專(zhuān)利名稱(chēng)：一種粗酶制劑及其生物轉(zhuǎn)化制備香草醛的方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種新的由植物提取的含脂氧合酶(Lipoxygenase)的粗酶制劑，及用其轉(zhuǎn)化丁香酚或異丁香酚制備香草醛的方法。
背景技術(shù)：
香草醛(Vanillin)，又名香蘭素，4-羥基-3-甲氧基苯甲醛(3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde)。分子式C8H8O3，分子量152.15。
香草醛是食品、飲料等工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的香料之一，還可作為保鮮劑及醫(yī)藥等工業(yè)的原料，需求量很大。香草醛目前主要由化學(xué)方法制備，但用化學(xué)合成法制得的香草醛不是天然香料。天然香草醛可以從香子蘭的花莢中提取，但用植物組織提取的方法生產(chǎn)的天然香草醛量少而價(jià)高，不能滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的需求，從而促使研究人員去尋找生產(chǎn)天然香草醛的替代方法。
隨著世界各國(guó)對(duì)食品安全越來(lái)越重視，對(duì)天然香草醛的需求越來(lái)越大。天然香料是指由動(dòng)植物材料經(jīng)物理(包括蒸餾、溶劑萃取)方法、酶法或微生物方法得到的，可通過(guò)傳統(tǒng)的食品加工方法(包括干燥、焙烤、發(fā)酵)加工后用于人類(lèi)消費(fèi)的物質(zhì)。根據(jù)歐洲和美國(guó)立法，利用動(dòng)植物資源通過(guò)物理方法、酶法或微生物法得到的物質(zhì)才能稱(chēng)為天然物質(zhì)(Muheim Andrea.US6,235,507.2001)。用生物法生產(chǎn)的香草醛，屬天然產(chǎn)品，可以生物降解，符合消費(fèi)者追求天然產(chǎn)品的消費(fèi)心理。因此，利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)生物香蘭素，是一種有效的、很有前途的替代方法。
用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)生物香草醛的研究已經(jīng)有十余年的歷史，研究中采用了多種生物材料，包括真菌(Laurence Lesage Meessen et al.US 05866380.1999；US 06162637.2000)、細(xì)菌(Rabenhorst Jurgen and Hopp Rudolf.US6133003.2000)、放線(xiàn)菌(Audrs & More.WO 9634971.1996；Rabenhorst & Hopp.EP0761817.1997；Muller.EP 0885968.1998)基因工程菌(Overhage J，et al.Journal of Biotechnology.2000)、植物細(xì)胞(Podstolski A and Havkin-FrenkelD.WO 9903975.1999)及提取得到的酶(Frost JW.WO 0017319.2000)，研究了各種微生物，植物細(xì)胞內(nèi)合成和降解香草醛的代謝途徑，研究者在細(xì)胞、酶學(xué)、基因水平上進(jìn)行了廣泛的研究，并取得了很多研究成果。隨著研究的深入，不少研究者開(kāi)始致力于實(shí)現(xiàn)生物香草醛的工業(yè)化生產(chǎn)，并且已有成功的例子，如法國(guó)Laurence Lesage-meessen(Lesage-Meessen，L.，et al.J.Biotechnol，1996)研究的利用阿魏酸作為底物的二步法，先用黑曲霉(Aspergillus niger)將阿魏酸轉(zhuǎn)化為香草酸，再用朱紅密孔菌(Pycnporus cinnabarnus)或黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)將香草酸還原成香草醛，在發(fā)酵培養(yǎng)中添加大豆磷脂、鹽酸硫胺素(VB1)等促生長(zhǎng)劑，6-7d，香草醛的濃度達(dá)到1，575mg/L。本發(fā)明者的研究小組也在這方面取得了成功(孫志浩.CN 1421523A.2002)。在研究起始原料制備天然香草醛的新方法的過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)，由于阿魏酸的價(jià)格較高，因此用這種方法生產(chǎn)的香草醛價(jià)格也比較高，而丁香酚、異丁香酚可在工業(yè)規(guī)模上從丁香油中提取，價(jià)格低廉，容易得到。我們也注意到，近10年前也已有一些用脂氧合酶轉(zhuǎn)化丁香酚或異丁香酚進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的研究(Markus PaulHenry.EP 0542348A2.1993；Mane J and Zucca J.WO 9402621.1994)。
在過(guò)去的十年里報(bào)道了許多用微生物法或酶法生產(chǎn)香草醛的方法，一般都是通過(guò)微生物或酶將合適的前體轉(zhuǎn)化為香草醛?？衫玫那绑w有阿魏酸、丁香酚、異丁香酚、姜黃素等，轉(zhuǎn)化率通常很低。特別是在微生物代謝系統(tǒng)中，不易得到高產(chǎn)量的香草醛，主要原因是由于香草醛具有細(xì)胞毒性，其濃度超過(guò)1g/L就會(huì)阻止微生物生長(zhǎng)，另外，由于在微生物系統(tǒng)中存在多種代謝途徑，通常發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化液中只有香草醇和香草酸而沒(méi)有香草醛積累。利用酶可以避免香草醛的毒性(Markus.EP0,542,348A2)。
1993年，Markus(EP 0542348A2)報(bào)道了用Sigma試劑脂氧合酶(Sigma-L8383)，以異丁香酚和丁香酚為底物酶法制備香草醛的過(guò)程，50ml規(guī)模，4h，香草醛濃度達(dá)22.8g/L；在3L規(guī)模的放大試驗(yàn)中，120h，香草醛濃度7.3g/L；并試驗(yàn)了土豆，大豆粉提取液來(lái)代替昂貴的脂氧化酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化，香草醛產(chǎn)量?jī)H0.0189g/L，幾乎得不到目的產(chǎn)物。1994年，Mane和Zucca(WO 9402621)報(bào)道Sigma試劑脂氧合酶在20ml規(guī)模上添加活性炭，3d，轉(zhuǎn)化異丁香酚得到香草醛的最高濃度達(dá)28.5g/L。1999年，Mane和Zucca(WO 9622381)又報(bào)道了他們的進(jìn)一步研究結(jié)果添加原卟啉IX、FeCl2或血紅素，3d，20ml規(guī)模，香草醛最高濃度為5.29g/L?？赡苁怯捎谠噭┟柑F，無(wú)實(shí)用價(jià)值，因此一般認(rèn)為利用脂氧合酶從經(jīng)濟(jì)角度分析是不合算的(Muheim Andrea.US6,235,507.2001)。近十年來(lái)并未見(jiàn)到深入研究與進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的報(bào)道。
脂氧合酶(Lipoxygenase，簡(jiǎn)稱(chēng)Lox)是一種二加氧合酶(Dioxygenase)。分子量范圍一般在90,000-100,000之間。Lox在自然界中廣泛存在，植物、動(dòng)物、藻類(lèi)、面包酵母、真菌以及氰細(xì)菌中均發(fā)現(xiàn)。
技術(shù)方案本發(fā)明的目的是提供一種能有效轉(zhuǎn)化異丁香酚和丁香酚為香草醛的新的粗酶制劑，并提供一種新的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)生成香草醛的方法。
本發(fā)明的粗酶制劑，含有大豆脂氧合酶，其特征在于用作丁香酚、異丁香酚轉(zhuǎn)化為香草醛的生物催化劑。所述粗酶制劑的制備方法，包括以下步驟(1)以大豆、馬鈴薯為原料，脫脂制成脫脂大豆粉；(2)低溫水萃取液用不同飽合度的硫酸銨分級(jí)沉淀；(3)用硼酸緩沖液溶解的方法，制得粗酶液。
本發(fā)明從脫脂大豆粉中提取含大豆脂氧合酶(Soybean Lipoxygenase，EC1.13.11.12)的粗酶制劑。粗酶制劑的制備方法是稱(chēng)一定量脫脂大豆粉，加10倍體積的水，冰浴中攪拌1hr，于10000r/min離心30min，加硫酸銨至40％飽合度靜置過(guò)夜，于4℃，6,000r/min離心20min；在上清液中加硫酸銨至60％飽合度，靜置過(guò)夜，于4℃，6,000r/min離心20min，將沉淀用0.1M，pH9.0的硼酸緩沖液溶解，所得粗酶液即粗酶制劑，可直接用作丁香酚、異丁香酚轉(zhuǎn)化為香草醛的生物催化劑?；蛘邔⑻崛〉拇置敢哼M(jìn)行真空冷凍干燥，制備凍干酶粉作為生物催化劑，可以長(zhǎng)期保存。
或者，以上述方法制得的粗酶液，用海藻酸鈉、卡拉膠、明膠、幾丁質(zhì)等載體包埋等方法，或者用樹(shù)脂共價(jià)結(jié)合或吸附、戊二醛交聯(lián)等方法固定化，制得固定化粗酶。以此作為酶源進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，固定化粗酶可反復(fù)回用，進(jìn)行多次生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
脂氧合酶酶活力的測(cè)定方法，可以采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法(鐘芳等，無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2001)，用亞油酸作為反應(yīng)底物進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明采用測(cè)定生物催化異丁香酚能力的方法，即用2％異丁香酚水溶液作為底物，在250ml三角瓶中裝20ml，于28℃，180r/min的搖瓶培養(yǎng)機(jī)上進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化結(jié)束后用比色法、薄層色譜法或高效液相色譜法測(cè)定轉(zhuǎn)化液中的香草醛和異丁香酚含量，計(jì)算轉(zhuǎn)化起始1h的產(chǎn)物香草醛生成量。用g/h表示粗酶的轉(zhuǎn)化能力。
香草醛和異丁香酚測(cè)定方法，參考文獻(xiàn)報(bào)道方法(何新亞等，分析實(shí)驗(yàn)室，1999)用硫代巴比妥酸比色法(TBA法)測(cè)香草醛。薄層色譜法(TLC法)可同時(shí)測(cè)定香草醛和異丁香酚，展開(kāi)劑正己烷-氯仿-無(wú)水乙醚-冰醋酸4∶3∶2∶0.1(v/v/v)，顯色劑碘蒸汽結(jié)合2，4-二硝基苯肼，即先用碘蒸氣使香草醛和異丁香醛同時(shí)顯色，再用2，4-二硝基苯肼使香草醛特異性地顯色以排除其它雜質(zhì)的干擾，掃描條件228nm單波長(zhǎng)反射矩齒掃描，狹縫0.4×0.4mm，SX＝3，靈敏度中等。高效液相色譜法(HPLC)也可同時(shí)測(cè)定香草醛和異丁香酚，固定相Lichrospher 100 RP-18，5um，250×4mm，流動(dòng)相用甲醇和0.01％的冰醋酸水溶液，梯度洗脫甲醇/0.01％冰醋酸水溶液65/35，非梯度洗脫流速1ml/min紫外270nm檢測(cè)。轉(zhuǎn)化液用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯蒸干，再用甲醇溶解，即可用HPLC測(cè)定。用TBA法或TLC法進(jìn)行定性或粗定量，對(duì)于要求結(jié)果準(zhǔn)確的樣品用HPLC法進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明的生產(chǎn)香草醛的生物轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟(1)將本發(fā)明的粗酶制劑作為生物催化劑；(2)將丁香酚、異丁香酚配制成溶液作為生物轉(zhuǎn)化底物；(3)將(1)的粗酶制劑，加入(2)的底物溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，生成香草醛；(4)回收未轉(zhuǎn)化底物異丁香酚，用于再次轉(zhuǎn)化；(5)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物香草醛的提純與精制。
底物濃度為10～100mg/mL，粗酶制劑用量為4.0×104～6.0×106U/ml，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為20～50℃，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間為48～96h。
在步驟(3)中可以用加入氧載體吐溫等表面活性劑、H2O2等改善供氧的方法，添加活性碳、白土、樹(shù)脂等吸附劑的方法，添加正己烷、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿等有機(jī)溶劑或助溶劑改善底物溶解度的方法，或者水-有機(jī)溶劑雙相體系等，改進(jìn)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)效果。
提純與精制是用乙酸乙酯、正己烷、氯仿等有機(jī)溶劑，用酸、堿或緩沖液調(diào)節(jié)控制反應(yīng)液在不同的pH條件，對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)液進(jìn)行分別萃取。使未轉(zhuǎn)化底物丁香酚、異丁香酚與產(chǎn)物香草醛分離。
以下是本發(fā)明方法的詳細(xì)描述底物丁香酚、異丁香酚溶液的制備用0.01～0.1mol，pH6.0～9.0的硼酸緩沖溶液，按所需要的濃度，在轉(zhuǎn)化容器中，直接加底物配制成10～100g/L的溶液(懸浮液)。
生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)用上述方法制得的粗酶液、凍干酶粉、或固定化粗酶等粗酶制劑作為酶源(催化劑)，以丁香酚或異丁香酚溶液為底物，底物濃度為10～100mg/mL，加粗酶制劑量為4.0×104～6.0×106U/ml(用亞油酸測(cè)定酶活)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為20～50℃，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間為48～96h。在此條件下所得的轉(zhuǎn)化液用硫代巴比妥酸比色法(TBA法)測(cè)香草醛，或高壓液相色譜分析(HPLC)及薄層層析法(TLC)測(cè)定控制轉(zhuǎn)化率與產(chǎn)率。
固定化酶反復(fù)分批轉(zhuǎn)化法是一批轉(zhuǎn)化結(jié)束后，用常規(guī)方法過(guò)濾，回收固定化酶，作為下一次轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶源，加入新配制的底物溶液中繼續(xù)轉(zhuǎn)化。固定化酶分批轉(zhuǎn)化可以連續(xù)反復(fù)進(jìn)行多次。
可以用改善供氧的方法，添加吸附劑的方法，添加溶劑或助溶劑改善底物溶解度的方法等，改進(jìn)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)效果。改善供氧的方法有增大攪拌速率、提高通氣速率、使用純氧通氣、提高反應(yīng)罐壓等，也可用加入氧載體的方法，加入常用的氧載體正十二烷，流加H2O2等。加入H2O2的濃度為0.1～10mmol。H2O2可以在過(guò)氧化氫酶的催化下分解放出氧氣，在反應(yīng)不是非常劇烈的情況下，氧氣將直接以分子形式進(jìn)行傳遞，不會(huì)形成氣-液傳質(zhì)阻力，提高了氧氣的傳質(zhì)速率；加入H2O2還具有對(duì)毒性低、成本低、操作簡(jiǎn)單及不會(huì)為產(chǎn)物分離帶來(lái)因難等優(yōu)點(diǎn)。添加0.1％～10.0％濃度的常規(guī)吸附劑如活性碳、白土、樹(shù)脂(包括大孔樹(shù)脂、離子交換樹(shù)脂等)，可以增強(qiáng)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)效果。在非水介質(zhì)如正己烷、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿等有機(jī)溶劑中，或者水-有機(jī)溶劑雙相體系中，也可以改進(jìn)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)效果。
未轉(zhuǎn)化底物異丁香酚、丁香酚的分離、回收利用上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)所得轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化液中含有香草醛，但仍含有一定量的未轉(zhuǎn)化底物異丁香酚、丁香酚。未轉(zhuǎn)化底物異丁香酚、丁香酚可以用有機(jī)溶劑在不同條件下進(jìn)行選擇性萃取，使之與產(chǎn)物香草醛分離。用于進(jìn)行選擇性萃取的有機(jī)溶劑有乙酸乙酯、正己烷、氯仿等。進(jìn)行選擇性萃取的不同條件可以用酸、堿或緩沖液調(diào)節(jié)控制反應(yīng)液在不同的pH條件，對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)液進(jìn)行分別萃取。例如用0.1～1mol的NaoH將轉(zhuǎn)化清液的pH調(diào)至7.0～10.0，用體積比為1∶9～9∶1的正己烷萃取1～5次，可萃取得到異丁香酚或丁香酚，回收率可達(dá)到100％。回收得到的異丁香酚或丁香酚可以繼續(xù)作為底物用于下一批轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
香草醛的提取回收異丁香酚或丁香酚后的萃取剩余水相，用體積比為1∶9～9∶1的有機(jī)溶劑，如乙酸乙酯、正己烷、氯仿等，萃取1～5次，萃取液加入1％～5％(w/v)活性炭，加熱脫色，濾紙過(guò)濾，收集濾液，用飽和氯化鈉溶液，加無(wú)水硫酸鈉等方法進(jìn)行脫水，所得到的脫色脫水有機(jī)相再次真空蒸發(fā)，回收溶劑。將真空濃縮至接近油狀的濃縮漿液干燥，即得白色粉狀結(jié)晶香草醛(粗品)。將香草醛粗品加約1～10倍量純水10～100℃溶解，調(diào)pH7.0后冷卻至室溫，將先析出的棕色油狀物除去，再冷卻至0～5℃結(jié)晶，抽濾，30～60℃干燥，得到精制香草醛成品。
有益效果本發(fā)明生物轉(zhuǎn)化法相對(duì)于傳統(tǒng)的化學(xué)合成法或從香蘭屬植物中提取的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)①產(chǎn)品香草醛的有害物質(zhì)含量極低，安全無(wú)毒副作用；②可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，不受季節(jié)影響；③生產(chǎn)操作簡(jiǎn)便，產(chǎn)品收得率高；④與香子蘭莢提取法相比費(fèi)用大大降低，甚至比微生物轉(zhuǎn)化阿魏酸方法成本也有很大降低；⑤作為生物催化劑的粗酶制劑制備容易，生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是發(fā)明了一種從大豆中提取含大豆脂氧合酶粗酶制劑的制備方法，該粗酶制劑轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛的酶活力高，轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物純度高，沒(méi)有香草酸、甲氧基氫醌、香草醇等代謝副產(chǎn)物，未轉(zhuǎn)化的異丁香酚容易回收，可用于再次轉(zhuǎn)化，對(duì)底物總摩爾轉(zhuǎn)化率70％以上，提取得率為75～80％；產(chǎn)品純度95％以上。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化工藝可以直接用大豆粗提取酶液添加異丁香酚進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可以用制備的凍干粉或其固定化粗酶加異丁香酚底物溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，固定化酶可反復(fù)利用多次。


圖1為本發(fā)明的工藝流程圖以下是用大豆提取粗酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化異丁香酚制備香草醛的實(shí)施例，用于說(shuō)明本發(fā)明的方法，但本發(fā)明并不限于所列出的幾個(gè)實(shí)例。
實(shí)施例實(shí)施例1脫脂大豆粉制備用中國(guó)東北大豆磨粉，40目，10倍體積石油醚脫脂、干燥后于冰箱中儲(chǔ)藏備用。
大豆粗酶制劑的制備稱(chēng)100g脫脂大豆粉，加10倍體積的水，用0.1molNaOH調(diào)pH9.0，冰浴中攪拌1h，于10,000r/min離心30min，加硫酸銨至40％飽合度靜置過(guò)夜，于4℃，6,000r/min離心20min；在上清液中加硫酸銨至60％飽合度，靜置過(guò)夜，于4℃，6,000r/min離心20min，將沉淀用0.1mol，pH9.0的硼酸緩沖液溶解，所得粗酶液中含大豆脂氧合酶4.27×105U/ml(用亞油酸測(cè)定酶活)。
用250ml三角瓶，加粗酶液與底物溶液，裝液量20ml，計(jì)算加酶量為2.4×105U/ml(用亞油酸測(cè)定酶活)，分別加底物丁香酚或異丁香酚各2％，28℃，180r/min搖床，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化過(guò)程中每隔12h取樣，用比色法測(cè)定香草醛含量，結(jié)果如下表1表1 大豆粗酶液轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛
實(shí)施例2按實(shí)例1方法，制得粗酶制劑裝液量20ml/250ml三角瓶，加底物異丁香酚2％，加入1mmol濃度的H2O2，25℃，180r/min搖床進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化過(guò)程中每隔24h取樣，用比色法測(cè)定香草醛含量，結(jié)果如下表2表2 大豆粗酶液加H2O2轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛
實(shí)施例3
按實(shí)例1方法，制得粗酶液，裝液量20ml/250ml三角瓶，加底物異丁香酚2％，加入1％濃度的活性碳，25℃，180r/min搖床，轉(zhuǎn)化72h，水相直接用比色法測(cè)定，活性碳濾出后加25倍體積的無(wú)水乙醇于25℃振搖萃取4h，過(guò)濾后測(cè)乙醇中香草醛含量，兩者結(jié)果相加，結(jié)果如下表3表3 大豆粗酶液加活性碳轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛
實(shí)施例4按實(shí)例1方法，用中國(guó)東北大豆制得粗酶制劑，所得粗酶制劑18ml中含大豆脂氧合酶總酶活7.687×106U(用亞油酸測(cè)定)，用真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，凍干后得到干粉2g。由脫脂大豆粉制備粗酶凍干粉的得率約為8.65％。凍干酶粉用pH9.0的硼酸緩沖液溶解后所得總酶活為4.294×106U，是凍干前酶活的凍干酶活收率為55.86％，凍干酶粉的酶活為2,147U/mg。
用250ml三角瓶，加凍干酶粉與底物溶液，裝液量20ml，計(jì)算加酶量為7.7×106U/ml(用亞油酸測(cè)定酶活)，加底物異丁香酚2％，28℃，180r/min搖床，轉(zhuǎn)化72h，用HPLC測(cè)定香草醛含量1,570mg/L。
實(shí)施例5按實(shí)例1方法，用中國(guó)東北大豆制得的粗酶制劑100ml，粗酶液含大豆脂氧合酶酶活力6.01×106U/ml(用亞油酸測(cè)定)，30℃保溫；另稱(chēng)取10g卡拉膠，加200ml生理鹽水，加熱溶解后，冷卻到55℃保溫。兩者在50℃以下混勻，倒入平皿，冷卻，加KCl溶液，放冰箱中硬化3h，稱(chēng)重得約300g固定化細(xì)胞。將此固定化細(xì)胞，按實(shí)例4方法進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。反復(fù)分批生物轉(zhuǎn)化10次結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 固定化酶反復(fù)分批轉(zhuǎn)化結(jié)果
實(shí)施例6按實(shí)例1方法，用中國(guó)東北大豆制得的粗酶制劑00ml，粗酶制劑含大豆脂氧合酶酶活6.01×106U/ml(用亞油酸測(cè)定)，用250ml三角瓶，裝液量20ml，加90％氯仿，10％酶液，與底物2％，，計(jì)算加酶量為6.0×105U/ml，28℃，180r/min搖床，每隔一定時(shí)間取樣用HPLC測(cè)定香草醛含量，結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 水-有機(jī)溶劑雙相體系轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛(mg/L)
實(shí)施例7按實(shí)施例2的方法，所得轉(zhuǎn)化液3500ml，轉(zhuǎn)化液中的香草醛的含量為1.06g/L，異丁香酚含量為1.06g/L。加入少許10％三氯乙酸(TCA)，緩慢加入，邊加邊攪拌，然后靜置使之沉淀，過(guò)濾，棄去沉淀，過(guò)濾所得的清液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，至原體積的1/10左右。用0.1mol的NaoH將清液pH調(diào)至9.0，用體積比為1∶1的正己烷萃取3次，用HPLC或TLC檢測(cè)水相中無(wú)殘留異丁香酚，合并的用正己烷萃取液，真空蒸發(fā)，回收溶劑。旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)至干，回收得到異丁香酚，稱(chēng)重為2.78g，HPLC測(cè)定純度為85.9％，回收率為100.94％。
正己烷萃取剩余水相100ml，用體積比為1∶1的自然pH乙酸乙酯萃取3次，萃取液加入4％(w/v)活性炭，加熱脫色，濾紙過(guò)濾，收集濾液，用100ml的飽和氯化鈉溶液進(jìn)行反萃乙酸乙酯，脫除其中殘留水份，再加約1％(w/v)的無(wú)水硫酸鈉，攪拌，進(jìn)一步脫水。將按以上步驟處理所得到的脫色有機(jī)相再次真空蒸發(fā)，回收溶劑。將濃縮至接近油狀的乙酸乙酯相干燥，即得白色粉狀結(jié)晶香草醛，稱(chēng)重為2.78g。經(jīng)HPLC測(cè)定，純度為85.9％，計(jì)算香草醛提取收率為64.34％。
香草醛精制取香草醛粗品，加約10倍量純水85℃溶解，調(diào)pH7.0后冷卻至室溫，將先析出的棕色油狀物除去，再冷卻至0-5℃結(jié)晶，抽濾，35℃干燥，得到成品，HPLC測(cè)定純度為98.9％。
權(quán)利要求
1.一種粗酶制劑，含有大豆脂氧合酶，其特征在于用作丁香酚、異丁香酚轉(zhuǎn)化為香草醛的生物催化劑。
2.如權(quán)利要求1所述粗酶制劑的制備方法，包括以下步驟(1)大豆、馬鈴薯為原料，脫脂制成脫脂大豆粉；(2)低溫水萃取液用不同飽合度的硫酸銨分級(jí)沉淀；(3)用硼酸緩沖液溶解的方法，制得粗酶液。
3.一種生產(chǎn)香草醛的生物轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟(1)將權(quán)利要求1所述的粗酶制劑作為生物催化劑；(2)將丁香酚、異丁香酚配制成溶液作為生物轉(zhuǎn)化底物；(3)將(1)的粗酶制劑，加入(2)的底物溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，生成香草醛；(4)回收未轉(zhuǎn)化底物異丁香酚，用于再次轉(zhuǎn)化；(5)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物香草醛的提純與精制。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于將權(quán)利要求1所述的粗酶制劑，制成凍干酶粉或固定化，作為生物催化劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于底物濃度為10～100mg/mL，粗酶制劑用量為4.0×104～6.0×106U/ml，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為20～50℃，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間為48～96h。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于轉(zhuǎn)化反應(yīng)在表面活性劑、H2O2、吸附劑、有機(jī)溶劑、助溶劑、水-有機(jī)溶劑雙相體系中的一種或多種物質(zhì)存在下進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的提純與精制是使用有機(jī)溶劑，在不同pH條件下，對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)液進(jìn)行分別萃取。
全文摘要
本發(fā)明涉及由植物提取的含脂氧合酶的粗酶制劑，及用其轉(zhuǎn)化丁香酚或異丁香酚制備香草醛的方法，該方法利用大豆提取酶，用于天然丁香油原料制取的異丁香酚的生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化2～3d，轉(zhuǎn)化液中含香草醛1～3g/L，對(duì)消耗底物的摩爾轉(zhuǎn)化率80％以上，未轉(zhuǎn)化的異丁香酚容易回收，可用于再次轉(zhuǎn)化，對(duì)底物總摩爾轉(zhuǎn)化率70％以上，提取得率為75～80％，產(chǎn)品純度95％以上。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化工藝可以直接用大豆粗提取酶液添加異丁香酚進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可以用制備的凍干粉，或其固定化粗酶加異丁香酚底物溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，固定化酶可反復(fù)利用多次。
文檔編號(hào)C12P7/24GK1600853SQ03157579
公開(kāi)日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2003年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月25日
發(fā)明者孫志浩 申請(qǐng)人:江南大學(xué)