)明的技術方案完全可以進行自動化進行，為商業(yè)化大批量生產單分子dsDNA陣列芯片鋪平了道路。
四

圖1單分子dsDNA微陣列芯片制備技術方案流程示意圖；圖2單分子dsDNA微陣列芯片制備技術方案輔助流程示意圖；圖3制備的單分子dsDNA微陣列芯片結構示意圖；圖4PCR生產點樣核酸制備單分子dsDNA微陣列芯片技術方案1示意圖；圖5PCR生產點樣核酸制備單分子dsDNA微陣列芯片技術方案2示意圖；圖6單分子dsDNA微陣列芯片制備技術效果示意圖；圖7單分子dsDNA微陣列芯片回收利用示意圖；圖8Cy3-dUTP滲入單分子dsDNA微陣列芯片制備效果圖；圖9Cy3-NF-κB與單分子dsDNA微陣列芯片雜交效果圖。
附圖注解A復性(Annealing)；AB抗體結合(Antibody Binding)；De變性(Denaturing)；Di消化(Digesting)；E延伸(Elongating)；E1以Cy3-dUTP延伸(Elongating with dATP，dGTP，dCTP and Cy3-dUTP)；E2以正常dNTP延伸(Elongating with dATP，dGTP，dCTP and dTTP)；I固定(Immobilizing)；NH2通用寡核苷酸示例修飾基團——氨基(Amino group，NH2)；P1、P2引物(Primer)；PB蛋白質結合(Protein Binding)；R循環(huán)(Recycling)；S掃描(Scanning)；SS固相基質(Solid Substrct)；St剝離(Striping)；TO靶寡核苷酸(Targrt Oligonucleotides)；UO通用寡核苷酸(Universal Oligonucleotide)。
五具體實施例方式
此處僅用表面以氨基硅烷處理的玻片為固相支持物，在芯片上制備含有同一檢測NF-κB蛋白的DNA探針的單分子dsDNA微陣列芯片為例，說明本發(fā)明單分子dsDNA微陣列芯片制備及應用的具體實施方式
。
1.玻片的準備及硅烷化及醛基修飾若使用商業(yè)化提供的基因芯片專用玻片如Telechem公司的SuperAldehyde Slides等，則此步不需要再執(zhí)行；若從普通制備組織切片的玻片開始，則不許對玻片進行處理。首先對玻片進行常規(guī)清洗，再用硅烷化試劑如Sigma公司的aminopropyltriethoxysilane(三乙氧基氨基硅烷)進行硅烷化處理5-10分鐘(含2％aminopropyltriethoxysilane的95％丙酮，acetone)。硅烷化處理后用去離子水洗滌兩次，在75℃烘烤45分鐘。將硅烷化處理好的玻片浸泡在含5％戊二醛(glutaraldehyde)的磷酸緩沖液(0.01M PB，pH7.0)中30分鐘，之后用去離子水洗滌兩次，氮氣吹干，保存在4℃，半月內使用。
2.寡核苷酸的設計及化學合成設計并用固相化學合成技術合成下面序列的靶寡核苷酸及通用寡核苷酸，合成產物需純化處理靶寡核苷酸3′TTGGAGGAGAGGGGTTTGGGACTTTCCGAATTCT -5′；通用寡核苷酸5′NH2-AACCTCCTCTCCCC-OH 3′。
3.寡核苷酸復性并準備點樣樣品兩寡核苷酸以80μM溶解在TE緩沖液中，混合并在95℃變性5分鐘，之后緩慢降溫到室溫，保持1小時使兩寡核苷酸復性；復性產物中加入等體積碳酸緩沖液(0.1M carbonatebuffer，pH9.0)；4.DNA點樣樣品在玻片表面固定及芯片制備①.DNA點樣樣品用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)點樣(濕度80％)到醛基修飾玻片表面，點樣后置于濕盒內0.1M碳酸緩沖液(pH9.0)浸濕的濾紙上，密封濕盒，在37℃溫育30分鐘，再用2×SSC/1％SDS溶液洗滌2分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，N2吹干；②.將DNA聚合酶反應液[Polymerase Reaction50mM Tris-HCl(pH 7.2)，10mMMgSO4，0.1mM DTT，40μM of each dNTP，20μg/ml acetylated BSA，2U/μl DNA polymerase Ilarge(Klenow)fragment(3′to 5′exo-；Promega，Madison，WI)]加到步驟①制備的寡核苷酸微陣列上，用憎水硅烷[Plusone Repel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％w/v inoctamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置于密封濕盒內37℃延伸反應30分鐘；反應后玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗滌2分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，N2吹干；③.將步驟②處理寡核苷酸微陣列芯片在95℃水煮變性5分鐘；反應后玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗滌5分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，N2吹干；④.將步驟③處理的寡核苷酸微陣列芯片用雜交液覆蓋，在45℃復性30分鐘；復性后用滅菌雙蒸水簡單淋洗，N2吹干；⑤.將DNA聚合酶反應液[Polymerase Reaction50mM Tris-HCl(pH 7.2)，10mMMgSO4，0.1mM DTT，40μM of each dNTP，20μg/ml acetylated BSA，2U/μl DNA polymerase Ilarge(Klenow)fragment(3′to 5′exo-；Promega，Madison，WI)]加到步驟④處理的寡核苷酸微陣列芯片上，用憎水硅烷[Plusone Repel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％w/v inoctamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置于密封濕盒內37℃延伸反應30分鐘；反應后玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗滌2分鐘，用滅菌雙蒸水簡單淋洗，N2吹干；為了反映制備效果，在此步DNA聚合酶反應中，一組芯片用四種正常dNTPs處理，另一組用dATP、dGTP、dCTP、Cy3-dUTP處理。
⑥.將步驟⑤處理的寡核苷酸微陣列芯片用微陣列芯片掃描儀(如ScanArray Lite，Packard Biochip Technologies)掃描(適當參數channel、laserpower，PMT gain，resolution.)，記錄熒光信號；結果在步驟⑤中以dATP、dGTP、dCTP、Cy3-dUTP處理的芯片出現熒光信號，如附圖8；而以四種正常dNTPs處理的芯片無熒光信號。
5.單分子dsDNA微陣列芯片檢測NF-κB蛋白①.轉錄因子NF-κB p50蛋白用人p50全長cDNA(編碼453氨基酸)表達載體在細菌中表達提取(Promega，Madison，WI)；②.將上面芯片制備中用四種正常dNTPs處理的單分子dsDNA微陣列芯片用5％BSA/PBS溶液封閉室溫封閉10分鐘；③.適量NF-κB蛋白溶解于DNA結合緩沖液中(DNA-binding buffer10mM HEPESpH7.9，50mM KCl，2.5mM DTT，0.1mM EDTA，0.05％NP-40，10％Glycerol，5％BSA)，室溫保育30分鐘；取10μL DNA結合緩沖液滴加到NF-κB檢測DNA微陣列上，用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％w/v in octamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，置密封濕盒內37℃或室溫保育30分鐘；④.反應后玻片在室溫下分別用PBS/0.05％Tween 20，PBS/0.01％Triton 100及PBS(141mM NaCl，7.2mM Na2HPO4，2.8mM NaH2PO4，pH7.4)各洗滌10分鐘；⑤.N2吹干玻片，取10μL含有適量熒光素Cy3(FluoroLinkTMCy3 monofunctional dye，Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)標記的NF-κB蛋白抗體[NF-κB p50(E-10)sc-8414，Santa Cruz Biotechnology，Inc.]的PBS(141mM NaCl，7.2mM Na2HPO4，2.8mMNaH2PO4，pH7.4)溶液，滴加到NF-κB檢測DNA微陣列上，用憎水硅烷[Plusone Repel-SilaneES(Dimethyldichlorosilance solution 2％w/v in octamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，置密封濕盒內37℃或室溫保育30分鐘；⑥.抗體反應后，玻片用PBS(141mM NaCl，7.2mM Na2HPO4，2.8mM NaH2PO4，pH7.4)溶液室溫洗滌10分鐘，再用用滅菌雙蒸水簡單淋洗，N2吹干。
⑦.芯片在微陣列芯片掃描儀(如ScanArray Lite，Packard Biochip Technologies)上掃描(適當參數channel、laserpower，PMT gain，resolution.)，記錄熒光信號；結果見附圖9。
權利要求
1.一種制備單分子雙鏈脫氧核糖核酸(dsDNA)微陣列芯片的新方法，包括步驟(1)、固相化學合成兩種單鏈寡核苷酸片段，一種為靶寡核苷酸，其5′端為兩段反向堿基互補序列，3′端為通用寡核苷酸互補序列；另一種為通用寡核苷酸，其3′端為羥基，5′端為化學修飾基團；(2)、在液相反應體系中將該通用寡核苷酸與靶寡核苷酸復性；(3)、兩寡核苷酸復性產物點樣固定到固相支持物表面，形成寡核苷酸微陣列；(4)、寡核苷酸微陣列在片核酸聚合酶延伸，形成雙分子dsDNA微陣列；(5)、雙分子dsDNA微陣列變性，形成單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)微陣列；(6)、ssDNA微陣列復性，單鏈3′端形成發(fā)卡結構；(7)、復性后ssDNA微陣列在片核酸聚合酶延伸，形成單分子dsDNA微陣列。
2.根據權利要求1所述的單分子dsDNA微陣列制備方法，其特征在于步驟(1)中合成的靶寡核苷酸和通用核苷酸具有下述結構特征，包括；(1)、靶寡核苷酸的5′端兩反向堿基互補序列間無其他核苷酸或連接分子間隔；(2)、靶寡核苷酸的5′端反向互補序列和3′端通用寡核苷酸互補序列間可含有特定使用目的的核苷酸序列，如DNA結合蛋白的識別位點；(3)、通用寡核苷酸的5′端序列必須與靶寡核苷酸片段3′端序列完全互補，且互補序列的長度和堿基構成足夠使兩種寡核苷酸形成穩(wěn)定的雜合體；(4)、通用寡核苷酸序列和靶寡核苷酸序列中可存在特定目的的堿基序列，如DNA限制性內切酶識別位點；(5)、通用寡核苷酸的5′端化學修飾基團必須與固相支持物表面修飾的化學基團發(fā)生化學反應，形成共價連接；
3.根據權利要求1所述的單分子dsDNA微陣列制備方法，其特征在于步驟(1)中合成的靶寡核苷酸，可以依靠與其5′端反向堿基互補序列配對的寡核苷酸和通用寡核苷酸為引物，通過核酸聚合酶擴增反應，合成大量雙鏈寡核苷酸，用于制備單分子dsDNA微陣列；
4.根據權利要求3所述的靶寡核苷酸核酸聚合酶擴增反應，其特征在于用擴增產物點樣制備單分子dsDNA微陣列時，擴增產物點樣制備的雙分子dsDNA微陣列，可接權利要求1步驟(5)進行單分子dsDNA微陣列制備；
5.根據權利要求1所述的單分子dsDNA微陣列制備方法，其特征在于步驟(1)中合成的靶寡核苷酸，可以在其5′端反向堿基互補序列外增加合成其它序列，該序列和反向堿基互補序列間存在特定限制性內切酶識別位點；
6.根據權利要求5所述的靶寡核苷酸，其特征在于該種靶寡核苷酸可以依靠與其5′增加序列配對的寡核苷酸和通用寡核苷酸為引物，通過核酸聚合酶擴增反應，合成大量雙鏈寡核苷酸，用于制備單分子dsDNA微陣列；
7.根據權利要求6所述的靶寡核苷酸核酸聚合酶擴增反應，其特征在于用擴增產物點樣制備單分子dsDNA微陣列時，擴增產物點樣制備的雙分子dsDNA微陣列，先用限制性內切酶進行徹底消化后，再接權利要求1步驟(5)進行單分子dsDNA微陣列制備；
8.根據權利要求1所述的單分子dsDNA微陣列制備方法，其特征在于步驟(3)中固相支持物的表面必須化學修飾特定的化學基團，該化學基團可與通用寡核苷酸的5′端修飾的化學基團發(fā)生化學反應，形成共價連接；
9.根據權利要求1所述的單分子dsDNA微陣列制備方法，其特征在于步驟(3)中固相支持物為剛性或半剛性材料，包括LB膜、(聚)四氟乙烯膜、(聚)偏二氟乙烯膜、聚苯乙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚碳酸酯、凝膠、玻片、硅片等；
10.根據權利要求1所述的單分子dsDNA微陣列制備方法，其特征在于步驟(4)和(7)中核酸聚合酶包括脫氧核糖核酸聚合酶及反轉錄酶等；
11.根據權利要求1所述的單分子dsDNA微陣列制備方法，其特征在于步驟(4)和(7)中參與核酸聚合反應的核苷酸包括所有四種脫氧核糖核苷酸及其他化學修飾的核苷酸；
全文摘要
本發(fā)明提出一種新的在固相支持物表面制備單分子(unimolecular)雙鏈脫氧核糖核酸(double－stranded DNA，dsDNA)微陣列(microarray)的方法。該方法首先用固相化學合成兩條寡核苷酸，一條為靶寡核苷酸(target oligonucleotide)，另一條為通用寡核苷酸(universaloligonucleotide)；其中靶寡核苷酸從5′端到3′端含有如下構件反向互補序列、蛋白質結合位點和通用寡核苷酸互補序列；通用寡核苷酸的5′端修飾特定化學基團，以便將DNA連接固定到固相支持物表面，3′端為羥基。芯片制備時，首先將靶寡核苷酸和通用寡核苷酸復性，將復性產物點印連接到固相支持物表面，制成寡核凸酸微陣列；對寡核苷酸微陣列進行在片(on－chip)DNA聚合酶延伸反應，使寡核苷酸微陣列成為雙分子(bimolecular)dsDNA微陣列；將微陣列變性處理，使其成為單鏈DNA(single－stranded DNA，ssDNA)微陣列；將ssDNA微陣列進行DNA復性處理，使單鏈DNA自由3′端形成發(fā)卡(hairpin)結構；最后對復性的ssDNA微陣列再進行在片DNA聚合酶延伸反應，使ssDNA微陣列成為單分子(unimolecular)dsDNA微陣列。本發(fā)明制備的單分子dsDNA微陣列芯片，在基礎分子生物學研究，特別是基因表達調控研究及生物醫(yī)學研究，如DNA結合蛋白相關疾病診斷、藥物作用機理和藥物性分子篩選研究中有廣泛的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK1590559SQ0315288
公開日2005年3月9日 申請日期2003年9月1日 優(yōu)先權日2003年9月1日
發(fā)明者王進科, 李同祥, 陸祖宏 申請人:王進科, 李同祥, 陸祖宏